CN101802006A - 展示结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备基因包的方法，所述基因包展示与靶结合和与支架配体结合的模块抗体结构域寡聚体，以及由其产生的基因包的载体和文库。本发明还涉及选择用于这类寡聚体展示的合适接头序列的方法。

Description

展示结合剂
本发明涉及制备基因包(genetic package)的方法，以及利用这些方法产生的二价基因包的载体和文库，所述基因包展示与靶结合和与支架配体结合的模块抗体结构域(modular antibody domains)的寡聚体。本发明还涉及选出适于在此种寡聚体展示中使用的接头序列的方法。
单克隆抗体已经被广泛的用作结合剂的支架。此处将利用完整的IgG1免疫球蛋白作为实例解释基本的抗体结构。
两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)结合形成Y形抗体分子。每条重链具有4个结构域。氨基末端可变区(VH)位于Y尖端。接着是三个恒定区：CH1，CH2和羧基末端CH3，位于Y主干的底部。一小段转换区(switch)连接重链可变区和恒定区。铰链连接CH2和CH3(Fc片段)与抗体的剩余部分(Fab片段)。通过蛋白水解切割完整抗体分子的铰链可以产生一个Fc和两个相同的Fab片段。轻链由两个结构域组成，可变区(VL)和恒定区(CL)，以转换区分开。
铰链区中的二硫键连接两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。根据免疫球蛋白的类型，Asn连接的碳水化合物部分附着于恒定区中的不同位置。对于IgG1来说，铰链区中的两个二硫键，在Cys235和Cys238对之间，联合两条重链。轻链通过另外两个二硫键与重链偶联，在CH1结构域的Cys229s和CL结构域的Cys214s之间。碳水化合物部分附着于每个CH2的Asn306，在Y的主干中产生显著的凸出。
这些特征具有深刻的功能后果。重链和轻链二者的可变区(VH)和(VL)位于Y的“尖端”，它们被置于此与抗原起反应。分子的这个尖端是氨基酸序列N末端所在的一侧。Y的主干以有效介导效应物功能的方式凸出，诸如激活补体和与Fc受体的相互作用，或者ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域凸出，便于与效应物蛋白质相互作用。氨基酸序列的C末端位于尖端的对侧，可称为Y的“底部”。
在抗体中发现两种类型的轻链，称为lambda(λ)和kappa(κ)。给定免疫球蛋白或具有κ链或具有λ链，而不是每种各一条。在具有λ或κ链的抗体之间没有发现功能差异。
抗体分子的每个结构域具有相似的结构，即在压缩的反平行β桶中彼此对立的两组压紧的β片层。此保守结构称为免疫球蛋白折叠。恒定区的免疫球蛋白折叠包含对立压紧的3链片层和4链片层。折叠通过每个片层的β折叠链之间的氢键、内部对立片层的残基之间的疏水键、和片层之间的二硫键得到稳定。3链片层包含C、F和G链，4链片层包含A、B、E和D链。字母A-G表示β折叠链沿免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的顺序位置。
可变区的折叠具有9条β链，排列成4条链和5条链的两组片层。5链片层在结构上与恒定区的3链片层类似，但包含额外的C’和C”链。其余链(A、B、C、D、E、F、G)与它们在恒定区免疫球蛋白折叠结构中的对应物具有相同的拓扑和相似的结构。一个二硫键连接对立片层中的B和F链，与恒定区中的一样。
免疫球蛋白轻链和重链的可变区都包含三个高变环或互补决定区(CDR)。V结构域的三个CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)在β折叠桶的一端簇集。CDR是连接免疫球蛋白折叠的β链B-C、C’-C”和F-G的环。CDR中的残基在免疫球蛋白分子间有变化，赋予各抗体以抗原特异性。
抗体分子尖端的VL和VH结构域压紧，使得6个CDR(每个结构域3个)协作而构建供抗原特异性结合的表面(或空腔)。如此，抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C’-C”和F-G链及重链可变区的B-C、C’-C”和F-G链的环构成。
有些环并非天然免疫球蛋白中的CDR环、或者也不是由CDR环和可能还有CDR环区内邻接环决定的抗原结合口袋的一部分，这样的环不具有抗原结合或表位结合特异性，但有助于完整免疫球蛋白分子和/或其效应物或其它功能的正确折叠，因此为了本发明的目的被称为结构环。
现有技术文献显示，到目前为止免疫球蛋白样支架被用于操控已有的抗原结合位点，从而导入新的结合特性。在大多数情况下CDR区已经被改造用于抗原结合，换言之，就免疫球蛋白折叠来说，只有天然抗原结合位点被改造以便改变其结合亲和力或特异性。存在大量文献描述这类被控制的免疫球蛋白的不同形式，经常以单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表达，在噬菌体颗粒的表面展示或在各种原核或真核表达系统中可溶性表达。
WO06072620A1描述了一种改造免疫球蛋白的方法，其包括在结构环区的改造以获得新的抗原结合位点。该方法广泛适用于免疫球蛋白，可用于产生一系列靶向于不同抗原的免疫球蛋白。CH3文库已经被证明可用于选择抗原的特异性结合剂。
尽管已经描述了基因包上蛋白的多价展示(诸如直接噬菌体克隆和展示，细菌展示，酵母展示)，但现有技术通常涉及结合结构域的单体单价展示。WO9209690描述了噬菌粒颗粒在颗粒表面展示单拷贝的融合蛋白。因此描述的是从噬菌粒颗粒(亦称为噬菌体)的文库获得高亲和力的结合剂。因此提供包括基因(编码结合多肽和噬菌体外壳蛋白)的可复制表达载体以形成编码融合蛋白的基因融合体，其是噬菌粒颗粒、噬菌体外壳蛋白和结合多肽的嵌合蛋白。
US5223409泛泛描述了将编码感兴趣蛋白的基因与丝状噬菌体M13基因III外壳蛋白的N端结构域融合的方法-所述基因融合体被突变形成结构相关融合蛋白(在噬菌粒颗粒的表面以较低量表达)的文库。使用生物学选择和筛选来鉴定可用作药物候选物的新配体。
但是，在使用这类“融合噬菌体”或单价噬菌体展示和相应单个融合蛋白方面存在一些限制。多个生物制品天然以低聚形式存在。对于本发明的目的来说，低聚表示二聚、三聚或甚至更高的多聚形式，直至24个单体。
现有技术的融合噬菌体被描述为展示单体融合蛋白，主要因为据信如果单个融合蛋白是通过噬菌粒颗粒展示的话，最高亲和力的结合剂只能选自一种文库。但是天然蛋白经常组装为二聚体或甚至以更高的寡聚程度组装。为了获得具有单个融合蛋白的二聚展示，已经开发出一些技术，包括位于外壳蛋白和结合多肽之间的条件终止密码子(Dall′Acqua et al TheJournal of Immunology，2002，169：5171-5180)。从而除了那些与噬菌体融合的多肽之外的多肽可溶性单体被表达，因此启动二聚体的形成。但是，这类终止密码子需要在特异性抑制者宿主细胞(其可以将终止密码子翻译为氨基酸)中增殖，以便提供合适量的除可溶性结合多肽之外的融合蛋白。WO03/029456描述了使用多链真核展示载体来筛选酵母细胞表面的免疫球蛋白Fab片段。
在一些情况下现有技术融合蛋白涉及接头序列来展示更大的结合多肽。通常使用最多24个氨基酸接头序列用于展示抗体可变区的标准目的。参见实例，展示载体pCOMB3x(Hybrid.Hybridomics.2003 Apr；22(2)：97-108.Development of functional human monoclonal single-chain variablefragment antibody against HIV-I from human cervical B cells.Berry JD，Rutherford J，Silverman GJ，Kaul R，Elia M，Gobuty S，Fuller R，Plummer FA，Barbas CF.)。
本发明的目的是提供制备模块抗体结构域的寡聚体、以及制备在复制型基因包表面展示的这类寡聚体的有效方法。
发明简述
所述目的通过本发明的主题解决。
根据本发明，包括一种制备展示与靶结合和与支架配体结合的模块抗体结构域寡聚体的基因包的方法，其包括
-提供基因包，和
-通过与所述包的外表面融合，展示至少两个抗体模块结构域。
基因包可以在移动系统(mobilized system)或细胞系统(cellular system)中展示，其中根据本发明所述移动系统可以选自病毒，噬菌体，噬菌粒，体外展示系统，mRNA系统和核糖体展示系统。可选的，可以使用酵母，哺乳动物细胞，细菌细胞，细菌孢子或昆虫细胞来选择细胞系统。
有可能通过与所述试剂的结构有关的寡聚化基元(oligomerizationmotif)(诸如亮氨酸拉链，二硫键，静电基元或疏水基元)形成寡聚体。
根据本发明的实施方案，寡聚体可以是二聚体，三聚体或四聚体，包括相同类型的单体(同聚体(homomers)或不同类型的单体(异聚体(heteromers))。本发明优选方法特别可用于在基因包上，如在噬菌粒颗粒或噬菌体或酵母上，提供同聚体，尤其是寡核苷酸的同二聚体。
本发明的方法可应用于寡聚体，所述寡聚体是具有指向基因包表面并靠近所述表面的靶结合位点的多肽，它们是生物制品，如多肽。
可选的，对这类多肽的适当设计可用于使结合位点相对于基因包的周围环境更靠近基因包表面。这对于具有更靠近多肽C端而非N端的潜在结合位点的结合多肽是有利的，尤其是当在C端环位置改造结合位点时。当在与基因包颗粒结合位点如细胞或病毒表面结构邻接处改造潜在结合位点时，选择对所述结合剂的结合伴侣具有确定的易接近性的稳定构建体是有利的。例如，C端环位置当与丝状噬菌体蛋白3的N端融合时，比N端环位置更不易接近，因为它们暴露给基因包并且在空间上靠近基因包。
但是，根据本发明的优选实施方案，提供了指定结构(诸如真正的低聚或二聚融合蛋白)以便有效改造N端环位置的潜在结合位点。本发明的一种实施方案涉及具有至少两个靶结合位点的多肽，有可能在单体或低聚靶结合剂处被改造。在一些情况下，这些单体结构间的相互作用使得能给结构、并因此给其它潜在结合位点带来其它变化。
根据本发明的优选实施方案，模块抗体是抗体，Fc片段，具有CDR区的抗体片段及其组合，还可包括具有位于结构环位置的结合位点的片段。
它还可以是具有CDR区的抗体片段，例如Fab，dAb，scfv，二价抗体(diabody)，unibody，SMIPs，TANDABS，Fc融合蛋白及其组合。
在基因包是丝状噬菌体的情况下，用于噬菌体的优选融合结构包括外表面蛋白的至少一部分，诸如p3、p6或p8，但是，p9或p10也可以用于本发明的目的。
在基因包是酵母的情况下，优选寡聚体是包括选自alpha-凝集素(agglutinin)，a-凝集素，Aga1p，Aga2p或FL01的酵母细胞表面受体蛋白之一的融合蛋白。
合适的基因包优选以特定形式提供，并且包含编码至少一种所述融合蛋白的载体。根据本发明，例如，提供一种盒载体，其包含编码一种或不止一种融合蛋白的与基因包可操作连接的序列。因此，至少两种嵌合融合蛋白结合在载体颗粒的表面。载体可以是，例如，噬菌粒。
还包括用于表达结合在本发明方法所得基因包表面的模块抗体结构域寡聚体的表达系统，其中所述寡聚体由单基因编码，融合蛋白在基因包表面展示至少两个拷贝。
通过使用本发明的方法和装置(means)，无需其中一种寡聚化伴侣的可溶性形式的受控表达就可展示模块抗体的寡聚体。这种技术可应用于分子如抗体片段，甚至那些两个以上免疫球蛋白区，例如至少4个免疫球蛋白区的抗体片段。因此可以避免带有终止密码子诸如UAG终止密码子的困难构建体。二聚体展示无需得到融合蛋白和可溶性单体的混合物。因此，可以容易地使用能管理含多种结合剂的混合物的优选技术，同时降低单体不充分匹配的风险。还可避免将抑制株用作宿主细胞。具有非抑制者功能的常规宿主细胞可以以标准方式来增加低聚融合蛋白。
在本发明的另一实施方案中，结合伴侣和基因包表面蛋白之间的融合使得它们之间没有条件终止密码子(即没有UAG，UAA，UGA或其它类似的条件终止密码子)。在这样的条件下，一旦辅助噬菌体感染，结合伴侣只作为融合蛋白存在，而不是可溶性形式。为了在基因包表面形成二聚体(三聚体或更高级聚体)，连接结合伴侣与基因包的接头需有足够的长度和足够的柔性。可以使用如上所述的方法选择满足该要求的接头。
在本发明的另一实施方案中，可以使用具有利于在基因包表面展示不止一个拷贝融合蛋白的特定性质的辅助噬菌体。这类辅助噬菌体的一个实例是所谓的超级噬菌体(hyperphage)(Rondot S，Koch J，Breitling F，Dubel S.A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display.Nat Biotechnol.2001 Jan；19(1)：75-78)，其自身缺乏p3，因此完全依赖于噬菌粒(phagmid)提供的p3融合蛋白以便具有感染性。使用这类辅助噬菌体优先导向在其表面载有超过一个拷贝融合蛋白的噬菌体颗粒，从而有利于结合蛋白在基因包表面形成二聚体。
根据本发明优选实施方案，制备在寡聚体情境下的每种融合蛋白单体，使可溶性结合剂部分不到20％，更优选不到10％，最优选不到1％。
根据本发明的方法，可以将基因包制备为优选展示至少两种融合蛋白。在具体实施方案中，本发明寡聚体的每个单体与基因包的外表面结合。本发明还提供展示来自寡聚体(每种包含通过表达而二聚化的寡聚体)的两种融合蛋白的二价噬菌体。
还要求基因包的文库，其示例性的包括至少10个变体基因包，其中所述变体基因包可以展示模块抗体结构域的异聚体。所述异聚体可以基于含靶结合位点的支架。根据本发明的具体实施方案，靶结合位点和支架结合位点可以是相似或相同的。本发明的支架配体还可以是CDR靶。例如，支架可以是亲本Fab，且所述亲本Fab变体有至少20％，优选至少30％，更优选至少40％结合所述亲本Fab的CDR靶。
本发明文库还可以包含根据本发明产生的寡聚体的变体，其氨基酸序列有差异。这可以通过至少一个插入或取代以导入至少一个外源氨基酸，和通过缺失来改变氨基酸序列而来提供。外源氨基酸可以通过随机化技术导入。外源氨基酸还可以选自氨基酸的特定组，以获得在随机化位置富含特定氨基酸的文库。当外源氨基酸选自氨基酸的特定组(诸如具有特定极性或疏水性的氨基酸)时，根据本发明可以获得在随机化位置富含氨基酸特定组的文库。这类文库还被称为“集中型(focused)”文库。
本发明还提供选择将多肽与基因包外表面结合的接头的方法，包括
a.提供基因包文库，其含有各种接头以便将第一多肽与基因包连接，
b.确定包含不显著干扰所述第一多肽功能的接头的文库成员，和
c.筛选所述接头用于将第二多肽与所述基因包连接。
从而可以获得用于相同类型融合蛋白的合适接头。相同类型的融合蛋白是指，相同形式的基因包和结合剂彼此连结。
本发明这种方法可进一步用于制备富集型文库，它包含预选的一组接头变体，它们符合至少一个选择标准，诸如柔性、结合位点相对于结合伴侣的空间易接近性。这可以通过在有各种接头序列的条件下检测公知结合剂的结合特性来确定。所述富集型文库因此可以进一步用另一标准进行选择，诸如蛋白酶抗性，这对于例如在含细菌蛋白酶的培养基中的稳定性是重要的。
选出的特异性接头序列然后可用于制备形式相同、但带有结合剂变体的融合蛋白文库，从而能够鉴定、筛选和制备在预定测试系统中具有最佳结合特性的那些试剂。
在本发明优选实施方案中，这类接头至少长20个氨基酸，优选至少25个氨基酸残基，更优选至少30个氨基酸残基，直至50个氨基酸残基。尤其当涉及氨基酸诸如负责接头的柔性的Gly、Ser或Ala时，这类接头被有利地用于展示靠近基因包表面、并且因空间原因不能结合其伴侣的潜在结合位点。
如果所展示的分子的潜在结合位点在空间上靠近噬菌体颗粒，则位于待展示的蛋白和基因包锚定蛋白(在丝状噬菌体情况下，例如p3，p8，pX，pIX，pVII)之间的接头是尤其重要的。在利用由CDR环形成的可变区和抗原结合位点、并将库成员展示为p3的氨基端融合物的抗体文库中，潜在的抗原结合位点指向背离噬菌体颗粒的方向。因此，库成员和噬菌体外壳蛋白之间的接头结构不太重要。但是改造免疫球蛋白区的底部环和进行噬菌体展示可能是一种低效(inefficient)步骤，降低抗原结合克隆的产率或甚至排斥(preclude)它。改变库成员蛋白与其融合伴侣之间位于表面的接头可以解决或可能至少减少该问题。
为了选择(在长度和柔性以及稳定性方面)最佳的接头序列，可以制备接头文库，在其中将复制型基因包表面的锚定蛋白与因空间原因而出了名地难于选择的已知结合蛋白融合。该文库的序列可以在长度和氨基酸含量方面不同。
在接头文库中选择最佳接头的方法取决于用途，但基本上应当是选择在某一方法学中希望具有的所有特性的方法。针对难于选择的抗原进行的富集可以产生允许库成员容易地接近该抗原的接头序列。在蛋白酶溶液中或其它苛刻条件下进行温育，或者在蛋白水解条件下(例如用老龄的微生物培养物)通过宿主细胞进行频繁传代，可以是稳定展示接头的合适选择法。
接头文库可用任何公知文库技术产生。合成的接头序列的长度可以为10-500个氨基酸不等。可选的，接头可以是已知具有柔性的完整蛋白。
本发明还提供产生与靶结合的模块抗体结构域寡聚体的方法，包括以下步骤：
-提供如本发明方法所述产生的模块抗体结构域寡聚体文库
-在支架配体存在的条件下将所述文库与所述靶接触
-筛选支架配体存在条件下与所述靶结合的库成员，和
-制备功能性寡聚体的制品。
支架配体可以选自效应分子，FcRn，血清白蛋白，蛋白A，蛋白G，蛋白L或CDR靶。举例来说，效应分子可以选自CD64，CD16，CD32，Fc受体。
寡聚体可以是选自VH/VL、CH1/CL、CH2/CH2、CH3/CH3、Fc和Fab，或其单链的二聚体。
本发明的方法可以提供包含至少102个表达模块抗体结构域或其变体的功能性寡聚体的独立克隆的文库。然后根据需要的结合亲和力筛选库成员，优选它具有Kd＜10-8M的靶结合亲和力。根据本发明还提供一种预选的独立克隆的库，其是例如亲和力成熟库，所述库包括优选至少10个，更优选至少100个，更优选至少1000个，更优选至少10000个，甚至超过100000个独立的克隆。这些包括预选库的文库是选择本发明高亲和力模块抗体的优选来源。
优选文库是酵母文库，酵母宿主细胞在细胞表面显示具有生物活性的寡聚体。酵母宿主细胞优选选自糖酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，裂殖酵母属(Schizisaccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，耶罗威亚酵母属(Yarrowia)和假丝酵母属(Candida)。最优选，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
根据本发明的具体实施方案，靶是erbB类(erbB class)的受体。在这种情况下，根据本发明的方法可以获得结合erbB类受体的免疫球蛋白。
本发明还提供包含至少106个独立克隆的高质量文库，所述克隆是模块抗体结构域或其变体的功能性二聚体的克隆，或者本发明还提供优化或预选克隆(例如亲和力成熟克隆)的库，所述库包含至少10个与靶结合并与支架配体结合的独立克隆。靶可以是与经历氨基酸变异的亲代分子结合的配体。亲代分子可以是功能性Fc或功能性Fab或其部分。
根据本发明的具体实施方案，亲代分子可以通过随机诱变或位点特异性诱变来变化。
文库可以包含与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域的功能性二聚体，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的功能性二聚体结合CD64。这对于包含CH2结构域诸如Fc支架的模块抗体是尤其优选。
可选的，文库可以包含与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域的功能性二聚体，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的功能性二聚体结合蛋白A。这对于包含CH2和CH3结构域诸如Fc支架的模块抗体是尤其优选。
可选的，文库可以包含与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域的功能性二聚体，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的功能性二聚体结合相同的CDR靶。这对于包含可变区(诸如对单个CDR靶具有特异性的Fab支架)的模块抗体是尤其优选。
附图：
图1：用于产生为组装文库Fcab01所用的片段的PCR。PCR引物用箭头表示各自的5′-3′方向，垂直线表示为组装突变基因所引入的限制性酶切位点的大概位置。限制性酶切位点包含在用于连接PCR片段的引物上。
图2：CH3结构域的氨基酸序列和二级结构(IMGT编号)。提供文库Fcab01到Fcab06的随机化方案。AB和EF环中的随机化位置用圆圈标记。X代表所有20种氨基酸(由NNB编码)，z只代表Ala、Asp、Ser、Tyr(由KMT编码；集中型文库)。
发明详述
本发明的模块抗体结构域寡聚体将用做独立的分子，以及融合蛋白或衍生物，最常见的是以成为例如完整抗体分子的更大结构或其部分的方式在改造之前或之后融合。根据本发明产生的免疫球蛋白或融合蛋白因此还包括Fc片段，Fab片段，Fv片段，单域抗体，单链抗体，尤其是单链Fv片段，双或多特异性scFv，二价抗体，unibodies，多体(multibodies)，免疫球蛋白区的多价或多聚体，等等。有可能使用改造的蛋白来产生单特异性，双特异性，三特异性，和甚至可以载有更多特异性的分子。通过本发明有可能根据这类分子计划用途的要求同时控制和预选结合的效价。
说明书全文使用的专有术语具有下列含义。
本发明使用的术语“免疫球蛋白”被定义为多肽或蛋白，其优选在至少两个，更优选至少三个针对例如病原体来源或人结构的抗原、效应分子或蛋白(例如包括细胞相关的或血清蛋白的自身抗原)的表位的特定结合位点显示单或二或多特异性，或单、二或多价结合特性。本发明使用的术语免疫球蛋白还包括抗体的功能性片段，诸如Fc，Fab，scFv，CH1/CL结构域的单链二聚体，Fv，二聚体样VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，或免疫球蛋白的其它衍生物或组合，例如免疫球蛋白区配对的单链。所述定义进一步包括可变区重链和轻链的结构域(诸如dAb，Fd，Vl，Vk，Vh，VHH)和完整抗体的恒定区或个别结构域诸如CH1，CH2，CH3，CH4，Cl和Ck，以及由结构环连接的免疫球蛋白区至少两条beta链组成的小结构域。
本发明使用的“模块抗体”被定义为抗原结合分子，例如人抗体，由至少一个多肽组件或蛋白结构域组成，优选采用天然形式。术语“模块抗体”包括抗原结合分子，其是免疫球蛋白，免疫球蛋白样蛋白，或显示类似于免疫球蛋白或抗体的模块形式和抗原结合特性的其它蛋白，其可用作抗原结合支架，优选基于人蛋白。
本发明使用的术语“免疫球蛋白样分子”涉及任意抗原结合蛋白，尤其是人蛋白，其具有可以模块方式构建的域结构。优选用于本发明的免疫球蛋白样分子是T细胞受体(TCR)，纤连蛋白，运铁蛋白，CTLA-4，单链抗原受体，例如与T细胞受体和抗体有关的那些，抗体模拟物，adnectins，anticalins，phylomers，重复蛋白诸如锚蛋白重复，avimers，VersabodiesTM，基于全蝎毒素(scorpio toxin)的分子，以及其它具有抗原结合特性的非抗体蛋白支架。
锚蛋白重复(AR)，armadillo重复(ARM)，亮氨酸富集重复(LRR)和三角形四肽(tetratricopeptide)重复(TPR)蛋白是重复蛋白这一类的最重要成员。重复蛋白由同源结构单位(重复蛋白)组成，这些单位堆积形成延长的结构域。结合相互作用通常由数个相邻重复介导，引向大的靶相互作用表面。
Avimers包含A结构域，是在数个细胞表面受体中排成一列的多个结构域。该家族的结构域天然结合超过100种不同的已知靶，包括小分子，蛋白和病毒。截断分析显示，靶通常与多个A结构域接触，其中每个结构域独立的结合特定表位。通过组合多个结合结构域来产生亲和力是增加亲和力和特异性的有效方法，这些受体在进化过程中已经利用了这一点。
Anticalins是源自脂笼蛋白(lipocalin)支架、具有指定的结合特性(主要是对于人源化抗体而言)的工程化人蛋白。脂笼蛋白包括160-180个氨基酸，与被4个环围绕的配体结合口袋一起形成锥状beta-桶蛋白。小的疏水化合物是脂笼蛋白的天然配体，将该结合口袋中的残基随机化后可以分离出具有新的化合物特异性的不同脂笼蛋白变体(亦称为“anticalins”)。
单链或单域抗原受体包含单个可变区，并且比骆驼单域抗体(camelidsingle domain antibodies)小20％。
Phylomers是源自生物多样化天然蛋白片段的肽。
很清楚术语“模块抗体”，“免疫球蛋白”，“免疫球蛋白样蛋白”还包括其衍生物。衍生物是本发明一种或更多种模块抗体的任意组合和/或融合蛋白，其中本发明模块抗体的任意结构域或小结构域可以在一种或更多种其它蛋白(诸如其它的模块抗体，免疫球蛋白，配体，支架蛋白，酶，毒素等等)的任意位置融合。还可以通过各种化学技术诸如共价偶联，静电相互作用，双硫醚键等等，利用关联或结合其它物质来获得本发明模块抗体的衍生物。结合免疫球蛋白的其它物质可以是脂质，碳水化合物，核酸，有机和无机分子或其任意组合(例如PEG，前体药物或药物)。衍生物还包括具有相同的氨基酸序列但完全或部分从非天然的或化学修饰的氨基酸制备的抗体。
本发明的“结构环”或“非CDR环”应以下列方式理解：模块抗体，免疫球蛋白或免疫球蛋白样物质由具有所谓免疫球蛋白折叠的结构域组成。实质上，反平行beta片层的链由环连接形成压缩的反平行beta桶。在可变区中，这些结构域的一些环对抗体的特异性即通过抗体的天然结合位点结合抗原具有实质上的贡献。这些环被称为CDR-环。CDR环位于CDR环区内，其在一些情况下还可以包括靠近CDR环的可变骨架区(称为“VFR”)。已知VFRs对抗体的抗原结合口袋(其通常主要由CDR环确定)有贡献。因此，那些VFRs被认为是CDR环区的一部分，不适合用于产生新的抗原结合位点。不同于CDR环区内或靠近CDR环的那些VFRs，可变区的其它VFRs尤其适用于本发明。这些是与CDR环区相对或位于免疫球蛋白可变区C端一侧的VFRs的结构环。
本发明使用的术语“抗原”或“靶”将特别包括能够被模块抗体的结合位点识别的所有抗原和靶分子。被本发明受体分子靶向的特别优选抗原是以下抗原或分子，其已经被证明是或能够是免疫或治疗上相关的，尤其是临床功效已经得到验证的那些。
本文使用的术语“靶”或“抗原”将包括选自以下的分子：变应原，肿瘤相关抗原，自体抗原包括细胞表面受体，酶，Fc-受体，FcRn，HSA，IgG，白介素或细胞因子，补体系统的蛋白，转运蛋白，血清分子，细菌抗原，真菌抗原，原生动物抗原和病毒抗原，以及引起传染性海绵状脑炎(TSE)的分子，如感染性或非感染性朊蛋白，和与炎性病症有关的标记物或分子如促炎因子，多发性硬化或阿尔茨海默尔病，或半抗原。
术语“细胞表面抗原”将包括能够被细胞表面的抗体结构和这类分子的片段识别的所有抗原。优选细胞表面抗原是以下抗原，其已经被证明是或能够是免疫或治疗上相关的，尤其是临床前或临床功效已经得到验证的那些。对于本发明的目的来说，调节细胞杀伤活性的那些细胞表面分子是特别适合的。当本发明的免疫球蛋白优选结合所述细胞表面分子中的至少两种时，免疫系统引起细胞裂解或细胞死亡，从而提供攻击人细胞的有效工具。
抗原既作为完整靶分子或这类分子的片段被识别，所述片段尤其是通称为表位的靶的子结构(substructure)。
只要它们是免疫上相关的(即还可以被天然或单克隆抗体识别)，抗原子结构就被通称为“表位”(例如B细胞表位，T细胞表位)。根据本发明本文使用的术语“表位”表示可以完全组成特定的结合伴侣或属于针对本发明模块抗体或免疫球蛋白的结合位点的特定结合伴侣一部分的分子结构。术语表位还可以表示半抗原。化学上，表位可以由碳水化合物，肽，脂肪酸，有机、生化或无机物或其衍生物及其任意组合组成。如果表位是多肽的话，在肽中通常包括至少3个氨基酸，优选8到50个氨基酸，和更优选约10-20个氨基酸。在肽的长度方面没有关键上限，其可以包括几乎全长的蛋白多肽序列。表位可以是线性或构象的表位。线性表位由多肽链主要序列的单个片段组成。线性的表位可以是连续或重叠的。构象表位由通过多肽折叠形成三级结构而汇集的氨基酸组成，所述氨基酸在线性序列中彼此不必接近。具体来说，表位是诊断相关分子的至少一部分，即样品中表位的缺失或存在与患者的疾病或健康状态或制备中的加工状态或环境和食品状况定性或定量相关。表位还可以是治疗相关分子的至少一部分，即可以被特定结合结构域(其改变疾病的过程)靶向的分子。
本文使用的术语“特异性结合”或“特异结合”涉及在分子的异质群体中确定感兴趣的同源配体的结合反应。因此，在指定条件下(例如免疫分析条件)，模块抗体结合其特定靶，而不大量结合样品中存在的其它分子。特异结合表示就靶特性而言结合是选择性的，如筛选的高、中或低结合亲和力或亲合力。如果结合常数或结合动力学是至少10倍不同的，优选差异是至少100倍，和更优选至少1000倍，则选择性结合一般被实现。
术语“表达系统”涉及包含需要的编码序列和可操作连接的调控序列的核酸分子，这样的话转化或转染这些序列的宿主能够产生编码的蛋白。为了影响转化，表达系统可以包括在载体上；但是，还可以将相关DNA整合到宿主染色体中。可选的，表达系统可以用于体外转录/翻译。表达系统优选使用宿主细胞(其是真核或原核宿主细胞)，优选哺乳动物或酵母宿主细胞，以及细菌宿主细胞。
用于融合蛋白的优选表达系统是非抑制者宿主细胞，其对终止密码子(诸如UAG终止密码子)敏感，因此其后将终止翻译。在没有这类终止密码子的情况下，优选使用这类非抑制者宿主细胞，优选大肠杆菌。在存在这类终止密码子的条件下，将使用抑制者宿主细胞。
免疫球蛋白氨基酸序列的所有编号是根据IMGT编号方案(IMGT，theinternational ImMunoGeneTics，Lefranc et al.，1999，Nucleic Acids Res.27：209-212)。
对于本发明的目的而言，术语“结合剂”或“配体”是指结合对的一员，尤其是有可能作为针对结合伴侣的结合结构域的结合多肽。结合伴侣的实例包括具有功能性相互作用的成对结合剂，所述结合剂诸如与配体结合的受体，与抗原或受体结合的抗体，与靶结合的药物，以及与底物结合的酶。
用于本发明目的的术语“融合蛋白”或“嵌合融合蛋白”表示由基因包，外表面结构的至少一部分(诸如外壳蛋白或其部分)，可选还有接头序列，以及结合剂组成的分子。融合蛋白由载体编码，所述载体有结合剂的基因和在基因包表面展示一个拷贝的结合剂的信息。
用于本发明目的的术语“细胞毒活性”表示效应细胞引起细胞毒T细胞活化的活性，或细胞介导抗体依赖性细胞型细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)的活性。本发明的模块抗体因此杀伤抗体包被的靶细胞，它们可选的结合它们的Fc受体。
“支架”表示在构建多肽的变体或所有组成成分时用于支持多肽分子结构的天然或人工临时骨架。它通常是维持亲代分子的三级结构或功能的多肽结构域的模块系统。示例性支架是模块抗体，其可以被诱变处理以在所述支架内产生变体获得文库。
用于本发明目的的术语“支架配体”表示结合模块抗体的支架或主链，从而确定所述模块抗体的分子结构或基本功能和特异性的配体。在优选情况下支架配体是功能性配体，在结合时调节生物功能，例如效应配体。在备选实施方案中，支架配体是功能性配体，其是CDR区、非结构环区或结构环区结合的特定靶。相同的支架配体可以结合模块抗体的多个变体，而与它们的靶特异性无关。通常，支架配体结合位点的存在提示变体被表达并且正确折叠。因此，支架配体与其结合位点的结合提供一种从多肽的所有组成成分预选功能性多肽的方法。设计保持对支架配体的结合性的模块抗体的变体避免制备出无功能的变体，例如作为引入基本上不能结合任意靶或效应配体的突变、折叠突变体或表达突变体的结果。这类无功能的突变体有时由构建多肽所有组成成分时的常规随机化和变异步骤产生。提供结合支架配体的功能性突变体允许本领域技术人员制备富含功能性、良好折叠和高表达库成员的模块抗体文库。
用于本发明目的的术语“效应配体”表示调节效应物功能的配体，例如效应分子。示例性的效应配体是干扰免疫球蛋白的Fc受体或Fc受体样分子。Fc受体是在一些细胞表面发现的蛋白-包括天然杀伤细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，和肥大细胞-其有助于免疫系统的保护功能。其名称来源于其对称为Fc(可结晶的片段)的抗体部分的结合特异性。Fc受体结合与感染细胞或侵入病原体粘附的抗体。通过抗体调节的细胞吞噬(ADCP)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，它们的活性刺激噬菌细胞或细胞毒细胞破坏微生物或感染细胞。存在数种不同类型的Fc受体，这基于它们识别的抗体类型进行分类；那些结合抗体最常见类型(IgG)的Fc受体，被称为Fc-gamma受体(FcγR)，结合IgA的那些Fc受体被称为Fc-alpha受体(FcαR)和那些结合IgE的Fc受体被称为Fc-epsilon受体(FcεR)。与效应配体相同并包括在该定义中的是识别模块抗体(诸如蛋白A)内相同或类似结合位点的任意替代配体。
所有FcγRs都属于免疫球蛋白超家族，对于诱导受调理(包被)微生物的吞噬来说是最重要的Fc受体。该家族包括数个成员，它们因为不同的分子结构而在抗体亲和力方面不同：FcγRI(CD64)，FcγRIIA(CD32a)，FcγRIIB(CD32b)，FcγRIIIA(CD16a)，FcγRIIIB(CD16b)。例如，FcγRI结合IgG比FcγRII和FcγRIII更强，并具有由3个免疫球蛋白(Ig)样结构域组成的胞外部分，比FcγRII和FcγRIII多一个结构域。这些特性允许通过单独的IgG分子(或单体)活化FcγRI，而后两种Fey受体必须结合免疫复合物内的多个IgG分子以被活化。
另一FcR在多种细胞类型中表达，在结构上与I型MHC相似。该受体还结合IgG，参与该抗体的保护以便增加其在体内的生物半衰期。但是，因为该Fc受体还参与通过胎盘将IgG从母亲转移到其胎儿或在乳汁中将IgG从母亲转移到其哺乳婴儿，所以它被称为新生儿Fc受体(FcRn)。最近该受体已被显示参与IgG血清水平的平衡。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种细胞介导免疫机制，由此免疫系统的效应细胞主动裂解被特定抗体结合的靶细胞。这是抗体作为体液免疫应答的一部分用于限制和包含感染的机制之一。典型的ADCC通过天然杀伤(NK)细胞调节；单核细胞和嗜酸性粒细胞也可以调节ADCC。例如嗜酸性粒细胞可以通过ADCC杀伤一些被称为蠕虫的寄生虫。ADCC属于获得性免疫应答，因为其依赖于现有的抗体应答。
在氨基酸背景下的术语“外源”表示新导入的氨基酸是天然存在的，但对改造位点来说是外来的，或天然存在氨基酸的取代。对于抗原结合位点来说“外源”表示抗原结合位点不是由试剂的特定结合区天然形成的，试剂的外源结合伴侣而不是天然结合伴侣被新改造的结合位点结合。
本文使用的术语“可变结合区”(有时称为“CDR区”)是指具有能与抗原结合相互作用的可变结构的分子。所述分子可以如此使用或掺入更大的蛋白内，从而形成具有结合功能的这类蛋白的特定区。所述可变结构可以来源于结合蛋白(诸如免疫球蛋白或phylomers)的天然所有组成成分或合成多样性，包括重复蛋白，avimers和anticalins。所述可变结构还可以通过随机化技术产生，尤其是本文描述的那些。这些包括诱变处理的免疫球蛋白可变区或恒定区的CDR或非CDR区，环区。
在特定位点具有不同改造的改造结合剂被称作“变体”。支架变体优选被归组形成结合剂的文库，其可用于选择具有预定功能的文库成员。据此，优选通过随机、半随机或，尤其是，通过定点随机诱变法，尤其是在环中(优选在结构环中)缺失、交换或导入随机产生的插入，优选将可能导致结合位点的包括一个或更多个环内位置的结合剂的环区突变或改造以产生文库。可选的，优选使用组合方法。可以使用已知诱变方法的任意一种，其中包括盒诱变(cassette mutagenesis)。这些方法可用于在本发明免疫球蛋白的目标位置进行氨基酸改造。在一些情况下位置是随机选择的，例如利用任意可能的氨基酸或筛选的优选氨基酸以将环序列随机化，或利用简化规则进行氨基酸变化。例如所有残基优选可以被突变为特定氨基酸，诸如丙氨酸，这称为氨基酸或丙氨酸扫描。这类方法可以伴随更复杂的使用选择法来筛选更高水平的序列多样性的工程化方法。
与全长抗体相比，分子量低于60kD或最多为60kD的本发明优选细胞毒模块抗体大小较小。优选大小为直至55kD。模块抗体单域通常的分子大小为10-15kD，因此基于4个模块抗体结构域的分子的分子大小为40-60kD，这取决于药理学活性物质的糖基化或任意其它结合，例如毒素或肽。
优选形式是由模块抗体结构域组成的寡聚体，优选直至4个结构域，更优选3个结构域，和更优选由2个结构域组成。基于5个模块抗体结构域或更多的组合的形式通常被认为不具有小型抗体片段的优势，所述优势是易于在各种表达系统中表达和组织穿透。
提供本发明优选模块抗体作为单域抗体是可行的。但是，抗体结构域在表达时倾向于二聚化，称为同二聚体(例如Fc)或异二聚体(例如Fab)。二聚结构因此被认为是优选稳定分子的基础。优选免疫球蛋白区二聚体选自单域二聚体，例如VH/VL，CH1/CL(kappa或lambda)，CH2/CH2和CH3/CH3。模块抗体结构域的二聚体或寡聚体还可以提供为单链或双链分子，尤其是将一个结构域的C端连结到另一结构域的N端的那些。
结合伴侣(binding partner)是通常通过非共价相互作用彼此特异性结合的试剂。结合伴侣的实例包括具有功能性相互作用的结合剂对，诸如结合配体的受体，结合抗原的抗体，结合靶的药物，和结合底物的酶。结合伴侣可在多个治疗、诊断、分析和工业用途中得到应用。最重要的结合伴侣，也称为结合对，是抗体或免疫球蛋白，其片段或衍生物。在大多数情况下需要这类结合剂的结合来调节生物学效应或功能，“功能性相互作用”。
根据本发明的具体实施方案，结合剂是人或小鼠来源的免疫球蛋白，可用于各种目的，尤其是用于药物组合物。当然，改造的免疫球蛋白也可以是人源化或嵌合的免疫球蛋白。
作为人免疫球蛋白的结合剂优选选自或源自IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM。小鼠免疫球蛋白结合剂优选选自或源自IgA，IgD，IgE，IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG2C，IgG3和IgM。
这类结合剂优选包括重链和/或轻链或其部分。本发明改造的免疫球蛋白可以包括重链和/或轻链，至少一个可变区和/或恒定区，或其包括小结构域的部分。
恒定区是免疫球蛋白分子恒定部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为恒定区的结构域(例如CH1，CH2，CH3，CH4，Ck，Cl)。
可变区是免疫球蛋白可变部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为可变区的结构域(例如Vh，Vk，Vl，Vd)。
本发明的示例性模块抗体由选自具有至少一个环区的CH1，CH2，CH3，CH4，Igk-C，IgI-C，其组合、衍生物或包括小结构域的部分组成，其特征在于所述至少一个环区包括至少一个氨基酸改造以形成至少一个改造的环区，其中所述至少一个改造的环区特异性结合抗原的至少一个表位。
本发明的另一模块抗体可以由具有至少一个环区的重链或轻链的可变区、组合、衍生物或其包括小结构域的部分组成，其特征在于所述至少一个环区包括至少一个氨基酸改造以形成至少一个改造的环区，其中所述至少一个改造的环区特异性结合抗原的至少一个表位。
本发明的模块抗体可以包括一个或更多个结构域(例如至少2，3，4，5，6，10个结构域)。如果模块抗体中存在不止一个结构域，则这些结构域可以是相同的类型或不同的类型(例如CH1-CH1-CH2，CH3-CH3，(CH2)2-(CH3)2，有或者没有铰链区)。当然单域的顺序也可以是任意种类(例如CH1-CH3-CH2，CH4-CH1-CH3-CH2)。
本发明优选涉及抗体的部分，诸如IgG，IgA，IgM，IgD，IgE等等。本发明的模块抗体也可以是功能性抗体片段诸如Fab，Fab2，scFv，Fv，Fc，FcabTM，抗原结合Fc，或其部分，或免疫球蛋白的其它衍生物或组合诸如minibodies，可变区重链和轻链的结构域(诸如dAb，Fd(由一个或更多个单域组成的结合位点)，VL，包括Vlambda(Vl)和Vkappa(Vk)，VH，VHH)以及由至少两个结构环连接的免疫球蛋白区两条beta-链组成的小结构域，作为分离的结构域或在天然结合分子的情况下。本发明的具体实施方案涉及抗体分子的Fc片段，通过氨基酸序列的改造作为抗原结合Fc片段(FcabTM)，或作为受体、肽或其它抗原结合模块(诸如scFv)的偶联物或融合体。
模块抗体可以作为分离的多肽或组合分子使用，例如通过与其它肽或多肽的重组、融合或结合技术。所述肽优选与免疫球蛋白区序列同源，优选长至少5个氨基酸，更优选长至少10或甚至至少50或100个氨基酸，并至少部分构成免疫球蛋白区的环区。优选结合特征涉及预先确定的表位结合、亲和力和亲合力。
本发明的模块抗体还可进一步与一个或更多个改造的模块抗体或未改造的模块抗体或其部分组合以获得组合模块抗体。组合优选通过重组技术获得，还可以通过吸附、静电相互作用等等或通过有或没有接头的连接或化学结合来获得。优选接头序列是天然接头序列或功能上合适的人工序列。
通常本发明的模块抗体可以用做结构单元以在分子上组合其它模块抗体或生物活性物质或分子。优选在分子上将通过可变或非可变序列(例如结构环)结合特定伴侣的至少一个抗体与至少一个其它结合分子(其可以是抗体，抗体片段，可溶性受体，配体或另一抗体结构域，或其结合部分)组合。其它组合是指蛋白性质的分子，核酸，脂质，有机分子和碳水化合物。
本发明的工程化分子将用做独立的蛋白，以及融合蛋白或衍生物，最常见的是以成为更大的抗体结构或完整抗体分子的部分或其部分或片段(诸如Fab片段，Fc片段，Fv片段等等)的方式进行融合。有可能利用改造的蛋白产生单特异性、双特异性、三特异性和甚至同时载有更多特异性的分子，还可根据这类分子的计划用途的要求同时控制和预选结合的效价。
根据本发明，模块抗体可选的具有针对抗原的一个或更多个结合区，包括特异性结合细胞表面靶的结合位点和调节效应物功能的结合位点。针对一个或更多个抗原的抗原结合位点由CDR区或任意其它天然受体结合结构呈现，或可以被导入可变区或恒定区结构的抗体结构域的结构环区。用于检测结合位点结合特性的抗原可以是天然存在的分子或化学合成分子或重组分子，其可以位于溶液或悬浮液中，例如位于颗粒(诸如固相)上或颗粒(诸如固相)中，在细胞上或细胞中或病毒表面。当在自然条件下抗原仍然粘附或结合分子和结构时，优选测定免疫球蛋白与抗原的结合。从而有可能鉴定和获得最适于诊断或治疗使用目的的那些改造的免疫球蛋白。
模块抗体或免疫球蛋白区可以根据本发明改造(本文使用的术语免疫球蛋白和抗体是可以互换的)，所述改造优选作用于包含环(CDR环或非CDR环)的免疫球蛋白区或其部分，结构环是改造或诱变的优选位点。在一些情况下优选使用指定改造的结构环或结构环区或其部分作为用于结合或组合目的的分离分子。
尤其优选本发明的模块抗体通过结构环和/或CDR环的至少一部分结合所述细胞表面靶。
在备选实施方案中，优选本发明的模块抗体通过结构环和/或CDR环的至少一部分结合所述效应配体，或这类效应配体的替代配体，例如蛋白A，从而调节效应物功能。
在优选实施方案中，结合剂利用其天然或改造的结合结构或新形成的结合位点与相同抗原或不同抗原的至少两个这类表位(彼此相同或不同)特异性结合。
在优选结合剂域结构中，优选改造至少一个环区，导致一个或更多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失和/或插入，优选点突变，或甚至全环的交换，更优选改变至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15，直至30个氨基酸。因此改造的序列包括未包含在环保守区内的氨基酸，新导入的氨基酸是天然存在的，但对改造位点来说是外源的，或是天然存在氨基酸的取代。
但是，插入结合剂环区的氨基酸最大数目优选不超过30，优选25，更优选最多20个氨基酸。氨基酸的取代和插入优选通过本领域已知的和本专利申请公开的方法，使用所有可能的氨基酸或用于随机化目的筛选的优选氨基酸随机或半随机进行。
改造位点可以位于特定单个环或环区，尤其是结构环或结构环区。环区通常由至少一个，优选至少两个，优选至少3个或至少4个环组成，所述环位于结构域的顶部或底部，彼此邻近或接近，可能通过形成抗原结合位点或抗原结合口袋导致抗原的结合。优选一个或更多个改造位点位于10个氨基酸的区域内，更优选位于20，30，40，50，60，70，80，90直至100个氨基酸内，尤其是结构区内以形成抗原可以空间上接近环区的表面或口袋。
在这点上优选改造在CH1、CH2、CH3和CH4的环区中进行，尤其是以下范围：氨基酸25到39，氨基酸41到81，氨基酸83到85，氨基酸89到103和氨基酸106到117。
在另一优选实施方案中，包括氨基酸92到98的结构环区的改造与包括氨基酸8到20的结构环区的改造组合。
上述鉴定的相应免疫球蛋白的氨基酸区包括待改造的环区。优选，包括氨基酸92到98的结构环区的改造与一个或更多个其它结构环中的改造组合。
在另一优选实施方案中，包括氨基酸92到98的结构环区的改造与包括氨基酸41到45.2的结构环区的改造组合。
最优选包括氨基酸92到98，氨基酸41到45.2和氨基酸8到20的结构环中的每一个包含至少一个氨基酸改造。
在另一优选实施方案中，包括氨基酸92到98，氨基酸41到45.2，和氨基酸8到20的结构环中的每一个包含至少一个氨基酸改造。
根据另一优选实施方案，位于CH3的15到17，29到34，41到45.2，84到85，92到100，和/或108到115位的氨基酸残基被改造。
优选人来源Igk-C和IgI-C的改造在环区的以下区域进行：氨基酸26到36，氨基酸41到82，氨基酸83到88，氨基酸92到100，氨基酸107到124和氨基酸123到126。
优选小鼠来源Igk-C和IgI-C的环区改造在以下区域的位置进行：氨基酸8到20，氨基酸26到36，氨基酸43到79，氨基酸83到85，氨基酸90到101，氨基酸108到116和氨基酸122到126。
根据本发明优选用作治疗剂的另一优选免疫球蛋白由具有至少一个环区(优选结构环区)的重链或轻链或其部分的可变区组成，其特征在于所述至少一个环区包括至少一个氨基酸改造以形成至少一个改造环区，其中所述至少一个改造环区形成如上所述的相关结合位点。
根据一个具体实施方案，本发明优选使用的免疫球蛋白可以包含位于可变区内的改造，所述可变区选自VH，Vkappa，Vlambda，VHH和其组合。更具体地，它们包括位于氨基酸7到22，氨基酸39到55，氨基酸66到79，氨基酸77到89或氨基酸89到104内的至少一个改造，其中结构域氨基酸位置的编号是IMGT编号。
在一个具体实施方案中，本发明优选使用的免疫球蛋白的特征在于人来源VH或Vkappa或Vlambda的环区包括位于氨基酸7到22，氨基酸43到51，氨基酸67到77，氨基酸77到88，和氨基酸89到104内的至少一个改造，最优选氨基酸12到17位，氨基酸45到50位，氨基酸68到77位，氨基酸79到88，和氨基酸92到99位，其中结构域氨基酸位置的编号是IMGT编号。
作为可能筛选用于改造目的的人来源免疫球蛋白可变区的结构环区优选位于以下区域：氨基酸8到20，氨基酸44到50，氨基酸67到76，氨基酸78到87，和氨基酸89到101。
根据优选实施方案，作为可能筛选用于改造目的的小鼠来源免疫球蛋白可变区的结构环区优选位于以下区域：氨基酸6到20，氨基酸43到52，氨基酸67到79，氨基酸79到87，和氨基酸91到100。
根据本发明优选用作治疗剂的免疫球蛋白还可以是骆驼来源。骆驼抗体只包括一条重链，与由轻链和重链组成的正常抗体具有相同的抗原亲和力。因为骆驼抗体比例如人抗体小得多，这允许它们穿透严密的组织到达抗原，而更大的蛋白无法到达。此外，在临床重要化合物的设计、生产或应用中骆驼的重链抗体比普通抗体具有优势：相对较纯，高亲和力和特异性以及到达活性位点并与其相互作用的潜力。
根据本发明另一优选实施方案，骆驼来源的模块抗体或免疫球蛋白的结构环区被改造，例如在VHH内，在氨基酸7到19，氨基酸43到55，氨基酸68到76，氨基酸80到87和氨基酸91到101的区域内。
本发明优选产生模块抗体的方法涉及改造模块抗体(其特异性结合至少一个第一表位并在至少两个结构环区中的每一个包括改造)，和确定所述至少两个环区与至少一个第二表位的特异性结合，其中未改造的结构环区(非CDR区)不与所述至少一个第二表位特异性结合。因此，对第一抗原特异的抗体或抗原结合结构可以通过以下方式改进：添加抗第二抗原(其特异性可以是相同的，针对不同的表位或相同表位)的另一效价或特异性，以增加效价或获得二、寡或多特异性分子。
另一方面优选使用包含与效应分子或免疫细胞相互作用的天然结构的模块抗体。所述天然结构保持不变或为了增强的效应物功能进行改造。例如Fc受体的结合位点被描述位于CH2和/或CH3结构域区，可以通过公知的技术进行诱变。
ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性是通过具有识别结合抗体恒定区的Fc受体的细胞对抗体包被的靶细胞的杀伤。大部分ADCC由在其表面具有Fc受体FcgammaRIII或CD16的NK细胞介导。典型分析法使用靶细胞，例如Ramos细胞，在添加新分离的效应细胞前与系列稀释的抗体温育。然后将ADCC分析物进一步温育数小时，检测细胞毒性％。通常靶：效应物比例为约1∶16，但可以是1∶1直至1∶50。
补体依赖性细胞毒性(CDC)是一种杀伤细胞的机制，其中与靶细胞表面结合的抗体固定补体，所述补体导致膜攻击复合物的组装，其穿透靶细胞膜上的孔导致随后的细胞裂解。常规使用的CDC分析法按照ADCC测定法的相同步骤，但是，利用包含补体的血清代替效应细胞。
当与对照相比细胞裂解百分比存在显著的增加，则证明本发明的模块抗体通过ADCC和CDC分析法之一确定的细胞毒活性。绝对百分比增长优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。
抗体依赖性细胞吞噬ADCP(有时称为ADPC)通常与培养的人细胞的细胞裂解一起被研究。可以如下确定抗体介导的吞噬细胞(通常人单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞)的吞噬。可以将纯化的单核细胞与细胞因子一起培养以增强FcγRs的表达或诱导分化为巨噬细胞。然后用靶细胞进行ADCP和ADCC分析。通过流式细胞术检测的阳性细胞百分比测定吞噬。通过吞噬细胞对抗体-抗原复合物的显著摄取证明阳性ADCP活性。绝对百分比增长优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。
在典型分析法中，将PBMC或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞按照100ml/孔1×105活细胞的浓度重悬于96孔板的RF2培养基(添加2％FCS的RPMI 1640)中。利用PKH2绿色荧光染料染色表达靶抗原的相应靶细胞，例如Her2/neu抗原和SKBR3细胞。随后将1×104PKH2-标记的靶细胞和不同浓度(例如1-100μg/ml)的Her 2特异性(IgG1)抗体(或模块抗体)或小鼠IgG1同型对照(或模块抗体对照)添加到PBMCs的孔中，在200ml的终体积中37℃温育24小时。温育后，利用EDTA-PBS收集PBMCs或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞和靶细胞，将其转移到96孔V形底的板。将板离心并吸出上清。细胞用100ml偶联RPE的抗CD11b、抗CD14和人IgG的混合物复染，在冰上温育60分钟。清洗细胞，并用2％甲醛-PBS固定。在最适门控下利用FACS Calibur进行双色流式细胞分析。在FL-1通道(发射波长，530nm)中检测到PKH2标记的靶细胞(绿色)，在FL-2通道(发射波长，575nm)中检测到RPE标记的PBMC或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞(红色)。剩余的靶细胞被定义为PKH2+/RPE-双重标记的细胞(PKH2+/RPE-)，它们被认为代表被PBMC或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞吞噬的靶。利用下列等式计算靶细胞的吞噬：吞噬百分比＝100×[(双阳性百分比)/(双阳性百分比+剩余靶百分比)]。所有试验重复两次或三次，结果可以表示为平均值6SD。
本发明模块抗体的效应物功能通常不同于任意合成的细胞毒活性，例如通过可以与免疫球蛋白结构偶联的毒素带来的活性。毒素通常不活化效应分子和生物学防御机制。因此，本发明模块抗体优选细胞毒活性是生物学细胞毒活性(通常是免疫刺激性)，导致有效的细胞裂解。
本发明的模块抗体可以特异性结合任何种类的结合分子或结构，尤其是结合抗原，蛋白性质的分子，蛋白，肽，多肽，核酸，聚糖，碳水化合物，脂质，有机分子，尤其是小有机分子，无机分子，或其组合或融合物，包括PEG，前体药物或药物。本发明优选模块抗体可以包括至少两个环或环区，因此每一环或环区可以特异性结合不同的分子或表位。
优选靶抗原选自细胞表面抗原，包括受体，尤其是来自erbB受体酪氨酸激酶(诸如EGFR，HER2，HER3和HER4，尤其是这类受体胞外结构域的那些表位，例如4D5表位)，TNF受体超家族的分子，诸如Apo-1受体，TNFR1，TNFR2，神经生长因子受体NGFR，CD40，T细胞表面分子，T细胞受体，T细胞抗原OX40，TACI受体，BCMA，Apo-3，DR4，DR5，DR6，诱饵受体，诸如DcR1，DcR2，CAR1，HVEM，GITR，ZTNFR-5，NTR-1，TNFL1但不限于这些分子，B细胞表面抗原，诸如CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，实体瘤或血液癌细胞的抗原或标记物，淋巴瘤或白血病的细胞，其它血细胞包括血小板，但不限于这些分子。
根据进一步优选实施方案，靶抗原选自由细胞(例如上皮细胞，实体瘤细胞，感染细胞，血细胞，抗原呈递细胞和单核细胞)呈现的那些抗原。由细胞表达或过表达的那些靶抗原优选作为靶标，其选自肿瘤相关抗原，尤其是EpCAM，肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)，肿瘤相关抗原CA 125，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)，表达Lewis Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEM，粘蛋白MUC1，MUC18和细胞角蛋白肿瘤相关抗原，细菌抗原，病毒抗原，变应原，变态反应相关分子IgE，cKIT和Fc-epsilon-受体1，IRp βO，IL-5受体，CCR3，红细胞受体(CRl)，人血清白蛋白，小鼠血清白蛋白，大鼠血清白蛋白，Fc受体，例如新生儿Fc-gamma-受体FcRn，Fc-gamma-受体Fc-gamma RI，Fc-gamma-RII，Fc-gamma RIII，Fc-alpha-受体，Fc-epsilon-受体，荧光素，溶菌酶，toll样受体9，红细胞生成素，CD2，CD3，CD3E，CD4，CD11，CD11a，CD14，CD16，CD18，CD19，CD20，CD22，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD32，CD33(p67蛋白)，CD38，CD40，CD40L，CD52，CD54，CD56，CD64，CD80，CD 147，GD3，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，LIF，OSM，干扰素alpha，干扰素beta，干扰素gamma；TNF-alpha，TNFbeta2，TNFalpha，TNFalphabeta，TNF-R1，TNF-RII，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，TRAIL，RANKL，TWEAK，APRIL，BAFF，LIGHT，VEGl，OX40L，TRAIL受体-1，Al腺嘌呤核苷受体，淋巴细胞毒素Beta受体，TACI，BAFF-R，EPO；LFA-3，ICAM-1，ICAM-3，整联蛋白beta1，整联蛋白beta2，整联蛋白alpha4/beta7，整联蛋白alpha2，整联蛋白alpha3，整联蛋白alpha4，整联蛋白alpha5，整联蛋白alpha6，整联蛋白alphav，alphaVbeta3整联蛋白，FGFR-3，角化细胞生长因子，GM-CSF，M-CSF，RANKL，VLA-1，VLA-4，L-选择蛋白，抗-Id，E-选择蛋白，HLA，HLA-DR，CTLA-4，T细胞受体，B7-1，B7-2，VNR整联蛋白，TGFbeta1，TGFbeta2，eotaxinl，BLyS(B-淋巴细胞刺激剂)，补体C5，IgE，IgA，IgD，IgM，IgG，因子VII，CBL，NCA 90，EGFR(ErbB-1)，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB4)，组织因子，VEGF，VEGFR，内皮缩血管肽(endothelin)受体，VLA-4，碳水化合物诸如血型抗原和相关碳水化合物，Galili-糖基化，胃泌素，胃泌素受体，肿瘤相关碳水化合物，半抗原NP-cap或NIP-cap，T细胞受体alpha/beta，E-选择蛋白，P-糖蛋白，MRP3，MRP5，谷胱甘肽-S-转移酶pi(多抗药性蛋白)，alpha-颗粒膜蛋白(GMP)140，地高辛，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶，转铁蛋白受体，类肝素酶I，人心脏肌球蛋白，糖蛋白Ilb/IIIa(GPIIb/IIIa)，人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白，HIV gpl20，HCMV，呼吸道合胞病毒RSV F，RSVF Fgp，VNR整联蛋白，Hep B gpl20，CMV，gpllbllla，HIV IIIB gpl20 V3 loop，呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp，单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白，产气荚膜梭菌毒素和其片段。
本发明优选模块抗体以高亲和力结合所述靶抗原，特别是以高结合和/或低解离率，或高的结合亲合力。通常Kd＜10-9M的结合剂被认为是高亲和力结合剂。根据本发明同样可以提供Kd低于10-6直至10-9M的中等亲和力结合剂，优选与亲和力成熟方法联用。
亲和力成熟是通过其产生对抗原的亲和力增加的抗体的方法。随着抗体的结构变化，包括氨基酸诱变或免疫球蛋白基因部分体细胞突变的结果，产生针对抗原的结合位点的变体，并筛选更大的亲和力。亲和力成熟的模块抗体可以显示比亲本抗体大几个对数级的亲和力。单个亲本抗体可以用于亲和力成熟。可选的对靶抗原具有类似结合亲和力的模块抗体库可以被看作亲本结构，它们被改变以获得亲和力成熟的单个抗体或这类抗体的亲和力成熟库。
本发明优选模块抗体的亲和力成熟变体显示结合亲和力至少10倍增加，优选至少100倍增加。亲和力成熟可用于利用亲代分子的对应库筛选的过程，利用中等结合亲和力的模块抗体来获得Kd＜10-8M的特异性靶结合性和/或IC50＜10-8M的功效的本发明模块抗体。可选的，结合功效或亲和力可以通过本发明模块抗体的亲和力成熟进一步增加，以获得对应于低于10-9M的Kd或IC50的高值，优选低于10-10M或甚至低于10-11M，最优选在皮摩范围。
IC50，亦称为50％饱和浓度，是模块抗体结合功效的测量值。它是在平衡或饱和条件下产生50％最大可能结合的结合剂摩尔浓度。拮抗剂的功效通常由其IC50值定义。对于指定拮抗剂来说，这可以通过确定需要引发激动剂最大结合的半饱和需要的拮抗剂浓度来计算。阐明IC50值有利于比较具有类似效应的抗体或抗体变体的功效；但是通过两种药物拮抗剂产生的剂量反应曲线必须相似。IC50越低，拮抗剂的功效越高，抑制最大生物反应(例如效应物功能或细胞毒活性)需要的药物浓度越低。更低的药物浓度还可能与更少的副作用有关。
通常抗体的亲和力与IC50密切相关。拮抗剂对其结合位点的亲和力(Ki)，被认为是其结合受体的能力，这决定了结合和相应激动剂活性的持续时间。通过亲和力成熟增加亲和力的措施通常还增加结合功效，导致Kd值相同范围内IC50值的相应降低。
可以利用本领域公知的饱和结合分析法测定IC50和Kd值。
本发明的模块抗体优选与标记或报告分子偶联，所述标记或报告分子选自有机分子，酶标记，放射性标记，有色标记，荧光标记，生色标记，发光标记，半抗原，地高辛，生物素，金属复合物，金属，胶体金和其混合物。例如在分析系统或诊断方法中可以使用与标记或报告分子偶联的改造免疫球蛋白。
本发明的模块抗体可以与其它分子偶联，这允许在例如结合分析法(例如ELISA)和结合研究中方便地检测所述偶联物。
在优选实施方案中，利用一种或更多种基于细胞的或体内分析法筛选抗体变体。对于这类分析法来说，通常外源添加纯化或未纯化的改造免疫球蛋白，这样的话将细胞暴露于属于一个文库的单个免疫球蛋白或免疫球蛋白库。这些分析法通常是，但不总是，基于免疫球蛋白的功能；即，抗体结合其靶和调节一些生化事件的能力能力，例如效应物功能，配体/受体结合抑制，凋亡，等等。这类分析法通常包括监测细胞对抗体的应答，例如细胞存活率，细胞死亡，细胞形态学的变化，或转录活化诸如天然基因或报告基因的细胞表达。例如，这类分析法可以检测抗体变体引发ADCC，ADCP或CDC的能力。对于一些分析法来说，除了靶细胞之外可能需要添加其它细胞或元件，例如血清补体，或效应细胞诸如外周血单核细胞(PBMCs)，NK细胞，巨噬细胞，等等。这类其它细胞可以来自任意生物体，优选人，小鼠，大鼠，兔，和猴。模块抗体可以造成表达靶的一些细胞系的凋亡，或它们可以介导已经添加到分析法中的免疫细胞对靶细胞的攻击。用于监测细胞死亡或活性的方法是本领域已知的，包括使用染料，免疫化学制品，细胞化学制品，和放射性试剂。例如，半胱天冬酶染色分析法可能检测凋亡，放射性底物或荧光染料诸如alamar blue的摄取或释放可以监测细胞生长或或活化。
在优选实施方案中，可以使用基于DELFIART EuTDA的细胞毒性分析法(Perkin Elmer，MA)。
可选的，可以通过检测一种或更多种天然胞内成分例如乳酸脱氢酶的释放来监测死亡或损伤的靶细胞。
在基于细胞的分析法中转录活化也可以用做分析功能的方法。在这种情况下，可以通过分析天然基因或免疫球蛋白(其可以被上调)来监测应答，例如可以检测一些白介素的释放，或可选的通过报告构建体来进行读数。基于细胞的分析法还可以涉及检测细胞的形态改变作为对模块抗体存在的应答。用于这类分析法的细胞类型可以是原核或真核的，可以使用本领域已知的各种细胞系。可选的，使用已经转化或转染编码变体的核酸的细胞进行基于细胞的筛选。也就是说，不向细胞外源添加抗体变体。例如，在一个实施方案中，基于细胞的筛选利用细胞表面展示。可以使用融合伴侣以便在细胞表面展示改造的免疫球蛋白(Wittrup，2001，Curr Opin Biotechnol，12：395-399)。
在优选实施方案中，可以利用一种或更多种基于细胞的分析法通过实验确定模块抗体的免疫原性。在优选实施方案中，使用体外(ex vivo)T细胞活化分析法实验定量免疫原性。在该方法中，利用感兴趣的肽或全抗体攻击来自匹配供体的抗原呈递细胞和初始T细胞一次或更多次。然后，可以利用多个方法检测T细胞活化，例如通过监测细胞因子的产生或检测氚化胸腺嘧啶的摄取。在最优选实施方案中，使用Elispot分析法监测干扰素gamma的产生。
可以在细胞、组织和完整生物体实验中体外(ex vivo)表征本发明模块抗体的生物学特性。如本领域所知，药物经常在动物体内检测，包括但不限于小鼠，大鼠，兔，狗，猫，猪，和猴，以便检测药物对于治疗疾病或疾病模型的功效，或检测药物的药代动力学，药效学，毒性和其它特性。所述动物可以被称为疾病模型。治疗剂经常在小鼠检验，包括但不限于裸鼠，SCID小鼠，异种移植小鼠，和转基因小鼠(包括敲入(knockins)和敲除(knockouts))。这种实验可提供有价值的数据用于确定具有合适半衰期，效应物功能，凋亡活性，细胞毒或溶胞活性的用做治疗剂的抗体的潜力。任意生物体，优选哺乳动物哺乳动物，可以用于检测。例如因为灵长类动物猴与人的遗传相似性，猴是合适的治疗模型，因此可以用于检测本发明模块抗体的功效，毒性，药代动力学，药效学，半衰期，或其它特性。物质在人类中的试验最终需要药物许可，因此当然预期会有这些实验。因此可以在人中检测本发明的模块抗体以确定它们的治疗效果，毒性，免疫原性，药代动力学，并且其它临床特性。在细胞靶向和交联时，尤其是通过至少两个结合基元结合单细胞或细胞复合物(优选结合至少三个结构交联的靶细胞)的本发明模块抗体被认为在效应物活性或预凋亡或凋亡活性方面是有效的。多价结合提供结合伴侣的相对较大结合(也称为交联)，这是凋亡和细胞死亡的先决条件。
本发明的模块抗体可用于各种各样的抗体产物。在一个实施方案中，本发明的模块模块抗体用于治疗或预防，例如作为主动或被动的免疫疗法，用于制备、工业或分析用途，作为诊断剂、工业化合物或研究试剂，优选作为治疗剂。模块抗体可用于单克隆或多克隆的抗体组合物。在优选实施方案中，本发明的模块抗体用于捕获或杀伤载有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在备选实施方案中，本发明的模块抗体用于阻断，拮抗，或激动靶抗原，例如通过拮抗细胞因子或细胞因子受体。
在备选实施方案中，本发明的模块抗体用于阻断，拮抗，或激动生长因子或生长因子受体，从而介导杀伤载有或需要靶抗原抗原的靶细胞。
在选择性优选实施方案中，本发明的模块抗体用于阻断，拮抗，或激动酶和酶的底物。
在优选实施方案中，给患者施用模块抗体以治疗特定病症。用于本发明目的的“患者”包括人和其它动物，优选哺乳动物和最优选人。本文“特定病症”表示可以通过施用包括本发明改造免疫球蛋白的药物组合物得到改善的病症。
在一个实施方案中，本发明的模块抗体是给患者施用的唯一治疗活性剂。可选的，本发明的模块抗体与一种或更多种其它治疗剂联合施用，包括但不限于细胞毒剂，化疗剂，细胞因子，发育抑制剂，抗激素剂，激酶抑制剂，抗血管生成剂，保心药，或其它治疗剂。模块抗体可以与一种或更多种其它治疗方式同时施用。例如，本发明的模块抗体可以与化疗，放疗，或化疗和放疗一起给患者施用。在一个实施方案中，本发明的模块抗体可以与一种或更多种抗体(可以包括或不包括本发明的模块抗体)联合施用。根据本发明的另一实施方案，使用本发明的模块抗体和一种或更多种其它抗癌疗法在体外治疗癌细胞。预期这类体外治疗可用于骨髓移植，尤其是自体骨髓移植。当然可以想到本发明的抗体可与其它治疗技术诸如手术联合使用。
发现各种其它治疗剂可用于和本发明的模块抗体一起施用。在一个实施方案中，模块抗体与抗血管生成剂(其是在一定程度上阻断或干扰血管发育的化合物)一起施用。抗血管生成因子可以是，例如，小分子或蛋白，例如抗体，Fc融合分子，或细胞因子，它们结合参与促进血管发生的生长因子或生长因子受体。本文优选抗血管生成因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。在备选实施方案中，模块抗体与诱导或增强获得性免疫应答的治疗剂(例如靶向CTLA-4的抗体)一起施用。在备选实施方案中，改造的免疫球蛋白与酪氨酸激酶抑制剂(其是在一定程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子)一起施用。在备选实施方案中，本发明的模块抗体与细胞因子一起施用。本文使用的“细胞因子”是细胞群释放的蛋白通称，它们作为细胞间的介质作用于另一细胞，包括趋化因子。
还包括药物组合物，其中本发明的模块抗体和一种或更多种治疗活性剂被一起配制。通过将具有所需纯度的所述免疫球蛋白与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂采用冻干剂或水溶液的形式制备本发明模块抗体的稳定制剂以便保存。用于体内施用的制剂优选是无菌的。这可以通过过滤除菌膜进行过滤或其它方法轻易地实现。本文公开的模块抗体和其它治疗活性剂还可以配制为免疫脂质体，和/或包括在微胶囊中。
包括本发明模块抗体的药物组合物(优选采用无菌水溶液的形式)的施用，可以各种方式完成，包括但不限于，口服，皮下，静脉内，鼻内，intraotically，经皮肤，粘膜，表面局部(topically)(如，凝胶，膏剂，洗剂，霜剂，等等)，腹腔内，肌内，肺内(例如，购自Aradigm的AERx TM可吸入技术，或购自Inhale Therapeutics的InhanceTM肺部输送系统)，阴道，肠胃外，直肠，或眼内。
本发明优选方法涉及编码免疫球蛋白、免疫球蛋白区或其部分的随机改造的核酸分子，其在结构环编码区内包括至少一个核苷酸重复单元，具有序列5′-NNS-3′，5′-NNN-3′，5′-NNB-3′或5′-NNK-3′。在一些实施方案中，改造的核酸包括选自以下的核苷酸密码子：TMT，WMT，BMT，RMC，RMG，MRT，SRC，KMT，RST，YMT，MKC，RSA，RRC，NNK，NNN，NNS或其任意组合(根据IUPAC进行编码)。
通过向核酸的更大部分导入合成的寡核苷酸或通过完整核酸分子的从头合成可以进行核酸分子的改造。如果将编码氨基酸的亚组，则利用三核苷酸结构单元(其将减少无义序列组合的数目)进行核酸的合成(例如Yanezet al.Nucleic Acids Res.(2004)32：el58；Virnekas et al.Nucleic Acids Res.(1994)22：5600-5607)。
随机改造的核酸分子可以包括上述鉴定的重复单位，其编码所有已知天然存在的氨基酸或其亚组。包含改造序列的那些文库(其中氨基酸的特定亚组用于改造目的)被称为“集中型”文库。这类文库的成员在改造位置具有这类亚组的氨基酸的概率增加，其比正常高至少两倍，优选高至少3倍或甚至至少4倍。这类文库还具有受限或更少数目的文库成员，这样的话实际文库成员的数目达到理论文库成员的数目。一些情况下集中型文库的文库成员数目不低于103倍理论数目，优选不低于102倍，最优选不低于10倍。
通常本发明的文库包括至少10个融合蛋白或潜在结合剂或支架蛋白的变体，优选至少100个，更优选至少1000个，更优选至少104个，更优选至少105个，更优选至少106个，更优选至少107个，更优选至少108个，更优选至少109个，更优选至少1010个，更优选至少1011个，直至1012个，就体外展示法(诸如核糖体展示)来说，甚至更高的数目也是可能的。
在制备编码随机化文库的基因方面存在各种选择。有可能通过完全合成法产生DNA，其中序列被分成重叠片段，所述片段随后作为合成寡核苷酸被制备。将这些寡核苷酸一起混合，通过首先加热到约100℃然后缓慢冷却到室温彼此退火。在该退火步骤后，合成组装的基因可以被直接克隆，或在克隆前先通过PCR扩增。
可选的，可以使用其它定点诱变的方法产生文库插入物，诸如Kunkel方法(Kunkel TA.Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.1985Jan；82(2)：488-92)或Dpnl方法(Weiner MP，Costa GL，Schoettlin W，Cline J，Mathur E，Bauer JC.Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chainreaction.Gene.1994 Dec 30；151(1-2)：119-23.)。
对于各种目的来说，将沉默突变导入编码文库插入物的序列是有利的。例如，可以导入限制性酶切位点，这有利于序列部分的克隆或模块交换。用于导入沉默突变的另一实例是“标记”文库的能力，这表示在筛选的位置给予它们特定的密码子，允许它们(或源自它们的筛选的克隆)例如在后续步骤期间被识别，其中例如具有不同特征的不同文库可以混合在一起，用做筛选或淘选步骤中的混合物。
本发明还提供一种产生结合靶的模块抗体结构域寡聚体的方法，包括以下步骤：
-提供如本发明方法所述产生的模块抗体结构域寡聚体文库
-在支架配体存在的条件下将所述文库与所述靶接触
-筛选支架配体存在条件下与所述靶结合的文库成员，和
-制备功能性寡聚体的制品。
支架配体可以选自效应分子、FcRn、蛋白A和CDR靶。举例来说，效应分子可以选自CD64，CD32，CD16，Fc受体。
寡聚体可以是选自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，Fc和Fab，或其单链的二聚体。
本发明的方法可以提供包含至少102个表达模块抗体结构域或其变体的功能性寡聚体的独立克隆的文库。
本发明使用的文库优选包括至少102个文库成员，更优选至少103个，更优选至少104个，更优选至少105个，更优选至少106个文库成员，更优选至少107个，更优选至少108个，更优选至少109个，更优选至少1010个，更优选至少1011个，直至1012个文库成员，它们优选源自亲代分子(其是作为包含至少一种特定功能或结合部分的支架的功能性模块抗体)，和其衍生物以改造除了所述亲本部分的原始功能性结合区以外的新结合位点。
通常本发明的文库进一步包含由诱变或随机化技术产生的模块抗体的变体。这些变体包括无活性或无功能的抗体。因此，优选用合适的分析法筛选任意这类文库以确定功效。本发明优选文库包括至少102个这类模块抗体的变体，更优选至少103个，更优选至少104个，更优选至少105个，更优选至少106个，更优选至少107个，更优选至少108个，更优选至少109个，更优选至少1010个，更优选至少1011个，直至1012个变体或更多以提供极其多样的抗体的所有组成成分用于筛选最适合的结合剂。可以利用本文公开的诱变方法产生任意这类合成文库。
优选文库是酵母文库，酵母宿主细胞在细胞表面显示具有生物活性的寡聚体或形成寡聚体的单体。酵母宿主细胞优选选自酿酒酵母属，毕赤酵母属，汉逊氏酵母属，裂殖酵母属，克鲁维酵母属，耶罗威亚酵母属和假丝酵母属。最优选，宿主细胞是毕赤酵母或酿酒酵母。
本发明进一步提供一种包含至少102个模块抗体结构域或其变体(它们与靶结合并与支架配体结合)的功能性二聚体的独立克隆的高质量文库。靶可以是结合经受氨基酸变异的亲代分子的配体。亲代分子可以是功能性寡聚体，尤其是功能性Fc或功能性Fab或其部分。
如本领域公知的，存在各种展示和筛选技术，它们可用于鉴定和分离具有某些结合特征和亲和力的蛋白，包括，例如，展示技术诸如细胞和非细胞的，尤其是移动展示系统。在细胞系统中可以使用噬菌体展示，病毒展示，酵母或其它真核细胞展示，诸如哺乳动物或昆虫细胞展示。移动系统涉及可溶形式的展示系统，诸如体外展示系统，其中包括核糖体展示、mRNA展示或核酸展示。
用于产生和筛选抗体变体的方法是本领域公知的。抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法描述于Antibody Engineering，Duebel&Kontermann编辑，Springer-Verlag，Heidelberg，2001；和Hayhurst&Georgiou，2001，Curr Opin Chem Biol 5：683-689；Maynard&Georgiou，2000，Annu RevBiomed Eng 2：339-76。
本发明的文库可以被设计为专用文库，其包含至少50％的特定形式，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，或主要由特定的抗体形式组成的那些。这类优选文库主要包含具有类似结构特征的相同种类的文库成员。特定的抗体形式是优选，这样的话本发明优选文库选自VH文库，VHH文库，Vkappa文库，Vlambda文库，Fab文库，CH1/CL文库，Fc文库和CH3文库。特征在于包含超过一个抗体结构域的混合分子内容物的文库(诸如IgG文库或Fc文库)是特别优选。其它优选文库是包含T细胞受体(形成T细胞受体文库)的那些文库。进一步优选文库是表位或肽文库，其中融合蛋白包括具有表位变体的分子，以便筛选结合性能类似但功能不同的竞争性分子。示例是TNFalpha文库，其中TNFalpha融合蛋白的三聚体由单个基因包展示。
本发明的另一个重要方面是，每个潜在结合结构域仍与特定DNA或其编码的RNA分子物理结合，此外，融合蛋白在基因包的表面寡聚体化以呈现天然和功能性低聚结构的结合多肽。一旦鉴定出成功的结合结构域，就可以非常容易的获得基因用于表达、重组或进一步的改造目的。这种结合采用的形式是“复制型基因包”，诸如病毒、细胞或孢子，它们复制并表达编码结合结构域的基因，然后将结合结构域输送到其外表面。另一形式是体外复制型基因包，诸如连结编码RNA与翻译蛋白的核糖体。在核糖体展示中，遗传物质通过聚合酶的酶扩增进行复制。
载有识别靶分子的结合剂的那些细胞或病毒核酸被分离和，必要时，被扩增。基因包优选是M13噬菌体，蛋白包括M13基因III蛋白的外表面输送信号。
优选在本发明的方法中，基因包的载体或质粒在转录调控元件的严密控制下，调节培养条件以便在颗粒表面展示少于两个拷贝融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量或数低于约20％。更优选，展示低于两个拷贝融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量低于展示一个或更多个拷贝融合蛋白的颗粒量的10％。最优选所述量低于1％。
本发明使用的表达载体优选能够表达结合多肽，可以如下产生：首先通过引入多个编码不同结合序列的多核苷酸，合成结合多肽基因文库。可以合成合适量的多个多核苷酸，将其以可操作的组合方式连接入载体，通过载体增殖来表达所述结合多肽的融合蛋白。可选的还可以通过聚合酶链式反应扩增多个多核苷酸以获得足够的材料用于表达。但是，这只在结合多肽由大的多核苷酸序列(例如长于200个碱基对，或有时长于300碱基对)编码的情况下才是有利的。因此，优选形成多样性合成文库，使得可以从所述多样性文库筛选至少一种能够产生具有所需预选功能和结合性(诸如特异性)的结合多肽的表达载体。
参照下列实施例将更全面的理解上述描述。但是，这类实施例仅仅是代表实施本发明一种或更多种实施方案的方法，不应被当作限制本发明的范围。
实施例
实施例1：构建非集中型Fcab文库(Fcab01)和进行噬菌体表面展示
IgG1 Fc片段的晶体结构公开于Brookhaven Database，登录号为lOQO.pdb，用它帮助设计Fcab文库。
用做构建Fcab文库的基础的序列在SEQ ID No.1中给出。在该序列中，第一个氨基酸对应于人IgG1的Glu 216(EU编号；根据IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html；2007年6月25日查询)，它是人IgG1铰链区(指定为人IgG1重链恒定铰链区的(E)PKSCDKTHTCPPCP)的第一个残基。SEQ IDNo.1的倒数第二个残基对应于人IgG1的Gly 446(EU编号；IMGT：人IgG1CH3结构域的残基号129)。
在仔细分析loqo.pdb的结构和目测检查形成连接beta链的环的残基后，决定将残基144，145和146(它们属于连接beta链A-B的环的一部分)以及198，199，200，203和204(它们属于连接SEQ ID No.1的beta链E-F的环的一部分)随机化。除突变残基之外，在SEQ ID No.1的残基号198处插入5个残基。在SEQ ID No.2中，给出文库Fcab01的文库插入物的序列，其中所有随机化的残基位置以及5个插入残基用字母X表示。
利用简并引物通过一系列PCR反应、之后将所获PCR产物连接来产生工程化基因。为了促进连接，对编码SEQ ID No.1的核苷酸序列的一些密码子进行修饰，以产生限制性酶切位点但不改变氨基酸序列(沉默突变)。为了插入克隆载体pHEN1(Nucleic Acids Res.1991 Aug 11；19(15)：4133-7Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage：methodologies fordisplaying antibody(Fab)heavy and light chains.Hoogenboom HR，GriffithsAD，Johnson KS，Chiswell DJ，Hudson P，Winter G.)，与pelB分泌信号位于同一读框中，使用靠近pelB分泌信号3′末端的NcoI限制性酶切位点。对于随机化的残基，使用密码子NNS(IUPAC编号，其中S表示核苷酸C和G)，其编码所有20种天然存在的氨基酸，但避开了3种终止密码子中的2种。还可以使用其它密码子诸如NNB(B表示核苷酸T、C和G)。工程化的序列在SEQ ID No.3的核苷酸序列中给出。该序列还包括用于克隆入噬菌粒展示载体pHEN1的限制性酶切位点，即5′端的NcoI位点和3′端的NotI位点。
用于组装突变CH3结构域的PCR引物序列在SEQ ID No.4到SEQ IDNo.9中给出。
SEQ ID No.4(PCR引物EPKSNCO)
ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc
SEQ ID No.5(PCR引物CH3LSAC)
agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg
SEQ ID No.6(PCR引物CH3CSAC)
gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg
SEQ ID No.7(PCR引物CH3CHIN)
tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg
SEQ ID No.8(PCR引物CH3RHIN)
tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg
SEQ ID No.9(PCR引物CH3RNOT)
agttgcggccgctttacccggagacagggagag
图1显示为组装突变基因而生成的PCR片段及其所用的引物。
人单克隆抗体3D6的重链cDNA(Felgenhauer M，Kohl J，Ruker F.Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-chainsof a human mono-clonal antibody specific to HIV-l-gp41.Nucleic Acids Res.1990 Aug 25；18(16)：4927)被用作PCR反应的模板。分别利用SacI和/或HindIII消化3个PCR产物，然后将其连接到一起。连接产物进一步用NcoI和NotI消化，然后连接入先前已经用NcoI和NotI消化的表面展示噬菌粒载体pHEN1中。然后通过电穿孔将连接产物转化入大肠杆菌。通过限制性分析和DNA测序控制多个选出的克隆，发现其中包含按计划的插入物，包括正确插入的随机化序列。对于下列噬菌体制备步骤，遵循标准步骤。简单来说，通过电穿孔将连接混合物转化入大肠杆菌TG1细胞。随后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞挽救(rescued)噬菌体颗粒。然后采用2步法利用PEG/NaCl从培养上清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于通过淘选法来选择，或可选的，将其保存于-80℃。
实施例2：构建集中型Fcab文库(Fcab02)和进行噬菌体表面展示
如实施例1所述，制备Fcab文库，其中随机化文库位置是完全随机的，即它们由密码子诸如NNS、NNB、NNK、NNN编码，或使用其它密码子。
为了清楚起见，字母诸如N、B、S或K的含义由IUPAC核苷酸模糊编码(ambiguity code)定义，这在下表中列出：
表1.IUPAC核苷酸模糊编码
Figure GPA00001037505500361
来源：Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences：recommendations 1984.A Cornish-Bowden，Nucleic Acids Res.1985 May 10；13(9)：3021-3030。
上面列出的这些密码子被设计为使得所有20种氨基酸都由它们编码。从可能的氨基酸中选择亚组有可能更好。实例可以参见文献(Fellouse FA，LiB，Compaan DM，Peden AA，Hymowitz SG，Sidhu SS.Molecular recognition bya binary code.J MoI Biol.2005 May 20；348(5)：1153-62.Epub 2005 Apr 1.；Fellouse FA，Wiesmann C，Sidhu SS.Synthetic antibodies from afour-amino-acid code：a dominant role for tyrosine in antigen recognition.ProcNatl Acad Sci U S A.2004 Aug 24；101(34)：12467-72.Epub 2004 Aug 11.)。例如通过使用密码子KMT(其编码氨基酸Ser、Tyr、Ala和Asp)可以构建例如只允许4种不同氨基酸类型的集中型文库。
除了NNS密码子被替换为KMT密码子之外，按照与实施例1描述的相同方式构建出集中型Fcab文库(命名为Fcab02)。
因此，SEQ ID No.2中的字母“X”现在表示“S，Y，A和D”(Ser，Tyr，Ala和Asp)以便描述集中型文库Fcab02。
实施例3：构建噬菌体表面展示文库，其在文库插入物(结合伴侣)和p3之间具有额外氨基酸残基
为了研究所展示蛋白的潜在结合位点的易接近性，进行结合分析法：将噬菌体悬浮液与抗myc mAb 9E10包被的微板(或免疫管(immunotubes))反应。清洗后，利用抗M13酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和myc-标签)与板反应。其它对照是噬菌体与未包被板的反应，以及噬菌体与识别噬菌体的p3融合伴侣的抗血清的反应。
理论上，展示p3融合蛋白的噬菌体的抗myc反应型应当给出非常清楚的ELISA读数，而针对抗myc-mAb的辅助噬菌体反应不应高于背景(未包被板)。通过结合作为锚(anchor)的蛋白III而在M13噬菌体表面展示的CH3二聚体的结构是这样的，每个CH3利用具有不同长度和组成的接头锚定到蛋白III。因此，CH3二聚体优选通过两个锚来展示。
接头优化：
如果所展示分子的潜在结合位点在空间上靠近噬菌体颗粒，则位于待展示蛋白和基因包锚定蛋白(在丝状噬菌体情况下，例如p3，p8，pX，pIX，pVII)之间的接头是尤其重要的。在利用由CDR环形成的可变区和抗原结合位点、并将库成员展示为p3的氨基端融合物的抗体文库中，潜在的抗原结合位点指向背离噬菌体颗粒的方向。因此，库成员和噬菌体外壳蛋白之间的接头结构不太重要。但是改造免疫球蛋白区的底部环和进行噬菌体展示可能是一种低效步骤，降低抗原结合克隆的产率或甚至排斥它。改变库成员蛋白与其融合伴侣之间位于表面的接头可以解决或可能至少减少该问题。
为了选择(在长度和柔性以及稳定性方面)最佳的接头序列，可以制备接头文库，在其中将复制型基因包表面的锚定蛋白与因空间原因而出了名地难于选择的已知结合蛋白融合。该文库的序列可以在长度和氨基酸含量方面不同。
在接头文库中选择最佳接头的方法取决于用途，但基本上应当是选择在某一方法学中希望具有的所有特性的方法。针对难于选择的抗原进行的富集可以产生允许库成员容易地接近该抗原的接头序列。在蛋白酶溶液中或其它苛刻条件下进行温育，或者在蛋白水解条件下(例如用老龄的微生物培养物)通过宿主细胞进行频繁传代，可以是稳定展示接头的合适选择法。
接头文库可通过任何公知的文库技术产生。合成的接头序列长度可以为10-500个氨基酸不等。可选的，接头可以是已知具有柔性的完整蛋白。
接头优化Fcab01：
举例来说，可以使用文库Fcab01(如实施例1所述)。首先，利用NcoI和NotI限制性酶切位点将该文库克隆入噬菌粒展示载体pHEN1。当采用这种方式克隆时，18个氨基酸残基位于Fcab01文库插入物的C端氨基酸残基与噬菌体M13 p3的N端氨基酸残基之间。该连接区的序列在SEQ ID No.10SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES中给出，解释如下：前4个残基SPGK是Fcab01文库插入物的4个C端残基，然后是氨基酸序列AAA(其是由NotI限制性酶切位点编码的氨基酸残基)，然后是序列EQKLISEEDL(其是myc表位)，然后是NGAA，其后存在一个UAG终止密码子，该终止密码子在大肠杆菌的琥珀抑制者菌株诸如TG1中被翻译为谷氨酰胺(Q)。SEQ IDNo.10的C端4个残基TVES是存在于载体pHEN1中的噬菌体M13 p3的N端4个残基。
为了构建展示Fcab插入物、且Fcab(结合伴侣)与噬菌体(基因包)之间的距离增加的噬菌体，将5个额外残基插入Fcab插入物FcabRGD4的C端，在紧接NotI克隆位点的上游，产生克隆FcabRGD4L。FcabRGD4是一种Fcab，其在CH3结构域的EF环中插入了能与整联蛋白结合的RGD基元，并且在ELISA中结合ανβ3-整联蛋白。作为长度增加的接头序列，使用氨基酸序列EGGGS，其在噬菌体M13p3序列中出现8次。所获FcabRGD4L氨基酸序列在克隆入pHEN1后表达为SEQ ID No.11。在SEQ ID No.11中，氨基酸残基198-204代表RGD基元，氨基酸残基237是Fcab插入物的C端残基，残基238-242代表插入的接头序列(其与未改造的pHEN1不同)，其后是myc标签、UAG终止密码子和p3序列。
为了克隆构建体，利用PCR引物EPKSNCO(SEQ ID No.4)和CH3rlinkactagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag(SEQ ID No.13)从pHENFcabRGD4(SEQ ID No.12)扩增FcabRGD4序列，并通过NcoI和NotI限制性酶切位点将其克隆入载体pHEN1。所获载体pHENFcabRGD4L(SEQID No.14)在核苷酸3057-3071位处具有额外的接头序列。
将两种噬菌粒载体pHENFcabRGD4和pHENFcabRGD4L转化入大肠杆菌TG1。随后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞挽救噬菌体颗粒。然后按照2步法利用PEG/NaCl从培养上清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于ELISA。
如下进行噬菌体ELISA：
噬菌体悬浮液与包被ανβ3-整联蛋白的微板(或免疫管)反应。清洗后，利用抗M13酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和myc-标签)与板反应，以及表面载有wtFcab的噬菌体颗粒与板反应。其它对照是噬菌体与未包被板的反应，以及噬菌体与识别噬菌体的Fcab融合伴侣的抗血清的反应。与具有pHENFcabRGD4包含的原始接头的噬菌体颗粒相比，具有源于pHENFcabRGD4L的增长接头的噬菌体颗粒更容易与ανβ3-整联蛋白反应，从而在ELISA中产生更强的信号。
可以进行噬菌体筛选，其中将具有wtFcab的噬菌体颗粒与少量载有FcabRGD4或FcabRGD4L的噬菌体颗粒混合。在数轮(通常3-5轮)淘选后，优先选出展示FcabRGD4L的噬菌体。
实施例4：Fcab文库设计
(″Fcab″是f-star Biotechnologische Forschungs-und Entwicklungsges.m.b.H.的注册商标)
Fcab文库的设计(在图2中显示)：抗体CH3恒定区的非CDR环中的氨基酸位置被考虑进行随机化。环A-B、C-D和E-F是特别被考虑的，因为它们都位于结构域的一侧。在具体位置随机化的一些设计标准在本文描述。
频繁参与抗原抗体相互作用的氨基酸在本文中被描述为包括在集中型文库中。本文中氨基酸Ala、Asp、Ser和Tyr用于设计集中型文库。
具有受限的氨基酸应用的文库已经被证明足以产生实质上抗任何抗原的结合剂(Sidhu&Fellhouse，NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2page 682ff；Koide et al PNAS，volume 104 p6632-6637)。这类受限(或集中型)文库的优点是它们完全可以用当前的技术手段来实现。理论上，氨基酸应用反映了配体受体结合的天然氨基酸应用。但是，即使只利用2种氨基酸(酪氨酸和丝氨酸)的文库据报道也得到较好的筛选结果(在抗不同结合剂的结合剂频率以及在亲和力方面)。
环的柔性：
支架蛋白可能需要一些环结构以便总体上维持天然结构。在随机化位置的一侧或双侧构建一些序列有可能促进环中多个氨基酸位置的随机化甚至环的延长。这些序列可以是柔性的序列，以便允许弥补这类位置中一些文库序列的任何张力。
表2：示例性的FcabTM文库，集中型和非集中型的
  随机化位置的编号   氨基酸水平的理论多样性   独立的细菌克隆的数目
  Fcab01   13   8.2x1016   0.6x109
  Fcab02   13，集中型的   6.7x107   0.6x109
  Fcab03   13   8.2x1016   1.0x109
  Fcab04   13，集中型的   6.7x107   1.0x109
  Fcab05   13   1.3x1018   0.8x109
  Fcab06   13，集中型的   1.3x1018   1.0x109
Fcab01文库在以上实施例中描述。集中型文库设计Fcab02、Fcab04和Fcab06的序列空间被大约10e9的实际细菌文库大小覆盖。与此相反，完全随机化的文库Fcab01、Fcab03和Fcab05事实上远远未能被充分代表。
实施例5：通过同源重组来克隆酵母展示文库
载体
使用载体pYD1(Invitrogen)作为基础载体。如下修饰载体，以便去除XhoI位点：用XhoI切割pYD1，再用DNA聚合酶的Klenow片段处理，然后重新连接。所获序列在pYD1dX(SEQ ID No.15)中给出。
pYD1dX在921/925位包含独特的BamHI限制性酶切位点，在963/967位包含独特的NotI限制性酶切位点。它被这两种限制性内切酶打开。
从编码人IgG1单克隆抗体重链的cDNA通过PCR制备编码人IgG1CH1-铰链-CH2-CH3的插入物。在该插入物中，利用标准方法引入点突变以将CH1结构域的C端半胱氨酸残基突变为丝氨酸。利用分别将BamHI和Not限制性酶切位点连接到两个末端的PCR引物扩增插入物。然后使用这些限制性酶切位点将插入物克隆入pYD1dX以得到展示载体pYD1dXFc(SEQ Id No.16)。CH1结构域C端的突变密码子(Cys到Ser)是序列pYD1dXFc中的1233-1235位。插入物的终止密码子是1917/1919位。
该载体被用作在酵母表面展示人CH1-铰链-CH2-CH3的阳性对照，还被用做构建载体pYD1CH12的起点(见下文)。
文库的克隆
在酵母中通过同源重组(缺口修补)进行文库的克隆，其中突变被引入CH3结构域的结构环中。为此，制备不包含CH3结构域的受体载体：pYD1dXFc用XhoI切割(1603/1607位)和用NotI切割(1921/1925位)，通过制备型凝胶电泳来制备大的片段，然后用DNA聚合酶的Klenow片段处理，并重新连接。该方法重建了独特的XhoI位点(1603/1607位)，并得到载体PYD1CH12(SEQ ID No.17)。pYD1CH12随后用XhoI切割，并被用做酵母中用于缺口修补的受体载体。
使用Fcab文库Fcab01(SEQ ID No.18)，Fcab02(SEQ ID No.19)，Fcab03(SEQ ID No.20)，Fcab04(SEQ ID No.21)，Fcab05(SEQ ID No.22)和Fcab06(SEQ ID No.23)作为插入物的来源。这些文库通过标准DNA合成法制备，在人IgG1 CH3结构域的AB环(残基359和361之间(EU编号))以及EF环(残基413和419之间(EU编号))中包含随机化残基以及插入残基。从该合成的DNA出发，利用PCR引物对gapch35 caacaaggccctgcctgcccccat cgagaagaccatctccaaggccaagggccagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgccc(SEQ ID No.24)和gapfcs3gagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagactcgatcgagcggccgctcatttacc cggagacagggagagctc ttc(SEQ ID No.25)通过PCR扩增用于酵母中缺口修补的插入物。将100μg经XhoI切割的载体pYD1CH12和100μg插入物混合，然后根据下列方案(其按100的系数放大以转化所需量的细胞和DNA)使用醋酸锂法转化酿酒酵母株EBY100(Invitrogen)。简而言之，对于1μg载体DNA和1μg插入DNA的单次转化来说，用一个酵母菌落接种10ml YPD(2％蛋白胨，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，然后在30℃振摇过夜。测定过夜培养物的OD600，然后用50ml YPD将所述培养物稀释到OD600为0.4，再培养6个小时。细胞在2500rpm沉淀，将其重悬于40ml蒸馏水中。细胞再在2500rpm沉淀，重悬于100mM LiAc中，然后在30℃温育30分钟，将1μg载体DNA、1μg插入物和50μl变性剪切的鲑精DNA(2mg/ml)与300μl酵母悬液混合。添加700μl 200mM醋酸锂和40％PEG-3350的溶液，将其与酵母/DNA悬液混合，然后在30℃温育30分钟。添加88μl DMSO并混合，将混合物在42℃温育40分钟，然后在微量离心机中离心10秒。然后去除上清，将细胞沉淀物重悬于1ml蒸馏水中。然后将沉淀物重悬于50-100μl TE中，铺在含亮氨酸的基本葡萄糖平板上(10g/l酵母氮碱，20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，15g/l琼脂)。在30℃温育平板2到4天后，出现单菌落，随后收集单菌落。
培养-诱导
将收集的酵母文库(yFcab文库)接种到10ml SD-CAA培养基(10g/l酵母氮碱，10g/l酪蛋白氨基酸和20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，9.67g/lNaH2PO4-2H2O和10.19g/l Na2HPO4·7H2O)，在250rpm的摇床上28℃培养6-8小时。测定培养物的OD600，将该培养物稀释到OD600为0.2，然后在相同条件下培养直至OD600达到1-2。离心(3000rpm/5分钟/4℃)收集细胞，将其重悬于诱导培养基SG/R-CAA(10g/l酵母氮碱，10g/l酪蛋白氨基酸和20g/l半乳糖，10g/l棉子糖，0.1g/l亮氨酸，9.67g/l Na2HPO4-2H2O和10.19g/l Na2HPO4·7H2O)。通过在250rpm的摇床上20℃温育2天来诱导培养物，随后进行分析和分选。
yFcab文库的质量控制。
用SD-CAA培养基诱导两天后检测yFcab文库的表达水平和表达的Fcab′s的质量。利用多克隆抗人IgG-Fc抗血清(Sigma)检测表达水平。为此，将0.5×10e6个文库细胞稀释于1ml染色缓冲液(SB)中，所述染色缓冲液包括含2％BSA的PBS。将细胞沉淀，然后用包含1/2000稀释的抗人IgG-Fc-PE抗血清(Sigma)的100μl SB在冰上染色30分钟，用SB清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上每个文库中所有细胞的70％-80％在其细胞表面表达Fcabs。为了验证Fcabs的正确折叠，进行对蛋白A的染色。再次将0.5×10e6个文库细胞稀释于1ml染色缓冲液SB中，将细胞沉淀并用包含1μg/ml Prot-A-FITC(Fluka)的100μl SB在冰上染色30分钟，用SB清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上，如上所述的yFcab文库显示≥40％的Prot A(蛋白A)阳性细胞。为了检验Fcabs是否在细胞表面表达为二聚体，进行对人CD64的染色。CD64的亲和力对于有效的单体结合来说太低，因此使用含二聚体的CD64复合物。为此，将例如来自R&D Systems的1μg重组CD64(包含HIS-标签)与1μg抗Penta HIS-alexafluor 488(来自Qiagen)在1ml SB(总体积)中混合。通过将5×10e5个细胞与100μl复合-混合物在冰上温育30分钟检测yFcab文库与CD64的结合，将细胞与单独的等量抗HIS-alexafluor 488(按1/200用SB稀释)温育作为对照。温育后，细胞用冷的SB清洗两次，然后在FACS中进行分析。总体上每个文库中所有细胞中＞50％在其细胞表面表达二聚化的Fcabs。
抗原(Her2)的生物素化
按照制造商的说明书，利用Pierce的EZ link system制备重组抗原例如Her2(Bendermedsystems)。简而言之，将所述抗原用PBS透析，然后用PBS稀释到1mg/ml，再与10mM硫代-LC-LC-生物素(EZ link，Pierce)(其预先溶于水中)混合。抗原和生物素的最终比例是1∶3，将混合物在室温下温育30分钟。然后利用Vivaspin MWCO3000(Sartorius)柱(5×8′，4000rpm)将混合物用PBS“透析”。最后通过HPLC检测生物素化抗原(Her2)的浓度，将其等分保存于-20℃。
通过ELISA检测生物素化抗原的质量。首先按照100μl/孔将平板用溶于PBS的10μg/ml Her2抗体(例如Herceptin)在4℃包被过夜，之后平板用清洗缓冲液(WB)(PBS+0.05％Tween20)清洗3次，然后在室温下用封闭缓冲液(BB)(PBS+2％BSA)封闭1小时。用WB清洗3次后，将不同浓度的Her2-生物素添加到100μl/孔BB中置于室温下1小时，然后用WB清洗3次。最后将平板与溶于BB的1∶25000链霉亲和素-HRP(GE healthcare)在室温下温育1小时，然后用WB清洗3次。通过添加100μl/孔的底物TMB(Sigma)显色，在大约10分钟后通过添加100μl/孔的30％H2SO4终止反应。利用ELISA读数器在450-630nm分析结果。
实施例6：抗原特异性(Her2)Fcabs的产生
利用FACS筛选抗原特异性(Her2)Fcabs
第一轮筛选：
在FACSorting前两天，如上所述用SG/R-CAA培养基诱导包含2.5×10e8个单独Fcab克隆的酵母文库以在其细胞表面表达Fcabs。两天后，将包含例如10倍文库(＝2.5×10e9)的细胞量与溶于2ml SB的500nM生物素化抗原(Her2)在冰上温育30分钟。然后将细胞用冷的SB清洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素-PE(来自R&D systems)在冰上温育30分钟。细胞用冷的SB清洗两次，然后稀释到终浓度1×10e9个细胞/ml。对照染色只用链霉亲和素-PE而不用抗原对100μl 5×10e6个细胞/ml进行。在例如来自BD的FACS ARIA中分析完整文库和对照染色。为了进行设置，使用分选对照细胞的门通条件(gate)。首先设置FSC/SSC门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1完成FSC-宽度对FSC-面积的曲线，在新的门(G2)中只选择非聚集细胞。随后利用FSC对FL-2(PE通道)分析G2中细胞与链霉亲和素-PE的反应性。G3被设置为包括0.1％的(假)阳性细胞。随后，利用如上所述的设置分析至少5×10e8个染色细胞(比文库规模大两倍，越大越好)，将G3中的细胞分入包含2-3ml SD-CAA培养基的管中。在第一轮筛选后收集到大约5×10e5个细胞(库1)，将其增殖1到2天，然后将细胞保存在-80℃，可以按照如上所述诱导等分试样以表达Fcabs。再过两天后进行下一轮筛选。
第二轮筛选：
如上所述诱导第1轮筛选的库1在其表面表达Fcab。将至少5×10e6个细胞(包括多拷贝的库1)与溶于1ml SB的500nM生物素化抗原(Her2)在冰上温育30分钟。然后将细胞用冷的SB清洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素-PE(来自R&D systems)以及2μg/ml蛋白A-FITC(Fluka)在冰上温育30分钟。然后细胞用冷的SB清洗两次，然后稀释到终浓度2×10e6个细胞/ml。此外，进行对照染色，其中如上所述将100μl 5×10e6个细胞/ml的库1与Prot A和链霉亲和素-PE的混合物温育，但不与抗原(Her2)温育。此外，在没有链霉亲和素-PE的情况下，将100μl表达Fcab wt非随机化Fc片段的酵母克隆的5×10e5个细胞用如上所述的Prot A-FITC染色。在例如BD的FACS ARIA中设门进行分选来分析表达Fcab-wt的细胞。首先设置FSC/SSC门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1完成FSC-宽度对FSC-面积的曲线，在新的门(G2)中只选择非聚集细胞。
随后利用FSC对FL-1(FITC)分析G2中细胞的蛋白A表达。G3被设置为包括强的Prot A阳性细胞(50-60％的亲本门，G4被设置为包括弱的Prot A阳性细胞(20-30％的亲本细胞)。G3+G4将包括G2中所有细胞的大概70-80％。现在将在Prot A-FITC存在条件下被链霉亲和素-PE染色的库细胞用于设置其余的分选门。首先用库细胞检查G1和G2，在必要时进行调整。库细胞在G3中具有较少的事件，可能在G4中也如此，提示不是所有库1中的细胞表达折叠为Fcab-wt的Fcabs。使用对照染色的库细胞，为了G3和G4制备新的门。在曲线FSC和FL-2(PE)中设置新的门。制备包括G3中0.1％(假)链霉亲和素阳性细胞的门(G5)，对G4中的细胞采取相同方法得到G6。在下一步中通过FACS-ARIA选出至少5×10e6个被Her2-生物素+链霉亲和素-PE和Prot A-FITC染色的细胞。在包含2-3ml酵母培养基的不同管中收集G5(库2.1)和G6(库2.2)的细胞。预期两个门中都有10到1000个克隆。将两个新库增殖1或2天，保存于-80℃。来自2.1和2.2的细胞可用于指导第3轮的进一步分选，或在FACS中被进一步分选前它们可以(优选在将两种克隆再次混合后)经历AB环的另一轮随机化(亲和力成熟)。
所选克隆/库的亲和力成熟
为进行亲和力成熟，向所选克隆或所选克隆的库的AB环中引入多样性。为此，利用在第359、360和361位(EU编号)包含简并密码子的引物(引物Abmut，gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.26)或可选的在第358、359、360、361和362位(EU编号)包含简并密码子的引物(引物Abmut2LR，gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.27)进行PCR。在这两种情况下用于所述PCRs的第二引物是gapfcs3。为了产生用于在酵母中有效缺口修补的侧翼序列，所获PCR产物用引物对gapch35和gapfsc3进一步扩增，然后通过醋酸锂将其与如上述经XhoI切割的pYD1CH12转化酿酒酵母株EBY100。作为AB环中所述残基随机化时用的备选引物，还可以使用引物诸如Abmut1L(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagectgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.28)或Abmut1R(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.29)。采用类似的方式，可以通过完全随机化或通过使用spiked寡核苷酸作为引物进行随机化或通过类似的诱变技术将EF环中的残基随机化。Abmut引物将为每个克隆产生8000个新变体(库2.3)，Abmut2LR引物导致3×10e6个新变体(库2.4)。因此库2.3和2.4均将产生大约10e8个个体的新文库，因为起始原料(库2.1+2.2)已经包含大约10-1000个克隆。
第三轮筛选
亲和力成熟库2.3和2.4以及必要时库2.1(优选只有Prot A阳性细胞)按上述进行诱导，以在其细胞表面表达Fcabs，随后按照“第二轮筛选”的描述进行分选，例外的是库2.3和2.4是更大的，因此库的染色体积等于在“第一轮筛选”中描述的文库染色体积。在第三轮筛选中，只有Her2阳性/Prot A阳性细胞被分选出。从这些选择过程选出的库大都包含＞20％的Her2/Prot A阳性细胞。若不然，进行组合Prot A以及Her2的第四和第五(或甚至更多)轮筛选。
克隆分析：
制备含Her2/Prot A细胞(优选＞20％)的库的单个克隆，方法是，将所述库铺于含SD-CAA培养基的琼脂平板上，或在平板上不产生库而直接经FACS ARIA分选出单细胞(＝克隆)。对这些克隆进行培养，将其转移到液体培养物中，并保存于-80℃。随后如上所述诱导克隆的等分试样以在其细胞表面表达Fcabs，并用多个参数进行FACS筛选。这些参数可以是：在有和没有上述Prot A-FITC、CD64染色的情况下进行筛选所用的抗原(Her2)的剂量应答范围。此外使用类似的染色方案，可以筛选多个无关的生物素化抗原来鉴定非交叉反应性Fcabs。
可以预期，在抗原(Her2)+Prot A阳性细胞的数轮筛选后，这些克隆中有较大百分比例当用500nM抗原(Her2)染色时显示＞25％的抗原(Her2)阳性，当用2μg/ml Prot A-FITC染色时显示＞70％的Prot A阳性。在大多数情况下，这些克隆还显示＞50％的CD64结合。因此模拟在酵母中表达的非随机化Fc片段(Fcab wt)的Prot A和CD64水平。
如上述选出的具有上述特征的克隆现可以制备为可溶性分子。这可以通过将Fcab DNA瞬时转染或稳定转染入新的宿主细胞来实现。为此，使用标准方法从单个酵母克隆分离DNA。通过PCR扩增编码完整CH3结构域或只是CH3结构域的已在文库中被随机化的部分的相关DNA，将其转移入包含Fcab缺失部分(missing part)+合适启动子和多种筛选标记物诸如G418之一(允许从未转染细胞群体中筛选出转染细胞)的新表达载体。然后将所述新载体例如瞬时转染新的宿主细胞诸如HEK293或CHO。回收宿主细胞，然后培养若干天。培养上清包含可溶性的Fcab，其可经或不经例如Prot A纯化就用于进一步检测。还可以通过标准方法制备稳定细胞系。
表2.筛选的Her2克隆的序列：参照Seq.ID No.1的编号
  克隆的名称   AB环AA143ff   EF环AA198ff
  Fcab wt   LTKNQ   -----DKSRWQQ
  克隆的名称   AB环AA143ff   EF环AA198ff
y-Her.C2-P3.1-1   LDNSQ(SEQ ID No.30)   IRSSVGSRRWWS(SEQ ID No.51)
y-Her.C2-P3.1-3   YEGSS(SEQ ID No.31)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.52)
y-Her.C2-P3.1-5   YMSAD(SEQ ID No.32)   SRRDSSLLRWAH(SEQ ID No.53)
y-Her.C2-P3.1-6   YRRGD(SEQ ID No.33)   APGSKGYRRWAL(SEQ ID No.54)
y-Her.C2-P3.1-8   LMSRQ(SEQ ID No.34)   DKPFWGTSRWSR(SEQ ID No.55)
y-Her.C2-P3.1-16   LHLAQ(SEQ ID No.35)   SINDLINHRWPY(SEQ ID No.56)
y-Her.C2-P3.1-18   YLSKD(SEQ ID No.36)   MWGSRDYWRWSH(SEQ ID No.57)
y-Her.C2-P3.2-3   YRSGS(SEQ ID No.37)   NSGSAMMVRWAH(SEQ ID No.58)
y-Her.C2-P3.2-9   LRDGQ(SEQ ID No.38)   QRSRLSRQRWWR(SEQ ID No.59)
  克隆的名称   AB环AA143ff   EF环AA198ff
y-Her.C2.P4.2-1   YSANT(SEQ ID No.39)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-3   YASNT(SEQ ID No.40)   ARYS PRMLRWAH(SEQ ID No.61)
y-Her.C2.P4.2-4   YSDGD(SEQ ID No.41)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.62)
y-Her.C2.P4.2-5   YSGGS(SEQ ID No.42)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.63)
y-Her.C2.P4.2-6   YGRDS(SEQ ID No.43)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.64)
y-Her.C2.P4.2-8   YAGGT(SEQ ID No.44)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.65)
y-Her.C2.P4.2-10   YSSDS(SEQ ID No.45)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.66)
y-Her.C2.P4.2-12   YHSGS(SEQ ID No.46)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.67)
y-Her.C2.P4.2-15   YLTNS(SEQ ID No.47)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.68)
  克隆的名称   AB环AA143ff   EF环AA198ff
y-Her.C2.P4.2-18   YGSEE(SEQ ID No.48)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.69)
y-Her.C2.P4.2-19   YRSGE(SEQ ID No.49)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.70)
y-Her.C2.P4.2-20   YGTDD(SEQ ID No.50)   ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.71)
实施例7：对4D5 Fab的酵母展示
为了在酵母中展示Fab片段，如下改造酵母展示载体pYD1(Invitrogen)(SEQ ID No.72)：
在581/586位通过定点诱变引入Nhel限制性酶切位点以获得改造的载体pYDINhe(SEQ ID No.73)。该载体用NheI和PmeI限制性消化得到3个片段。最大的片段是剩余的载体主链，向其中插入合成的寡核苷酸接头得到载体pYD1lnk(SEQ ID No.74)。然后通过PCR从载体pYD1扩增包括MATα转录终止区的盒，将其通过BamHI和Pstl限制性消化和连接克隆入pYD1lnk。所获载体是pYD1mata(SEQ ID No.75)。通过PCR从pYD1扩增包含GAL1启动子、编码Aga2的基因以及具有NotI和SfiI克隆位点的合成接头的盒，将其通过EcoRI和PacI限制性消化克隆入pYD1mata得到载体pYD1gal(SEQ ID No.76)。
作为在酵母中展示的Fab的实例，合成分别编码抗体4D5(Herceptin)的VH-CH1和VL-CL的基因：序列4D5H(SEQ ID No.77)和4D5L(SEQ IDNo.78)。
4D5H侧翼为SfiI和NotI限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD1gal得到载体pYD4D5hc(SEQ ID No.79)。在该载体中，将4D5H的N端融合到Aga2的C端，并在4D5H的C端连接六聚组氨酸标签，后面是终止密码子。4D5的VH-CH1氨基酸序列在4D5hp(SEQ ID No.80)中给出。
4D5L侧翼为NcoI和Ascl限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD4D5hc得到载体pYD4D5hl(SEQ ID No.81)。4D5L在其前面有一个Aga2分泌信号，并在CL结构域的C端半胱氨酸残基后载有一个终止密码子。4D5的VL-CL氨基酸序列在4D51p(SEQ ID No.82)中给出。
为了展示4D5Fab，将载体pYD4D5hl转化入酵母菌株EBY100(Invitrogen)，在不含色氨酸的基本培养基上筛选转化体，然后按照标准步骤(Invitrogen)通过在包含半乳糖的培养基上生长来诱导重组蛋白的表达。
实施例8：构建文库，其在4D5 Fab CL结构域的结构环中有随机化残基
作为酵母展示文库构建的第一步，利用限制性内切酶BsiWI和AscI从展示载体pYD4D5hl中切割出野生型CL(C kappa)结构域。制备侧翼为BsiWI和AscI位点(在pYD4D5hl的情况下)的编码人C kappa结构域的合成基因，其中在AB和EF环中分别引入随机突变和插入。在该具体实施例中，在人C kappa结构域的16和17位氨基酸之间插入3，4或5个NNB密码子，将第92，93，94，95，97，98和99位残基用NNB密码子取代(IMGT编号，参见图2)。NNB密码子包含位置1和2处的全部4个核苷酸以及位置3处的C、G和T。因此NNB编码全部20种天然编码的氨基酸。
文库按照标准方法进行制备和筛选。
使用CDR靶Her2neu和4D5表位作为支架配体。筛选文库成员用于产生本发明的细胞毒模块抗体，它们在CL结构域中加入了结合位点，所述位点特异性结合效应分子如Fcgamma受体或半衰期已延长的蛋白如血清白蛋白。对所获Fab进行以下测试：(i)以Kd＜10-8M和IC50＜10-8M进行Her2neu结合，和(ii)用CDC和/或ADCC分析效应功能，和可选的确定白蛋白结合。
序列表
<110>F-星生物技术研究与开发有限公司(f-star Biotechnologische Forschungs-und
     Entwicklungsges.m.b.H.)
 
<120>展示结合剂
 
<130>FS9.1
 
<160>82
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>232
<212>PRT
<213>人
 
<400>1
 
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
 
<210>2
<211>237
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>包含随机氨基酸修饰的人IgG
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(144)..(146)
<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(198)..(205)
<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(208)..(209)
<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸
 
<400>2
 
Olu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Oly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Xaa
    130                 135                 140
Xaa Xaa Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Trp Xaa
        195                 200                 205
Xaa Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
    210                 215                 220
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230                 235
 
<210>3
<211>728
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于克隆修饰的IgG的DNA序列
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(438)..(439)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(441)..(442)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(444)..(445)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(600)..(601)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(603)..(604)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(606)..(607)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(609)..(610)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(612)..(613)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(615)..(616)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(618)..(619)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(621)..(622)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(630)..(631)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(633)..(634)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>3
ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg   60
aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga  120
tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg  180
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg  240
aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact  300
ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg  360
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc  420
catcccgtga cgagctcnns nnsnnscaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct  480
atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga  540
ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag cttaccgtgn  600
nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsaggtggn nsnnsgggaa cgtcttctca tgctccgtga  660
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag  720
cggccgca                                                           728
 
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物EPKSNCO
 
<400>4
ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctc                                33
 
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物CH3LSAC
<400>5
agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg                                      30
 
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物CH3CSAC
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(12)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(15)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(18)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>6
gtacgagctc nnsnnsnnsc aagtcagcct gacctgcctg g                        41
 
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物CH3CHIN
 
<400>7
tgccaagctt gctgtagagg aagaaggagc cg                                  32
 
<210>8
<211>59
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物CH3RHIN
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(18)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(24)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(33)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(36)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>8
tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsaggtg gnnsnnsggg aacgtcttct catgctccg      59
 
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物CH3RNOT
 
<400>9
agttgcggcc gctttacccg gagacaggga gag                                  33
 
<210>10
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>连接区
 
<400>10
 
Ser Pro Gly Lys Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
1               5                   10                  15
Leu Asn Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser
            20                  25
 
<210>11
<211>662
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>FcabRGD4L的氨基酸序列
 
<400>11
 
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Olu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Gly Cys Arg Gly Asp Cys Leu Ser Arg Trp Gln
        195                 200                 205
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
    210                 215                 220
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
                245                 250                 255
Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn
            260                 265                 270
Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala
        275                 280                 285
Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr
    290                 295                 300
Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala
305                 310                 315                 320
Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr
            340                 345                 350
Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro
        355                 360                 365
Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu
    370                 375                 380
Ser Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn
385                 390                 395                 400
Arg Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr
                405                 410                 415
Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala
            420                 425                 430
Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His
        435                 440                 445
Ser Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser
    450                 455                 460
Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly
465                 470                 475                 480
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
                485                 490                 495
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser
            500                 505                 510
Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met
        515                 520                 525
Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys
    530                 535                 540
Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile
545                 550                 555                 560
Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe
                565                 570                 575
Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser
            580                 585                 590
Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser
        595                 600                 605
Val Glu Cys Arg Pro Tyr Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe
    610                 615                 620
Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe
625                 630                 635                 640
Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn
                645                 650                 655
Ile Leu His Lys Glu Ser
            660
<210>12
<211>5200
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>载体pHENFcabRGD4
 
<400>12
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt     60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt    120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat    180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt    240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg    300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga    360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc    420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac    480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg    540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca    600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg    660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg    720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg    780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag    840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg    900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct    960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac   1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact   1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga   1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt   1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct   1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc   1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc   1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc   1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg   1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt   1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg   1620
agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg   1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt   1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag   1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt   1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta    1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt    1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc    2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca    2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc    2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg    2220
accatgatta cgccaagctt aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa    2280
tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca    2340
tggccgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac    2400
tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct    2460
cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca    2520
agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg    2580
agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc    2640
tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga    2700
aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat    2760
cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc    2820
ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca    2880
cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctt accgtgggtt    2940
gccgcggtga ttgtctgagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc    3000
atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaagcgg    3060
ccgcagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag actgttgaaa    3120
gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa    3180
ctttagatcg ttacgctaac tatgagggct gtctgtggaa tgctacaggc gttgtggttt    3240
gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt gctatccctg    3300
aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg    3360
gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat atcaaccctc    3420
tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg    3480
aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga aataggcagg    3540
gtgcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt aaaacttatt    3600
accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac ggtaaattca    3660
gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa tatcaaggcc    3720
aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt ggtggttctg    3780
gtggcggctc tgagggtggc ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggctctgagg    3840
gtggcggttc cggtggcggc tccggttccg gtgattttga ttatgaaaaa atggcaaacg    3900
ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag    3960
gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg    4020
tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa  4080
tggctcaagt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac  4140
cttctttgcc tcagtcggtt gaatgtcgcc cttatgtctt tggcgctggt aaaccatatg  4200
aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat  4260
atgttgccac ctttatgtat gtattttcga cgtttgctaa catactgcat aaggagtctt  4320
aataagaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc  4380
caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc  4440
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg  4500
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca cgtcaaagca accatagtac  4560
gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct  4620
acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg  4680
ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt  4740
gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca  4800
tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga  4860
ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa  4920
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caccctgccc ccatcccggg atgagctgkm tkmtkmtcag gtgagcctga cctgcctggt    480
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa    540
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa    600
gctcaccgtg kmtkmtkmtk mtkmtkmtkm tkmtaggtgg kmtkmtggga acgtcttctc    660
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc    720
tccgggtaaa gcggccgc                                                  738
 
<210>20
<211>750
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>Fcab03
 
<220>
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<222>(449)..(450)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
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<222>(452)..(453)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(620)..(621)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(623)..(624)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(626)..(627)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(629)..(630)
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<220>
<221>misc_feature
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<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(635)..(636)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_fea ture
<222>(638)..(639)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(653)..(654)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(656)..(657)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>20
ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg     60
cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga    120
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga    180
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac    240
aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct    300
gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc    360
agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta    420
caccctgccc ccttcccggg atgagctgnn bnnbnnbcag gtcagcctga cctgcctggt    480
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa    540
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa    600
gctcaccgtg ggttctnnbn nbnnbnnbnn bnnbnnbnnb agcggcaggt ggnnbnnbgg    660
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<210>21
<211>750
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>Fcab04
 
<400>21
ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg     60
cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga    120
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga    180
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac    240
aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct    300
gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc    360
agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta    420
caccctgccc ccatctcggg atgagctgkm tkmtkmtcag gtcagcctga cctgcctggt    480
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa    540
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa    600
gctcaccgtg ggttctkmtk mtkmtkmtkm tkmtkmtkmt agcggcaggt ggkmtkmtgg    660
gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag    720
cctctccctg tctccgggta aagcggccgc                                     750
 
<210>22
<211>738
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>Fcab05
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(449)..(450)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(452)..(453)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(455)..(456)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(611)..(612)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(614)..(615)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(617)..(618)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(620)..(621)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(623)..(624)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(626)..(627)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(629)..(630)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(632)..(633)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(641)..(642)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(644)..(645)
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<400>22
ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg    60
cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga   120
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga   180
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agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta   420
caccctgccc ccatcccgtg atgagkmtnn bnnbnnbkmt gtcagcctga cctgcctggt   480
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa   540
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa   600
gctcaccgtg nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn bnnbaggtgg nnbnnbggga acgtcttctc   660
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc   720
tccgggtaaa gcggccgc                                                 738
 
<210>23
<211>738
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>Fcab06
 
<400>23
ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg   60
cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga  120
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga  180
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac  240
aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct  300
gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc  360
agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta    420
caccctgccc ccatcccggg acgagkmtkm tkmtkmtkmt gtcagcctga cctgcctggt    480
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa    540
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa    600
gctcaccgtg kmtkmtkmtk mtkmtkmtkm tkmtaggtgg kmtkmtggga acgtcttctc    660
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc    720
tccgggtaaa gcggccgc                                                  738
 
<210>24
<211>85
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物gapch35
 
<400>24
caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa gaccatctcc aaggccaagg gccagcctcg    60
agaaccacag gtgtacaccc tgccc                                          85
 
<210>25
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>PCR引物gapfcs3
 
<400>25
gagaccgagg agagggttag ggataggctt accttcgaag ggccctctag actcgatcga    60
gcggccgctc atttacccgg agacagggag aggctcttc                           99
 
<210>26
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>引物Abmut
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(44)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(47)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>26
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgnnbnnbnn bcaggtcagc    60
ctgacctgcc tggtcaaag                                                 79
<210>27
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>引物Abmut2LR
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(44)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(47)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(53)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>27
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagn nbnnbnnbnn bnnbgtcagc    60
ctgacctgcc tggtcaaag                                                 79
 
<210>28
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>引物Abmut1L
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(44)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(47)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>28
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagn nbnnbnnbnn bcaggtcagc    60
ctgacctgcc tggtcaaag                                                 79
 
<210>29
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>引物Abmut1R
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(44)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(47)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>n是a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(53)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>29
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgnnbnnbnn bnnbgtcagc    60
ctgacctgcc tggtcaaag                                                 79
 
<210>30
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>30
 
Leu Asp Asn Ser Gln
1               5
 
<210>31
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>31
 
Tyr Glu Gly Ser Ser
1               5
 
<210>32
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>32
 
Tyr Met Ser Ala Asp
1               5
 
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>33
 
Tyr Arg Arg Gly Asp
1               5
 
<210>34
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>34
 
Leu Met Ser Arg Gln
1               5
 
<210>35
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>35
 
Leu His Leu Ala Gln
1               5
 
<210>36
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>36
 
Tyr Leu Ser Lys Asp
1               5
 
<210>37
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>37
 
Tyr Arg Ser Gly Ser
1               5
 
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>38
 
Leu Arg Asp Gly Gln
1               5
 
<210>39
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>39
 
Tyr Ser Ala Asn Thr
1               5
 
<210>40
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>40
 
Tyr Ala Ser Asn Thr
1               5
 
<210>41
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>41
 
Tyr Ser Asp Gly Asp
1               5
 
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
<400>42
 
Tyr Ser Gly Gly Ser
1               5
 
<210>43
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>43
 
Tyr Gly Arg Asp Ser
1               5
 
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>44
 
Tyr Ala Gly Gly Thr
1               5
 
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>45
 
Tyr Ser Ser Asp Ser
1               5
 
<210>46
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>46
 
Tyr His Ser Gly Ser
1               5
 
<210>47
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>47
Tyr Leu Thr Asn Ser
1               5
 
<210>48
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>48
 
Tyr Gly Ser Glu Glu
1               5
 
<210>49
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>49
 
Tyr Arg Ser Gly Glu
1               5
 
<210>50
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>AB-环序列AA143ff
 
<400>50
 
Tyr Gly Thr Asp Asp
1               5
 
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>51
 
Ile Arg Ser Ser Val Gly Ser Arg Arg Trp Trp Ser
1               5                   10
 
<210>52
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>52
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>53
 
Ser Arg Arg Asp Ser Ser Leu Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>54
 
Ala Pro Gly Ser Lys Gly Tyr Arg Arg Trp Ala Leu
1               5                   10
 
<210>55
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>55
 
Asp Lys Pro Phe Trp Gly Thr Ser Arg Trp Ser Arg
1               5                   10
 
<210>56
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>56
 
Ser Ile Asn Asp Leu Ile Asn His Arg Trp Pro Tyr
1               5                   10
 
<210>57
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>57
 
Met Trp Gly Ser Arg Asp Tyr Trp Arg Trp Ser His
1               5                   10
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<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
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Asn Ser Gly Ser Ala Met Met Val Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
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<212>PRT
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<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
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<400>60
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>61
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>61
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>62
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>62
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>63
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>64
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>64
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>65
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<212>PRT
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<220>
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<400>65
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
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<220>
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<400>66
 
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1               5                   10
 
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<210>68
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>68
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>69
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>69
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>70
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>70
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>71
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>EF-环序列AA198ff
 
<400>71
 
Ala Arg Tyr Ser Pro Arg Met Leu Arg Trp Ala His
1               5                   10
 
<210>72
<211>5009
<212>DNA
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<220>
<223>载体pYD1
 
<400>72
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acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac  180
ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga  240
ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat  300
taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc  360
ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac     420
ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac     480
gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt     540
tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa     600
ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga     660
ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa     720
cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca     780
cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt     840
ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg     900
acgatgacga taaggtacca ggatccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt     960
ggcggccgct cgagtctaga gggcccttcg aaggtaagcc tatccctaac cctctcctcg    1020
gtctcgattc tacgcgtacc ggtcatcatc accatcacca ttgagtttaa acccgctgat    1080
ctgataacaa cagtgtagat gtaacaaaat cgactttgtt cccactgtac ttttagctcg    1140
tacaaaatac aatatacttt tcatttctcc gtaaacaaca tgttttccca tgtaatatcc    1200
ttttctattt ttcgttccgt taccaacttt acacatactt tatatagcta ttcacttcta    1260
tacactaaaa aactaagaca attttaattt tgctgcctgc catatttcaa tttgttataa    1320
attcctataa tttatcctat tagtagctaa aaaaagatga atgtgaatcg aatcctaaga    1380
gaattgggca agtgcacaaa caatacttaa ataaatacta ctcagtaata acctatttct    1440
tagcattttt gacgaaattt gctattttgt tagagtcttt tacaccattt gtctccacac    1500
ctccgcttac atcaacacca ataacgccat ttaatctaag cgcatcacca acattttctg    1560
gcgtcagtcc accagctaac ataaaatgta agctctcggg gctctcttgc cttccaaccc    1620
agtcagaaat cgagttccaa tccaaaagtt cacctgtccc acctgcttct gaatcaaaca    1680
agggaataaa cgaatgaggt ttctgtgaag ctgcactgag tagtatgttg cagtcttttg    1740
gaaatacgag tcttttaata actggcaaac cgaggaactc ttggtattct tgccacgact    1800
catctccgtg cagttggacg atatcaatgc cgtaatcatt gaccagagcc aaaacatcct    1860
ccttaggttg attacgaaac acgccaacca agtatttcgg agtgcctgaa ctatttttat    1920
atgcttttac aagacttgaa attttccttg caataaccgg gtcaattgtt ctctttctat    1980
tgggcacaca tataataccc agcaagtcag catcggaatc tagagcacat tctgcggcct    2040
ctgtgctctg caagccgcaa actttcacca atggaccaga actacctgtg aaattaataa    2100
cagacatact ccaagctgcc tttgtgtgct taatcacgta tactcacgtg ctcaatagtc    2160
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aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta    2280
ggacggatcg cttgcctgta acttacacgc gcctcgtatc ttttaatgat ggaataattt    2340
gggaatttac tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat    2400
aaagaaggta gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt    2460
caacaaaaag cgtactttac atatatattt attagacaag aaaagcagat taaatagata    2520
tacattcgat taacgataag taaaatgtaa aatcacagga ttttcgtgtg tggtcttcta    2580
cacagacaag atgaaacaat tcggcattaa tacctgagag caggaagagc aagataaaag    2640
gtagtatttg ttggcgatcc ccctagagtc ttttacatct tcggaaaaca aaaactattt    2700
tttctttaat ttcttttttt actttctatt tttaatttat atatttatat taaaaaattt    2760
aaattataat tatttttata gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcact tttcggggaa    2820
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tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc    2940
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc    3000
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt    3060
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt    3120
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg    3180
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact    3240
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg    3300
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga    3360
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg    3420
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa    3480
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aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc    3600
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca    3660
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggca    3720
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta    3780
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cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt    3960
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ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggccgag cctatggaaa aacgccagca    4560
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<210>73
<211>5009
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的载体pYD1Nhe
 
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acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac   180
ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga   240
ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat   300
taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc   360
ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac   420
ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac   480
gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt   540
tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt gctagcacag gaactgacaa   600
ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga   660
ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa   720
cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca   780
cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt   840
ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg   900
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caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg    3300
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga    3360
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg    3420
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1               5                   10                  15
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            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
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65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
 
<210>81
<211>7100
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>载体pYD4D5h1
 
<400>81
acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt     60
cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga    120
acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac    180
ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga    240
ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat    300
taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc    360
ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac    420
ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac    480
gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt    540
tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt gctagccgct ggggccatgg    600
cggatatcca gatgacccag tccccgagct ccctgtccgc ctctgtgggc gatagggtca    660
ccatcacctg ccgtgccagt caggatgtga atactgctgt agcctggtat caacagaaac    720
caggaaaagc tccgaaacta ctgatttact cggcatcctt cctctactct ggagtccctt    780
ctcgcttctc tggatccaga tctgggacgg atttcactct gaccatcagc agtctgcagc    840
cggaagactt cgcaacttat tactgtcagc aacattatac tactcctccc acgttcggac    900
agggtaccaa ggtggagatc aaacgtacgg tggcggcgcc atctgtcttc atcttcccgc    960
catctgatga gcagcttaag tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct   1020
atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc   1080
aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga   1140
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg   1200
gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttgaggc gcgccggatc   1260
cgatgtaaca aaatcgactt tgttcccact gtacttttag ctcgtacaaa atacaatata   1320
cttttcattt ctccgtaaac aacatgtttt cccatgtaat atccttttct atttttcgtt   1380
ccgttaccaa ctttacacat actttatata gctattcact tctatacact aaaaaactaa   1440
gacaatttta attttgctgc ctgccatatt tcaatttgtt ataaattcct ataatttatc   1500
ctattagtag ctaaaaaaag atgaatgtga atcgaatcct aagagaattg ctgcagaatt    1560
cacggattag aagccgccga gcgggtgaca gccctccgaa ggaagactct cctccgtgcg    1620
tcctcgtctt caccggtcgc gttcctgaaa cgcagatgtg cctcgcgccg cactgctccg    1680
aacaataaag attctacaat actagctttt atggttatga agaggaaaaa ttggcagtaa    1740
cctggcccca caaaccttca aatgaacgaa tcaaattaac aaccatagga tgataatgcg    1800
attagttttt tagccttatt tctggggtaa ttaatcagcg aagcgatgat ttttgatcta    1860
ttaacagata tataaatgca aaaactgcat aaccacttta actaatactt tcaacatttt    1920
cggtttgtat tacttcttat tcaaatgtaa taaaagtatc aacaaaaaat tgttaatata    1980
cctctatact ttaacgtcaa ggagaaaaaa ccccggatcg gactactagc agctgtaata    2040
cgactcacta tagggaatat taagctaatt ctacttcata cattttcaat taagatgcag    2100
ttacttcgct gtttttcaat attttctgtt attgcttcag ttttagcaca ggaactgaca    2160
actatatgcg agcaaatccc ctcaccaact ttagaatcga cgccgtactc tttgtcaacg    2220
actactattt tggccaacgg gaaggcaatg caaggagttt ttgaatatta caaatcagta    2280
acgtttgtca gtaattgcgg ttctcacccc tcaacaacta gcaaaggcag ccccataaac    2340
acacagtatg tttttaagct tctgcaggct agtggtggtg gtggttctgg tggtggtggt    2400
tctggtggtg gtggttctgc tagcatgact ggtggccagc aaggccaaga ggttcaacta    2460
gtggagtctg gcggtggcct ggtgcagcca gggggctcac tccgtttgtc ctgtgcagct    2520
tctggcttca acattaaaga cacctatata cactgggtgc gtcaggcccc gggtaagggc    2580
ctggaatggg ttgcaaggat ttatcctacg aatggttata ctagatatgc cgatagcgtc    2640
aagggccgtt tcactataag cgcagacaca tccaaaaaca cagcctacct gcagatgaac    2700
agcctgcgtg ctgaggacac tgccgtctat tattgttcta gatggggagg ggacggcttc    2760
tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcctcggc tagcaccaag    2820
ggccccagcg tgttccctct ggcccccagc tccaagagca cctccggcgg caccgccgcc    2880
ctgggctgcc tggtgaagga ttacttccca gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcggc    2940
gccctgacca gcggcgtgca cacctttccc gccgtgctgc agtccagcgg cctgtactcc    3000
ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgcaat    3060
gtgaaccaca agcccagcaa taccaaggtg gataagaagg tggagcccaa gagctgcgcg    3120
gccgcacatc atcaccatca ccattgatta attaagttta aacccgctga tctgataaca    3180
acagtgtaga tgtaacaaaa tcgactttgt tcccactgta cttttagctc gtacaaaata    3240
caatatactt ttcatttctc cgtaaacaac atgttttccc atgtaatatc cttttctatt    3300
tttcgttccg ttaccaactt tacacatact ttatatagct attcacttct atacactaaa    3360
aaactaagac aattttaatt ttgctgcctg ccatatttca atttgttata aattcctata    3420
atttatccta ttagtagcta aaaaaagatg aatgtgaatc gaatcctaag agaattgggc    3480
aagtgcacaa acaatactta aataaatact actcagtaat aacctatttc ttagcatttt    3540
tgacgaaatt tgctattttg ttagagtctt ttacaccatt tgtctccaca cctccgctta    3600
catcaacacc aataacgcca tttaatctaa gcgcatcacc aacattttct ggcgtcagtc    3660
caccagctaa cataaaatgt aagctctcgg ggctctcttg ccttccaacc cagtcagaaa    3720
tcgagttcca atccaaaagt tcacctgtcc cacctgcttc tgaatcaaac aagggaataa    3780
acgaatgagg tttctgtgaa gctgcactga gtagtatgtt gcagtctttt ggaaatacga    3840
gtcttttaat aactggcaaa ccgaggaact cttggtattc ttgccacgac tcatctccgt    3900
gcagttggac gatatcaatg ccgtaatcat tgaccagagc caaaacatcc tccttaggtt    3960
gattacgaaa cacgccaacc aagtatttcg gagtgcctga actattttta tatgctttta    4020
caagacttga aattttcctt gcaataaccg ggtcaattgt tctctttcta ttgggcacac    4080
atataatacc cagcaagtca gcatcggaat ctagagcaca ttctgcggcc tctgtgctct    4140
gcaagccgca aactttcacc aatggaccag aactacctgt gaaattaata acagacatac    4200
tccaagctgc ctttgtgtgc ttaatcacgt atactcacgt gctcaatagt caccaatgcc    4260
ctccctcttg gccctctcct tttctttttt cgaccgaatt tcttgaagac gaaagggcct    4320
cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt aggacggatc    4380
gcttgcctgt aacttacacg cgcctcgtat cttttaatga tggaataatt tgggaattta    4440
ctctgtgttt atttattttt atgttttgta tttggatttt agaaagtaaa taaagaaggt    4500
agaagagtta cggaatgaag aaaaaaaaat aaacaaaggt ttaaaaaatt tcaacaaaaa    4560
gcgtacttta catatatatt tattagacaa gaaaagcaga ttaaatagat atacattcga    4620
ttaacgataa gtaaaatgta aaatcacagg attttcgtgt gtggtcttct acacagacaa    4680
gatgaaacaa ttcggcatta atacctgaga gcaggaagag caagataaaa ggtagtattt    4740
gttggcgatc cccctagagt cttttacatc ttcggaaaac aaaaactatt ttttctttaa    4800
tttctttttt tactttctat ttttaattta tatatttata ttaaaaaatt taaattataa    4860
ttatttttat agcacgtgat gaaaaggacc caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg    4920
gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat    4980
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc    5040
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa    5100
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac    5160
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga    5220
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag    5280
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca    5340
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca    5400
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa    5460
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc    5520
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa    5580
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag    5640
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct    5700
ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac    5760
tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggc agtcaggcaa    5820
ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt    5880
aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat    5940
ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg    6000
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc    6060
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg    6120
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag    6180
cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact    6240
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg    6300
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc    6360
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg    6420
aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg    6480
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag    6540
gggggaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc    6600
gatttttgtg atgctcgtca ggggggccga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct    6660
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc    6720
ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc    6780
gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac    6840
cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact    6900
ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta cctcactcat taggcacccc    6960
aggctttaca ctttatgctt ccggctccta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat    7020
ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct cggaattaac cctcactaaa    7080
gggaacaaaa gctggctagt                                                7100
 
<210>82
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>4D51p
 
<400>82
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210

Claims (47)

1.一种制备基因包的方法，所述基因包展示与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域寡聚体，所述方法包括
-提供基因包，和
-通过与所述包的外表面融合，展示至少两个抗体模块结构域。
2.权利要求1的方法，其中所述基因包在移动系统或细胞系统中展示。
3.权利要求1或2之一的方法，其中所述移动系统选自病毒，噬菌体，噬菌粒，体外展示系统，mRNA系统和核糖体展示系统。
4.权利要求1-3之一的方法，其中所述基因包是丝状噬菌体，所述寡聚体是包括蛋白p3、p6或p8之一的融合蛋白。
5.权利要求1或2之一的方法，其中所述细胞系统选自酵母，哺乳动物细胞，细菌细胞，细菌孢子和昆虫细胞。
6.权利要求1-2和5之一的方法，其中所述基因包是酵母，所述寡聚体是一种酵母细胞表面受体蛋白的融合蛋白，所述受体蛋白选自由包括蛋白alpha-凝集素、a-凝集素、Aga1p、Aga2p或FL01之一组成的组。
7.权利要求1-6之一的方法，其中所述寡聚体包括至少一个亮氨酸拉链，二硫键，静电基元或疏水性基元。
8.权利要求1-7之一的方法，其中所述寡聚体选自二聚体、三聚体和四聚体。
9.权利要求1-8之一的方法，其中所述寡聚体是同聚体。
10.权利要求1-9之一的方法，其中所述寡聚体是具有靶结合位点的多肽，所述靶结合位点指向基因包表面并与所述表面接近。
11.权利要求1-10之一的方法，其中所述寡聚体是在C端环位置具有靶结合位点的多肽。
12.权利要求1-11之一的方法，其中所述寡聚体是具有靶的多肽，相对于多肽的N端所述靶更靠近C端。
13.权利要求1-12之一的方法，其中所述寡聚体具有至少两个靶结合位点。
14.权利要求1-13之一的方法，其中所述模块抗体选自抗体、Fc片段、具有CDR区的抗体片段及其组合。
15.权利要求14的方法，其中所述模块抗体包括在结构环位置具有结合位点的片段。
16.权利要求14或15之一的方法，其中所述具有CDR区的抗体片段选自Fab，dAb，scFv，二价抗体，unibody，SMIPs，TANDABS，Fc融合蛋白及其组合。
17.用于权利要求1-16之一的方法的盒载体，包含与基因包可操作连接的编码不止一种融合蛋白的序列。
18.权利要求17的载体，其是噬菌粒。
19.用于表达在基因包表面结合的模块抗体结构域寡聚体的表达系统，所述基因包根据权利要求1-16之一产生，其中所述寡聚体由单基因编码，所述融合蛋白在基因包表面展示至少两个拷贝。
20.在非抑制者宿主细胞中表达根据权利要求1-16之一产生的基因包的方法，所述基因包展示模块抗体结构域寡聚体。
21.按照权利要求1-16之一的方法制备的基因包。
22.展示至少两种融合蛋白的权利要求21的基因包。
23.权利要求21和22之一的基因包，其中所述寡聚体的每个单体与所述基因包的外表面结合。
24.展示两种融合蛋白的二价噬菌体，所述融合蛋白来自权利要求1-16之一产生的寡聚体，且每种均包含通过表达而二聚化的寡聚体。
25.权利要求21-24之一的基因包的文库。
26.权利要求25的文库，包括至少10个变体基因包，其中所述变体基因包展示模块抗体结构域的异聚体。
27.权利要求26的文库，其中所述异聚体基于含靶结合位点的支架。
28.权利要求26或27之一的文库，其中所述支架是亲本Fab，且至少20％的亲本Fab变体结合所述亲本Fab的CDR-靶。
29.权利要求25-28之一的文库，包括氨基酸序列有差异的所述寡聚体的变体。
30.权利要求25-29之一的文库，其中所述氨基酸序列通过至少一个插入或取代以导入至少一个外源氨基酸、以及通过缺失而被改造。
31.权利要求30的文库，其中通过随机化技术导入所述外源氨基酸。
32.权利要求30或31的文库，其中所述外源氨基酸选自氨基酸的特定组，以获得在所述随机化位置富含特定氨基酸的文库。
33.产生与靶结合的模块抗体结构域寡聚体的方法，包括以下步骤：
a.提供权利要求1-16之一产生的模块抗体结构域寡聚体的文库，
b.在支架配体存在的条件下将所述文库与所述靶接触，
c.在支架配体存在的条件下筛选与所述靶结合的文库成员，和
d.制备功能性寡聚体的制品。
34.权利要求33的方法，其中所述支架配体选自效应分子、FcRn、蛋白A和CDR靶。
35.权利要求33或34之一的方法，其中所述效应分子选自CD64、CD16、CD32和Fc受体。
36.权利要求33-35之一的方法，其中所述寡聚体是选自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，Fc和Fab，或其单链的二聚体。
37.权利要求1-16和33-36之一的方法，其中所述文库包含至少102个表达模块抗体结构域的功能性寡聚体的独立克隆。
38.权利要求1-16和33-37之一的方法，其中筛选Kd＜10-8M的靶结合亲和力的文库成员。
39.权利要求1-16和33-38之一的方法，其中所述靶是erbB类受体。
40.通过权利要求1-16和33-39之一的方法获得的免疫球蛋白，其中所述靶是erbB类受体。
41.包含至少102个独立克隆的高质量文库，所述克隆是模块抗体结构域的功能性二聚体的独立克隆，所述结构域与靶结合并与支架配体结合。
42.权利要求41的高质量文库，其中所述靶是与经历了氨基酸变异的亲代分子结合的配体。
43.权利要求41或42之一的高质量文库，其中所述亲代分子是功能性Fc或功能性Fab或其部分。
44.权利要求41或42之一的高质量文库，其中所述亲代分子通过随机诱变或位点特异性诱变来改变。
45.权利要求41-44之一的文库，其中至少20％的功能性二聚体结合CD64。
46.权利要求41-44之一的文库，其中至少20％的功能性二聚体结合蛋白A。
47.权利要求41-46之一的高质量文库，其中至少20％的功能性二聚体结合相同的CDR靶。
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