CN107988259B - SmartBac杆状病毒表达系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SmartBac杆状病毒表达系统及其应用。该系统可包括受体质粒(含片段A或者含片段B和C)和供体质粒(含片段D)；片段A含启动子、蛋白酶编码序列、蛋白酶切割位点、待表达目的物编码基因的插入区和终止序列；片段B含启动子、蛋白酶编码序列和终止序列；片段C含启动子、待表达目的物编码基因的插入区和终止序列；片段D含启动子、待表达目的物编码基因的插入区和终止序列。本发明还提供三种克隆的策略以实现分子量小于600kDa的蛋白质复合物表达、分子量大于600kDa的蛋白质复合物表达及高效筛选最适添加纯化标签的亚基。本发明对于在昆虫细胞中重组表达组分复杂、分子量较大的蛋白质复合物具有重要意义。

Description

SmartBac杆状病毒表达系统及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种杆状病毒表达系统及其应用，具体涉及一种新型的在昆虫细胞中同时表达多种蛋白质的杆状病毒表达系统SmartBac系统及其在表达超大分子复合物上的应用。
背景技术
杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression System，BVES)是在昆虫细胞中高效表达外源蛋白质的用力工具，具有安全性好、表达水平高、可进行翻译后加工等优点。由于杆状病毒的基因组庞大，外源基因的克隆不能通过酶切连接的方法直接插入，所以人们对杆状病毒基因组进行改造，并构建与之相匹配的转移载体，使两者重组为能够感染昆虫细胞的含外源基因的重组杆状病毒。在目前广泛使用的Bac to Bac系统中，杆状病毒穿梭载体(Bacmid)既可以在大肠杆菌中复制，又可以感染鳞翅目昆虫细胞，其在大肠杆菌中可以与含外源基因的匹配转移载体发生Tn7位点特异性重组。重组得到的杆状病毒穿梭载体能在大肠杆菌中高效复制，被提纯后可用于转染昆虫细胞。
杆状病毒基因组容量大，可以在转移载体上插入多个开放阅读框(ORF，OpenReading Frame)，继而使得到的重组杆状病毒穿梭载体在昆虫细胞中同时表达多个蛋白质。这也是目前在昆虫细胞中实现多种蛋白质共表达的通用思路。例如质粒pFastBac-Dual含有两个头对头放置的开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)，一个ORF以p10启动子起始，HSV tk polyadenylation(简称HSV tk pA)信号序列终止；另一个ORF以polyhedrin启动子起始，SV40polyadenylation(简称SV40pA)信号序列终止。质粒pFastBac-Dual可以作为转移载体，但只能同时表达两种蛋白质，若要表达两种以上的蛋白质，则需要另构建其它转移载体。例如要表达由四种不同亚基构成的蛋白质复合物，需要经过如下步骤：(1)构建重组质粒pFastBac-Dual-A-B(含A基因和B基因的质粒pFastBac-Dual)和重组质粒pFastBac-Dual-C-D(含C基因和D基因的质粒pFastBac-Dual)；(2)将步骤(1)构建的重组质粒分别与Bacmid进行重组，得到两种重组Bacmid；(3)将步骤(2)得到的两种重组Bacmid分别转染昆虫细胞，得到两种病毒。(4)用步骤(3)得到的两种病毒同时感染昆虫细胞，实现四种亚基的共表达。这种多病毒共感染方法的蛋白表达量通常要低于单一病毒感染细胞的蛋白表达量。
近几年流行的MultiBac系统考虑到这一点，只用一种重组Bacmid感染细胞，进行蛋白质复合体的表达。该系统的表达思路也是一个ORF表达一种蛋白质。通过受体质粒与供体质粒上LoxP位点介导的重组，实现质粒的融合，将不同来源的ORF整合到一个转移载体上，然后与Bacmid重组，实现多种蛋白质的共表达。这种方法的局限性为要构建多种含目的基因的供体质粒与受体质粒，供体质粒与受体质粒要经过多次整合与筛选，才能得到最终用于表达的转移载体，耗时耗力。
上述两种方法除了分子克隆操作繁琐外，还含有以下几种缺陷：一是在表达过程中无法控制各个亚基的拷贝数，最终无法纯化到性质较为均一的蛋白质复合体；二是在病毒感染过程中无法判断目的蛋白是否表达。
为了解决上述问题，本发明的发明人所在团队开发了一种新型的在昆虫细胞中同时表达多种蛋白质的方法(后面简称方法1)并申请了专利(申请号：201610248592.8)。在方法1中，编码TEV酶的基因和编码各蛋白质的基因被串联在一个ORF里：首先以一条多肽链的形式被表达出来；然后，位于多肽链N端的TEV酶会通过各蛋白之间的TEV酶剪切位点(TCS)，将各个蛋白质从多肽链上剪切下来，以实现多种蛋白质的同时表达和体内组装。为了在昆虫细胞中监测这些ORF的表达情况，将编码不同颜色荧光蛋白的基因通过TCS连接在多蛋白基因后面，与多个蛋白以一条长的多肽链共同表达。这一想法在发明人构建的pFBD-mCEG载体中得到了实现。使用上述方法和载体，发明人构建了重组质粒pFBD-mCEG-COPI，在昆虫细胞中成功的表达了由7个不同亚基构成的，具有活性的人源COPI蛋白。
但是方法1仍然具有一定的使用局限性。首先，方法1要求将编码蛋白质亚基的各个基因都串联起来，插入在一个载体上进行蛋白质表达工作。而对于那些分子量较大的蛋白质复合体，其对应的DNA序列也较长。无论是通过基因合成的方法还是在实验室利用经典分子克隆的手段，构建含有较长基因片段的载体(载体大小在20kb左右)都是比较困难和耗时的。其次，将荧光蛋白接在多肽链末端融合表达，虽然可以很好的监测多肽链的表达情况，但是偶尔也会出现荧光蛋白与多肽链之间剪切不完全的情况。这必然会影响蛋白质复合物在表达细胞内的正常组装。第三，pFBD-mCEG载体在大肠杆菌中的复制起点是高拷贝数的复制起点。利用这个载体构建出来的较大质粒在大肠杆菌中进行复制时，由于其自身高拷贝数复制，会给菌体带来较大的压力，而细菌可能会启动其它代谢途径来对抗这种压力。最终的结果是质粒稳定性差，极有可能出现基因丢失的现象。
此外，在体外重组表达含有多个亚基的蛋白质复合物，常常需要筛选最适于添加纯化标签的亚基。当我们重组表达蛋白质复合物时，通常将一种纯化标签加在某一个亚基上，利用亲和层析的方法对含有这一标签的亚基进行纯化。由于这一亚基与组成复合物的其它亚基之间有较为紧密的相互作用，可以将整个蛋白质复合物纯化出来。但是纯化标签加在不同的亚基上，对于纯化整个复合物常常有着不同的效果。如果不采用有效的克隆策略，会花费大量的时间和精力来构建表达载体。假设我们要用pFBD-mCEG载体表达一个含8个亚基的、分子量在600kDa左右蛋白质复合物，如果我们用简单的试错法，需要构建8种大小在25kb左右的表达载体，每种表达载体的区别就是带有纯化标签的亚基是不同的。这对于任何分子生物学实验室都不是非常轻松的工作。
发明内容
为了有效的解决上述问题，本发明提供了一种新型的SmartBac杆状病毒表达系统，并提出了三种克隆的策略以实现分子量的在600kDa以下的蛋白质复合物表达、分子量在600kDa以上的蛋白质复合物的表达以及高效筛选最适合添加纯化标签的亚基。
本发明所提供的SmartBac杆状病毒表达系统，为如下(A)-(D)中任一：
(A)SmartBac杆状病毒表达系统A，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；
所述受体质粒为受体质粒甲和/或受体质粒乙；
所述受体质粒甲上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；
所述受体质粒乙上含有DNA片段B和DNA片段C；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列B；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列C；
所述供体质粒上含有DNA片段D；所述DNA片段D自上游到下游依次包含：启动子D、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列D；
所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段。
(B)SmartBac杆状病毒表达系统B，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；
所述受体质粒上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；
所述供体质粒为供体质粒甲和/或供体质粒乙；
所述供体质粒甲上含有DNA片段B；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列B；
所述供体质粒乙上含有DNA片段C和DNA片段D；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列C；所述DNA片段D自上游到下游依次包含：启动子D、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列D；
所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段。
(C)SmartBac杆状病毒表达系统C，包括所述SmartBac杆状病毒表达系统A或所述SmartBac杆状病毒表达系统B中的所述受体质粒；可不含供体质粒。
(D)SmartBac杆状病毒表达系统D，与所述SmartBac杆状病毒表达系统A或所述SmartBac杆状病毒表达系统B或所述SmartBac杆状病毒表达系统C相比，差别仅在于：将其中的所述待表达目的物的编码基因的插入区替换为两两之间由所述蛋白酶的切割位点识别序列间隔开来的若干个插入区，每个插入区用于插入一个所述待表达目的物的编码基因。
所述受体质粒上还含有用于产生重组杆状病毒的小型Tn7元件侧翼。
进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段A中，在所述待表达目的物的编码基因的插入区和所述终止序列A之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列。
进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段B中，在所述蛋白酶的编码基因序列和所述终止序列B之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列。
进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段D中，在所述待表达目的物的编码基因的插入区和所述终止序列D之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列。
在本发明中，所述受体质粒和所述供体质粒上均含有位点特异性重组酶的识别序列；依靠所述位点特异性重组酶的识别序列，所述受体质粒和所述供体质粒可以融合为一个大的质粒。
进一步地，所述位点特异性重组酶具体为Cre重组酶；相应的，所述位点特异性重组酶的识别序列为loxP位点序列。当然所述位点特异性重组酶也可以为其他具有相同或类似功能的重组酶。
进一步地，所述受体质粒中含有非条件型复制起点；所述供体质粒中含有条件型复制起点。
更加具体地，在本发明中，所述非条件型复制起点具体为p15A复制起点(p15A复制起点允许质粒以低拷贝在普通大肠杆菌克隆菌株中繁殖，它更好的维持了大质粒的稳定性)；所述条件型复制起点具体为R6Kγ复制起点(质粒仅能在含有pir基因的细菌宿主中繁殖)。
进一步地，所述受体质粒和所述供体质粒上含有不同的抗性筛选标记基因。
更加具体地，在本发明中，所述受体质粒上携带有氨苄青霉素抗性基因和庆大霉素抗性基因；所述供体质粒上携带有卡那霉素抗性基因。
进一步地，在本发明中，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述启动子A为p6.9启动子；所述启动子B为GP64启动子；所述启动子C为p6.9启动子；所述启动子D为p10启动子。
其中，p6.9启动子与常规使用的极晚期多角体蛋白polyhedrin启动子相比，在感染的早期阶段驱动表达，这时的细胞状态与病毒感染晚期相比更好，可以避免表达的外源蛋白质的聚集。
进一步地，在本发明中，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述终止序列A为SV40pA信号序列；所述终止序列B为IE1ter信号序列；所述终止序列C为SV40pA信号序列；所述终止序列D为HSV tk pA信号序列。
进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述待表达目的物的编码基因的插入区自上游到下游依次含有多克隆位点1、LacZ-α表达盒和多克隆位点2。
其中，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，在所述DNA片段D中，所述待表达目的物的编码基因的插入区中的所述多克隆位点1和所述多克隆位点2之间还含有PUC复制起点。
在本发明中，所述蛋白酶具体为TEV蛋白酶。当然所述蛋白酶也可以为具有相同或类似功能的其他蛋白酶。
更进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段A自上游到下游依次由p6.9启动子(SEQ ID No.1的第1235-1329位或SEQ ID No.2的第1235-1329位)、N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列(SEQ ID No.1的第1339-2097位或SEQ ID No.2的第1339-2097位)、TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)(SEQ ID No.1的第2098-2118位或SEQ ID No.2的第2098-2118位)、Twin-Strep标签编码序列(SEQ ID No.1的第2119-2205位或SEQ ID No.2的第2119-2205位)、肠激酶切割位点的识别序列(SEQ ID No.1的第2206-2220位或SEQ ID No.2的第2206-2220位)、多克隆位点1(SEQ ID No.1的第2222-2249位或SEQ ID No.2的第2222-2249位)、LacZ-α表达盒(SEQ ID No.1的第2250-2790位或SEQ IDNo.2的第2250-2790位)、多克隆位点2(SEQ ID No.1的第2799-2837位或SEQ ID No.2的第2799-2843位)、TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)(SEQ ID No.1的第2839-2859位或SEQID No.2的第2845-2865位)、荧光蛋白的编码基因序列(SEQ ID No.1的第2869-3585位所示的EGFP或SEQ ID No.2的第2875-3585位所示的TagRFP)和SV40pA信号序列(SEQ ID No.1的第3731-3971位或SEQ ID No.2的第3731-3971位)连接而成。
更进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段B自上游到下游依次由GP64启动子(SEQ ID No.3的第3047-3252位或SEQ ID No.4的第3044-3249位)、N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列(SEQ ID No.3的第2275-3033位或SEQ ID No.4的第2272-3030位)、TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)(SEQ ID No.3的第2254-2274位或SEQ ID No.4的第2251-2271位)、荧光蛋白的编码基因序列(SEQ ID No.3的第1531-2247位所示的EGFP或SEQ ID No.4的第1531-2244位所示的TagRFP)和IE1ter信号序列(SEQ IDNo.3的第1208-1514位或SEQ ID No.4的第1208-1514位)连接而成。
更进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段C自上游到下游依次由p6.9启动子(SEQ ID No.3的第3306-3400位或SEQ ID No.4的第3303-3397位)、Twin-Strep标签编码序列(SEQ ID No.3的第3419-3505位或SEQ ID No.4的第3416-3502位)、肠激酶切割位点的识别序列(SEQ ID No.3的第3506-3520位或SEQ ID No.4的第3503-3517位)、多克隆位点1(SEQ ID No.3的第3522-2549位或SEQ ID No.4的第3519-3546位)、LacZ-α表达盒(SEQ ID No.3的第3550-4090位或SEQ ID No.4的第3547-4087位)、多克隆位点2(SEQ ID No.3的第4099-4149位或SEQ ID No.4的第4096-4146位)和SV40pA信号序列(SEQ ID No.3的第4281-4521位或SEQ ID No.4的第4278-4528位)连接而成。
更进一步地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段D自上游到下游依次由p10启动子(SEQ ID No.5的第259-368位或SEQ ID No.6的第259-368位)、10×His标签编码序列(SEQ ID No.5的第397-426位或SEQ ID No.6的第397-426位)、肠激酶切割位点的识别序列(SEQ ID No.5的第436-450位或SEQ ID No.6的第436-450位)、多克隆位点1(SEQ ID No.5的第452-473位或SEQ ID No.6的第452-473位)、PUC复制起点(SEQ IDNo.5的第644-1232位或SEQ ID No.6的第644-1232位)、LacZ-α表达盒(SEQ ID No.5的第1443-1983位或SEQ ID No.6的第1443-1983位)、多克隆位点2(SEQ ID No.5的第1992-2030位或SEQ ID No.6的第1992-2036位)、TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)(SEQ ID No.5的第2032-2052位或SEQ ID No.6的第2038-2058位)、荧光蛋白的编码基因序列(SEQ IDNo.5的第2062-2778位所示的EGFP或SEQ ID No.6的第2068-2778位所示的TagRFP)和HSVtk pA信号序列(SEQ ID No.5的第2907-3188位或SEQ ID No.6的第2907-3188位)连接而成。
其中，所述荧光蛋白在本发明中具体为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
更加具体地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段A的序列具体为SEQ ID No.1的第1235-3971位或者为SEQ ID No.2的第1235-3971位。
更加具体地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段B的序列为SEQ ID No.3的第1208-3252位或者为SEQ ID No.4的第1208-3249位。
更加具体地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段C的序列为SEQ ID No.3的第3306-4521位或者为SEQ ID No.4的第3303-4518位。
更加具体地，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述DNA片段D的序列为SEQ ID No.5的第259-3188位或者为SEQ ID No.6的第259-3188位。
另外，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，在所述受体质粒和所述供体质粒中的p6.9启动子和p10启动子区域的两侧分别存在几个单一的限制性位点，这样当需要时，可以将现有的启动子剪切下来，替换为其它的可以在昆虫细胞中启动蛋白质表达的启动子。
在本发明的具体实施例中，对于所述SmartBac杆状病毒表达系统A来说，所述受体质粒甲为4V1G质粒和/或4V1R质粒；所述4V1G质粒的全序列为SEQ ID No.1；所述4V1R质粒的全序列为SEQ ID No.2。所述受体质粒乙为5V1TG质粒和/或5V1TR质粒；所述5V1TG质粒的全序列为SEQ ID No.3；所述5V1TR质粒的全序列为SEQ ID No.4。所述供体质粒为4V2G质粒和/或4V2R质粒；所述4V2G质粒的全序列为SEQ ID No.5；所述4V2R质粒的全序列为SEQ IDNo.6。
其中，SEQ ID No.1的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1224位为多克隆位点BP，第1235-1329位为p6.9启动子，第1339-2097位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第2098-2118位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2119-2205位为Twin-Strep标签编码序列，第2206-2220位为肠激酶切割位点的识别序列，第2222-2249位为多克隆位点1，第2250-2790位为LacZ-α表达盒，第2799-2837位为多克隆位点2，第2839-2859位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2862-2867位为SalI识别位点，第2869-3585位为荧光蛋白EGFP的编码基因序列，第3731-3971为SV40pA信号序列，第4000-4165位为Tn7L元件，第4349-4804位为f1复制起点，第4936-5796位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6067-6612位为p15A复制起点。
SEQ ID No.2的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1224位为多克隆位点BP，第1235-1329位为p6.9启动子，第1339-2097位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第2098-2118位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2119-2205位为Twin-Strep标签编码序列，第2206-2220位为肠激酶切割位点的识别序列，第2222-2249位为多克隆位点1，第2250-2790位为LacZ-α表达盒，第2799-2843位为多克隆位点2，第2845-2865位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2868-2873位为SalI识别位点，第2875-3585位为荧光蛋白TagRFP的编码基因序列，第3731-3971为SV40pA信号序列，第4000-4165位为Tn7L元件，第4349-4804位为f1复制起点，第4831-4935位为Amp启动子，第4936-5796位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6067-6612位为p15A复制起点。
SEQ ID No.3的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1193位为I-CeuI酶切位点，第1202-1207位为AatII酶切位点，第1208-1514位为IE1ter信号序列，第1515-1522位为FseI酶切位点，第1531-2247位为荧光蛋白EGFP的编码基因序列，第2248-2253位为SmaI酶切位点，第2254-2274位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2275-3033位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第3034-3041位为SwaI酶切位点，第3047-3252位为GP64启动子，第3290-3295位为BspEI酶切位点，第3306-3400位为P6.9启动子，第3407-3418位为多克隆位点AP，第3419-3505位为Twin-Strep标签编码序列，第3506-3520位为肠激酶切割位点的识别序列，第3522-2549位为多克隆位点1，第3550-4090位为LacZ-α表达盒，第4099-4149位为多克隆位点2，第4281-4521位为SV40pA信号序列，第4550-4715位为Tn7L元件，第4899-5354位为f1复制起点，第5486-6346位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6617-7162位为p15A复制起点。
SEQ ID No.4的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1193位为I-CeuI酶切位点，第1202-1207位为AatII酶切位点，第1208-1514位为IE1ter信号序列，第1515-1522位为FseI酶切位点，第1531-2244位为荧光蛋白TagRFP的编码基因序列，第2245-2250位为SmaI酶切位点，第2251-2271位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2272-3030位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第3031-3038位为SwaI酶切位点，第3044-3249位为GP64启动子，第3287-3292位为BspEI酶切位点，第3303-3397位为P6.9启动子，第3404-3415位为多克隆位点AP，第3416-3502位为Twin-Strep标签编码序列，第3503-3517位为肠激酶切割位点的识别序列，第3519-3546位为多克隆位点1，第3547-4087位为LacZ-α表达盒，第4096-4146位为多克隆位点2，第4278-4518位为SV40pA信号序列，第4547-4712位为Tn7L元件，第4896-5351位为f1复制起点，第5483-6343位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6614-7159位为p15A复制起点。
SEQ ID No.5的第169-202位为LoxP位点，第208-215位为NotI酶切位点，第259-368位为p10启动子，第376-393位为多克隆位点AP，第397-426位为10×His标签编码序列，第436-450位为肠激酶切割位点的识别序列，第452-473位为多克隆位点1，第644-1232位为PUC复制起点，第1443-1983位为LacZ-α表达盒，第1992-2030位为多克隆位点2，第2032-2052位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2055-2060位为SacI识别位点，第2062-2778位为荧光蛋白EGFP的编码基因序列，第2907-3188位为HSV-tk pA信号序列，第3224-3579位为R6Kγ复制起点，第3940-4734位为卡那霉素抗性蛋白编码序列。
SEQ ID No.6的第169-202位为LoxP位点，第208-215位为NotI酶切位点，第259-368位为p10启动子，第376-393位为多克隆位点AP，第397-426位为10×His标签编码序列，第436-450位为肠激酶切割位点的识别序列，第452-473位为多克隆位点1，第644-1232位为PUC复制起点，第1443-1983位为LacZ-α表达盒，第1992-2036位为多克隆位点2，第2038-2058位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2061-2066位为SacI识别位点，第2068-2778位为荧光蛋白TagRFP的编码基因序列，第2907-3188位为HSV-tk pA信号序列，第3224-3579位为R6Kγ复制起点，第3940-4734位为卡那霉素抗性蛋白编码序列。
所述SmartBac杆状病毒表达系统具体可由所述4V1G质粒、所述4V1R质粒、所述5V1TG质粒、所述5V1TR质粒、所述4V2G质粒和所述4V2R质粒组成。
当然，由前文所述的DNA片段A、所述DNA片段B、所述DNA片段C和所述DNA片段D中的全部或部分组成的DNA片段组也属于本发明的保护范围。
将所述SmartBac杆状病毒表达系统中的所述受体质粒和所述供体质粒中被昆虫细胞识别的用于表达目的蛋白的启动子、终止序列替换为能被哺乳动物细胞识别的启动子和终止序列后得到的哺乳动物细胞表达系统；以及由所述哺乳动物细胞表达系统中的所述DNA片段A、所述DNA片段B、所述DNA片段C和所述DNA片段D中的全部或部分组成的DNA片段组也属于本发明的保护范围。
所述DNA片段组或前文所述的SmartBac杆状病毒表达系统在同时表达n个目的物中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；所述n为2以上的自然数。
本发明还要求保护利用前文所述的SmartBac杆状病毒表达系统表达蛋白质复合物的方法。
本发明所提供的利用前文所述的SmartBac杆状病毒表达系统表达蛋白质复合物的方法，具体可为如下(1)或(2)：
(1)当待表达的蛋白质复合物的分子量小于600kDa时，所述方法包括如下步骤：
(a1)将组成所述蛋白质复合物的全部亚基的编码基因分成总长度接近的两组，将每组中的各亚基编码基因以所述蛋白酶的切割位点识别序列为间隔融合成一条长的融合基因，两组得到两条融合基因。
(a2)将所述两条融合基因中的一条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒；将所述两条融合基因中的另一条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒。
该步骤中所使用的所述受体质粒和所述供体质粒可选择携带有不同颜色荧光蛋白编码基因的质粒，以便可以监测不同蛋白的表达情况。
(a3)将所述重组受体质粒和所述重组供体质粒在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒。
(a4)将所述转移质粒转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒。
(a5)将所述重组杆状病毒穿梭质粒感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒；
(a6)将所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，从而实现所述蛋白质复合物的表达；
在该方法中，所述受体质粒既可为所述受体质粒甲(具体如所述4V1G质粒或所述4V1R质粒)也可为所述受体质粒乙(具体如所述5V1TG质粒或所述5V1TR质粒)。
(2)当待表达的蛋白质复合物的分子量在600kDa以上时，所述方法为如下(B)或(C)：
(B)包括如下步骤：
(b1)将组成所述蛋白质复合物的全部亚基的编码基因分成M组，将每组中的各亚基编码基因以所述蛋白酶的切割位点识别序列为间隔融合成一条长的融合基因，M组得到M条融合基因；其中，M＝2m，m为2以上的自然数。
(b2)将所述M条融合基因中的第1条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒1；将所述M条融合基因中的第2条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒1；将所述M条融合基因中的第3条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒2；将所述M条融合基因中的第4条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒2；以此类推；将所述M条融合基因中的第M-1条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒m；将所述M条融合基因中的第M条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒m。该步骤中针对所述M条融合基因所使用的各所述受体质粒最好为携带有不同颜色荧光蛋白编码基因的质粒，以便可以监测不同蛋白的表达情况。另外，克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区的所述融合基因最好是带有终止密码子的，这样保证后续所得的单个转移质粒具有单一颜色的荧光。
(b3)将所述重组受体质粒1和所述重组供体质粒1在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒1；将所述重组受体质粒2和所述重组供体质粒2在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒2；以此类推；将所述重组受体质粒m和所述重组供体质粒m在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒m。
(b4)将所述转移质粒1转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒1；将所述转移质粒2转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒2；以此类推；将所述转移质粒m转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒m。
(b5)将所述重组杆状病毒穿梭质粒1感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒1；将所述重组杆状病毒穿梭质粒2感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒2；以此类推；将所述重组杆状病毒穿梭质粒m感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒m。
(b6)将所述重组杆状病毒1、所述重组杆状病毒2、以此类推、所述重组杆状病毒m共同感染昆虫细胞，从而实现所述蛋白质复合物的表达。
(C)包括如下步骤：
(c1)将组成所述蛋白质复合物的全部亚基的编码基因分成M组，将每组中的各亚基编码基因以所述蛋白酶的切割位点识别序列为间隔融合成一条长的融合基因，M组得到M条融合基因；其中，M＝2m-1，m为2以上的自然数。
(c2)将所述M条融合基因中的第1条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒1；将所述M条融合基因中的第2条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒1；将所述M条融合基因中的第3条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒2；将所述M条融合基因中的第4条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒2；以此类推；将所述M条融合基因中的第M-2条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒(M-1)/2；将所述M条融合基因中的第M-1条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒(M-1)/2；将所述M条融合基因中的第M条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒m。该步骤中针对所述M条融合基因所使用的各所述受体质粒最好为携带有不同颜色荧光蛋白编码基因的质粒，以便可以监测不同蛋白的表达情况。另外，克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区的所述融合基因最好是带有终止密码子的，这样保证后续所得的单个转移质粒具有单一颜色的荧光。
(c3)将所述重组受体质粒1和所述重组供体质粒1在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒1；将所述重组受体质粒2和所述重组供体质粒2在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒2；以此类推；将所述重组受体质粒(M-1)/2和所述重组供体质粒(M-1)/2在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒(M-1)/2；所述重组受体质粒m即为转移质粒m。
(c4)将所述转移质粒1转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒1；将所述转移质粒2转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒2；以此类推；将所述转移质粒(M-1)/2转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒(M-1)/2；将所述转移质粒m转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒m。
(c5)将所述重组杆状病毒穿梭质粒1感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒1；将所述重组杆状病毒穿梭质粒2感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒2；以此类推；将所述重组杆状病毒穿梭质粒m感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒m。
(c6)将所述重组杆状病毒1、所述重组杆状病毒2、以此类推、所述重组杆状病毒m共同感染昆虫细胞，从而实现所述蛋白质复合物的表达。
在方法(B)和(C)中，所述受体质粒最好为所述受体质粒乙(具体如所述5V1TG质粒或所述5V1TR质粒)。
本发明还要求保护一种利用前文所述的SmartBac杆状病毒表达系统筛选待表达蛋白复合物中适于添加纯化标签的亚基的方法。
本发明所提供的利用前文所述的SmartBac杆状病毒表达系统筛选待表达蛋白复合物中适于添加纯化标签的亚基的方法，具体可为如下(3)或(4)：
(3)当待表达的蛋白质复合物的分子量小于600kDa时，所述方法包括如下步骤：
(a’1)按照所述(a1)-(a3)的步骤构建得到一个转移质粒；所述转移质粒不含有纯化标签编码序列。
(a’2)将所述待表达蛋白复合物的全部亚基的编码基因分别克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，并能够与所述纯化标签编码序列融合表达，对应每个亚基各得到一个重组受体质粒，所述重组受体质粒即为转移质粒。
(a’3)将步骤(a’1)和(a’2)中的所有转移质粒分别转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，对应每个转移质粒均得到一个重组杆状病毒穿梭质粒。
(a’4)将步骤(a’3)中的所有重组杆状病毒穿梭质粒分别感染昆虫细胞，得到各自对应的重组杆状病毒。
(a’5)将对应步骤(a’2)中各转移质粒的所有所述重组杆状病毒中每一种分别与对应步骤(a’1)中所述转移质粒的所述重组杆状病毒组合，共同感染昆虫细胞，然后根据所述纯化标签对感染后的各组细胞所表达的蛋白复合物进行纯化，从而确定所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基。
其中，在根据所述纯化标签对感染后的各组细胞所表达的蛋白复合物进行纯化后，可进行SDS-PAGE，然后根据SDS-PAGE结果按照如下确定所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基：若某添加所述纯化标签的亚基A可以将组成复合物的其它亚基都捕捉到，且除了带所述纯化标签的亚基A之外，其他各亚基之间的比例也相对比较均匀，则可确定所述亚基A为所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基。
(4)当待表达的蛋白质复合物的分子量在600kDa以上时，所述方法包括如下步骤：
(b’1)按照所述(b1)-(b3)的步骤或者所述(c1)-(c3)的步骤构建得到m个转移质粒；所述转移质粒不含有纯化标签编码序列。
(b’2)将所述待表达蛋白复合物的全部亚基的编码基因分别克隆入所述受体载体的所述待表达目的物的编码基因的插入区，并能够与所述纯化标签编码序列融合表达，对应每个亚基各得到一个重组受体质粒，所述重组受体质粒即为转移质粒。
(b’3)将步骤(b’1)和(b’2)中的所有转移质粒分别转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，对应每个转移质粒均得到一个重组杆状病毒穿梭质粒。
(b’4)将步骤(b’3)中的所有重组杆状病毒穿梭质粒分别感染昆虫细胞，得到各自对应的重组杆状病毒。
(b’5)将对应步骤(b’2)中各转移质粒的所有所述重组杆状病毒中的每一种分别与对应步骤(b’1)中所述m个转移质粒的m个所述重组杆状病毒组合，共同感染昆虫细胞，然后根据所述纯化标签对感染后的各组细胞所表达的蛋白复合物进行纯化，从而确定所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基。
其中，在根据所述纯化标签对感染后的各组细胞所表达的蛋白复合物进行纯化后，可进行SDS-PAGE，然后根据SDS-PAGE结果按照如下确定所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基：若某添加所述纯化标签的亚基A可以将组成复合物的其它亚基都捕捉到，且除了带所述纯化标签的亚基A之外，其他各亚基之间的比例也相对比较均匀，则可确定所述亚基A为所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基。
进一步地，在本发明中所述纯化标签为Twin-Strep标签。相应的，对所述待表达的蛋白复合物进行纯化时可用Strep亲和介质进行纯化。
在本发明的一个实施例中，所述m具体为2。
在本发明的一个具体实施例中，所述待表达蛋白复合物具体为人源exocyst复合物。所述人源exocyst复合物由如下8个蛋白亚基组成：EXOC1(102kDa)，EXOC2(104kDa)，EXOC3(86kDa)，EXOC4(110kDa)，EXOC5(82kDa)，EXOC6(94kDa)，EXOC7(78kDa)和EXOC8(82kDa)。
相应的，本发明提供的表达所述人源exocyst复合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)将重组受体质粒5V1TR-E47(全序列如SEQ ID No.16所示)和重组供体质粒4V2-E1S5(全序列如SEQ ID No.19所示)在Cre重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒E1S547；将重组受体质粒5V1TG-E63(全序列如SEQ ID No.15所示)和重组供体质粒4V2-E28(全序列如SEQ ID No.18所示)在Cre重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒E2863。
(2)将所述转移质粒E1S547转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒BC-E1S547；将所述转移质粒E2863转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒BC-E2863。
(3)将所述重组杆状病毒穿梭质粒BC-E1S547转染昆虫细胞，可以得到重组杆状病毒BV-E1S547；将所述重组杆状病毒BC-E2863转染昆虫细胞，可以得到重组杆状病毒BV-E2863。
(4)将所述重组杆状病毒BV-E1S547与所述重组杆状病毒BV-E2863共同感染昆虫细胞，从而实现所述人源exocyst复合物的表达。
在本发明中，所述昆虫细胞具体为Sf9细胞。
最后，本发明还要求保护利用前文所述的哺乳动物细胞表达系统表达蛋白质复合物的方法。该方法与本发明所提供的利用前文所述的SmartBac杆状病毒表达系统表达蛋白质复合物的方法相比，差别仅在于将其中的所述SmartBac杆状病毒表达系统替换为所述哺乳动物细胞表达系统，并将昆虫细胞替换为哺乳动物细胞。
针对方法1中所出现的三种问题，本发明设计了SmartBac系列载体来解决，并提出了三种克隆的策略以实现分子量的在600kDa以下的蛋白质复合物表达、分子量在600kDa以上的蛋白质复合物的表达以及高效筛选最适合添加纯化标签的亚基。实验证明，采用本发明所设计的新型SmartBac杆状病毒表达系统及具体克隆策略表达人源exocyst复合物，发现带有Twin-strep标签的EXOC5亚基最适合于纯化整个Exocyst复合物，并且最终成功表达纯化出人源exocyst，其与从酵母中提取的exocyst有着相似的尺寸和形状，而且体外活性测定表明该重组表达的exocyst复合物具有生物学活性。本发明对于在昆虫细胞中重组表达组分复杂、分子量较大的蛋白质复合物具有重要意义。此外，本发明中各载体上被昆虫细胞识别的用于表达目的蛋白的启动子、终止序列可以替换为能被哺乳动物细胞识别的启动子和终止序列，则替换后的载体系统可以用于在哺乳动物细胞中表达复杂的蛋白质复合物，因此本发明也提供了一种在哺乳动物细胞中重组表达复杂蛋白质复合物的方法。
附图说明
图1为SmartBac系统所含6种载体的质粒图谱。
图2为表达蛋白质复合物的克隆策略(方案1和方案2)。a和b为表达分子量小于600kDa的蛋白质复合物的克隆策略(方案1)。a为将编码8种亚基的基因分成总长度接近的两组。b为表达分子量小于600kDa的蛋白质复合物的具体克隆示意图。c为表达分子量大于600kDa的蛋白质复合物的克隆策略(方案2)。
图3为筛选最佳的带有纯化标签的亚基的策略(方案3)。a为所构建的10个转移质粒；b为包装出的10个重组杆状病毒；c为感染昆虫细胞的8种病毒组合(每种组合都含有3种病毒)；d为确定了适于带有纯化标签的亚基后继续表达蛋白复合物的流程图。
图4为采用SmartBac杆状病毒表达系统表达人源exocyst复合物的表达效果鉴定。a为根据荧光蛋白表达情况初步判定蛋白亚基表达情况；b为SDS-PAGE鉴定哪个蛋白亚基适合于带有Twin-strep标签用于纯化整个exocyst复合物；c为SDS-PAGE鉴定纯化好的exocyst复合物；d为exocyst复合物的电镜负染图；e为d所示电镜图进一步使用RELION 2进行二维分类的结果；f为使用EMAN2产生的exocyst复合物的初始模型。
图5为昆虫细胞表达的人源exocyst复合物的生物学活性测定结果。a为四个组中实验组(脂质体A+Rab11Q70L+Exocyst+脂质体B)相对于其它三个对照组在585nm处，有明显的荧光发射峰，而只加入Rab11Q70L或exocyst复合物的对照组，相对于没有加入任何一种蛋白的对照组AB，均没有明显的荧光能量共振转移。b为三次独立实验的平均值及误差，纵坐标是三个对照组与实验组在585nm处荧光值与533nm处荧光值的比。
具体实施方式
1、SmartBac载体系统描述
SmartBac系统含有6种载体，其中有4种是受体质粒，2种是供体质粒(图1)。本发明采用广泛适用的UPS(univector plasmid-fusion system)策略来克服用常规克隆方法构建大质粒的困难。该策略使用Cre-loxP位点特异性重组来催化供体质粒和受体质粒之间的融合。具有卡那霉素抗性(K+)的供体质粒携带R6Kγ条件复制起点，质粒仅能在含有pir基因的细菌宿主中繁殖。具有氨苄青霉素抗性(A+)的受体质粒携带非条件型复制起点，在所有菌株中都能复制。供体质粒和受体质粒上都有一个LoxP位点，可以被Cre重组酶识别发生分子间重组。将供体质粒和受体质粒进行融合反应后，将反应产物转化不含有pir基因的菌株(pir-菌株)，用A+K+双抗平板进行筛选，可以得到含有融合质粒的菌落。利用这种策略，本发明可以先制备含有几个目的基因的供体和受体质粒，再将供体、受体质粒融合来得到较大的质粒。
4种受体质粒分别是4V1G，4V1R，5V1TG和5V1TR，2种供体质粒分别是4V2G和4V2R。受体质粒含有p15A复制起点，其允许质粒以低拷贝在普通大肠杆菌克隆菌株中繁殖，它更好的维持了大质粒的稳定性。受体质粒还含有氨苄青霉素和庆大霉素的抗性标记，以及用于产生重组杆状病毒的小型Tn7元件侧翼。受体质粒中启动转基因序列在昆虫细胞中表达的是p6.9启动子。与常规使用的极晚期多角体蛋白polyhedrin启动子相比，p6.9启动子在感染的早期阶段驱动表达，这时的细胞状态与病毒感染晚期相比更好，可以避免表达的外源蛋白质的聚集。
4V1G和4V1R受体质粒携带N端HA标记的TEV蛋白酶编码序列，随后是TEV蛋白酶切割位点(TCS)和Twin-Strep标签编码序列，随后是肠激酶切割位点的识别序列。在多克隆位点(MCS)1和2之间，存在LacZ-α表达盒，其允许重组克隆的蓝/白选择。另一个TCS和EGFP(4V1G)或TagRFP(4V1R)编码序列在MCS2的下游。荧光蛋白和靶蛋白可以表达为单个ORF。通过观察感染细胞的荧光，就可以很容易地确定目标蛋白是否已经表达。
在5V1TG和5V1TR受体质粒中(不同于4V1G与4V1R受体质粒)，将TEV蛋白酶和EGFP(5V1TG)或TagRFP(5V1TR)编码序列融合并表达为GP64启动子驱动的ORF。这样可以完全避免4V1G与4V1R中可能出现的荧光蛋白与多肽链之间剪切不完全的情况。
4V2G和4V2R供体质粒携带N-末端10×His标签编码序列，随后是肠激酶切割位点的识别序列。两种载体均含有卡那霉素抗性标记。筛选区域由高拷贝PUC复制起点和侧翼为MCS1和MCS2的LacZ-α表达盒组成。在MCS2的下游，存在TCS和荧光蛋白(4V2G中为EGFP和4V2R中为TagRFP)编码序列。靶蛋白的表达是由非常晚的p10启动子驱动的。4V2载体也含有条件复制起点R6Kγ。一旦筛选区被外源基因取代，供体载体仅包含R6Kγ起点，并且只能在具有pir+基因型的大肠杆菌菌株中繁殖。
在4V1/5V1受体质粒和4V2供体质粒中的p6.9和p10启动子区域的两侧分别存在几个单一的限制性酶切位点，这样当需要时，就可以将现有的启动子剪切下来，替换为其它的可以在昆虫细胞中启动蛋白质表达的启动子。
2、SmartBac载体系统应用策略
使用Smartbac载体系统可以在昆虫细胞中更容易和更快地表达大的蛋白质复合物。可以使用多种实验方案从Smartbac载体产生最终用于表达蛋白质复合物的转移质粒。这里本发明只提出两个经典方案来说明如何使用Smartbac系列载体。
方案1、表达分子量小于600kDa的蛋白质复合物的克隆策略
假设要在昆虫细胞中表达由8个不同亚基A，B，C，D，E，F，G和H构成的蛋白质复合物。如果该复合物的分子量小于600kDa，可以采用方案1。如图2中a所示，将编码8种亚基的基因分成总长度接近的两组，第一组含有基因A、B、C、D；第二组含有基因E、F、G和H。将每一组的四条基因拼接成以TCS编码位点为间隔的一条长的融合基因。第一组的融合DNA片段为ABCD，第二组的融合DNA片段为EFGH。接下来，将长的ABCD片段进一步分成两个短的DNA片段AB和CD；而长的EFGH片段则分成EF和GH这两个较短的DNA片段。接下来设计相应的引物，利用重叠PCR的方法将A、B片段融合为AB，C、D片段融合为CD，E、F片段融合为EF，G、H片段融合为GH。然后通过Gibson组装反应，将片段AB和CD与线性化的Smartbac RFP表达受体质粒融合。同理，片段EF和GH也与线性化的Smartbac GFP表达供体质粒(4V2G)进行了融合。利用SmartBac系列载体，含有阳性重组质粒4V1R-ABCD与4V2G-EFGH重组菌可以很容易的通过蓝白筛选选择出来。最后提取出4V1R-ABCD与4V2G-EFGH这两种质粒，通过Cre-LoxP位点特异性重组将它们融合为最终转移质粒ABCD-EFGH。将该质粒转化到DH10Bac感受态细胞后，将获得重组Bacmid。将该Bacmid转染昆虫细胞中，就会产生用于表达目标复合物的高滴度杆状病毒BV-ABCD-EFGH。通过监测TagRFP的红色荧光，可以知道ABCD融合蛋白的表达情况；而监测EGFP的绿色荧光，可以判断EFGF融合蛋白的表达情况。图2中b所示的是使用4V1R与4V2G，但也可以使用5V1TR与4V2G，或使用4V1G与4V2R，或使用5V1TG与4V2R。
方案2、表达分子量大于600kDa的蛋白质复合物的克隆策略
如果要表达的蛋白质复合物的分子量大于600kDa，使用方案1就需要构建出长度大于25kb的最终转移质粒。在没有经验的情况下构建这么大的质粒通常是很困难的。即使构建成功，多蛋白复合物也可能不能在昆虫细胞中表达。这是因为大转移质粒产生的重组杆状病毒易于展现出内在的遗传不稳定性。在P2代病毒扩增期间可能发生外源基因的丢失。在这种情况下，使用方案2更加合适。如图2中c所示，片段A和B与线性化的5V1TR组装形成5V1TR-AB质粒，片段C和D与线性化的4V2载体融合成4V2-CD质粒。基因D的3’末端加入了终止密码子，这样存在于4V2G和4V2R载体上的荧光蛋白不会被表达。5V1TR-AB与4V2-CD会通过Cre-LoxP位点特异性重组融合为最终转移质粒ABCD(RFP)，这个质粒转化DH10Bac会产生重组Bacmid-ABCD。同理制备装载片段E和F的5V1TG-EF质粒与装载片段G和H的4V2-GH质粒，两者可以融合为另一个最终转移质粒EFGH(GFP)，并转化DH10Bac产生重组Bacmid-EFGH。用两种重组Bacmid分别感染昆虫细胞，会得到两种重组杆状病毒BV-ABCD与BV-EFGH。BV-ABCD会表达亚基A，B，C和D以及TagRFP，而BV-EFGH会表达亚基E，F，G和H以及EGFP。因此用这两种病毒同时感染杆状病毒的昆虫细胞将产生完整的蛋白质复合物，其中TagRFP和EGFP荧光的出现表明各亚基已经成功表达。图2中c所示的是使用5V1TG与5V1TR这两种受体质粒，也可使用以下的受体质粒组合：4V1G与4V1R，5V1TG与4V1R，5V1TR与4V1G。
方案3、筛选最佳的带有纯化标签的亚基的策略
Smartbac系统的4种受体质粒都携带N端Twin-Strep标签，2种供体质粒携带N端10×His标签。每个标签可以与目的亚基融合表达，用来纯化整个复合物。假设要表达一个分子量大于600kDa，含8种不同亚基A，B，C，D，E，F，G和H构成的蛋白质复合物。由于先验知识的缺乏，不知道把纯化标签加在哪一种亚基上对纯化整个复合物更加有利。本发明要采用以下的克隆构建方案，筛选出最适合加纯化标签的亚基，用于整个复合物的纯化。首先根据方案2构建两个大的最终转移质粒ABCD(TagRFP)和EFGH(EGFP)，这两个大质粒上表达的任何一个亚基都不含有纯化标签(图3中a)。然后用任意一种受体质粒(4V1G，4V1R，5V1TG或5V1TR)构建出8个较小的转移质粒(从V1-TSA到V1-TSH)，每个质粒都表达N端带有Twin-Strep-标签的亚基。这样最终会获得10个重组杆状病毒，包括BV-ABCD(TagRFP)，BV-EFGH(EGFP)和BV-TSn(其中n从A到H)(图3中b)。接下来用三种杆状病毒——BV-ABCD(TagRFP)，BV-EFGH(EGFP)和一种BV-TSn共感染昆虫细胞。这样我们一共有8种病毒组合(每种组合都含有3种病毒)要尝试(图3中c)。在将用8种病毒组合感染的细胞进行裂解，并用Strep亲和介质进行纯化后，会分析出带亲和标记的亚基H用于纯化整个复合物的效果最好。这时为了增加产量并获得更均匀的样品，需要构建一个新的中间载体G-TSH，在这个新载体中亚基H带有Twin-Strep亲和标签。利用新载体G-TSH和原有的中间载体EF融合，将产生一个新的转移载体——EFG-TSH(EGFP)，这个新的转移载体会产生新的重组杆状病毒BV-EFG-TSH(GFP)。用它和已有的重组杆状病毒BV-ABCD(TagRFP)一起感染昆虫细胞，将实现目的蛋白质复合物的表达(图3中d)。病毒感染和蛋白质表达情况可以由被感染细胞的EGFP和TagRFP的荧光分布和强度来监测。
实施例1、采用SmartBac杆状病毒表达系统表达人源exocyst复合物
本实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、本发明首先构建SmartBac系统的6种载体。6种载体在金唯智基因合成公司合成。
四种受体质粒：
(1)4V1G质粒
4V1G质粒的全序列为SEQ ID No.1。其中，SEQ ID No.1的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1224位为多克隆位点BP，第1235-1329位为p6.9启动子，第1339-2097位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第2098-2118位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2119-2205位为Twin-Strep标签编码序列，第2206-2220位为肠激酶切割位点的识别序列，第2222-2249位为多克隆位点1，第2250-2790位为LacZ-α表达盒，第2799-2837位为多克隆位点2，第2839-2859位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2862-2867位为SalI识别位点，第2869-3585位为荧光蛋白EGFP的编码基因序列，第3731-3971为SV40pA信号序列，第4000-4165位为Tn7L元件，第4349-4804位为f1复制起点，第4936-5796位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6067-6612位为p15A复制起点。
(2)4V1R质粒
4V1R质粒的全序列为SEQ ID No.2。其中，SEQ ID No.2的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1224位为多克隆位点BP，第1235-1329位为p6.9启动子，第1339-2097位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第2098-2118位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2119-2205位为Twin-Strep标签编码序列，第2206-2220位为肠激酶切割位点的识别序列，第2222-2249位为多克隆位点1，第2250-2790位为LacZ-α表达盒，第2799-2843位为多克隆位点2，第2845-2865位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列(TCS)，第2868-2873位为SalI识别位点，第2875-3585位为荧光蛋白TagRFP的编码基因序列，第3731-3971为SV40pA信号序列，第4000-4165位为Tn7L元件，第4349-4804位为f1复制起点，第4831-4935位为Amp启动子，第4936-5796位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6067-6612位为p15A复制起点。
(3)5V1TG质粒
5V1TG质粒的全序列为SEQ ID No.3。其中，SEQ ID No.3的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1193位为I-CeuI酶切位点，第1202-1207位为AatII酶切位点，第1208-1514位为IE1ter信号序列，第1515-1522位为FseI酶切位点，第1531-2247位为荧光蛋白EGFP的编码基因序列，第2248-2253位为SmaI酶切位点，第2254-2274位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2275-3033位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第3034-3041位为SwaI酶切位点，第3047-3252位为GP64启动子，第3290-3295位为BspEI酶切位点，第3306-3400位为P6.9启动子，第3407-3418位为多克隆位点AP，第3419-3505位为Twin-Strep标签编码序列，第3506-3520位为肠激酶切割位点的识别序列，第3522-2549位为多克隆位点1，第3550-4090位为LacZ-α表达盒，第4099-4149位为多克隆位点2，第4281-4521位为SV40pA信号序列，第4550-4715位为Tn7L元件，第4899-5354位为f1复制起点，第5486-6346位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6617-7162位为p15A复制起点。
(4)5V1TR质粒
5V1TR质粒的全序列为SEQ ID No.4。其中，SEQ ID No.4的第20-243位为Tn7R元件，第310-843位为庆大霉素抗性蛋白的编码基因序列，第1131-1164位为loxP位点，第1168-1193位为I-CeuI酶切位点，第1202-1207位为AatII酶切位点，第1208-1514位为IE1ter信号序列，第1515-1522位为FseI酶切位点，第1531-2244位为荧光蛋白TagRFP的编码基因序列，第2245-2250位为SmaI酶切位点，第2251-2271位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2272-3030位为N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列，第3031-3038位为SwaI酶切位点，第3044-3249位为GP64启动子，第3287-3292位为BspEI酶切位点，第3303-3397位为P6.9启动子，第3404-3415位为多克隆位点AP，第3416-3502位为Twin-Strep标签编码序列，第3503-3517位为肠激酶切割位点的识别序列，第3519-3546位为多克隆位点1，第3547-4087位为LacZ-α表达盒，第4096-4146位为多克隆位点2，第4278-4518位为SV40pA信号序列，第4547-4712位为Tn7L元件，第4896-5351位为f1复制起点，第5483-6343位为氨苄青霉素抗性蛋白的编码基因序列，第6614-7159位为p15A复制起点。
两种供体质粒：
(1)4V2G质粒
4V2G质粒的全序列为SEQ ID No.5。其中，SEQ ID No.5的第169-202位为LoxP位点，第208-215位为NotI酶切位点，第259-368位为p10启动子，第376-393位为多克隆位点AP，第397-426位为10×His标签编码序列，第436-450位为肠激酶切割位点的识别序列，第452-473位为多克隆位点1，第644-1232位为PUC复制起点，第1443-1983位为LacZ-α表达盒，第1992-2030位为多克隆位点2，第2032-2052位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2055-2060位为SacI识别位点，第2062-2778位为荧光蛋白EGFP的编码基因序列，第2907-3188位为HSV-tk pA信号序列，第3224-3579位为R6K复制起点，第3940-4734位为卡那霉素抗性蛋白编码序列。
(2)4V2R质粒
4V2R质粒的全序列为SEQ ID No.6。其中，SEQ ID No.6的第169-202位为LoxP位点，第208-215位为NotI酶切位点，第259-368位为p10启动子，第376-393位为多克隆位点AP，第397-426位为10×His标签编码序列，第436-450位为肠激酶切割位点的识别序列，第452-473位为多克隆位点1，第644-1232位为PUC复制起点，第1443-1983位为LacZ-α表达盒，第1992-2036位为多克隆位点2，第2038-2058位为TEV蛋白酶切割位点的识别序列，第2061-2066位为SacI识别位点，第2068-2778位为荧光蛋白TagRFP的编码基因序列，第2907-3188位为HSV-tk pA信号序列，第3224-3579位为R6K复制起点，第3940-4734位为卡那霉素抗性蛋白编码序列。
2、利用本发明的方案3，首次在昆虫细胞中表达了人源exocyst复合物，筛选到了最适于纯化该复合物的亚基。利用该亚基上的纯化标签，成功的纯化到较为均一的、具有生物学活性的exocyst复合物。对纯化后的样品使用负染色技术进行了电镜观察，发现该样品的形状与酿酒酵母中天然提取的exocyst复合物的形状相似。
Exocyst复合体负责将分泌小泡束缚在质膜上，为可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)附着蛋白受体(SNARE)介导的膜融合做准备。人源exocyst复合物包含8个在进化上非常保守的亚基——EXOC1(102kDa)，EXOC2(104kDa)，EXOC3(86kDa)，EXOC4(110kDa)，EXOC5(82kDa)，EXOC6(94kDa)，EXOC7(78kDa)和EXOC8(82kDa)。因为该复合物之前没有被重组表达过，所以不知道在哪个亚基上加纯化标签最适于纯化整个exocyst复合物。为了确定最适和纯化整个复合物的亚基，本发明采用方案3进行载体构建工作。表1列出了本发明在昆虫细胞中重组表达exocyst所构建的所有载体。
表1 使用SmartBac系统重组表达人源Exocyst复合物所构建的载体及使用的病毒
Figure GDA0001585712070000181
编码exocyst各亚基的基因都来自Origene公司(EXOC1-SC126966，EXOC2-SC111916，EXOC3-RC209413，EXOC4-SC102359，EXOC5-SC127665，EXOC6-SC100885，EXOC7-RC227511，EXOC8-RC207859)。Rab11(1-173)Q70L基因在金唯智公司合成。所用到的引物在Invitrogen公司进行合成。所有克隆的测序都在北京博尚公司进行。限制性内切酶BamHI-HF、EcoRI-HF、KpnI-HF、NdeI、NotI-HF、XhoI，碱性磷酸酶CIP，DNA聚合酶Q5Premix，Cre重组酶及Gibson组装试剂盒
Figure GDA0001585712070000182
HiFi DNA Assembly Master Mix为NEB公司产品。胶回收试剂盒为Qiagen公司产品。DNA聚合酶KOD-FX为Toyoba公司产品。GT115感受态细胞是Invivogen公司产品。Trans2-blue感受态细胞是全式金公司公司产品。DNA Ligation Kit来自Takara公司。感受态细胞DH10Bac、昆虫细胞sf9、转染试剂cellfectin II和Grace’sInsect Cell Culture Medium，Unsupplemented培养基均为Invitrogen公司产品，产品目录号分别为10361012、B82501、10362100和11595030。活性测定用磷脂Rhod B-DHPE也购自Invitrogen公司，其它各种磷脂和制备脂质体所用的Extruder装置均购自Avanti LipidsPolar公司。昆虫细胞培养基ESF921为Expression System公司产品。Strep亲和介质为IBA公司产品。蛋白酶抑制剂(Complete-EDTA Free)与Ni-NTA介质为Roche公司产品。分子筛Superdex 200(10/300GL)购自GE公司。GTP购自Sigma公司。其它试剂材料，均可从商业途径得到。
裂解缓冲液1：含有50mM HEPES pH 8.0，150mM NaCl，10％(v/v)甘油，1mM DTT(补充了Roche蛋白酶抑制剂)。
洗脱缓冲液1：含有50mM HEPES pH 8.0，150mM NaCl，10％(v/v)甘油，1mM DTT，10mM脱硫生物素。
裂解缓冲液2：含有20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，20mM imidazole，0.1mMPMSF。
洗脱缓冲液2：含有20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，150mM imidazole，0.1mMPMSF。
分子筛缓冲液：含有20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.1mM PMSF。
测活缓冲液：50mM Hepes pH7.4，150mM NaCl。
2.1双基因中间载体的构建
双基因中间载体构建时用到的引物如表2所示
表2 双基因中间载体构建时用到的引物
Figure GDA0001585712070000191
(1)各亚基片段的PCR反应
Exocyst八种亚基基因的PCR反应如表3所示。
表3 Exocyst八种亚基基因的PCR反应
模板 第一轮PCR反应用引物对 第二轮PCR反应用引物对
EXOC1基因 E1F1和E1R1 E1F2和E1R2
EXOC2基因 E2F1和E2R1 E2F2和E2R2
EXOC3基因 E3F1和E3R1 E3F2和E3R2
EXOC4基因 E4F1和E4R1 E4F2和E4R2
EXOC5基因 E5F1和E5R1 E5F2和E5R2
EXOC6基因 E6F1和E6R1 E6F2和E6R2
EXOC7基因 E7F1和E7R1 E7F2和E7R2
EXOC8基因 E8F1和E8R1 E8F2和E8R2
以含有目的基因的质粒为模板，进行表3中的PCR反应。第一轮PCR用NEB公司的Q5Premix完成。反应程序为：98℃，30s；(98℃10s，72℃3min，共30个循环)，72℃10min。第一轮PCR产物回收后，作为模板进行第二轮PCR反应。反应程序为：98℃，30s；(98℃10s，72℃3min，共30个循环)，72℃10min。回收PCR产物。
(2)载体的线性化
用限制性内切酶NdeI、KpnI-HF和EcoRI-HF酶切质粒4V2G，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；最后利用胶回收试剂盒回收约2.5kb的载体骨架4V2。
用限制性内切酶NdeI、XhoI酶切质粒5V1TG，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；最后利用胶回收试剂盒回收约7kb的载体骨架。
用限制性内切酶NdeI、XhoI酶切质粒5V1TR，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；最后利用胶回收试剂盒回收约7kb的载体骨架。
(3)PCR产物与线性化载体的Gibson组装反应
按照HiFi DNA Assembly Master Mix的说明书，将线性化的4V2载体骨架与EXOC1、EXOC5的第二轮PCR产物进行Gibson重组，以得到重组质粒4V2-E15；将线性化的4V2载体骨架与EXOC2、EXOC8的第二轮PCR产物进行重组，以得到重组质粒4V2-E28。重组产物转化GT115感受态细胞，通过抗生素筛选和蓝白斑筛选，挑取白色的重组菌落，进行PCR鉴定。阳性菌落提取质粒并送测序。保存测序正确的克隆。
同理，将线性化的5V1TG载体与EXOC6、EXOC3的第二轮PCR产物进行Gibson组装，以得到重组质粒5V1TG-E63；将线性化的5V1TR载体与EXOC4、EXOC7的第二轮PCR产物进行Gibson组装，以得到重组质粒5V1TR-E47。将这两种组装产物分别转化Trans2-blue感受态细胞，通过抗生素筛选和蓝白斑筛选，挑取白色的重组菌落，进行PCR鉴定。阳性菌落提取质粒并送测序。保存测序正确的克隆。
重组质粒4V2-E15的全序列如SEQ ID No.17所示；重组质粒4V2-E28的全序列如SEQ ID No.18所示；重组质粒5V1TG-E63的全序列如SEQ ID No.15所示；重组质粒5V1TR-E47的全序列如SEQ ID No.16所示。这四个重组质粒不表达Twin-Strep标签。
2.2单基因中间载体的构建
(1)各亚基片段的PCR反应及酶切处理
以含有目的基因的质粒为模板，进行表3中的第一轮PCR反应。用NEB公司的Q5Premix完成。反应程序为：98℃，30s；(98℃10s，72℃3min，共30个循环)，72℃10min。回收PCR产物。EXOC1、EXOC6的PCR产物用BamHI-HF和XhoI双酶切，EXOC7的PCR产物用KpnI-HF和XhoI双酶切；EXOC2，EXOC3，EXOC4，EXOC5的PCR产物用NotI和XhoI双酶切；EXOC8的PCR产物用EcoRI-HF和KpnI-HF双酶切。
(2)载体的线性化
用限制性内切酶BamHI-HF和XhoI双酶切质粒5V1TG，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；
用限制性内切酶KpnI-HF和XhoI双酶切质粒5V1TG，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；
用限制性内切酶NotI和XhoI双酶切质粒5V1TG，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；
用限制性内切酶EcoRI-HF和KpnI-HF双酶切质粒5V1TG，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；
利用胶回收试剂盒回收以上四种约7kb的载体骨架。
(3)目的片段与载体骨架的连接反应
按照Takara DNA ligation Kit的说明书进行酶切处理的PCR片段与线性化载体的连接反应，以生成5V1TG-SEn系列质粒(n为从1到8的自然数，对应于EXOC1到EXOC8)。连接反应物转化将这两种组装产物分别转化Trans2-blue感受态细胞，通过抗生素筛选和蓝白斑筛选，挑取白色的重组菌落，进行PCR鉴定。阳性菌落提取质粒并送测序。保存测序正确的克隆。
重组质粒5V1TG-SE1的全序列如SEQ ID No.7所示；重组质粒5V1TG-SE2的全序列如SEQ ID No.8所示；重组质粒5V1TG-SE3的全序列如SEQ ID No.9所示；重组质粒5V1TG-SE4的全序列如SEQ ID No.10所示；重组质粒5V1TG-SE5的全序列如SEQ ID No.11所示；重组质粒5V1TG-SE6的全序列如SEQ ID No.12所示；重组质粒5V1TG-SE7的全序列如SEQ IDNo.13所示；重组质粒5V1TG-SE8的全序列如SEQ ID No.14所示。这八个重组质粒中EXOC蛋白的N端与Twin-Strep标签融合表达。
2.3最终转移载体E1547与E2863的构建
(1)将0.1pmol的重组质粒5V1TR-E47与4V2-E15和1μl的Cre重组酶在20μl反应体系中混匀，30℃孵育1小时。用10μl反应混合物转化100μl Trans2-blue感受态细胞。42℃热休克30s后，加入500μl SOC培养基，30℃振荡孵育4h。将细胞悬浮液铺在含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，30℃倒置培养24小时。使用引物Loxp-F(5'-CCACTGCGCCGTTACCAC-3')和Loxp-R(5'-GCCGGTATGTACAGGAAG-3')对重组菌落进行PCR鉴定。阳性菌落可以扩增出375bp的PCR产物。从阳性克隆中提取最终转移质粒E1547。
(2)由重组质粒5V1TG-E63与4V2-E28构建出最终转移质粒E2863的过程参考步骤(1)完成。
2.4昆虫细胞中试表达人源Exocyst复合体并筛选最适于纯化整个复合物的亚基
(1)将8种重组质粒5V1TG-SEn，2种最终转移质粒E1547、E2863转化DH10Bac感受态细胞，通过抗生素筛选和蓝白斑筛选，得到重组菌落。(注释：E1547和E2863为大于19kb的大质粒，因此它们的转化菌在30℃培养以避免基因丢失现象)
(2)完成步骤(1)后，提取重组菌落的重组Bacmid DNA，并进行PCR鉴定。5V1TG-SEn的各重组Bacmid用经典的鉴定方法即可(详见Invitrogen Bac to Bac manual)。E1547、E2863质粒产生的Bacmid首先用下面三对引物进行鉴定。Tn7R引物对：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’和5’-AAGTTTGAGCAGCCGCGTAG-3’；Tn7L引物对：5‘-CAGGAAACAGCTATGAC-3’和5‘-ACCTCCCCCTGAACCTGAAA-3’；Empty引物对：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’和5‘-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。对于阳性Bacmid，使用“Tn7R”和“Tn7L”引物对，可以扩增出661bp和521bp的PCR产物。如果重组Bacmid被野生型杆粒污染，则使用“Empty引物对”会产生300bp的PCR产物。
(3)完成步骤(2)后，进一步用PCR的方法鉴定各条基因在重组Bacmid中真实存在。
(4)用Grace’s Insect Cell Culture Medium，Unsupplemented昆虫细胞培养基稀释处于对数生长期的sf9细胞，得到稀释液，稀释液中sf9细胞的密度为5.0×105个/mL。
(5)向直径为35mm的平皿中加入2mL步骤(4)得到的稀释液，28℃、培养4h。
(6)向溶液B中加入溶液A，混匀，室温放置25min，得到混合物。其中，溶液A的制备方法为向100μL Grace’s Insect Cell Culture Medium，Unsupplemented昆虫细胞培养基加入2.5μg步骤(2)提取的重组Bacmid DNA(PCR鉴定为阳性结果)；溶液B的制备方法为取100μLGrace’s Insect Cell Culture Medium，Unsupplemented昆虫细胞培养基加入8μLcellfectin II。
(7)完成步骤(6)后，取所述平皿，逐滴加入步骤(6)得到的混合物，然后28℃、培养4h；弃上清，加入2mL Sf-900TMII SFM培养基，28℃静置培养144h。
(8)完成步骤(7)后，取所述平皿，用Nikon TS100倒置荧光显微镜观察(使用NikonB-2A荧光模块观察，激发波长范围450～490nm；使用Nikon-2A荧光模块观察，激发波长范围510～560nm)。若绿色荧光与红色荧光都有较好的表达(图4中a)，则收取上清，获得P1代病毒液。5V1TG-SEn质粒、E2863质粒和E1547质粒最终产生的病毒分别命名为BV-SEn、BV-E2863、BV-E1547。
(9)完成步骤(8)后，取P1代病毒液200μL，接种于装有180mL、sf9细胞浓度为2.0×106个/mL的昆虫细胞培养基的2L三角摇瓶中，28℃、150rpm培养96h。然后4℃、2000g离心5min，取上清液，获得P2代病毒液。
(10)取5mL BV-E1547P2代病毒液，5ml BV-E2863-P2代病毒，2.5ml BV-SEn病毒中的一种(因为BV-SEn病毒一共有8种，因此这里一共有8种病毒组合，每种组合含有三种病毒)接种于装有500mL、sf9细胞浓度为2.0×106个/mL的昆虫细胞培养基的2L三角摇瓶中，28℃、150rpm培养72h。然后4℃、2000g离心5min，收集沉淀，即为SEn感染细胞。将收集的细胞冻存于-80℃。
(11)完成步骤(10)后，取所述感染细胞，先用裂解缓冲液1重悬，使用Dounce匀浆器匀浆40次(整个匀浆过程中，细胞一直处于冰浴中)得到细胞裂解液；然后4℃、18000rpm离心40min，收集上清液。
(12)完成步骤(11)后，将收集的上清液上样至Strep自装柱，先用50个柱体积的裂解缓冲液1洗脱以去除杂蛋白，再用10个柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收集过柱后的洗脱液进行SDS-PAGE，结果如图4中b所示。从SDS-PAGE结果上看，用带有Twin-strep标签的EXOC5进行的纯化，可以抓到较多的亚基，且除了带Twin-strep标签的EXOC5之外，各亚基之间的比例比较均匀，因此判断从实验结果判断带有Twin-strep标签的EXOC5最适合于纯化整个exocyst复合物。
为了得到更加均一的exocyst样品，本发明进行了第二轮的分子克隆设计。主要是完成4V2-E1S5质粒的构建。在这个质粒中，EXOC5含有Twin-strep标签。具体方法如下：
2.5中间转移载体4V2-E1S5的构建
(1)以5V1TG-SE5质粒为模板，引物S5-F与S5-R(序列见表1)及NEB Q5Premix进行PCR反应。反应程序为：98℃，30s；(98℃10s，72℃3min，共30个循环)，72℃10min。回收PCR产物，得到S-EXOC5片段。
(2)将线性化的4V2载体骨架与EXOC1的第二轮PCR产物、S-EXOC5片段进行Gibson重组，得到重组质粒4V2-E1S5。
重组质粒4V2-E1S5的全序列如SEQ ID No.19所示。
2.6最终转移载体E1S547的构建
将0.1pmol的重组质粒5V1TR-E47与4V2-E1S5和1μl的Cre重组酶在20μl反应体系中混匀，30℃孵育1小时。用10ul反应混合物转化100μl的Trans2-blue感受态细胞。42℃热休克30s后，加入500μl SOC培养基，30℃振荡孵育4h。将细胞悬浮液铺在含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，30℃倒置培养24小时。使用引物Loxp-F(5'-CCACTGCGCCGTTACCAC-3')和Loxp-R(5'-GCCGGTATGTACAGGAAG-3')对重组菌落进行PCR鉴定。阳性菌落可以扩增出375bp的PCR产物。从阳性克隆中提取最终转移质粒E1S547。
2.7在昆虫细胞中表达人源Exocyst复合体并进行电镜负染观察
(1)将最终转移质粒E1S547转化DH10Bac感受态细胞，通过抗生素筛选和蓝白斑筛选，得到重组菌落。
(2)完成步骤(1)后，提取重组菌落的重组Bacmid DNA，并进行PCR鉴定。鉴定方法同2.4的步骤(2)和步骤(3)。
(3)取得E1S547的P2代病毒，即BV-E1S547的第二代病毒。具体步骤同2.4的步骤(4)至步骤(9)。
(4)完成步骤(3)后，用5mL BV-E1S547P2代病毒液和5ml BV-E2863-P2代病毒共同感染培养在2L三角摇瓶中的500mL的sf9细胞，细胞密度为2.0×106个/mL。细胞培养物在28℃、150rpm培养72h。然后4℃、2000g离心5min，收集沉淀，冻存于-80℃。
(5)完成步骤(4)后，进行蛋白质的纯化。步骤同2.4的步骤(11)和步骤(12)。纯化好的exocyst复合物进行SDS-PAGE，结果如图4中c所示，含有组成复合物的全部8种亚基，各亚基比例相当。
(6)完成步骤(5)后，将纯化得到的exocyst复合物用裂解缓冲液1稀释至0.02mg/ml，再用经辉光放电处理的铺有薄碳膜的载网(载网为Life Trust公司产品)吸附样品1min。用裂解缓冲液1将载网洗涤两次，并用4％(w/v)乙酸铀酰染色2分钟。
(7)完成步骤(6)后，用FEI Talos F200C电子显微镜(ThermoFisher，USA)在200kv下观察载网。在28,000倍放大率下，使用4K×4K DE20照相机(Direct Electron，USA)，像素尺寸为1.582埃采集图像(如图4中d所示)。离焦值范围从-2.5到-3.5μm。
(8)完成步骤(7)后，使用Gctf程序估计衬度传递函数(CTF)。用Gautomatch(http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/)和RELION半自动地选取了微粒。共选取了379张显微照片和18669个微粒。使用RELION 2进行二维分类(图4中e)。使用EMAN2产生初始模型(图4中f)。从这些实验结果来看，重组表达的人源exocyst与从酵母中提取的exocyst有着相似的尺寸和形状。
2.8对在昆虫细胞中表达的人源Exocyst复合体进行体外活性测定
Exocyst复合物被认为能够将来自于高尔基体分泌的小泡锚定到细胞质膜上，此活性依赖于GTP/GDP交换蛋白Rab11和细胞质膜上的磷脂PI(4,5)P2以及其它结合细胞质膜的蛋白组分。在体外构建两种脂质体，分别模拟高尔基体小泡和细胞质膜的磷脂成分，且在两种脂质体上分别加入荧光标记的磷脂NBD-PA(Ex:Es:460/534nm)RhodB-DHPE(Ex:Es:560/580)。用重组表达的方法取得人源Rab11(1-173)Q70L蛋白，此蛋白结合GTP，而不水解GTP，因此一直保持在可以结合exocyst的状态。将以上纯化出的人源exocyst复合体以及Rab11(1-173)Q70L蛋白和两种脂质体孵育，如果重组表达的exocyst具有生物学活性，将在Rab11(1-173)Q70L蛋白的协助下将两种脂质体拉近。当两种脂质体之间的距离小于10nm时，使用NBD-PA的激发光激发反应体系，会发生能量共振转移的现象，在580nm附近有明显的转移发射峰。
2.8.1人源Rab11(1-173)Q70L蛋白的克隆、表达和纯化
(1)原核表达载体pEXS-DH-Rab11Q70L的构建
合成的人源Rab11(1-173)Q70L基因用引物Rab11F与Rab11R进行PCR反应。
Rab11F：5’-AAAACATATGGGCACCCGTGACGACGAGTA-3’；
Rab11R：5’-ATTTCTCGAGCCGTAGATCTCGGTGAGGATGGTC-3’。
PCR反应使用NEB公司的Q5Premix完成。反应程序为：98℃，30s；(98℃10s，72℃30s，共30个循环)，72℃5min。回收PCR产物。所述PCR产物用限制性内切酶NdeI，XhoI处理，并回收。用限制性内切酶NdeI、XhoI酶切原核表达载体pEXS-DH，37℃处理1h；然后加入CIP，37℃处理1h；最后利用胶回收试剂盒回收约5kb的载体骨架。参照2.2的步骤(3)进行目的片段与载体的连接反应。将连接产物转化MT感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。挑取单菌落进行PCR鉴定，并送测序。重组质粒pEXS-DH-Rab11Q70L的全序列如SEQID No.20所示。
(2)目的蛋白Rab11(1-173)Q70L的表达纯化
将测序正确的质粒pEXS-DH-Rab11Q70L转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。挑取单菌落接种5ml带有氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃振荡培养过夜。次日以5ml接种量转接800ml带有氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃摇床培养到OD值为0.6-0.8之间。加入终浓度为0.25mM的IPTG，在16℃诱导表达20小时。
然后菌液在5000rpm，4℃离心10min，收集菌体。用裂解缓冲液2重悬，对细菌重悬液用超声的方法进行破碎。破碎后的菌液用18000rpm，4℃离心35min，上清重复挂用裂解缓冲液平衡好的Ni-NTA介质1ml两次，然后用20ml裂解缓冲液2清洗介质，最后用洗脱缓冲液2洗脱下目的蛋白。
将浓缩后的目的蛋白用分子筛Superdex 200(10/300GL)进行进一步的纯化，过柱缓冲液为分子筛缓冲液。收集蛋白峰，浓缩后测定浓度，液氮冻存后，保存在-80℃冰箱待用。
2.8.2对昆虫细胞表达的人源exocyst复合物进行活性测定
(1)使用Extruder制备脂质体
将各种磷脂组分用氯仿溶解，按表4中的量和比例加入后，得到A和B两种磷脂混合物。其中磷脂混合物A模拟高尔基体小泡的磷脂成分，而磷脂混合物B模拟细胞质膜的磷脂成分。使用真空泵抽真空4小时，抽去有机溶剂。加入一定体积的测活缓冲液到抽干的两种磷脂混合物中，使磷脂的终浓度为5mg/mL。然后，将磷脂悬液放入37℃水浴锅中，水合30min。之后，用液氮速冻磷脂悬液，再用37℃水浴解冻磷脂悬液。一共反复冻融5次。
用装有0.05μm滤膜Extruder制备表4中的脂质体A，(具体仪器操作详见Avanti公司网页上对Extruder的说明)；用装有0.2μm滤膜Extruder制备表4中的脂质体B。
制备好的脂质体放到4℃，当天使用。
表4 脂质体A、脂质体B所含的磷脂成分配方
Figure GDA0001585712070000251
Figure GDA0001585712070000261
(2)使用荧光分光光度计测定exocyst的活性
表5 Exocyst复合物的体外测活反应体系
Figure GDA0001585712070000262
按表5体系准备对照组和实验组反应体系。此处以准备实验组反应体系为例，说明测活各组分的添加顺序。先向EP管中加入测活缓冲液、MgCl2，GTP与DTT，充分混匀；再向EP管内加入脂质体A和Rab11Q70L蛋白，在冰上孵育1-2h。Hitaiki F7000荧光分光光度计提前预热好，在测定实验即将开始前，向孵育好的脂质体A和Rab11Q70L混合物中加入exocyst复合体和脂质体B并混匀。之后立即加入1mL石英比色皿，放入机器中进行测量。测定模式为波长扫描，激发光为460nm，发射扫描波长范围为470-700nm，电压500V。测定37℃水浴条件下孵育30min后的荧光强度，先测对照组，再测定实验组，实验结果如图5所示。可见昆虫细胞表达的人源exocyst复合物具有生物学活性。
如图5中a所示，四个组中实验组(脂质体A+Rab11Q70L+Exocyst+脂质体B)相对于其它三个对照组在585nm处，有明显的荧光发射峰(见图5中a中的箭头处)，表明有明显的荧光能量共振转移，即exocyst复合物将一定量A和B两种脂质体拉近且距离小于10nm，这表明体外纯化的exocyst复合物具有将两种膜锚定到一起的活性。而只加入Rab11Q70L或exocyst复合物的对照组，相对于没有加入任何一种蛋白的对照组AB，均没有明显的荧光能量共振转移，这表明Rab11Q70L和exocyst单独存在时均不能将两种脂质体拉近，也说明了Exocyst发挥功能依赖于结合GTP的Rab11。图5中b图显示了三次独立实验的平均值及误差，表明测活结果是可信的。纵坐标是三个对照组与实验组在585nm处荧光值与533nm处荧光值的比。533nm处的荧光是NBD-PA在460nm激发光下的发射波长。
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<210> 1
<211> 7187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gatgccctgc gtaagcgggt gtgggcggac aataaagtct taaactgaac aaaatagatc 60
taaactatga caataaagtc ttaaactaga cagaatagtt gtaaactgaa atcagtccag 120
ttatgctgtg aaaaagcata ctggactttt gttatggcta aagcaaactc ttcattttct 180
gaagtgcaaa ttgcccgtcg tattaaagag gggcgtggcc aagggcatgt aaagactata 240
ttcgcggcgt tgtgacaatt taccgaacaa ctccgcggcc gggaagccga tctcggcttg 300
aacgaattgt taggtggcgg tacttgggtc gatatcaaag tgcatcactt cttcccgtat 360
gcccaacttt gtatagagag ccactgcggg atcgtcaccg taatctgctt gcacgtagat 420
cacataagca ccaagcgcgt tggcctcatg cttgaggaga ttgatgagcg cggtggcaat 480
gccctgcctc cggtgctcgc cggagactgc gagatcatag atatagatct cactacgcgg 540
ctgctcaaac ttgggcagaa cgtaagccgc gagagcgcca acaaccgctt cttggtcgaa 600
ggcagcaagc gcgatgaatg tcttactacg gagcaagttc ccgaggtaat cggagtccgg 660
ctgatgttgg gagtaggtgg ctacgtctcc gaactcacga ccgaaaagat caagagcagc 720
ccgcatggat ttgacttggt cagggccgag cctacatgtg cgaatgatgc ccatacttga 780
gccacctaac tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctgcgtaa 840
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atgcccgagg catagactgt acaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg 960
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<210> 4
<211> 7734
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
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ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 7500
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caccgcatag accagccgcg taacctggca aaatcggtta cggttgagta ataaatg 10077
<210> 11
<211> 9283
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
gatgccctgc gtaagcgggt gtgggcggac aataaagtct taaactgaac aaaatagatc 60
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atagcataca ttatacgaag ttatctgtaa ctataacggt cctaaggtag cgagtttaaa 1200
cgacgtccta gattggttac tgggcgatga aggtttagtc ggcaaatcgt ccaacgttag 1260
tgacagcgtc agcggcaagt taatgcctat cattttgttg ataggcgcgg tcttgttttt 1320
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<210> 14
<211> 9364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
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caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcggactg aacggggggt tcgtgcatac 10920
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<223>
<400> 19
cgcgccggta tgtacaggaa gaggtttata ctaaactgtt acattgcaaa cgtggtttcg 60
tgtgccaagt gtgaaaaccg atgtttaatc aaggctctga cgcatttcta caaccacgac 120
tccaagtgtg tgggtgaagt cagatgttta aacccatgtg cctggcagat aacttcgtat 180
aatgtatgct atacgaagtt atggtacgcg gccgcgtaga ggatctgttg atcagcagtt 240
caacctgttg ataatacgga cctttaattc aacccaacac aatatattat agttaaataa 300
gaattattat caaatcattt gtatattaat taaaatacta tactgtaaat tacattttat 360
ttacaatcac tcgacaccgg tgatatccat atgggatcca cagcaatcaa gcatgcatta 420
caaagagaca tttttacacc aaatgatgaa cgcctgctga gcattgtgaa tgtctgcaaa 480
gcaggaaaaa agaaaaagaa ctgtttttta tgtgccacag tgacaactga acgccctgtg 540
caggttaagg tggtcaaagt caagaaatcc gataagggag atttctacaa aaggcagatt 600
gcatgggccc ttcgagatct tgctgtggta gatgccaaag atgctatcaa agaaaatcct 660
gaatttgatt tacactttga aaaaatatat aaatgggttg ccagcagcac tgctgaaaag 720
aatgcattta tttcatgcat ttggaaattg aatcagcgat atctccggaa gaaaattgat 780
tttgtcaatg ttagctcaca gcttttggaa gaactgccta aagttacaga agaatctgtt 840
ccaagtggag aaaatcagag tgtgacagga ggtgatgaag aagtagtaga tgaataccaa 900
gagttaaatg caagagaaga acaggatatc gaaataatga tggaaggctg tgaatatgca 960
atctcgaatg cggaagcctt tgcagaaaaa ttgtccagag agctgcaggt gctagatggg 1020
gctaacatcc agtcaatcat ggcatctgaa aaacaagtca acatcctgat gaaattgcta 1080
gatgaggctc taaaggaggt agatcagatt gaattgaaac tgagcagtta tgaggaaatg 1140
ctccaaagtg taaaagaaca aatggatcag atctctgaaa gcaaccacct aattcatctt 1200
agtaacacta ataatgtaaa actcctatct gagatagagt tccttgtgaa ccacatggac 1260
ttggccaaag gtcatataaa ggcccttcag gaaggagatc ttgcttcttc cagaggcatt 1320
gaggcctgca ccaatgctgc tgatgccctt ctgcagtgca tgaatgtagc tcttcgacca 1380
ggccatgact tgcttctggc agtcaaacag caacagcagc gattcagtga tttgcgagag 1440
ctttttgccc ggagactggc cagtcacctc aacaatgttt ttgttcaaca gggtcatgat 1500
cagagttcga ctcttgccca acactctgtt gaactgactt tacccaatca tcatccattt 1560
catagagatt tgctccgata tgccaagctg atggagtggc taaagagtac agattatgga 1620
aaatatgaag gactaacaaa gaattacatg gattatttat cccgactata tgaaagagaa 1680
atcaaagatt tctttgaagt tgcaaagatc aagatgactg gcacaactaa agaaagcaag 1740
aagtttgcta cactgcctcg aaaagaaagt gctgtcaaac aggaaacaga gagtcttcat 1800
ggaagttcgg ggaaattaac tggatctact tctagtctaa ataagctcag tgttcagagt 1860
tcagggaatc gcagatctca gtcatcttcc ctgttggata tgggaaacat gtctgcctct 1920
gatctcgatg ttgctgacag gaccaaattt gataagatct ttgaacaggt actaagtgaa 1980
ctggagcccc tatgtctggc agaacaggac ttcataagta aatttttcaa actacagcaa 2040
catcaaagta tgcctggaac tatggctgaa gcagaggacc tggatggagg aacattatca 2100
cggcaacata attgtggcac accactgcct gtttcatctg agaaagatat gatccgccaa 2160
atgatgatta aaatatttcg ctgcattgag ccagagctga acaacctaat tgcattagga 2220
gacaaaattg atagctttaa ctctctttat atgttagtca aaatgagtca tcatgtgtgg 2280
actgcacaaa atgtggaccc tgcttctttc ctaagtacta cattgggaaa tgttttggtg 2340
actgtcaaaa ggaactttga caaatgcatt agtaaccaaa taaggcaaat ggaagaagta 2400
aagatctcaa aaaagagtaa agttggaatt cttccatttg ttgctgaatt tgaagaattt 2460
gctggacttg cagaatcaat cttcaaaaat gctgagcgtc gtggagacct ggataaagca 2520
tacaccaaac ttatcagagg agtatttgtt aatgtggaga aagtagcaaa tgaaagccag 2580
aagaccccca gggatgtggt tatgatggaa aactttcacc atatttttgc aactctttct 2640
cgattgaaaa tctcatgtct agaagcagaa aaaaaagaag ccaaacaaaa atacacagat 2700
caccttcagt cttatgtcat ttactcttta ggacaacctc ttgaaaaact aaatcatttc 2760
tttgaaggtg ttgaagctcg cgtggcacag ggcataaggg aggaggaagt aagttaccaa 2820
cttgcattta acaaacaaga acttcgtaaa gtcattaagg agtaccctgg aaaggaagta 2880
aaaaaaggtc tagataacct ctacaagaaa gttgataaac atttatgtga agaagagaac 2940
ttacttcagg tggtgtggca ctccatgcaa gatgaattta tacgccagta taagcacttt 3000
gaaggtttga tagctcgctg ttatcctgga tctggtgtta caatggaatt cactattcag 3060
gacattctgg attattgttc cagcattgca cagtcccacg gctcgagtga aaacctgtac 3120
ttccagagct ctagcttaag catggcctgg agccatccgc aatttgaaaa aggtggcggg 3180
tccggcggag gtagcggcgg aggttcttgg tctcaccctc agttcgagaa ggatgacgat 3240
gataaaacca tgggatccct aggtaccgcg gccgcgacca cggccgagtt gttcgaggag 3300
ccttttgtgg cagatgaata tattgaacgt cttgtatgga gaaccccagg aggaggctct 3360
agaggtggac ctgaagcttt tgatcctaaa agattattag aagaatttgt aaatcatatt 3420
caggaactcc agataatgga tgaaaggatt cagaggaaag tagagaaact agagcaacaa 3480
tgtcagaaag aagccaagga atttgccaag aaggtacaag agctgcagaa aagcaatcag 3540
gttgccttcc aacatttcca agaactagat gagcacatta gctatgtagc aactaaagtc 3600
tgtcaccttg gagaccagtt agagggggta aacacaccca gacaacgggc agtggaggct 3660
cagaaattga tgaaatactt taatgagttt ctagatggag aattgaaatc tgatgttttt 3720
acaaattctg aaaagataaa ggaagcagca gacatcattc agaagttgca cctaattgcc 3780
caagagttac cttttgatag attttcagaa gttaaatcca aaattgcaag taaataccat 3840
gatttagaat gccagctgat tcaggagttt accagtgctc aaagaagagg tgaaatctcc 3900
agaatgagag aagtagcagc agttttactt cattttaagg gttattccca ttgtgttgat 3960
gtttatataa agcagtgcca ggagggtgct tatttgagaa atgatatatt tgaagacgct 4020
ggaatactct gtcaaagagt gaacaaacaa gttggagata tcttcagtaa tccagaaaca 4080
gtcctggcta aacttattca aaatgtattt gaaatcaaac tacagagttt tgtgaaagag 4140
cagttagaag aatgtaggaa gtccgatgca gagcaatatc tcaaaaatct ctatgatctg 4200
tatacaagaa ccaccaatct ttccagcaag ctgatggagt ttaatttagg tactgataaa 4260
cagactttct tgtctaagct tatcaaatcc attttcattt cctatttgga gaactatatt 4320
gaggtggaga ctggatattt gaaaagcaga agtgctatga tcctacagcg ctattatgat 4380
tcgaaaaacc atcaaaagag atccattggc acaggaggta ttcaagattt gaaggaaaga 4440
attagacagc gtaccaactt accacttggg ccaagtatcg atactcatgg ggagactttt 4500
ctatcccaag aagtggtggt taatctttta caagaaacca aacaagcctt tgaaagatgt 4560
cataggctct ctgatccttc tgacttacca aggaatgcct tcagaatttt taccattctt 4620
gtggaatttt tatgtattga gcatattgat tatgctttgg aaacaggact tgctggaatt 4680
ccctcttcag attctaggaa tgcaaatctt tattttttgg acgttgtgca acaggccaat 4740
actatttttc atctttttga caaacagttt aatgatcacc ttatgccact aataagctct 4800
tctcctaagt tatctgaatg ccttcagaag aaaaaagaaa taattgaaca aatggagatg 4860
aaattggata ctggcattga taggacatta aattgtatga ttggacagat gaagcatatt 4920
ttggctgcag aacagaagaa aacagatttt aagccagaag atgaaaacaa tgttttgatt 4980
caatatacta atgcctgtgt aaaagtctgt gcttacgtaa gaaaacaagt ggagaagatt 5040
aaaaattcca tggatgggaa gaatgtggat acagttttga tggaacttgg agtacgtttt 5100
catcgactta tctatgagca tcttcaacaa tattcctaca gttgtatggg tggcatgttg 5160
gcaatttgtg atgtagccga atataggaag tgtgccaaag acttcaagat tccaatggta 5220
ttacatcttt ttgatactct gcatgctctt tgcaatcttc tggtagttgc cccagataat 5280
ttaaagcaag tctgctcagg agaacaactt gctaatctgg acaagaatat acttcactcc 5340
ttcgtacaac ttcgtgctga ttatagatct gcccgccttg ctcgacactt cagctaaggt 5400
acccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 5460
ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat cctcaggggg 5520
agatggggga ggctaactga aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg 5580
acggcaataa aaagacagaa taaaacgcac gggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg 5640
ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt gggaccaata 5700
cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca acccccaagt tcgggtgaag gcccagggct 5760
cgcagccaac gtcggggcgg caagccctgc catagccact acgggtacgt ctgaaagcat 5820
gcctttttgg aatttacgta ctaagctctc atgtttcacg tactaagctc tcatgtttaa 5880
cgtactaagc tctcatgttt aacgaactaa accctcatgg ctaacgtact aagctctcat 5940
ggctaacgta ctaagctctc atgtttcacg tactaagctc tcatgtttga acaataaaat 6000
taatataaat cagcaactta aatagcctct aaggttttaa gttttataag aaaaaaaaga 6060
atatataagg cttttaaagc ttttaaggtt taacggttgt ggacaacaag ccagggatgt 6120
aacgcactga gaagccctta gagcctctca aagcaatttt cagtgacaca ggaacactta 6180
acggctgaca gaattagctt cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag 6240
gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag 6300
ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 6360
tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 6420
gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 6480
cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 6540
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 6600
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 6660
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 6720
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 6780
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 6840
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 6900
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 6960
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 7020
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 7080
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac acatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 7140
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 7200
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 7260
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 7320
tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg 7380
acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 7440
ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 7500
gagttcttcg cccacatcat atcgat 7526
<210> 20
<211> 5911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160
cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgggc acccgtgacg 5220
acgagtacga ctacctgttc aaggtggtgc tgatcggtga cagcggcgtg ggtaaatcca 5280
acctgctgtc ccgcttcacc cgtaacgagt tcaacctgga gtccaagtcc accatcggcg 5340
tggagttcgc cacccgttcc atccaggtgg acggtaagac catcaaggct cagatctggg 5400
acaccgctgg tctggagcgc taccgcgcca tcacctccgc ttactaccgc ggtgccgtgg 5460
gtgctctcct ggtgtacgac atcgctaagc acctgaccta cgagaacgtg gagcgctggc 5520
tgaaggagct gcgcgaccac gctgactcca acatcgtcat catgctggtg ggcaacaagt 5580
ccgacctgcg ccacctgcgt gctgtgccta ctgacgaagc tcgcgctttc gctgagaaga 5640
acggcctgtc cttcatcgag accagcgctc tggactccac caacgtggag gccgctttcc 5700
agaccatcct caccgagatc tacggctcga gtgggagctc tggaggccac catcaccatc 5760
atcaccatca ctaagtaacc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 5820
gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 5880
tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t 5911

Claims (15)

1.SmartBac杆状病毒表达系统，为如下任一：
(A)SmartBac杆状病毒表达系统A，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；
所述受体质粒为受体质粒甲和/或受体质粒乙；
所述受体质粒甲上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；
所述受体质粒乙上含有DNA片段B和DNA片段C；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列B；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列C；
所述供体质粒上含有DNA片段D；所述DNA片段D自上游到下游依次包含：启动子D、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列D；
所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；
(B)SmartBac杆状病毒表达系统B，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；
所述受体质粒上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；
所述供体质粒为供体质粒甲和/或供体质粒乙；
所述供体质粒甲上含有DNA片段B；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列B；
所述供体质粒乙上含有DNA片段C和DNA片段D；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列C；所述DNA片段D自上游到下游依次包含：启动子D、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列D；
所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；
(D)SmartBac杆状病毒表达系统D，与所述SmartBac杆状病毒表达系统A或所述SmartBac杆状病毒表达系统B相比，差别仅在于：将其中的所述待表达目的物的编码基因的插入区替换为两两之间由所述蛋白酶的切割位点识别序列间隔开来的若干个插入区，每个插入区用于插入一个所述待表达目的物的编码基因；
在所述(A)或(B)或(D)中，所述受体质粒和所述供体质粒上均含有位点特异性重组酶的识别序列；所述受体质粒中含有非条件型复制起点；所述供体质粒中含有条件型复制起点。
2.根据权利要求1所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段A中，在所述待表达目的物的编码基因的插入区和所述终止序列A之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段B中，在所述蛋白酶的编码基因序列和所述终止序列B之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段D中，在所述待表达目的物的编码基因的插入区和所述终止序列D之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列。
3.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述位点特异性重组酶为Cre重组酶。
4.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述非条件型复制起点为p15A复制起点；所述条件型复制起点为R6Kγ复制起点。
5.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述受体质粒和所述供体质粒上含有不同的抗性筛选标记基因。
6.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述启动子A为p6.9启动子；所述启动子B为GP64启动子；所述启动子C为p6.9启动子；所述启动子D为p10启动子。
7.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述待表达目的物的编码基因的插入区自上游到下游依次含有多克隆位点1、LacZ-α表达盒和多克隆位点2。
8.根据权利要求7所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，在所述DNA片段D中，所述待表达目的物的编码基因的插入区中的所述多克隆位点1和所述多克隆位点2之间还含有PUC复制起点。
9.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述蛋白酶为TEV蛋白酶。
10.根据权利要求9所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段A自上游到下游依次由p6.9启动子、N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、Twin-Strep标签编码序列、肠激酶切割位点的识别序列、多克隆位点1、LacZ-α表达盒、多克隆位点2、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、荧光蛋白的编码基因序列和SV40pA信号序列连接而成；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段B自上游到下游依次由GP64启动子、N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、荧光蛋白的编码基因序列和IE1 ter信号序列连接而成；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段C自上游到下游依次由p6.9启动子、Twin-Strep标签编码序列、肠激酶切割位点的识别序列、多克隆位点1、LacZ-α表达盒、多克隆位点2和SV40 pA信号序列连接而成；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段D自上游到下游依次由p10启动子、10×His标签编码序列、肠激酶切割位点的识别序列、多克隆位点1、PUC复制起点、LacZ-α表达盒、多克隆位点2、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、荧光蛋白的编码基因序列和HSVtk pA信号序列连接而成。
11.根据权利要求10所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段A的序列为SEQ ID No.1的第1235-3971位或者为SEQID No.2的第1235-3971位；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段B的序列为SEQ ID No.3的第1208-3252位或者为SEQ ID No.4的第1208-3249位；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段C的序列为SEQ ID No.3的第3306-4521位或者为SEQ ID No.4的第3303-4518位；
在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段D的序列为SEQ ID No.5的第259-3188位或者为SEQ ID No.6的第259-3188位。
12.根据权利要求11所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述受体质粒甲为4V1G质粒和/或4V1R质粒；所述4V1G质粒的全序列为SEQ ID No.1；所述4V1R质粒的全序列为SEQ ID No.2；
所述受体质粒乙为5V1TG质粒和/或5V1TR质粒；所述5V1TG质粒的全序列为SEQ IDNo.3；所述5V1TR质粒的全序列为SEQ ID No.4；
所述供体质粒为4V2G质粒和/或4V2R质粒；所述4V2G质粒的全序列为SEQ IDNo.5；所述4V2R质粒的全序列为SEQ ID No.6。
13.权利要求1-12中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统在同时表达n个目的物中的应用；所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；所述n为2以上的自然数。
14.利用权利要求1-12中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统表达蛋白质复合物的方法，为如下(1)或(2)：
(1)当待表达的蛋白质复合物的分子量小于600kDa时，所述方法包括如下步骤：
(a1)将组成所述蛋白质复合物的全部亚基的编码基因分成总长度接近的两组，将每组中的各亚基编码基因以所述蛋白酶的切割位点识别序列为间隔融合成一条长的融合基因，两组得到两条融合基因；
(a2)将所述两条融合基因中的一条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒；将所述两条融合基因中的另一条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒；
(a3)将所述重组受体质粒和所述重组供体质粒在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒；
(a4)将所述转移质粒转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒；
(a5)将所述重组杆状病毒穿梭质粒感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒；
(a6)将所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，从而实现所述蛋白质复合物的表达；
(2)当待表达的蛋白质复合物的分子量在600kDa以上时，所述方法为如下(B)或(C)：
(B)包括如下步骤：
(b1)将组成所述蛋白质复合物的全部亚基的编码基因分成M组，将每组中的各亚基编码基因以所述蛋白酶的切割位点识别序列为间隔融合成一条长的融合基因，M组得到M条融合基因；其中，M＝2m，m为2以上的自然数；
(b2)将所述M条融合基因中的第1条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒1；将所述M条融合基因中的第2条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒1；将所述M条融合基因中的第3条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒2；将所述M条融合基因中的第4条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒2；以此类推；将所述M条融合基因中的第M-1条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒m；将所述M条融合基因中的第M条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒m；
(b3)将所述重组受体质粒1和所述重组供体质粒1在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒1；将所述重组受体质粒2和所述重组供体质粒2在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒2；以此类推；将所述重组受体质粒m和所述重组供体质粒m在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒m；
(b4)将所述转移质粒1转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒1；将所述转移质粒2转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒2；以此类推；将所述转移质粒m转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒m；
(b5)将所述重组杆状病毒穿梭质粒1感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒1；将所述重组杆状病毒穿梭质粒2感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒2；以此类推；将所述重组杆状病毒穿梭质粒m感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒m；
(b6)将所述重组杆状病毒1、所述重组杆状病毒2、以此类推、所述重组杆状病毒m共同感染昆虫细胞，从而实现所述蛋白质复合物的表达；
(C)包括如下步骤：
(c1)将组成所述蛋白质复合物的全部亚基的编码基因分成M组，将每组中的各亚基编码基因以所述蛋白酶的切割位点识别序列为间隔融合成一条长的融合基因，M组得到M条融合基因；其中，M＝2m-1，m为2以上的自然数；
(c2)将所述M条融合基因中的第1条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒1；将所述M条融合基因中的第2条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒1；将所述M条融合基因中的第3条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒2；将所述M条融合基因中的第4条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒2；以此类推；将所述M条融合基因中的第M-2条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒(M-1)/2；将所述M条融合基因中的第M-1条克隆入所述供体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组供体质粒(M-1)/2；将所述M条融合基因中的第M条克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，得到重组受体质粒m；
(c3)将所述重组受体质粒1和所述重组供体质粒1在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒1；将所述重组受体质粒2和所述重组供体质粒2在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒2；以此类推；将所述重组受体质粒(M-1)/2和所述重组供体质粒(M-1)/2在所述位点特异性重组酶的作用下融合为一个大质粒，即得转移质粒(M-1)/2；所述重组受体质粒m即为转移质粒m；
(c4)将所述转移质粒1转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒1；将所述转移质粒2转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒2；以此类推；将所述转移质粒(M-1)/2转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒(M-1)/2；将所述转移质粒m转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，得到重组杆状病毒穿梭质粒m；
(c5)将所述重组杆状病毒穿梭质粒1感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒1；将所述重组杆状病毒穿梭质粒2感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒2；以此类推；将所述重组杆状病毒穿梭质粒(M-1)/2感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒(M-1)/2；将所述重组杆状病毒穿梭质粒m感染昆虫细胞，得到重组杆状病毒m；
(c6)将所述重组杆状病毒1、所述重组杆状病毒2、以此类推、所述重组杆状病毒m共同感染昆虫细胞，从而实现所述蛋白质复合物的表达。
15.一种利用权利要求1-12中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统筛选待表达蛋白复合物中适于添加纯化标签的亚基的方法，为如下(3)或(4)：
(3)当待表达的蛋白质复合物的分子量小于600kDa时，所述方法包括如下步骤：
(a’1)按照所述(a1)-(a3)的步骤构建得到一个转移质粒；所述转移质粒不含有纯化标签编码序列；
(a’2)将所述待表达蛋白复合物的全部亚基的编码基因分别克隆入所述受体质粒的所述待表达目的物的编码基因的插入区，并能够与所述纯化标签编码序列融合表达，对应每个亚基各得到一个重组受体质粒，所述重组受体质粒即为转移质粒；
(a’3)将步骤(a’1)和(a’2)中的所有转移质粒分别转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，对应每个转移质粒均得到一个重组杆状病毒穿梭质粒；
(a’4)将步骤(a’3)中的所有重组杆状病毒穿梭质粒分别感染昆虫细胞，得到各自对应的重组杆状病毒；
(a’5)将对应步骤(a’2)中各转移质粒的所有所述重组杆状病毒中每一种分别与对应步骤(a’1)中所述转移质粒的所述重组杆状病毒组合，共同感染昆虫细胞，然后根据所述纯化标签对感染后的各组细胞所表达的蛋白复合物进行纯化，从而确定所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基；
(4)当待表达的蛋白质复合物的分子量在600kDa以上时，所述方法为包括如下步骤：
(b’1)按照所述(b1)-(b3)的步骤或者所述(c1)-(c3)的步骤构建得到m个转移质粒；所述转移质粒不含有纯化标签编码序列；
(b’2)将所述待表达蛋白复合物的全部亚基的编码基因分别克隆入所述受体载体的所述待表达目的物的编码基因的插入区，并能够与所述纯化标签编码序列融合表达，对应每个亚基各得到一个重组受体质粒，所述重组受体质粒即为转移质粒；
(b’3)将步骤(b’1)和(b’2)中的所有转移质粒分别转化含有杆状病毒穿梭质粒的受体菌，对应每个转移质粒均得到一个重组杆状病毒穿梭质粒；
(b’4)将步骤(b’3)中的所有重组杆状病毒穿梭质粒分别感染昆虫细胞，得到各自对应的重组杆状病毒；
(b’5)将对应步骤(b’2)中各转移质粒的所有所述重组杆状病毒中的每一种分别与对应步骤(b’1)中所述m个转移质粒的m个所述重组杆状病毒组合，共同感染昆虫细胞，然后根据所述纯化标签对感染后的各组细胞所表达的蛋白复合物进行纯化，从而确定所述蛋白复合物中适于添加所述纯化标签的亚基。
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