JP7442443B2 - 多重特異性抗体 - Google Patents
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Description
a)少なくとも1つのCD137結合ドメイン(CD137-BD);及び
b)少なくとも1つのPDL1結合ドメイン(PDL1-BD)。
a)50nM未満、特に10nM未満、特に5nM未満、特に1nM未満、特に500 pM未満、さらに特に100pM未満、さらに特に50pM未満(特にSRPで測定した場合)の解離定数(KD)でヒトCD137に結合する;特に前記抗体はscFv(一価親和性)である;
b)特にSPRで測定した場合、Koff速度が10-3s-1以下、又は10-4s-1以下、又は10-5s-1以下のヒトCD137に結合する;特に前記抗体はscFvである;
c)特にSPRで測定した場合、少なくとも104M-1s-1以上、少なくとも105M-1s-1以上、少なくとも106M-1s-1以上のKon速度でヒトCD137に結合する;特に前記抗体はscFvである;
d)必要に応じて、ウレルマブと競合しない;
e)必要に応じて、ウトミルマブと競合しない;及び/又は
f)Macaca fascicularis(カニクイザル)CD137と交差反応する;及び/又は
g)scFv形式の場合、示差走査蛍光分析により測定された場合、少なくとも50℃、好ましくは少なくとも55℃、より好ましくは少なくとも60℃の融解温度を有し、特に抗体又はその抗原結合断片は、pH6.4、150mM NaClのリン酸-クエン酸緩衝液で処方され、特に、前記抗体は、pH6.4の150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸緩衝液で処方される;
h)scFv形式の場合、4℃で少なくとも2週間、特に少なくとも4週間保管した後、7%未満、例えば本発明の抗体が10mg/mlの開始濃度である場合、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、好ましくは1%未満、及び特に、本発明の抗体は、pH6.4で150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸塩緩衝液に製剤化される;及び/又は
i)scFv形式の場合、40℃で少なくとも2週間、特に少なくとも4週間保管した後、本発明の抗体が10mg/mlの開始濃度である場合、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、好ましくは1%未満のモノマー含有量が失われ、特に本発明の抗体がpH6.4の150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸緩衝液で処方される
である、項目13に記載の多重特異性抗体。
a)50nM未満、特に10nM未満、特に5nM未満、特に1nM未満、特に500 pM未満、さらに特に100pM未満、好ましくは10pM未満、より好ましくは5pM(特にSRPで測定した場合)の解離定数(KD)でヒトPDL1に結合する;特に前記抗体はscFv(一価親和性)である;
b)特にSPRで測定した場合、Koff速度が10-3s-1以下、又は10-4s-1以下、又は10-5s-1以下のヒトPDL1に結合する;特に前記抗体はscFvである;
c)特にSPRで測定した場合、少なくとも103M-1s-1以上、少なくとも104M-1s-1以上、少なくとも105M-1s-1以上、少なくとも106M-1s-1以上のKon速度でヒトPDL1に結合する;特に前記抗体はscFvである;
d)Macaca fascicularis(カニクイザル)PDL1と交差反応する;及び/又は;
e)Mus musculus PDL1と交差反応しない;及び/又は
f)scFv形式の場合、示差走査蛍光分析により測定された場合、少なくとも55℃、例えば、少なくとも60℃、好ましくは少なくとも65℃、より好ましくは少なくとも70℃の融解温度を有し、特に抗体又はその抗原結合断片は、pH6.4、150mM NaClのリン酸-クエン酸緩衝液で処方され、特に、前記抗体は、pH6.4の150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸緩衝液で処方される;
g)scFv形式の場合、5回の連続した凍結融解サイクル後に、本発明の抗体が10mg/mlの開始濃度であり、特に前記抗体が、pH6.4で150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸塩緩衝液中に処方される場合、5%未満、好ましくは3%未満、より好ましくは1%未満のモノマー含有量の損失がある;及び/又は
h)scFv形式の場合、4℃で少なくとも2週間、特に少なくとも4週間保存した後、本発明の抗体が10mg/mlの開始濃度である場合、特に本発明の抗体が、pH6.4で150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸塩緩衝液に処方される場合、15%未満、例えば12%未満、10%未満、7%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、好ましくは1%未満のモノマー含有量が失われる
である、項目25に記載の多重特異性抗体。
例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域で置き換えることにより改変することができる。ヒト定常領域での置換により、キメラ抗体は、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性を低下させながら、抗原を認識する際のその特異性を保持することができる。
(i)50nM未満、特に10nM未満、特に5nM未満、特に1nM未満、特に500pM未満、特に100pM未満、より具体的には50pM未満の解離定数(KD)でヒトCD137に結合し、特に前記抗体はscFv(一価の親和性)である;
(ii)SPRで測定した場合、Koff率速度が10-3s-1以下、又は10-4s-1以下、又は10-5s-1以下でヒトCD137に結合し、前記抗体はscFvである;
(iii)SPRで測定した場合、少なくとも104M-1s-1以上、少なくとも105M-1s-1以上、少なくとも106M-1s-1以上のKon速度でヒトCD137に結合し、特に、前記抗体はscFvである;
(iv)必要に応じて、ウレルマブと競合しない;
(v)必要に応じて、ウトミルマブと競合しない;
(vi)必要に応じて、Macaca fascicularis(カニクイザル)CD137と交差反応する;及び
(vii)必要に応じて、特に競合ELISAで測定した場合、CD137とそのリガンドCD137Lの相互作用を阻害しない。
本発明のCD137-BDのCD137タンパク質への結合を阻害する試験結合ドメインの能力は、試験結合ドメインがCD137への結合についてそのCD137-BDと競合できることを実証している;そのような結合ドメインは、非限定的な理論によれば、それが競合するCD137-BDと同じ又は関連する(例えば、構造的に類似又は空間的に近位の)CD137上のエピトープに結合することができる。特定の実施形態では、本発明のCD137-BDと同じCD137上のエピトープに結合する結合ドメインは、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒト又はヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製及び単離され得る。
例えば、上記のエピトープマッピングプロトコルを参照されたい。タンパク質の抗原性領域は、例えば、Oxford Molecular Groupから入手可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算されたものなど、標準的な抗原性及びハイドロパシープロットを使用して特定することもできる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためのホップ/ウッズ法(Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828);ハイドロパシープロットのためのKyte-Doolittle技術(Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157: 105-132)を採用する。
a)scFv形式の場合、示差走査蛍光分析(DSF)によって測定された場合、少なくとも50℃、好ましくは少なくとも55℃、より好ましくは少なくとも60℃の融解温度(Tm)を有し、特に前記抗体又はその抗原結合断片は、pH6.4、150mM NaClのリン酸-クエン酸緩衝液、特にpH6.4の50mMのリン酸-クエン酸緩衝液、150mM NaCl中で処方される。
b)scFv形式の場合、4℃で少なくとも2週間、特に少なくとも4週間保存した後、本発明の抗体が10mg/mlの開始濃度である場合、モノマー含有量が7%未満、例えば、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、好ましくは1%未満の喪失であり、特に、本発明の抗体、例えば、前記抗体又はその抗原結合断片は、pH6.4で150mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸塩緩衝液に処方される;及び/又は
c)scFv形式の場合、40℃で少なくとも2週間、特に少なくとも4週間保存した後、本発明の抗体が10mg/mlの開始濃度である場合、モノマー含有量が5%未満、例えば、4%未満、3%未満、2%未満、好ましくは1%未満の喪失であり、特に、本発明の抗体、例えば、前記抗体又はその抗原結合断片は、pH6.4で150 mM NaClを含む50mMリン酸クエン酸塩緩衝液に処方される。
さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossom 62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか、ギャップウェイトの16、14、12、10、8、6、又は4、長さの重みの1、2、3、4、5、又は6を用いて、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanとWunsch(J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)アルゴリズムを使用して決定できる。
(a)配列番号38と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるHCDR1;(b)配列番号39と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるHCDR2;(c)配列番号40と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるHCDR3;(d)配列番号51と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるLCDR1;(e)配列番号52と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるLCDR2;及び(f)配列番号53と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるLCDR3を含む。
(i)以下のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列:
a.それぞれ配列番号1、2、及び3、ならびにそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;又は
b.それぞれ配列番号35、36、及び37、ならびにそれぞれ配列番号48、49、及び50のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;又は
c.それぞれ配列番号59、60、及び61、ならびにそれぞれ配列番号74、75、及び76のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;好ましくはVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4、より好ましくはVH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;ならびに
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、特にVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及び特に、配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、より具体的には配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくは配列番号199のアミノ酸配列を含むVλ FR4を含むVLフレームワークを含むVLドメイン
を含む。
(i)以下のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列:
a.それぞれ配列番号4、6、及び7、及びそれぞれ配列番号21、22、及び23のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列:
b.それぞれ配列番号5、6、及び7、及びそれぞれ配列番号21、22、及び23のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;又は
c.それぞれ配列番号38、39、及び40、及びそれぞれ配列番号51、52、及び53のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;好ましくはVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4、より好ましくはVH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;及び
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、特にVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及び特に、配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、より具体的には配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくは配列番号199のアミノ酸配列を含むVλ FR4を含むVLフレームワークを含むVLドメイン
を含む。
(i)CDRドメインCDR1、CDR2及びCDR3;
(ii)ヒトVκフレームワーク領域FR1~FR3、特にヒトVκ1フレームワーク領域FR1~FR3;
(iii)(a)FR4のヒトVλ生殖系列配列、特に配列番号199~205の列挙から選択されるVλ生殖系列配列、好ましくは配列番号199のアミノ酸配列を含むVλFR4;及び(b)配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むFR4の最も近いヒトVλ生殖系列配列と比較して、1つ又は2つの変異、特に1つの変異を有するVλベースの配列、好ましくは配列番号199のアミノ酸配列を含むVλFR4から選択されるFR4
を含むVlを含む。
(i)以下のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列:
a.それぞれ配列番号4、6、及び7、及びそれぞれ配列番号21、22、及び23のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
b.それぞれ配列番号5、6、及び7、及びそれぞれ配列番号21、22、及び23のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;又は
c.それぞれ配列番号38、39、40、及びそれぞれ配列番号51、52、及び53のLCDR1、LCDR2、LCDR3配列;
(ii)VH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;及び
(iii)Vκ1フレームワークFR1、FR2、及びFR3を含むVLフレームワーク、配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、特に配列番号199~配列番号205、好ましくは配列番号199で示されるVλFR4を含むVLドメイン
を含む。
(i)それぞれ配列番号1、2、及び3のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;及び
(iii)Vκ1フレームワークFR1、FR2、及びFR3を含むVLフレームワーク、配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、特に配列番号199~配列番号205、好ましくは配列番号199で示されるVλFR4を含むVLドメイン
を含む。
(i)それぞれ配列番号59、60、及び61のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号74、75、及び76のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;及び
(iii)Vκ1フレームワークFR1、FR2、及びFR3を含むVLフレームワーク、配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、特に配列番号199~配列番号205、好ましくは配列番号199で示されるVλFR4を含むVLドメイン
を含む。
(a)それぞれ配列番号1、2、及び3のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(b)それぞれ配列番号1、2、及び3のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%同一であるVL配列;
(c)それぞれ配列番号1、2、及び3のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(d)それぞれ配列番号1、2、及び3のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号30のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、前記VHはG51C変異(AHo番号付け)を含み、前記VLはT141C変異(AHo番号付け)を含む;又は
(e)それぞれ配列番号35、36、及び37のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号48、49、及び50のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号57のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列
を含む。
(a)配列番号14のVH配列及び配列番号27のVL配列;
(b)配列番号15のVH配列及び配列番号28のVL配列;
(c)配列番号16のVH配列及び配列番号29のVL配列;
(d)配列番号17のVH配列、及び配列番号30のVL配列;又は
(e)配列番号47のVH配列及び配列番号57のVL配列
を含む。
(a)配列番号14のVH配列及び配列番号27のVL配列;
(b)配列番号15のVH配列及び配列番号28のVL配列;
(c)配列番号16のVH配列及び配列番号29のVL配列;
(d)配列番号17のVH配列、及び配列番号30のVL配列;又は
(e)配列番号47のVH配列及び配列番号57のVL配列
を含む。
CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトさせた、特定の天然に存在する抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣した組換え抗体又は結合ドメインを発現させることができる(例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522- 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86: 10029-10033; U.S. Pat. No. 5,225,539 to Winter, and U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370 to Queen et al.を参照されたい)。
(i)特に表面プラズモン共鳴(SPR)で測定した場合、10nM未満、特に5nM未満、特に1nM未満、特に500pM未満、さらに特に100pM未満、好ましくは50pM未満、より好ましくは10pM未満、より好ましくは5pMの解離定数(KD)でヒトPDL1に結合し、ここで、前記抗体はscFv(一価親和性)である;
(ii)SPRで測定した場合、Koff速度が10-3s-1以下、又は10-4s-1以下、又は10-5s-1以下でヒトPDL1に結合し、ここで、前記抗体はscFvである;
(iii)SPRで測定した場合、Kon速度が少なくとも103M-1s-1以上、少なくとも104M-1s-1以上、少なくとも105M-1s-1以上、少なくとも106M-1s-1以上でヒトPDL1に結合し、特に、前記抗体がscFvである;
(iv)表面プラズモン共鳴(SPR)で測定した場合、10nM未満、5nM未満、特に1nM未満、特に500pM未満、さらに特に100pM未満、好ましくは10pM未満の解離定数(KD)でMacaca fascicularis(カニクイザル)PDL1に結合する;
(v)特にSPRで測定した場合、Mus musculus PDL1に対して非交差反応性である;及び/又は
(vi)特にSPRで測定した場合、ヒトPDL2に結合しない。
(i)以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列:
a.それぞれ配列番号92、94、及び95のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号108、109、及び110のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
b.それぞれ配列番号122、124、及び125のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号138、139、及び140のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列:又は
c.それぞれ配列番号123、124、及び125のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号138、139、及び140のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメイン、好ましくはVH4ドメイン;ならびに
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、具体的にはVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及びVκFR4、具体的にはVκ1 FR4、Vκ3 FR4、及びVλ FR4から選択されるフレームワークFR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むVλ FR4、より好ましくはVλ FR4は配列番号199に記載される、を含むVLドメイン。
(i)それぞれ配列番号93、94、及び95のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号108、109、及び110のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH1A、VH1B、VH3又はVH4ドメイン、好ましくはVH1A又はVH1Bドメイン;ならびに
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、具体的にはVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及びVκFR4、具体的にはVκ1 FR4、Vκ3 FR4、及びVλ FR4から選択されるフレームワークFR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくはVλ FR4は配列番号199~配列番号205に記載され、より好ましくはVλ FR4は配列番号199に記載される、を含むVLドメイン。
(i)それぞれ配列番号119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメイン、好ましくはVH4ドメイン;ならびに
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、具体的にはVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及びVκFR4、具体的にはVκ1 FR4、Vκ3 FR4、及びVλ FR4から選択されるフレームワークFR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくはVλ FR4は配列番号199~配列番号205に記載され、より好ましくはVλ FR4は配列番号199に記載される、を含むVLドメイン。
(i)それぞれ配列番号89、90、及び91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;好ましくは、VH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;ならびに
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、具体的にはVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及びVκFR4、具体的にはVκ1 FR4、Vκ3 FR4、及びVλ FR4から選択されるフレームワークFR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくはVλ FR4は配列番号199~配列番号205に記載され、より好ましくはVλ FR4は配列番号199に記載される、を含むVLドメイン。
(i)CDRドメインCDR1、CDR2及びCDR3;
(ii)ヒトVκフレームワーク領域FR1~FR3、特にヒトVκ1フレームワーク領域FR1~FR3;
(iii)(a)FR4のヒトVλ生殖系列配列、特に配列番号199~205の列挙から選択されたVλ生殖系列配列から選択されるFR4、好ましくはVλFR4は配列番号199に示されるとおりである;及び(b)配列番号199~配列番号205、好ましくは配列番号199のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むFR4の最も近いヒトVλ生殖系列配列と比較して、1つ又は2つの変異、特に1つの変異を有するVλベースの配列。
(a)それぞれ配列番号92、94、及び95のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号108、109、及び110のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号102と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号114と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL;
(b)それぞれ配列番号93、94、及び95のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号108、109、及び110のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号103と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号114と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(c)それぞれ配列番号92、93及び94のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号108、109及び110のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号104と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号115と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、前記VHはG56A及びY105F変異(AHo番号付け)を含み、前記VLはS9A及びA51P変異(AHo番号付け)を含む;
(d)それぞれ配列番号122、124、及び125のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号138、139、及び140のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号132と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号144と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(e)それぞれ配列番号123、124、125のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号138、139、及び140のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号133と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号145と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、前記VHはV2S、V25A、I44V、G56A、V82K、F89V及びY105F変異(AHo番号付け)を含み、前記VLは、I2F、M4L及びA51P変異(AHo番号付け)を含む;又は
(f)それぞれ配列番号122、124及び125のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号138、139、及び140のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号134と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号144と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、前記VHは、V25A、I44V、G56A、V82K及びF89V変異(AHo番号付け)を含む、を含む。
(a)それぞれ配列番号89、90、91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号102と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号114と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(b)それぞれ配列番号89、90、91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号103と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号114と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(c)それぞれ配列番号89、90、91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号105、106、107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号104と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号115と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、VHはG56A及びY105F変異(AHo番号付け)を含み、VLはS9A及びA51P変異(AHo番号付け);
(d)それぞれ配列番号119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号132と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、及び配列番号144と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列;
(e)それぞれ配列番号119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号133と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、配列番号145と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、ここで、前記VHは、V2S、V25A、I44V、G56A、V82K、F89V及びY105F変異(AHo番号付け)を含み、前記VLは、I2F、M4L及びA51P変異(AHo番号付け)を含む;又は
(f)それぞれ配列番号119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、それぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号134と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、配列番号144と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは、前記VHは、V25A、I44V、G56A、V82K及びF89V変異(AHo番号付け)を含む。
軽鎖可変領域は、配列番号114、115、144及び145、好ましくは配列番号114又は115、より好ましくは配列番号115からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80パーセント、少なくとも90パーセント、又は少なくとも95パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。
(i)少なくとも1つのCD137-BD、ここで、前記CD137-BDは、それぞれ配列番号1、2、及び3のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号18、19、及び20のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号17のVH配列、及び配列番号30のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号30のVL配列;及び
(ii)少なくとも1つのPDL1-BD、ここで、前記PDL1-BDは以下を含む:(a)それぞれ配列番号89、90、91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号102のVH配列、及び配列番号114のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号114のVL配列;又は
(b)それぞれ配列番号89、90、91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号104のVH配列、及び配列番号115のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号115のVL配列;又は
(c)それぞれ配列番号119、120、121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号133のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号133のVH配列、及び配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号145のVL配列;又は
(d)それぞれ配列番号119、120、121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号134のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号134のVH配列、及び配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号144のVL配列。
(i)少なくとも1つのCD137-BD、ここで、前記CD137-BDは、それぞれ配列番号59、60及び61のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号74、75及び76のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列、配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは、配列番号71のVH配列、及び配列番号83のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号83のVL配列を含む;及び
(ii)少なくとも1つのPDL1-BD、ここで、前記PDL1-BDは以下を含む:
(a)それぞれ配列番号89、90、及び91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号102のVH配列、及び配列番号114のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号114のVLのVL配列;又は
(b)それぞれ配列番号89、90、及び91のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号105、106、及び107のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号104のVH配列、及び配列番号115のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号115のVH配列;又は
(c)それぞれ配列番号119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号133のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号133のVH配列、及び配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号145のVH配列;又は
(d)それぞれ配列番号119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号135、136、及び137のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号134のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列、好ましくは配列番号134のVH配列、及び配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列、好ましくは配列番号144のVH配列。
(i)少なくとも1つのヒト血清アルブミンドメインを含む本発明の多重特異性抗体の血清半減期は、IgGのそれと同等である;
(ii)本発明の多重特異性抗体へのヒト血清アルブミン結合ドメインの追加は、他の結合ドメインの機能と互換性がある、例えば、PDL1-BDはそのブロッキング活性を保持し、CD137-BDは、クラスタリング時にCD137シグナル伝達を活性化するその能力を保持する;
(iii)ヒト血清アルブミン結合ドメインは、CD137を活性化するために本発明の多重特異性抗体のEC50を増加させるとしても、予期せぬことに最大効果サイズを改善する、例えば、CD137シグナル伝達の最大活性化は著しく高くなる。
(i)以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列:
(a)それぞれ配列番号152、153、及び154のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号165、166、及び167のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;又は
(b)それぞれ配列番号176、177、及び178のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号189、190、及び191のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;好ましくはVH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;及び
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、具体的にはVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及びVκFR4、具体的にはVκ1 FR4、Vκ3 FR4、及びVλ FR4から選択されるフレームワークFR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列に記載されるVλ FR4、より好ましくは配列番号199のアミノ酸配列に記載されるVλ FR4を含むVLフレームワークを含むVLドメイン
を含む。
(i)それぞれ配列番号149、150、及び151のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、及びそれぞれ配列番号162、163、及び164のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列;
(ii)VH3又はVH4ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;好ましくはVH3ドメインフレームワーク配列FR1~FR4;及び
(iii)VκフレームワークFR1、FR2及びFR3、具体的にはVκ1又はVκ3 FR1~FR3、好ましくはVκ1 FR1~FR3、及びVκFR4、具体的にはVκ1 FR4、Vκ3 FR4、及びVλ FR4から選択されるフレームワークFR4、好ましくは配列番号199~配列番号205のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも60、70、80、90パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FR4、より好ましくは配列番号199のアミノ酸配列を含むVλ FR4を含むVLフレームワークを含むVLドメイン
を含む。
(i)CDRドメインCDR1、CDR2及びCDR3;
(ii)ヒトVκフレームワーク領域FR1~FR3、具体的にはヒトVκ1フレームワーク領域FR1~FR3;
FR4であって、(a)FR4のヒトVλ生殖系列配列、特に配列番号199~205、好ましくは配列番号199の列挙から選択されるVλ生殖系列配列;及び(b)配列番号199~配列番号199のいずれか、好ましくは配列番号199から選択される挙げられる配列を含むFR4の最も近いヒトVλ生殖系列配列と比較して、1つ又は2つの変異、特に1つの変異を有するVλベースの配列から選択されるFR4
を含むVLを含む。
(a)それぞれ配列番号152、153、及び154のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号165、166、及び167のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号161と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するVH配列は、及び配列番号171と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%のとの同一性を有するVL配列;又は
(b)それぞれ配列番号176、177、及び178のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列と、それぞれ配列番号189、190、及び191のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号185と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するVH配列、及び配列番号195と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するVL配列
を含む。
(a)それぞれ配列番号149、150、及び151のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号162、163、及び164のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号161と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するVH配列、及び配列番号171と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の同一性を有するVL配列;又は
(b)それぞれ配列番号173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号186、187、及び188のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列、配列番号185と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するVH配列、及び配列番号195と少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するVL配列
を含む。
Genmab技術(Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150参照)及びMerus(de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750)技術を含む。機能的抗体Fc部分を含む二重特異性抗体の製造方法も当技術分野で知られている(例えば、Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134、及びSuresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228参照)。
方法:
異なる種のPDL1への親和性は、Biacore T200デバイス(GE Healthcare)を使用したSPR測定によって決定された。ヒトIgGのFc領域に特異的な抗体をアミンカップリングによってセンサーチップ(CM5センサーチップ、GE Healthcare)に固定化した。Fcを含むMorrison形式を除いて、すべての形式で、異なる種のPDL1-Fcキメラタンパク質が固定化抗体によって捕捉された。この実験では、Fcタグ付きヒトCD137(R&D Systems、カタログ838-4B-100)及びFcタグ付きヒトPDL1(Sino Biological、カタログ10084-H02H)は、GE HealthcareのHuman Antibody Captureキット(カタログBR-1008-39)を用いて捕捉された。
異なる種の血清アルブミン(SA)に対する分子の親和性は、Biacore T200デバイス(GE Healthcare)を使用したSPR測定によって決定された。SAは、アミンカップリング化学を使用して、CM5センサーチップ(GE Healthcare)に直接結合された。再生スカウティングと表面性能試験を行って最適なアッセイ条件を見つけた後、用量反応を測定し、得られた結合曲線を二重参照(空の参照チャネルとゼロの検体注入)し、1:1ラングミュアモデルを使用して速度論パラメーターを取得してフィッティングした。このアッセイは、pH5.5の1×PBS-Tween緩衝液で行った。
scDb-scFvのヒトPDL1への親和性を表6に示す。ヒトPDL1への結合は、すべてのscDb-scFvについて確認された。ヒト化構築物の結合速度の測定値は、クローン33-03-G02のCDRと構造(STR)グラフトを比較すると、PDL1の結合親和性に違いがあることを示し、STRグラフトは、同じクローンのCDRグラフトと比較すると、親和性が20倍向上する(表6のPRO885対PRO1126)。クローン37-20-B03に由来するCDRグラフト(PRO997)は、クローン33-03-G02のSTRグラフトと比較して、約2倍高い親和性を示す。33-03-G02のCDRグラフトの結合親和性は、異なる多重特異性形式に結合されたときに親のscFvの結合親和性と類似する(表6のPRO830をPRO885、PRO951、PRO1123、PRO1124、PRO963、PRO966、PRO1057、PRO1058、PRO1059及びPRO1060と比較されたい)。両方のクローンに由来するscFvは、ヒト及びカニクイザルPDL1とほぼ同じ親和性を示す(表6のPRO977及びPRO830を参照されたい)。対応するscFvと比較すると、抗PDL1部分33-03-G02 sc18、37-20-B03 sc01、及び37-20-B03 sc09.1を含む多重特異性の親和性は類似していることが判明した(PRO1392、33-03-G02 sc18のscFv:KD=9.94E-12M;PRO908、37-20-B03 sc01のscFv:KD=5.94E-12M;及びPRO1347、37-20-sc09.1のscFv:KD=9.00E-12M)。対照的に、対応するscFv PRO1183と比較すると、抗PDL1部分33 03-G02 sc03を運搬するすべてのscDb-scFvでヒトPDL1への親和性の低下が観察された(33 03-G02 sc03のscFv:KD<2.09E-12M)。これらの構築物の親和性の損失は、主に解離速度が増加するオフレートの加速によるものである。PDL1に対する最高の親和性は、抗PDL1結合部分37-20-B03 sc09.1を含むPRO1430で見出された。
方法:
生物発光レポーター遺伝子アッセイでは、NFAT(活性化T細胞の核因子)-ルシフェラーゼレポーターとヒトPD-1を安定して発現する人工Jurkat T細胞がエフェクターT細胞として機能する。ヒトPDL1及びT細胞受容体(TCR)活性化因子を安定的に発現する細胞は、抗原提示細胞として機能する。2つの細胞株を共培養すると、TCR活性化分子/TCR複合体の架橋を介してJurkat NFAT経路の活性化が誘導される。PDL1発現細胞が関与すると、PD-1エフェクターT細胞におけるPD-1シグナル伝達がT細胞機能を阻害し、NFAT経路の阻害をもたらす。PD-1とPDL1受容体の相互作用の遮断は、NFAT経路の再活性化につながる。100μlの細胞培養液(DMEM/F12、10%FCS)中の35,000個のCHO/PDL1/TCR活性化分子(BPS Bioscience)細胞を、白色細胞培養プレートの内側のウェルに加え、37℃で16~20時間、5%CO2でインキュベートした。翌日、各ウェルから95μlの細胞培養液を除去し、参照アベルマブを含む、試験対象の各分子(3,000から0.46ng/ml)の2倍濃縮段階希釈液を50μl加えた。次に、アッセイ緩衝液(10%FCSを含むRPMI1640)で400,000細胞/mlに希釈したPD-1(BPS Bioscience)を発現するエフェクターJurkat細胞50μlを各ウェルに加え、プレートを37℃で5時間、5%CO2でインキュベートした。最後に、製造元のプロトコルに従って調製された50μLのルシフェラーゼ基質(BPS Bioscience)をウェルごとに加え、プレートを暗闇で30分間インキュベートし、Topcountを使用して発光を測定した。
各プレートの個々のIC50値は、各プレートで測定された参照分子アベルマブのIC50に対してキャリブレーションされた(相対IC50:IC50、アベルマブ/IC50、試験scFv)。効力を表7にまとめる。これは、試験したすべての分子のIC50がアベルマブのIC50の0.1倍から3.73倍であることを示す。
これらのアッセイは、PDL1とPD-1又はPDL1とB.71の間の相互作用をブロックするPDL1阻害剤の能力を評価するために実行された。scFvs、scDbs、scDb-scFv、及びモリソンを含む様々な形式を競合ELISAで分析し、参照IgGアベルマブと比較した。
方法
4μg/mlのヒトPD-1を4℃で一晩コーティングしたELISAマイクロプレートを、ウェルあたり450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。各ウェルに1%BSAと0.2%tween(希釈緩衝液)を含む300μlのPBSを加えることにより、プレートを室温で1時間ブロックした。阻害剤は、1ng/mlのビオチン化ヒトPDL1を含む希釈緩衝液で、300倍から0.005ng/mlの範囲の最終濃度に3倍のステップで段階的に希釈した。混合物を、回転ミキサー(21rpm)で穏やかに攪拌しながら室温で1時間プレインキュベートし、ウェルあたり450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した後、マイクロプレートに加えた。プレートを穏やかに攪拌しながら室温で1.5時間インキュベートし、ウェルあたり450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した後、10ng/mlのストレプトアビジン-ポリHRP40を各マイクロプレートウェルに添加した。RTで1時間インキュベートした後、プレートを450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄し、TMB基質溶液を加えた。6分後に1M HClを加えることにより酵素反応を停止させ、参照波長として690nmを使用して450nmで吸光度を測定した。IC50値の計算では、4つのパラメーターのロジスティック(4PL)カーブフィットが、参照減算値を使用してGraph Pad Prismで実行された。
各プレートの個々のIC50値は、各プレートで測定された参照分子アベルマブのIC50に対してキャリブレーションされた(相対IC50:IC50、アベルマブ/IC50、試験scFv)。効力を表8にまとめる。図7及び表8に示すように、競合ELISAで試験すると、すべてのPDL1阻害剤がPD-1とPDL1の相互作用をブロックした。 scFv PRO830は類似の効力との相互作用をブロックしたが、PRO997及びPRO1013はアベルマブよりも有意に低いIC50値を示し、より強力な阻害剤である。複数の特定の形式、つまりscDbsやMorrisonsに組み合わせると、すべての分子がその阻害特性を保持した。PRO885はアベルマブよりも効力が低かったのに対し、改善された抗PDL1ドメインを含むPRO1126については、より低いIC50値が決定された。モリソン形式は、アベルマブと比較した場合、効力がわずかに劣っていた。PRO1057の中和効果は、ヒト血清アルブミンの存在下でも示され、IC50値は約2倍高かった。
方法
4μg/mlのヒトB7.1で4℃で一晩コーティングしたELISAマイクロプレートを、ウェルあたり450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。各ウェルに1%BSAと0.2%tween(希釈緩衝液)を含む300μlのPBSを加えることにより、プレートを室温で1時間ブロックした。阻害剤を3倍の段階で段階的に希釈し、40ng/mlのビオチン化PDL1を含む希釈緩衝液で900~0.015ng/mlの範囲の最終濃度にした。混合物を、回転ミキサー(21rpm)で穏やかに攪拌しながら室温で1時間プレインキュベートし、ウェルあたり450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した後、マイクロプレートに加えた。プレートを穏やかに攪拌しながら室温で1.5時間インキュベートし、ウェルあたり450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した後、10ng/mlのストレプトアビジン-ポリHRP40を各マイクロプレートウェルに添加した。RTで1時間インキュベートした後、プレートを450μlの洗浄緩衝液で3回洗浄し、TMB基質溶液を加えた。6分後に1M HClを加えることにより酵素反応を停止させ、参照波長として690nmを使用して450nmで吸光度を測定した。IC50値の計算では、4つのパラメーターのロジスティック(4PL)カーブフィットが、参照減算値を使用してGraph Pad Prismで実行された。
各プレートの個々のIC50値は、各プレートで測定された参照分子アベルマブのIC50に対してキャリブレーションされた(相対IC50:IC50、アベルマブ/IC50、試験scFv)。効力を表8にまとめる。PRO1126を除いて、すべてのPDL1阻害剤は、PD-1とB7.1の相互作用をブロックする能力についても試験された。PRO830はアベルマブと同様の効力を示したのに対し、PRO997とPRO1013のIC50値は低くなった。すべてのscDbsとMorrisonsもPDL1とB.7-1の間の相互作用を抑制した。scDb PRO885はアベルマブと同様の効力を示したが、モリソンのIC50値は約2~3.4倍低かった。図8と表8にデータを示す。
方法:
PRO885がCD137へのCD137リガンド(CD137L)の結合を妨害しないことを示すために、競合ELISAを採用した。市販の阻害性ポリクローナル抗CD137ヤギ抗体(Antibodies online、Cat#ABIN636609)が参照として使用された。手短に言えば、CD137をELISAプレートに一晩コーティングし、PRO885の段階希釈をELISAプレートに加えた。その後、ビオチン化CD137Lを添加し、結合したリガンドをストレプトアビジン-HRPの添加により検出した。最後に、HRP基質TMBが追加された。5分間の現像後、反応を1M HCl溶液で停止した。参照として、450nmと690nmで吸光度を測定した。
クローン38-02-A04に由来するCD137ドメインを含むPRO885で得られた滴定曲線を図9Aに示し、クローン38-27-C05に由来するCD137ドメインを含むPRO951で得られた結合曲線を図9Bに示す。クローン38-27-A11に由来するCD137ドメインを含むPRO1359及びPRO1360で得られた滴定曲線を図9Cに示す。参照抗体はCD137LのCD137への結合を完全に防止したが、PRO885、PRO951、PRO1359及びPRO1360は、CD137LのCD137への結合を有意に阻害しなかったため、中和なしと定義された。
方法:
タンパク質PRO885(38-02-A04 CDRグラフトを含むscDb)、PRO951(38-27-C05 CDRグラフトを含むscDb)、クローン38-27-A11に由来するウサギIgG、及び競合分子ウレルマブのCD137の結合エピトープ(BMS)及びオトミルマブ(Pfizer)は、MASS-1デバイス(Sierra Sensors)を使用したSPRエピトープビニングアッセイで比較された。分子が互いにCD137への結合をブロックするかどうかを調べるために、サンドイッチ構成が選択された。したがって、PRO885、PRO951、クローン38-27-A11由来のウサギIgG、ウレルマブ、及びウトミルマブは、高容量アミンセンサーチップ(HCA、Sierraセンサー)に固定化された。次に、90nMの抗原CD137(PeproTech、カタログ310-15)をscDbs、ウサギIgG 38-27-A11、ウレルマブ、又はウトミルマブに注入して捕捉し、すぐに22.5nMの二次抗体を注入した(PRO885、PRO951、ウサギIgG 38-27-A11、ウレルマブ又はオトミルマブ)。各タンパク質のCD137の捕捉レベルと2番目の結合応答レベルを決定した(応答単位、RU)。関与するタンパク質の分子量と捕捉レベルに依存する理論的な最大応答(Rmax)を計算することにより、捕捉された抗原上のタンパク質の相対結合レベル(%)が決定された。分子が、CD137上の同じ、重複している(例えば、構造的に類似又は空間的に近位)又は類似のエピトープに結合する場合、捕捉されたCD137の上に注入された抗体の結合は観察されない。その結果、抗体の結合が観察されると、2つの抗体ペアは重複しないエピトープに結合する。相対結合レベル(%)を各抗体ペアについて決定した。定義により、10%未満の結合レベルは、CD137と同じ又は重複している(例えば、構造的に類似又は空間的に近位)ことを示し、30%を超えると、重複していないエピトープを指す。
PRO885がセンサーチップに固定化されると、3つの抗体PRO951、ウレルマブ、オトミルマブのすべてが、PRO885によって捕捉されたCD137への結合を示した。予想通り、コントロールを使用したPRO885では結合は観察されなかった(図10及び図11)。PRO951がセンサーチップに固定化されると、ウレルマブとPRO885は結合を示したが、対照として使用されたウトミルマブとPRO951は有意な結合を示さなかった(図10及び図12)。これらの結果は、クローン38-02-A04に由来するPRO885が、CD137のウレルマブ、ウトミルマブ、及び38-27-C05に由来するPRO951とは異なるエピトープに結合することを示す。対照的に、RO951は、ウトミルマブと重なっているが、ウレルマブとPRO885とは重なっていないエピトープに結合する。
導入
このアッセイでは、Jukat細胞におけるCD137シグナル伝達の活性化を評価した。CD137シグナル伝達の活性は、Jurkatレポーター細胞株におけるCD137誘導NF-kB活性化によって駆動されるルシフェラーゼ発現の測定によって報告される。ルシフェラーゼの発現は、CD137の活性と直接相関する。さらに、シグナル経路の活性化に必要なCD137のクラスター化は、Jurkat細胞とPDL1発現細胞株の間の免疫シナプスの形成を介して促進される。したがって、レポーター細胞株におけるCD137のクラスター化と活性化にはPDL1発現が必要である。
PDL1発現CHO(クローンA2)細胞及びHCC827細胞を未刺激又は24時間、10ng/mlのIFNγで刺激してPDL1発現を増加させ、96ウェル培養プレートに25,000細胞/ウェルで播種した。陰性対照として、PDL1発現のないCHO WT細胞を同じ細胞密度で播種した。次に、抗PDL1xCD137分子と競合ウレルマブの段階希釈液を調製し、細胞に加えた。次に、Jurkatレポーター細胞を、HSAを25mg/mlで含むか含まないアッセイ培地で調製し、ウェルあたり40,000細胞の細胞密度で添加した。ルシフェラーゼ発現をルシフェラーゼ試薬の添加により検出し、Jurkat細胞の添加の6又は24時間後に発光リーダーにより読み取った。ウレルマブ(図13~18、図19A)又はPRO885(図19B)で測定されたRLUに対する試験サンプルの相対発光単位(RLU)を正規化してデータを分析し、CD137シグナル伝達の相対活性化の値を得た。
I.CHO-PDL1細胞を使用したPRO885及びPRO951の試験:
図13に示すように、PRO885及びPRO951は、PDL1発現CHO細胞の存在下で、ウレルマブよりも効率的にCD137シグナル伝達を活性化した。PRO885は最高の効力と最高の活性化シグナルを示した(PRO885、EC50=11.72ng/ml、PRO951:EC50=33.68ng/ml;ウレルマブ:EC50=79.11ng/ml、表9)。PDL1が存在しない場合、PRO885もPRO951もレポーター細胞でCD137を活性化できなかったが、ウレルマブはPDL1とは無関係にCD137シグナル伝達の活性化を示した。
図14と表10に示すように、抗PDL1xCD137 scDb分子は、CD137シグナル伝達を、ウレルマブよりも効率的に刺激した。ウレルマブとは対照的に、PDL1を発現する標的細胞が存在する場合、scDbに対してのみ刺激効果が見られなかった。すべてのscDbは、PDL1を高レベルで発現するCHO細胞の存在下でNf-kBレポーター遺伝子の活性化を刺激する同一の効力を示した。次に、同じ分子を、より少量のPDL1を発現する細胞の存在下で試験した。
図15と表11に示すように、抗PDL1xCD137 scDb分子は、CD137シグナル伝達をウレルマブよりも効率的に刺激した。親和性が改善されたCD137ドメインを有するscDb(38-02-A04、PRO1120、及びPRO1124のSTRグラフト)は、CDRグラフトされたCD137ドメインと比較した場合、CD137活性化において改善された効力を示した(例えば、PRO885、EC50=13.02ng/ml、PRO1124:EC50=5.62ng/ml、表11)。注目すべきことに、PDL1ドメイン(Pro1126)のSTRグラフトで見つかったため、PDL1への親和性の増加はまた、親分子PRO885と比較し場合、増加した効力に至った(PRO885、EC50=13.02ng/ml、PRO1126:EC50=6.97ng/ml、表11)。高濃度では、STRグラフトscDbは、活性化のシグナルを減少させる傾向を示した。これは、STRグラフトCD137ドメイン(PRO1120及びPRO1126)を有する分子でより顕著であった。興味深いことに、PDL1ドメインのSTRグラフトをCD137のCDRグラフトと組み合わせた場合、高濃度でのシグナルの減少は観察されなかった(図15のPRO885とPRO1124を比較されたい)。したがって、CD137とPDL1への親和性の増加に伴い、効力はわずかに増加した。PDL1への親和性の増加はこの効果に寄与しなかったが、高濃度(ベル形の曲線)でのシグナルの減少は、CD137への親和性の増加とともにより顕著になった。したがって、各ドメインの絶対的な親和性よりもむしろ、CD137とPDL1に対する親和性の比率が、最大活性の濃度ウィンドウを拡張するために重要であると考えられる。
IFNγによるHCC827の刺激は、scDb分子の効力を変更せずに活性化のシグナルを増加させた。注目すべきことに、この設定では、試験されたscDbの高濃度でのシグナルの低下はそれほど明白ではなく、PDL1発現との相関を示唆する(図16及び表12)。
図17及び18、表13及び14に示すように、試験された長い半減期の抗PDL1xCD137分子は、CD137シグナル伝達をウレルマブと同じ程度に刺激した。Morrision形式(PRO1060、PRO1062)をscDb-scFv形式(PRO1057、PRO1058)と比較すると、違いがあった。モリソン形式はより高い効力を示したが、活性化の最大シグナルは、scDb-scFvが試験されたときに大幅に増加した。注目すべきことに、24時間のインキュベーション後、PRO1057は活性化の驚くべき高いシグナルを示した。試験されたすべての長い半減期の分子は、PDL1発現細胞の存在下でのみCD137シグナル伝達を活性化した。興味深いことに、両方のターゲットに類似した親和性があるにもかかわらず、PRO1057はPRO1058よりもはるかに高い最大シグナルを示した。さらに、一価のscDb-scFv PRO1057は、それぞれの二価のモリソン形式PRO1060よりも強い活性化を示した。
図19A及び表15に示すように、試験された長い半減期の抗PDL1xCD137分子は、より少量のPDL1を発現する細胞の存在下で、ウレルマブと同じ程度にCD137シグナル伝達を刺激した。試験された分子の最大活性化は、標的細胞がIFNγによって刺激されたときにさらに増加し、CD137の活性化と標的細胞上のPDL1発現のレベルとの直接的な相関が示唆された。前述のように、PRO1057はモリソン形式(PRO1060)と比較して、より高いレベルのレポーター遺伝子活性化を示した。
方法
PDL1を発現するCHO-A2細胞を、抗ヒトCD3抗体でプレコートした96ウェル培養プレートに、ウェルあたり50,000~200,000細胞の範囲の3つの異なる密度で播種した。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、末梢血単核細胞(PBMC)が密度勾配遠心分離により新鮮なヒト全血から単離された。ウェルあたり100,000個のPBMCを96ウェルプレートに添加し、続いて抗PDL1xCD137 scDb PRO885を500、50及び5ng/mlの濃度で添加した。インキュベーションの76時間後、細胞上清を回収した。培養上清中のヒトインターロイキン-2(IL-2)レベルは、キットの指示に従って、BiolegendのIL-2ヒトELISA MAXアッセイを使用して定量した。IL-2濃度はIL-2標準曲線から内挿され、逆算され、EC50値の計算のためにPRO885濃度に対してプロットされた。
図20に示すように、IL-2は、PD-1/PDL1相互作用の同時遮断と二重特異性分子PRO885の追加によるCD137の刺激に続いてT細胞から分泌された。分泌されるIL-2レベルは、抗CD3抗体とCHO-A2細胞密度の増加、及びPRO885濃度の増加とともに増加した。抗CD3抗体がない場合、IL-2レベルは基礎IL-2分泌と同等であった。PRO885は、抗CD3抗体によって共刺激されたT細胞のみを活性化した。抗CD3による刺激がない場合、IL-2の用量依存的産生はなく、抗原特異的T細胞の選択的活性化を確認する。この発見は、PRO885が活性化T細胞のみを刺激することを示し、インビボPRO885が腫瘍特異的T細胞を特異的に刺激することを示唆する。
この実験では、PD-1/PDL1阻害とCD137アゴニズムの相乗効果を評価した。このアッセイでは、抗原提示細胞(APC)及びT細胞でPDL1を、T細胞でCD137をそれぞれ発現させるために、スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)で刺激された末梢血単核細胞(PBMC)を使用した。抗PDL1xCD137分子を適用することにより、2つのT細胞調節シグナル伝達経路が同時に標的にされた:抑制性PD-1/PDL1経路の阻害と、二重特異性抗PDL1xCD137分子PRO885によって、又は三重特異性抗PDL1xCD137xHSA分子PRO1175、PRO1430、PRO1479若しくはPRO1480によって媒介される免疫シナプスの形成によるCD137経路の活性化。二重特異性抗PDL1xCD137分子PRO885(配列番号209)による、又は三重特異性抗PDL1xCD137xHSA分子PRO1175(配列番号220)、PRO1430(配列番号222)、PRO1479(配列番号223)若しくはPRO1480(配列番号229)によるT細胞の活性化が評価された。T細胞の活性化は、インターロイキン2(IL-2)の分泌によって評価され、ベンチマーク基準抗体アベルマブによって媒介されるPDL1阻害によって媒介される効果と比較された。さらに、抗PDL1 scFv、PRO997が試験され、同じ実験設定でアベルマブと比較された。さらに、二重特異性抗PDL1xCD137分子PRO885(配列番号209)による、又は三重特異性抗PDL1xCD137xHSA分子PRO1175(配列番号220)、PRO1430(配列番号222)、PRO1479(配列番号223)若しくはPRO1480(配列番号229)によるT細胞の活性化を参照抗体アベルマブ又はウレルマブ、又はそれらの組み合わせの効果と比較した。
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離により新鮮なヒト全血から単離された。次に、抗CD56抗体とMACS細胞分離キット(Miltenyi Biotec)を使用して、NK細胞のPBMCを枯渇させた。次に、ウェルあたり100,000個のPBMCを96ウェルプレートに追加し、続いてSEAを含むアッセイ緩衝液に10ng/mlの濃度でPRO885、PRO997、PRO1175、PRO1430、PRO1479又はPRO1480、アベルマブ、ウレルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせを段階希釈したものを追加した。37℃、5%CO2で96時間インキュベーションした後、細胞上清を回収し、培養液のヒトインターロイキン-2(IL-2)レベルをキットの指示に従ってBioLegendのIL-2ヒトELISA MAXアッセイを使用して定量した。IL-2濃度は、IL-2標準曲線から内挿され、逆計算されて、EC50値の計算のためのためにアベルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせ、及びPRO885濃度に対してプロットされ(図21及び表18)、又はEC50値の計算のためにアベルマブ、ウレルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせ、PRO885及びPRO1175、又はPRO1186濃度に対してプロットされた(図23及び表19)。
この実験では、PD-1/PDL1阻害とCD137アゴニズムの相乗効果を評価した。このアッセイでは、T細胞でのCD137の発現を誘導するために、PDL1発現CHO細胞と抗CD3抗体の存在下で末梢血単核球(PBMC)を使用した。抗PDL1xCD137分子を適用することにより、2つのT細胞調節シグナル伝達経路が同時に標的にされた:阻害性PD-1/PDL1経路の阻害と、三重特異性抗PDL1xCD137xHSA分子によって媒介される免疫シナプスの形成によるCD137経路の活性化(PRO1186)。三重特異性抗PDL1xCD137xHSA分子PRO1186によるT細胞の活性化は、インターロイキン-2(IL-2)又はIFNγの分泌によって評価され、ベンチマーク参照抗体アベルマブ、ウレルマブによって媒介される交差連結、又はそれらの組み合わせによって媒介されるPDL1阻害媒介される効果と比較された。
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離により新鮮なヒト全血から単離された。次に、ウェルあたり100,000個のPBMCを、2mcg/mlの濃度の抗CD3抗体(BD Pharmingen、カタログ番号551916)を含む96ウェルプレートに添加し、ウェルあたり10,000個のCHO細胞がヒトPDL1を発現した後、アッセイ緩衝液にPRO1186、アベルマブ、ウレルマブ、及びアベルマブとウレルマブの組み合わせを段階希釈したものを添加した。37℃、5%CO2での72時間のインキュベーション後、細胞上清を回収し、培養上清中のヒトインターロイキン-2(IL-2)及びIFNγレベルを定量した。キットの指示に従い、BioLegendのIL-2ヒトELISA MAXアッセイを使用して、ヒトインターロイキン-2(IL-2)レベルを定量した。IL-2濃度は、IL-2標準曲線から内挿された(図23E)。ELISAによるキットの指示に従い、R&D SystemsのHumanIFN-γDuoSet ELISAアッセイを使用して、ヒトIFNγレベルを定量化した(図23F)。
図23(E)及び(F)に示すように、IL-2及びIFNγは、PD1/PDL1相互作用の同時遮断と、三重特異性分子PRO1186の追加によるCD137の刺激に続いてT細胞から分泌された。この発見は、三重特異性抗PDL1xCD137xHSA scDb-scFv PRO1186が、アベルマブによる単なるPDL1遮断、又はウレルマブによるCD137遮断、又はそれらの組み合わせよりも強いT細胞刺激を誘導できることを示しす。PRO1186は、IL-2(図23E)及びIFNγ(図23F)の産生を誘発するのに、アベルマブ又はウレルマブ、あるいはその2つの組み合わせよりも強力であった。抗CD3抗体がない場合、IL-2及びIFNγのレベルは、試験したすべての濃度で基礎サイトカイン分泌に匹敵し、生産的なCD137シグナル伝達にはTCRシグナル伝達又はCD3関与が必要であることを示す。
本発明の多重特異性抗体の抗腫瘍活性を、タコニック及び同種異系ヒト末梢血単核細胞由来の免疫不全NOGマウス株を用いたヒトHCC827 NSCLC異種グラフト片における抗PDL1及び抗CD137療法と比較した。グラフトしたヒトTリンパ球は、外来主要組織適合性(MHC)クラスI及びIIとマウス細胞からの他の抗原に対して異種反応性を示す。結果として、Tリンパ球は異なる臓器に炎症性浸潤を引き起こし、数週間後に動物の死に至る。これは異種グラフト片対宿主病(xGVHD)として公知であるプロセスである。抗PDL1や抗CD137などの免疫調節抗体による治療は、xGVHDを悪化させることが示された(Sanmamed MF et al. Nivolumab and urelumab enhance antitumor activity of human T lymphocytes engrafted in Rag2-/-IL2Rgnull immunodeficient mice. Cancer Res 2015;75(17):3466-3478)。腫瘍体積に対するPRO1057(scDb-scFv;配列番号218)とPRO1060(IgGの重鎖のC末端にCD137 scFvが融合したIgG-scFv;配列番号234及び235)の効果は、本発明の多重特異性抗体(例えば、PRO1137)と同じPDL1特異的可変ドメインを含むIgG1、及び同じCD137特異的可変ドメイン(PRO1138)を有するIgG4による処置と比較された。ローカライズされた抗腫瘍免疫応答のさらなる証拠を提供するために、CD8+、CD4+、制御性T細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の頻度をフローサイトメトリーで分析した。抗CD137/抗PDL1治療後の免疫系の変調を全身的に調査するために、肝臓及び脾臓におけるCD4+及びCD8+T細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。さらに、定量的ELISA法を使用して全身のIFNgレベルを分析した。
雌NOGマウスは、5×106個のHCC827細胞の片側注射を受けた。細胞を、PBS中の50%細胞懸濁液と50%マトリゲルの混合液に100μlの総注入量で注入した。NOGマウスへの腫瘍細胞の注入及び腫瘍グラフトの成功(中央群腫瘍体積80-100mm3)後、静脈内注射によってマウスを5×106個のヒトPBMCに置き換えた。無作為化の日に、各グループの4匹のマウスをドナーAのPBMCで再構成し、別の4匹のマウスをドナーBのPBMCで再構成した。PBMCの注射の1~2時間後に治療を開始し、以下のように適用した。
免疫不全症を使用したヒトHCC827 NSCLC異種グラフト片における多重特異性抗体PRO1057(scDb-scFv抗PDL1xCD137xHSA)及びPRO1060(モリソン形式抗PDL1xCD137)、抗PDL1(PRO1137)及び抗CD137(PRO1138又はurelumab)の抗腫瘍活性NOGマウス系統及び同種異系ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)は、腫瘍体積を測定することにより評価された(図24)。腫瘍体積は、17日目又は18日目にマウスが犠牲になるまで週2回測定された。腫瘍体積は、治療開始時の腫瘍体積(相対腫瘍体積)に対して正規化された。図24に示すように、抗CD137(PRO1138又はurelumab)又は抗PDL1(PRO1137)モノクローナル抗体で処理されたHCC827腫瘍保有マウスは、ベヒクルコントロールグループと同様の腫瘍増殖を示した。対照的に、scPb-scFv(PRO1057)やIgG-scFv(PRO1060)などの抗PDL1xCD137二重特異性抗体による治療は、腫瘍増殖の明確な安定化をもたらした。さらに、ドナーBからのPBMCで再構成されたマウスにおける二重特異性抗PDL1xCD137分子による処置は、腫瘍の退縮をもたらした(図24B及び24D)。特に、二重特異性分子による処置では、体重の中央値が低下することはなく、分子が試験した用量レベルで十分に許容されることを示唆しているが、ウレルマブによる処置では、治療開始から17日後に体重の中央値が減少した(図25)。
本発明の多重特異性抗体の抗腫瘍活性を、ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞(UCB HSCs)をグラフトしたNOGマウス株を用いたヒトHCC827 NSCLC異種グラフト片における抗PDL1及び抗CD137単剤及び併用療法と比較した。腫瘍体積に対するPRO1186(scDb-scFv;配列番号221)の効果を、本発明の多重特異性抗体と同じPDL1特異的可変ドメイン(例えば、PRO1196、配列番号242及び243)、アベルマブ(Aavelumab)、ウレルマブと比較した。さらに、腫瘍体積に対するPRO1186(scDb-scFv;配列番号221)の効果を、本発明の多重特異性抗体(PRO1196、配列番号242及び243)と同じPDL1特異的可変ドメインを含むIgG1の併用治療と、同じCD137特異的可変ドメイン(PRO1138、配列番号244及び245)を有するIgG4を比較した。ローカライズされた抗腫瘍免疫応答のさらなる証拠を提供するために、CD8+、CD4+、制御性T細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の頻度をフローサイトメトリーで分析した。抗CD137/抗PDL1治療後の免疫系の変調を全身的に調査するために、肝臓及び脾臓におけるCD4+及びCD8+T細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。さらに、定量的ELISA法を使用して、全身のIFNγレベルを分析した。
ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞(UCB HSC)をグラフトしたメスのNOGマウスに、HCC827 NSCLC細胞を皮下注射した。マウスは、5×106個のHCC827細胞の片側注射を受けた。細胞を、PBS中の50%細胞懸濁液と50%マトリゲルの混合液に100μlの総注入量で注入した。NOGマウスへの腫瘍細胞の注入及び腫瘍グラフトの成功(中央群腫瘍体積80~100mm3)後、マウス(n=10)を無作為に治療群に分けた。
ヒト臍帯血をグラフトした免疫不全NOGマウス系統を使用したヒトHCC827 NSCLC異種グラフト片における多重特異性抗体PRO1186(scDb-scFv抗PDL1xCD137xHSA)、抗PDL1(PRO1196又はavelumab)及び抗CD137(ウレルマブ)の抗腫瘍活性由来のCD34+造血幹細胞(UCB HSC)は、腫瘍体積を測定することで評価された(図28及び29)。腫瘍体積は、マウスが25、29、又は30日目に犠牲になるまで週2回測定された。腫瘍体積は、治療開始時の腫瘍体積(相対腫瘍体積)に対して正規化された。図28及び29に示すように、scDb-scFv(PRO1186)などの抗PDL1xCD137xHSA三重特異性抗体、及び抗PDL1(PRO1196)と抗CD137(PRO1138)の組み合わせによる治療は、腫瘍増殖の明確な安定化をもたらした。特に、三重特異性分子(PRO1186)による治療は、分子が中央値の減少につながらず、抗PDL1(PRO1196)と抗CD137(PRO1138)は、治療開始の24日後に、体重減少がそれぞれ10%又は15%を超える動物の数の増加をもたす(図30)。抗PDL1xCD137xHSA(PRO1186)療法は、抗PDL1 IgG(PRO1196)又は抗CD137 IgG(ウレルマブ)による療法よりも腫瘍増殖の強い減少をもたらした。抗PDL1xCD137xHSA(PRO1186)療法は、より高い奏効率(30%vs 20%)をもたらし、一般に抗PDL1と抗CD137の併用療法よりも忍容性が高かった。これは、より高い頻度の細胞毒性T細胞(CD8+及びCD8+、GrB+)と相関し、腫瘍のCD8+/CD4+及びCD8+、GrB+/Treg比が増加する(図31及び32)。Tリンパ球、すなわち細胞障害性T細胞(CD8+、GrB+)、CD4+T細胞、Treg細胞(図31及び32)の頻度を腫瘍の治療の24日目、29日目、及び30日目に分析した。
さらに、本発明の多重特異性抗体の抗腫瘍活性は、無傷の免疫系を有する同系C57BL / 6マウスのMC38結腸癌モデルで試験される。このモデルは、CD137アゴニストとPD-1/PDL1アンタゴニストの併用治療により抗腫瘍活性の増強を示すために他の人によって使用されている(Chen S et al. Combination of 4-1BB agonist and PD-1 antagonist promotes antitumor effector/memory CD8 T cells in a poorly immunogenic tumor model. Cancer Immunol Res 2014;3(2):149-160、及びRodriguez-Ruiz ME et al. Abscopal effects of radiotherapy are enhanced by combined immunostimulatory mAbs and are dependent on CD8 T cells and crosspriming. Cancer Res 2016;76(20):5994-6005)。
腫瘍容積に対する本発明の多重特異性抗体の効果は、ND021と同じPDL1特異的可変ドメインを含むヒト化IgG1と同じCD137特異的可変ドメインを有するヒト化IgG4との併用治療と比較される。ローカライズされた抗腫瘍免疫応答のさらなる証拠を提供するために、CD8+、CD4+及び制御性T細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の頻度がフローサイトメトリーによって分析される。抗CD137/抗PDL1治療に続く免疫系の変調を探索するために、肝臓及び脾臓におけるCD4+及びCD8+T細胞の頻度がフローサイトメトリー及びおそらく免疫組織化学によって分析される。さらに、定量的ELISA法を使用して、全身のIFNgレベルを分析できる。抗CD137/抗PDL1併用療法の安全性プロファイルをさらに特徴付けるために、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベルの増加など、主に肝毒性(臨床で抗CD137療法で観察)に関連する臨床化学病理学パラメーターアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを評価することができる。
一般的な説明scD
単鎖ダイアボディ(scDb)は、2つの異なる抗体からの2つのVH及び2つのVLドメインを含む、1つの鎖で構成される小さな二価抗体断片である(Holliger et al. PNAS, 1993 Jul 15;90(14):6444-8)。Numab scDb形式では、可変ドメインはGSリンカーによってVLA-VHB-VLB-VHAドメイン方向に接続される。これらの単鎖ダイアボディ(scDbs)のリンカーは、ドメインの正しいアセンブリを強制し、抗原結合活性を変更せずに安定性を向上させる。VLAをVHBに、VLBをVHAに接続する短いG4Sリンカーは、隣接するドメインのアセンブリを可能にし、ドメインを開いたコンフォメーションに保ち、対応するドメインの正しいペアリングを可能にするために必要なものよりもかなり短い。VLA-VHB及びVLB-VHAダイアボディアームは、VHBドメインとVLBドメイン間の長い(G4S)4リンカーによって接続され、頭から尾への配向で二量体化して、分子量が約50kDaのコンパクトな二重特異性分子を生成する。scDbは、E.coli又はCHO-S宿主細胞のいずれかで組換え発現させることができる。図22Aを参照されたい。
PRO885は、2つの短い隣接するG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーによって接続された外側(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc01)と内側(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-02-A04 sc01)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、VH4様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。
PRO951は、2つの短い隣接したG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーで接続された外側(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc01)と内側(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-27-C05 sc02)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、ヒトのアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。PDL1特異的CDRは、VH4コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトし、CD137特異的CDRは、VH3のコンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトした。
PRO1123は、2つの短い隣接したG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーで接続された外部(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc01)と内部(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-02-A04 sc05)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、VH4コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。さらに、CD137ドメインには、VL-VH界面の形成に関与するウサギの残基がほとんど含まれていない。
PRO1124は、2つの短い隣接したG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーで接続された外部(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc01)と内部(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-02-A04 sc06)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、VH4コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。さらに、CD137ドメインは、VL-VH界面の形成に関与し、抗原と相互作用する可能性のあるいくつかのウサギ残基を含む。
PRO1125は、2つの短い隣接したG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーで接続された外側(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc02)と内側(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-02-A04 sc01)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、VH4コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。さらに、PDL1ドメインは、VL-VH界面の形成に関与するウサギの残基をほとんど含まない。
PRO1126は、2つの短い隣接したG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーで接続された外側(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc03)と内側(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-02-A04 sc01)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、VH4コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。さらに、PDL1ドメインは、VL-VH界面の形成に関与し、抗原と相互作用する可能性のあるバック変異ウサギ残基を含む。
PRO1134は、2つの短い隣接したG4Sリンカーと長い中央(G4S)4リンカーで接続された外部(VLA/VHA)PDL1結合ドメイン(33-03-G02 sc07)と内部(VHB/VLB)CD137特異的ドメイン(38-02-A04 sc01)を含むscDb分子である。どちらのドメインも、VH4コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。さらに、PDL1ドメインは、VL-VH界面の形成に関与し、抗原と相互作用する可能性のあるウサギの生殖系列残基を含む。
scDb-scFv)はNumabで開発された形式であり、(G4S)2リンカーを介して接続された3番目の単鎖可変ドメインペア(VLC/VHC)を上記のように非常に安定した単鎖ダイアボディ(scDb)形式に追加する(VLA-VHB-VLB-VHAドメイン方向(短いG4Sコアリンカーと長い(G4S)4中央リンカーを有する)。したがって、scDb-scFv形式は、単一タンパク質鎖上のscFvエンティティと約80kDaの分子量を有するscDbのタンデム配置からなる。scDb-scFv抗体断片は、哺乳動物細胞で組換え発現させることができる。図22Bを参照されたい。
PRO963は、抗HSA scFv実体(19-01-H04-sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(33-03-G02 sc01、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc01、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1及びCD137特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、HSAドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのCDRからなる。
PRO966は、抗HSA scFvエンティティ(19-01-H04-sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(33-03-G02 sc01、VLA/VHA)及び抗CD137(38-27-C05 sc01、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1及びCD137特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、HSAドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのCDRからなる。
PRO1057は、抗HSA scFvエンティティ(23-13-A01-sc03、VLC/VHC)とC末端で抗PDL1(33-03-G02 sc01、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc01、VHB/VLB)scDbコアで融合したscDb-scFv分子である。PDL1及びCD137特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、HSAドメインは、マウス血清アルブミンに対する交差反応性を含む親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのCDRからなる。
PRO1058は、抗HSA scFv実体(23-13-A01-sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(33-03-G02 sc01、VLA/VHA)と抗CD137(38-27-C05 sc01、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1及びCD137特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、HSAドメインは、マウス血清アルブミンに対する交差反応性を含む親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのCDRからなる。
PRO1086は、抗HSA scFv実体(23-13-A01-sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(37-20-B03 sc01、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc01、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。 PDL1及びCD137特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、HSAドメインは、マウス血清アルブミンに対する交差反応性を含む親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのCDRからなる。
PRO1430は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(37-20-B03 sc01、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc13、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1特異的ドメインは、グラフトされたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、CD137及びHSAドメインは、ヒトVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのCDRからなる。HSAドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、CD137特異的ドメインは、安定化するVL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
PRO1479は、抗HSA scFvエンティティのあるターミナル(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(37-20-B03 sc09.1、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc13、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのCDRを有するヒトVH3コンセンサス様アクセプターフレームワークである。PDL1及びHSA特異的ドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、CD137特異的ドメインは、安定化VL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
PRO1482は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗CD137(38-02-A04-sc13、VLA/VHA)及び抗PDL1(37-20-B03 sc03、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、CD137及びHSA特異的ドメインは、ヒトVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギCDRからなる。すべてのドメインは、親のウサギIgG結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含む。
PRO1431は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(33-03-G02 sc18、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc13、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、CD137及びHSA特異的ドメインは、ヒトVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギCDRからなる。HSAドメインは、親ウサギIgG結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、CD137特異的ドメインは、安定化VL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
PRO1473は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(33-03-G02 sc03、VLA/VHA)と抗CD137(38-02-A04 sc13、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、CD137及びHSA特異的ドメインは、ヒトVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギCDRからなる。HSA及びPDL1特異的ドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基含み、CD137ドメインは、安定化VL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
PRO1476は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗CD137(38-02-A04 sc13、VLA/VHA)と抗PDL1(33-03-G02 sc03、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、CD137及びHSA特異的ドメインは、ヒトVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギCDRからなる。HSA及びPDL1特異的ドメインは、親ウサギIgG結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、CD137固有ドメインは、安定化VL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
PRO1432は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗CD137(38-02-A04 sc13、VLA/VHA)と抗PDL1(33-03-G02 sc18、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。PDL1特異的ドメインは、グラフトしたウサギのCDRを有するヒトVH4コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、CD137及びHSA特異的ドメインは、ヒトのVH3ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギCDRからなる。HSA及びPDL1特異的ドメインは、親ウサギIgG結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、CD137特異的ドメインは、安定化VL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
PRO1480は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(37-20-B03 sc09.1、VLA/VHA)及び抗CD137(38-27-A11sc02、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのCDRを有するヒトVH3コンセンサス様アクセプターフレームワークである。PDL1及びHSA特異的ドメインは、親ウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含む。
PRO1481は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC)とC末端で融合した抗PDL1(37-20-B03 sc09.1、VLA/VHA)と抗CD137(38-27-A11sc03、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのCDRを有するヒトVH3コンセンサス様アクセプターフレームワークである。PDL1、CD137、及びHSA特異的ドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含む。
DiSを有するPRO1480は、抗HSA scFv実体(19-01-H04 sc03、VLC/VHC))とC末端で融合した抗PDL1(37-20-B03 sc09.1、VLA/VHA)及び抗CD137(38-27-A11sc07、VHB/VLB)scDbコアからなるscDb-scFv分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのCDRを有するヒトのVH3コンセンサス様アクセプターフレームワークである。PDL1及びHSA特異的ドメインは、親のウサギIgG結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、CD137特異的ドメインは、安定化VL/VHドメイン間ジスルフィド結合を含む。
IgG-scFv分子は、単一特異性IgGに融合したscFv部分からなる二重特異性抗体である(Coloma M.J., Morrison S.L. Nat. Biotechnol. 1997;15:159-163)。各軽鎖又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに、異なる特異性のscFvドメインを付加することができ、これにより、IgG-scFv二重特異性抗体タイプの多様なレパートリーがもたらされる。Numabで生成された分子は、IgG(H)-scFv又はIgG(L)-scFvタイプのもであり、2つのscFvは、完全長のIgG重鎖(HC)又は軽鎖(LC)のC末端に同じ特異性を有し、サイレンシングされたFc部分と、IgG部分とscFv部分を接続する(G4S)2リンカーを含む。両方のタイプの合計分子量は約200kDaであり、分子は哺乳類細胞で組換え発現させることができる。図22C及び22Dを参照されたい。
LCのC末端に融合した抗CD137 scFvドメイン(38-02-A04 sc01)を有するサイレント抗PDL1(33-03-G02-sc01)hIgG1。(G4S)2リンカーはIgG部分とscFv部分を接続する。これは、それ自体が(G4S)4リンカーを介して対応するVHドメインに接続されたVLドメインからなる。
HCのC末端に融合した抗CD137(38-02-A04 sc01)scFvドメインを有するサイレント抗PDL1(33-03-G02-sc01)hIgG1。(G4S)2リンカーはIgG部分とscFv部分を接続する。これは、それ自体が(G4S)4リンカーを介して対応するVHドメインに接続されたVLドメインからなる。
LCのC末端に融合した抗CD137 scFvドメイン(38-27-C05 sc01)を備えたサイレンシングされた抗PDL1(33-03-G02-sc01)hIgG1。(G4S)2リンカーはIgG部分とscFv部分を接続する。これは、それ自体が(G4S)4リンカーを介して対応するVHドメインに接続されたVLドメインからなる。
HCのC末端に融合した抗CD137(38-27-C05 sc01)scFvドメインを有するサイレント抗PDL1(33-03-G02-sc01)hIgG1。(G4S)2リンカーはIgG部分とscFv部分を接続する。これは、それ自体が(G4S)4リンカーを介して対応するVHドメインに接続されたVLドメインからなる。
選択されたドメインはより大きなスケールで生成され(0.2L~1.2Lの発現量)、精製後に遠心濃縮チューブを使用して10mg/mL以上に濃縮された(表21)。
選択された多重特異性分子を4週間の安定性研究などの安定性研究に供し、多重特異性分子を次の緩衝液:150mM NaCl、1Mショ糖、pH5.5、10mg/mlを含む25mMリン酸クエン酸塩緩衝液に配合し、<-20℃、4℃、20℃及び40℃で4週間保存した。少なくとも、製剤中のモノマーとオリゴマーの割合は、SE-HPLCを利用して、1日、4日、1週間後、及び12週間まで毎週評価された。表は、調査結果をまとめた表26である。
Claims (15)
- a)1つのCD137結合ドメイン(CD137-BD);及び
b)1つのPDL1結合ドメイン(PDL1-BD)
を含み、CD137特異性及びPDL1特異性について一価である多重特異性抗体であって、ここで、前記CD137-BDは、前記PDL1-BDのヒトPDL1への結合の解離定数(KD)と比較して、少なくとも10倍高い解離定数(KD)でヒトCD137に結合し、
ここで、前記CD137-BDは、
1)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号1、2及び3のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号14、15及び17からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列において構成されるそれぞれ配列番号18、19及び20のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号27、28及び30からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列;又は
2)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号35、36及び37のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号47のアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるVH配列HCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列において構成されるそれぞれ配列番号48、49及び50のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号57のアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列;又は
3)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号59、60及び61のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号71、72及び73からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列において構成されるそれぞれ配列番号74、75及び76のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号83、84及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列
を含み、並びに
前記PDL1-BDは、
1)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号89、90及び91のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号102、103及び104からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列においてそれぞれ配列番号105、106及び107のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号114及び115からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列;又は
2)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号119、120及び121のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号132、133及び134からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列においてそれぞれ配列番号135、136及び137のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号144及び145からなる群から選択されるアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列
を含む、上記多重特異性抗体。 - 前記抗体が、少なくとも1つのヒト血清アルブミン結合ドメインをさらに含む、請求項1に記載の多重特異性抗体。
- 前記抗体が、少なくとも1つのヒト血清アルブミン結合ドメインをさらに含む、請求項1又は2に記載の多重特異性抗体。
- 前記CD137-BDが、前記PDL1-BDのヒトPDL1への結合の解離定数(KD)と比較して、少なくとも20倍高い解離得定数(KD)でヒトCD137に結合する、請求項1~3のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。
- 前記CD137-BDが、CD137のアゴニストである、請求項1~4のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。
- 前記CD137-BDが、
a)SPRで測定した場合、5nM未満、具体的には1nM未満の解離定数(KD)でヒトCD137に結合し、ここで、前記抗体はscFvであり;
b)SPRで測定した場合、Koff速度が10-3s-1以下でヒトCD137に結合し、ここで、前記抗体はscFvであり;
c)SPRで測定した場合、Kon速度が少なくとも105M-1s-1以上でヒトCD137に結合し、前記抗体はscFvであり;
d)ウレルマブと交差競合せず;
e)ウトミルマブと交差競合しない;及び/又は
f)Macaca fascicularis(カニクイザル)CD137と交差反応する、請求項5に記載の多重特異性抗体。 - 前記CD137-BDが、VH配列において構成されるそれぞれ配列番号59、60及び61のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号71のアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列、及びVL配列において構成されるそれぞれ配列番号74、75及び76のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、配列番号83のアミノ酸配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるVL配列を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。
- 前記PDL1-BDがPDL1の遮断薬である、請求項1~7のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。
- 前記PDL1-BDが、
a)SPRで測定した場合、500pM未満、より具体的には100pM未満の解離定数(KD)でヒトPDL1に結合し、ここで、前記抗体はscFvであり;
b)SPRで測定した場合、Koff速度が10-3s-1以下、又は10-4s-1以下でヒトPDL1に結合し、前記抗体がscFvであり;
c)SPRで測定した場合、Kon速度が少なくとも105M-1s-1以上、少なくとも106M-1s-1以上でヒトPDL1に結合し、前記抗体がscFvであり;
d)Macaca fascicularis(カニクイザル)PDL1と交差反応性であり;及び/又は
e)Mus musculus PDL1に交差反応性ではない、請求項8に記載の多重特異性抗体。 - 前記PDL1-BDが、VH配列において構成されるそれぞれ配列番号92、93及び94のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号104のアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列、及びVL配列においてそれぞれ配列番号108、109及び110のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号115のアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。
- 前記HSA-BDが、
(a)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号149、150及び151のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号161のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列においてそれぞれ配列番号162、163及び164のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号171のアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列;又は
(b)VH配列において構成されるそれぞれ配列番号173、174及び175のHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号185のフレームワーク配列と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3配列;及びVL配列においてそれぞれ配列番号186、187及び188のLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列であって、フレームワーク配列がともに、配列番号195と少なくとも95、96、97、98又は99パーセント同一であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3配列
を含む、請求項2~7のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。 - 前記多重特異性抗体が、配列番号229、230及び231を有する抗体から選択される、請求項1に記載の多重特異性抗体。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の多重特異性抗体及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
- 医薬品として使用するための、請求項1~12のいずれか1項に記載の多重特異性抗体又は請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の多重特異性抗体又はその結合ドメイン若しくはその断片をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の多重特異性抗体を製造する方法。
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