JP5602625B2 - 結合物質のディスプレイ - Google Patents
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Description
本発明の課題は、本発明の対象により解決される。
−遺伝子パッケージを提供し、かつ、
−少なくとも2個の抗体モジュラードメインを前記パッケージの外表面に融合によりディスプレイすることを含む、標的及びスカフォールドリガンドと結合するモジュラー抗体ドメインのオリゴマーをディスプレイする遺伝子パッケージを製造する方法を対象に含む。
a.第1ポリペプチドと遺伝子パッケージとを結合する種々のリンカーを含む遺伝子パッケージのライブラリを提供し、
b.前記第1ポリペプチドの機能との顕著に相互作用しないリンカーを含むライブラリの要素を決定し、
c.第2ポリペプチドと前記遺伝子パッケージとを結合するために前記リンカーを選択することを含む。
−前記のようにして本発明による方法によって製造されたモジュラー抗体ドメインのオリゴマーのライブラリを提供し、
−前記ライブラリを前記標的と、スカフォールドリガンドの存在下に接触させ、
−スカフォールドリガンドの存在下に、前記標的に対して結合するライブラリ要素を選択し、かつ、
−機能性オリゴマーを製造する。
図1:
ライブラリFcab01のアセンブリ用フラグメントの製造に使用されたPCRsの模式図である。PCRプライマーは、矢印によりそのそれぞれの5’−3’方向が示され、かつ縦線は、突然変異された遺伝子のアセンブリのために使用された導入された制限部位の適切な位置を示す。制限部位は、PCRフラグメントのライゲーションのためのプライマー上に含まれる。
CH3ドメインのアミノ酸配列及び二次構造(IMGT番号付け)。ランダム化の図式は、ライブラリFcab01〜Fcab06に関して提供される。
本発明によるモジュラー抗体領域のオリゴマーは、独立型分子として、同様に融合タンパク質又は誘導体として使用することが可能であり、最も一般的には改質化前又は改質化後に、より大きい構造、例えば完全な抗体分子の一部分であるか、あるいは、前記のものの一部分であるように融合される。このようにして本発明により製造された免疫グロブリン又は融合タンパク質は、Fcフラグメント、Fabフラグメント、Fvフラグメント、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、特に単鎖Fvフラグメント、二特異性又は多特性scFv、diabody、unibody、multibody、免疫グロブリン領域の多価又多量体等である。一特異性、二特異性、三特異性及びそれ以上の特異性を有していてもよい分子を製造するために工学的に作成されたタンパク質を使用することができる。本発明によれば、このような分子の計画的使用の要求にしたがって、結合価の制御及び予めの選択が同時に可能である。
−前記のようにして本発明による方法によって製造されたモジュラー抗体領域のオリゴマーのライブラリを提供し、
−前記ライブラリと前記標的とを、スカフォールドリガンドの存在下に接触させ、
−スカフォールドリガンドの存在下で、前記標的に結合するライブラリ要素を選択し、かつ、
−機能性オリゴマーを製造する。
例1:ノン−フォーカスト(non-focussed)Fcabライブラリ(Fcab01)の構築及びファージ表面ディスプレイ
IgG Fcフラグメントの結晶構造、この場合、これはBrookhavenデータベース中に10Q0.pdb入力で掲載されており、Fcabライブラリのデザインを助けるために利用される。
198、199、200、203及び204をランダム化することを決定した。突然変異された残基の他に、5個の残基を、配列番号1の残基番号198に挿入した。配列番号2において、ライブラリFcab01のライブラリインサートの配列が示され、この場合、すべてのランダム化された残基位置並びに5個の挿入された残基が、文字Xで示されている。
例1に記載したようにFcabライブラリを製造し、その際、ランダム化されたライブラリ位置を完全にランダム化し、すなわち、これらはコドン、例えばNNS、NNB、NNK、NNN等を使用してコードされる。
ディスプレイされたタンパク質の潜在的な結合部位のアクセシビリティーを試験するため結合アッセイを実施する:ファージ懸濁液を、抗−myc mAb 9E10−被覆マイクロプレート(又はイムノチューブ)と反応させる。洗浄後に、結合したファージを、抗M13−酵素結合体を用いて検出する。コントロールとして、タンパク質融合及びmyc−tagをディスプレイしないヘルパーファージを、プレートと反応させる。他のコントロールは、非被覆プレートとのファージの反応及びファージのp3−融合パートナーを認識する抗血清とのファージの反応である。
ディスプレイされるべきタンパク質と遺伝子パッケージとの間のリンカー(線維状ファージの場合には、例えばp3、p8、pX、pIX、PVII)は、特に、ディスプレイされた分子の潜在的結合部位が、ファージ粒子の空間的近位である場合には、特に重要である。可変ドメイン及びCDR−ループにより形成された抗原結合部位及びp3に対するアミノ末端融合としてのライブラリ要素のディスプレイを使用する抗体ライブラリにおいて、潜在的抗体結合部位は、ファージ粒子に向けられていない。したがって、ライブラリ要素とファージ被覆タンパク質との間のリンカー構造は、あまり重要ではない。免疫グロブリン領域の底部ループの工学的作成及びファージディスプレイの実施は、しかしながら非効率的な方法であってもよく、かつ抗原結合クローンの収量を減少させるか、それどころか得られない。ライブラリ要素タンパク質と表面上のその融合パートナーとの間のリンカーを変更することでこの問題を解決するか、あるいは、少なくとも減少させることができる。
例として、ライブラリFcab01(例1に記載したもの)を使用することができる。元々、このライブラリをファージミドディスプレイベクターpHEN1中に、NcoI及びNotI制限部位を用いてクローニングする。この方法でクローニングする場合には、18個のアミノ酸残基は、Fcab01ライブラリインサートのC−末端アミノ酸残基と、ファージM13p3のN−末端アミノ酸残基との間に存在する。この接合領域の配列は配列番号10 SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVESに示し−かつ、以下のようにして説明される:最初の4残基であるSPGKは、Fcab01ライブラリインサートの4個のC−末端残基であり、その後にアミノ酸配列AAAが続き、この場合、これは、NotI制限部位によってコードされたアミノ酸配列であり、引き続いて配列EQKLISEEDLが続き、この場合、これはmycエピトープであり、引き続いてNGAAであり、この後に、アンバー終止コドンが存在し、この場合、これは、E.Coliのアンマー抑制菌株、例えばTG1中でグルタミン(Q)に翻訳される。配列番号10のC−末端4残基であるTVESは、ベクターpHEN1中にファージM13p3のN−末端4残基として存在する。
を使用して、pHENFcabRGD4(配列番号14)から増幅させ、かつNcoI及びNotI制限部位を介してベクターpHEN1中にクローニングした。得られたベクターであるpHENFcabRGD4L(配列番号14)は、ヌクレオチド位置3057−3071で付加的なリンカー配列を有する。
ファージ懸濁液を、αvβ−インテグリン被覆マイクロプレート(又はイムノチューブ)と反応させた。洗浄後に、結合したファージを、抗M13−酵素結合体を用いて検出する。コントロールとして、タンパク質融合をディスプレイしないヘルパーファージ及びmyc−tagを、プレート並びにその表面上にwtFcabを有するファージ粒子と反応させる。他のコントロールは、非被覆プレートとファージとの反応及びファージのFcab−融合パートナーを認識する抗血清とファージとの反応である。pHENFcabRGD4LcabRGD4Lから生じる、増加した長さのリンカーを有するファージ粒子は、より簡単に、pHENFcabRGD4中に含まれるような元々のリンカーを有するファージ粒子よりも、αvβ−インテグリンと反応し、これによって、ELISA中でより強いシグナルを生じる。
("Fcab"は、f-star Biotechnologische Forschungs-und Entwicklungsges .m.b.H.の登録商標である)
Fcabライブラリのデザイン(図2に例証されている):抗体のCH3定常ドメインの非CDRループ中のアミノ酸位置はランダム化に関して考慮される。特に、ループA−B、C−D及びE−Fは、これらがドメインの片側において存在すると考えられる。特定の位置におけるランダム化のためのいくつかのデザイン基準は、本願明細書中に記載する。
特定のループ構造は、スカフォールドタンパク質によって要求されてもよく、これによって全体の天然構造を維持する。ループ中の多くのアミノ酸位置のランダム化及びループの伸長であってさえも、ランダム化位置の片側又は両側における特定の配列の構築によって容易にすることができる。これらの配列はフレキシブルな配列であってもよく、これによって、このような位置で特定のライブラリ配列で、任意の伸長(tension)を補完することが可能である。
ベクター
pYD1(Invitrogen)は、基本ベクターとして使用される。このベクターは、以下のようにしてXhoI位置を除去するために改質化する:pYD1はXhoIで消化され、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理され、かつ再度ライゲーションされる。得られる配列は、pYD1dX(配列番号15)に示す。
突然変異体はCH3ドメインの構造的ループ中に導入されたライブラリのクローニングは、相同組み換えによって酵母中で実施される(ギャップ修復gap repair)。この目的のために、レシピエントベクターはCH3ドメインを欠くものを製造する:pYD1dXFCは、XhoI(位置1603/1607)及びNotI(位置1921/1925)で切断し、より大きいフラグメントを、調製されたゲル電気泳動法により製造し、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理し、かつ再度ライゲートした。この方法は、特有のXhoI部位(位置1603/1607)を再構築し、かつ、ベクターpYD1CH12を得た。その後にpYD1CH12をXhoIで切断し、かつ酵母中でのギャプ修復のためのレシピエントベクターとして使用する。
ハーベストされた酵母ライブラリ(yFcabライブラリ)を、10mlのSD−CAA培地(10g/lの酵母窒素ベース、10g/lのカザミノ酸、及び20g/lのデキストロース、0.1g/lのロイシン、9.67g/lのNaH2PO4・2H2O及び10.19g/lのNa2HPO4・7H2O)中に接種し、かつシェーカー中で250rpmで、28℃で6〜8時間に亘って増殖させた。培養物のOD600を測定し、かつ培養物を、0.2のOD600になるまで希釈し、かつ同様の条件下でOD600が1〜2に達するまで増殖させた。細胞を、遠心分離(300rpm/5分/4℃)によりハーベストし、かつ誘導培地SG/R−CAA(10g/lの酵母窒素ベース、10g/lのカザミノ酸及び20g/lのガラクトース、10g/lのラフィノース、0.1g/lのロイシン、9.67g/lのNaH2PO4・2H2O及び10.19g/lのNa2HPO4・7H2O)中に再懸濁する。培養物を、2日間に亘ってシェーカー上で250rpmで、20℃での恒温保持により誘導し、かつ引き続いて分析及び分類した。
yFabライブラリを、SDCAA培地での誘発の2日後における、その発現レベル及び発現されたyFabの質について試験した。この発現レベルは、ポリクローナル抗ヒトIgG−Fc抗血清(Sigma)を用いて試験した。この目的に関して、0.5×10e6個のライブラリ細胞を、1mlの出発バッファー(SB)中で希釈し、この場合、これは、2%BSAを含むPBSを含有する。細胞をペレット化し、かつ1/2000希釈された抗血清IgG−Fc−PE抗血清(Sigma)を含有する100μlのSBで30分に亘って氷上で染色し、2回に亘ってSBで洗浄し、かつ引き続いてFACS中で分析した。一般に、それぞれのライブラリ中の70〜80%のすべての細胞は、その細胞表面上でFcabsを発現する。Fcabsの正確なホールディングを試験するために、プロテインAを用いての染色を実施した。再度0.5×10e6個のライブラリ細胞を、1mlの染色バッファーSB中で希釈し、細胞をペレット化し、かつ1μg/mlのProt−A−FITC(Fluka)を含む100μlのSBを用いて、30分に亘って氷上で染色し、かつSBを用いて2回に亘って洗浄し、かつ引き続いてFACS中で分析した。一般に、上記に示すyFcabライブラリは、≧40%のProtAポジティブ細胞を示す。Fcabが、細胞表面上の二量体として発現するかどうかを試験するために、ヒトCD64での染色を実施した。CD64のアフィニティーは効率的なモノマー結合に関して極めて低く、したがって二量体を含むCD64複合体を使用する。この目的のために、例えば1μgの組み換えCD64(HIS−tagを含む(R&D System))を1μgの抗Penta HIS−Alexafluor488(Qiagen)と一緒に1mlのSB(全量)中で混合した。yFcabライブラリを、5×10e5細胞を100μlの複合帯混合物と一緒に氷上で30分に亘って恒温保持することにより、CD64との結合に関して試験し、この場合、コントロールとして、細胞を、等価の抗HIS−Alexafluor488単独で(SB中1/200の希釈)と一緒に恒温保持した。細胞の恒温保持の後に、細胞を2回に亘って氷冷SB中で洗浄し、かつFACS中で分析した。一般に、それぞれのライブラリ中の>50%のすべての細胞は、その細胞表面上で二量体Fcabsを発現する。
組み換え抗原、例えばHer2(Bendermedsystems)を、製造元指示書にしたがって、Pierceのhe EZ Link systemで実施した。要するに、抗原をPBSで透析し、PBS中1mg/mlに希釈し、かつ10mMのスルホ−LC−LCビオチン(EZ link, Pierce)と一緒に混合し、この場合、このビオチンは予め水中に溶解されたものである。抗原とビオチンとの最終比は1:3であり、かつ混合物を室温で30分(30’)に亘って恒温保持した。いいかえれば、混合物をPBSに対してVivaspin MWCO3000 (Sartorius)カラムを用いて「透析」する(5×8’、4000rpm)。最終的に、ビオチン化された抗原(Her2)の濃度はHPLCにより試験され、かつアリコートを−20℃で貯蔵した。
Fcas第1選択段階を用いての、抗原特異的(Her2)Fcabsの選択:
FACS分類の2日前において、2.5×10e8個の独立したFcabコロニーを含有する酵母ライブラリを、SG/R−CAA培地を用いて誘導し、上記に示すようにその細胞表面上にFcabsを発現させた。2日間後に、ライブラリの例えば10倍(=2.5×10e9)をカバーする細胞量を、500nMのビオチン化抗体(Her2)と一緒に、2mlのSB中で恒温保持した。その後に細胞を、冷SBを用いて1回洗浄し、引き続いて30分に亘って氷上でストレプトアビジン−PE(R&D systems)と一緒に恒温保持し、この場合、これは、SB中1:100で希釈されていた。この細胞を、2回に亘って氷冷SBを用いて洗浄し、かつ1×109細胞/mlの最終濃度に希釈した。100μl中5×10e6細胞/mlでのコントロール染色を、抗原の不含下でストレプトアビジン−PEのみで製造した。完全なライブラリ及びコントロール染色の双方を、BDからの例えばFACS ARIA中で分析した。コントロール細胞分類のためのゲートを調整するために使用した。第1のFSC/SSCゲート(G1)を健康な酵母細胞を同定するために設定し、G1からFSC面積に対するFSC幅をプロットし、かつ非凝集細胞のみを新規ゲート(G2)中で選択した。G2中の細胞を引き続いて、FL−2に対するFSCを用いて(PEチャネル)ストレプトアビジン−PEとの反応性に関して分析した。G3を、0.1%の(偽)ポジティブ細胞を含むように調整した。引き続いて、少なくとも5×10e8染色細胞(ライブラリサイズの2倍又は一般にそれ以上)を、前記設定で分析し、かつG3中の細胞を2〜3mlのSD−CAA培地を含むチューブに分類した。約5×10e5細胞(プール)を選択の第1段階中に収穫し、かつ1〜2日間に亘って増殖させ、その後に細胞は−80℃で貯蔵し、かつアリコートは、上記のようにFcabsの発現を誘導させることができる。さらに2日間後に、次の選択段階を実施することができる。
第1段階において選択されたプールを、上記に示すようにその表面上でFcabsを発現させるために誘発した。少なくとも5×10e6細胞(プールの多重コピーを含有する)を、500nMビオチン化抗体(Her2)を用いて1mlSB中で、氷上で30分に亘って恒温保持した。その後に細胞を冷SBを用いて1回洗浄し、引き続いて30分に亘って氷上で、SB中1:100に希釈されたストレプトアビジン−PE(R&D systems)を用いて2μg/mlのプロテインA−FTIC(Fluka)と一緒に恒温保持する。その後に細胞を2回に亘って氷冷SBを用いて洗浄し、かつ〜2×10e6の細胞/mlの最終濃度に希釈した。さらにコントロール染色をおこない、その際、100μlの細胞中の5×10e6細胞/mlのプールを、上記に示すようにして、ProtAとストレプトアビジン−PEの混合物と一緒に恒温保持するが、しかしながら、抗原(Her2)を用いての恒温保持はおこなわなかった。さらに、Fcab wtを発現する100μlの酵母クローン中の5×10e5細胞(非ランダム化Fcフラグメント)を、ストレプトアビジンの不含下で、上記に示すようにしてProt−A FITCで染色した。Fcab−wt発現細胞を、例えばBDからのFACS面積中で分析し、分類のためのゲートを調整した。第1のFSC/SSCゲートG1は、健康な酵母細胞を同定するために調製し、G1からFSC面積に対するFSC幅をプロットし、かつ非凝集細胞のみを新規ゲート(G2)中で選択する。
アフィニティー突然変異のために、多様度(diversity)を選択されたクローン中又は選択されたクローンのプール中にABループ中に導入した。この目的のために、PCRを、変性コドンを位置259、360及び361(EU番号付け)で含む、以下のプライマー;
を用いておこなうか、あるいは、二者択一的に、
変性コドンを位置358、359、360、361及び362(EU番号付け)を含む、以下のプライマー
を用いておこなう。これらのPCRs中で使用された第2プライマーは、双方の場合においてgapfcs3である。酵母中の有効なギャップ修復のためのフランキング配列を生じさせるために、得られたPCR産物をさらに、プライマー対gapch35及びgapfsc3を用いて増幅し、かつ引き続いてSaccharomyces cerevisiae菌株EBY100中に、上記に示すようにXhoI切断されたpYD1CH12と一緒に、酢酸リチウム形質転換によって形質転換した。ABループ中の記載された残基のランダム化のための代替的プライマーとして、例えばAbmut1L
又はAbmutlR
をさらに使用することができる。同様の方法で、EFループ中の残基を、例えば全ランダム化によってか、あるいは、プライマーとしてスパイクト(spiked)オリゴヌクレオチドを用いてのランダム化によって、あるいは、類似の突然変異技術によってランダム化することができる。Abmutプライマーは、それぞれのクローンの8000個の新規変異体(プール2.3)を生じさせ、かつAbmut2LRプライマーは、3×10e6個の新規変異体(プール2.4)を導く。したがって、プール2.3及び2.4の双方は、約10e8の新規ライブラリを独立して生じるが、それというのも、出発材料(プール2.1+2.2)はすでに約10〜1000クローンを含有しているためである。
アフィニティー突然変異されたプール2.3及び2.4及び必要に応じて、プール2.1(ProtAポジティブ細胞のみが好ましい)は、上記に示すようにその細胞表面上でFcabsを発現するために誘導され、かつ引き続いて「第2の選択段階」に関して記載されたようにして分類するが、但し、プール2.3及び2.4がより大きく、かつしたがって、プールに関する染色体積量は、「第1の選択段階」中で記載されたライブラリ染色のものと同等である。第3の選択段階において、Her2ポジティブ/ProtAポジティブ細胞のみが分類された。これらの選択から誘導されたプールは、典型的には、>20%のHer2/ProtAポジティブ細胞を含有する。そうでない場合には、ProtA及びHer2を組み合わせる選択の第4及び第5(又はそれ以上)の段階を実施することができる。
Her2/ProtA細胞(>20%が好ましい)を含有するプールからの独立した細胞は、SD−CAA培地を含むアガープレート上へのプールのプレーティングによってか、あるいは、単一細胞(=クローン)をFaCS ARIAから直接的に、プールを製造することなしにプレート上において分類することにより製造する。クローンは増殖させることができ、かつ、液体培養物中に移し、かつ−80℃で貯蔵することができる。クローンのアリコートは、引き続いて上記に示すようにその細胞表面上にFcabsを発現させるために誘導し、かつFACS中でいくつかのパラメータについてスクリーニングした。これらのパラメータは:ProtA−FITCの存在下又は不含下で、選択(Her2)のために使用された抗原の用量応答範囲であってもよく、この場合、CD64染色は上記とおりである。さらに、類似の染色プロトコールを使用して、いくつかの関係のないビオチン化抗原をスクリーニングして、非交差反応Fcabsを同定することができる。
酵母上のFabフラグメントのディスプレイのために、酵母ディスプレイベクターpYD1(Invitrogen)(配列番号72)は、以下のようにして改質化する:
NheI制限部位は、部位指定突然変異によって位置581/586で導入され、改質化されたベクターpYD1Nhe(配列番号73)が得られる。このベクターをNheI及びPmeIを用いて制限し、3個のフラグメントが得られる。最も長いフラグメントは、残りのベクター骨格であり、その中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーが挿入され、ベクターpYD1lnk(配列番号74)が得られた。MaTα転写末端領域を含むカセットは、その後にPCRにより、ベクターpYD1から増幅され、かつBamHI及びPstI制限を介してpYD1lnk中にクローニングし、かつライゲートした。得られるベクターはpYD1mata(配列番号75)である。GAL1プロモーター、Aga2をコードする遺伝子及びNotI及びSfiIクローニング部位を有する合成リンカーを含むカセットを、PCRによりpYD1から増幅し、かつ、EcoRI及びPacI制限を介してpYD1mata中にクローニングして、ベクターpYD1gal(配列番号76)が得られる。
酵母ディスプレイライブラリ構築における最初の工程として、野生型CL(Cκ)ドメインを、ディスプレイベクターpYD4D5hlから、制限酵素BsiWI及びAscIを用いて切り出した。BsiWI及びAscI部位によりフランキングされたヒトCκドメインをコードする合成遺伝子(pYD4D5hlによる内容)が製造され、その際、ランダム突然変異及び挿入のそれぞれを、ABループ及びEFループ中に導入する。この特別な実施例において、3、4又は5個のNNBコドンの挿入は、ヒトCκドメインのアミノ酸位置16及び17との間でおこなわれ、かつ残基位置92、93、94、95、97、98及び99を、NNBコドンにより置換する(IMGT番号付け、図2参照)。NNBコドンは、全4個のヌクレオチドを、位置1及び2で、かつC、G及びTを位置3で含有する。したがってNNBは、20個の天然にコードされるアミノ酸すべてをコードするものである。
Claims (8)
- 標的及びスカフォールドリガンドに結合するモジュラー抗体ドメインのオリゴマーを製造する方法において、その際、このスカフォールドリガンドは、モジュラー抗体ドメインのオリゴマーの標的特異性にかかわらず、モジュラー抗体ドメインのオリゴマー骨格と結合するものであり、かつ前記モジュラー抗体ドメインのオリゴマーが抗原結合Fcフラグメントであって:
(a)モジュラー抗体ドメインのオリゴマーのライブラリを提供し、その際、標的及びスカフォールドリガンドと結合するモジュラー抗体ドメインのオリゴマーをディスプレイする遺伝子パッケージが、
(i)遺伝子パッケージを提供し、その際、遺伝子パッケージが酵母であり、かつ、
(ii)少なくとも2種のドメインを前記パッケージの外表面に融合によりディスプレイすることを含む、方法によって製造され、
(b)前記スカフォールドリガンドの存在下で、前記ライブラリと前記標的とを接触させ、
(c)前記スカフォールドリガンドの存在下で、前記標的と結合するライブラリ要素を選択し、かつ、
(d)モジュラー抗体ドメインの機能的オリゴマーを製造する、
工程を含む、前記方法。 - 前記ライブラリが、モジュラー抗体ドメインのオリゴマーを発現する少なくとも10 6 個の独立したクローンを含有する、請求項1に記載の方法。
- スカフォールドリガンドがエフェクター分子、FcRn、プロテインA及びプロテインGから成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- エフェクター分子が、CD64、CD16、CD32及びFcレセプターから成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記モジュラー抗体ドメインの機能的オリゴマーが、Kd<10−8Mの標的抗原結合アフィニティーを有する、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的が、erbBクラスのレセプターである、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- モジュラー抗体のアフィニティーを、アフィニティー突然変異によって増加させる、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- モジュラー抗体のアフィニティー突然変異による変異体が得られ、この変異体が、前記標的との結合アフィニティーの少なくとも10倍の増加を示す、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
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