CN101372685B - 构建重组杆状病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种零背景构建重组杆状病毒的方法。具体步骤为：(1)构建以R6Kγ作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；(2)封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7受体位点，获得DH10BacΔTn7；(3)常规方法转化重组供体质粒进入DH10BacΔTn7获得重组杆状病毒；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。本发明利用以R6Kγ为复制子构建条件限制型供体质粒，同时封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7重组位点，只需常规转化即可获得重组杆状病毒，并且由于其超过99％的阳性重组率，无须复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，做到零背景真正高效快速的构建重组杆状病毒，促进杆状病毒表达系统的广泛利用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种构建重组杆状病毒的方法。
背景技术
昆虫杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，它具备所有真核表达系统翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化、磷酸化、信号肽切除等，表达出的重组蛋白具有天然蛋白的生物学功能。Smith等(1983)用苜宿银纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(AcMNPV，Autographacalifornica multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus)作载体在草地夜蛾细胞Sf-21中高效表达人β-干扰素的研究成果开拓了杆状病毒作为载体表达外源基因的新领域。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能象细菌或酵母载体一样通过酶切连接的方式直接插入，而必须通过转移载体的介导。因此如何高效快速地构建重组杆状病毒成为利用杆状病毒表达外源基因的最关键一步。
目前构建重组杆状病毒方法有传统的昆虫细胞内同源重组，细菌内重组即Bac-to-Bac系统，以及直接连接等三种方式。其中昆虫细胞内同源重组和直接连接由于重组效率低，转座背景高，需要多轮空斑纯化，耗时费力，现在已经很少有研究者使用。目前最常用的杆状病毒表达系统是细菌内重组即Bac-to-Bac系统，其本质上是将NPV基因组DNA改造成可在细菌内复制并能与供体质粒在细菌内发生转座且同时对昆虫细胞保留感染性的大型穿梭载体。其转座原理基于Tn7转座子的专一位点转座系统，它通过将杆状病毒DNA改造成可在大肠杆菌菌株中复制的Bacmid载体，即在杆状病毒基因组中含有可在大肠杆菌复制的F因子复制子，卡那霉素抗性基因，Tn7转座接触位点以及lacZ′盒式结构，由于杆状病毒基因组为环状闭合双链DNA分子，因此这种Bacmid可以像质粒一样在大肠杆菌中以低拷贝形式复制。而在转移载体中外源基因位于多角体启动子的驱动下，两端分别为Tn7转座子的左、右端转座序列，当将重组转移载体转化到含有Bacmid的大肠杆菌中后，在辅助质粒提供的转座酶的介导下进行转座，将重组转移载体上含外源基因的表达盒式结构转座到Bacmid的lacZ′盒式结构中，破坏α互补，因此重组病毒可以通过简单的蓝白斑方法筛选，从白色菌落中分离的重组病毒DNA直接转染昆虫细胞即可以获得有感染性的重组病毒粒子。
然而即使是Bac-to-Bac系统，虽然其不需要在昆虫细胞内进行同源重组，但在细菌内转座效率也不是非常高，通常只10％左右的白斑，而且白斑菌落需要进一步划线培养和PCR验证以去除假阳性，比较耗时复杂。现有方法基本能够满足在构建单个或者少量重组病毒，一旦需要构建数十个甚至更多的重组病毒大量表达外源基因时则效率太低。而且由于获得重组病毒的效率少于90％，不合适构建高质量库容量大的杆状病毒cDNA文库。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建重组杆状病毒的方法，可去除转座中的背景干扰，避免复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，真正做到高效快速构建重组杆状病毒。
本发明所述的构建重组杆状病毒的方法按下述步骤实现：(1)构建以R6Kγ作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；(2)封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7受体位点，获得DH10BacΔTn7；(3)常规方法转化重组供体质粒进入DH10BacΔTn7获得重组杆状病毒；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。
本发明供体质粒以R6Kγ作为复制子，DH10BacΔTn7中封闭了宿主菌上的attTn7受体位点，两种策略的单独使用都可以提高转座效率。
本发明的理论依据：Bacmid宿主菌E.coli DH10B基因组内存在有Tn7转座受体位点(attTn7)，这些受体位点会与Bacmid中的attTn7竞争，造成目标转座效率下降；另一方面以pUC为基本骨架的转移载体和具有F因子复制子的Bacmid在宿主菌中可以共存，使得抗性筛选背景非常高，增加了获得重组病毒的程序和时间。R6Kγ复制子的复制依赖于宿主菌pir基因的表达产物Rep蛋白π，如果在转移载体中利用R6Kγ作为复制子，这样就可以避免转移载体以质粒的形式和Bacmid在宿主菌中共存的问题，减少抗性筛选背景；封闭宿主菌基因组中的attTn7位点，就避免了这些受体位点与Bacmid中的attTn7竞争，解决了目标转座效率下降的问题。
有益效果：
本发明利用以R6Kγ为复制子构建条件限制型供体质粒，同时封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7重组位点，只需常规转化即可获得重组杆状病毒，并且由于其超过99％的阳性重组率，无须复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，做到真正高效快速的构建重组杆状病毒，促进杆状病毒表达系统的广泛利用。
附图说明
图1是供体质粒结构示意图，pRCDM含有R6Kγ复制子，两个杆状病毒强启动子(p10和polh)，两个多克隆位点(MCS1和MCS2)以及转座同源臂(Tn7L和Tn7R)。
图2是封闭宿主菌基因组中Tn7受体位点的质粒R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R结构示意图，该质粒含有FLP/FRT重组序列(FRT-L和FRT-R)，Tn7重组序列(Tn7-L和Tn7-R)以及两个抗性筛选标记(Zeocin和chloramphenicol)。
图3是pRCDM-gfp转座BmDH10BacΔTn7后重组病毒的鉴定。以M13通用引物PCR扩增重组杆状病毒，12个单克隆都扩增出大约3100bp的条带。
图4是重组杆状病毒BmBacmid-gfp感染BmN细胞。其中(A)是使用488nm荧光观察感染72小时后的BmN细胞，(B)是同一视野下普通光观察感染72小时后的BmN细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；孙明主编，高等教育出版社，2006，基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著)；黎路林编著，华中师范大学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按照制造厂商的操作指南所建议的方法进行。
实施例1：获得重组BmBacmid的方法
(1)供体质粒的构建
如图1所示，该质粒以R6Kγori为条件限制型复制子，在表达pir基因的菌株中才能复制繁殖。具体构建过程如下：以pUCDM(T.J.Richmond赠送)为模板，上游引物R6Kγ-F：ggcgcgccTAGGGATAACAGGGTAATGAGCTCCGTGG GCCCAATTCTGTCA，下游引物R6Kγ-R：ggcgcgccTAGGGATAACAGGGTAATT CGAAACGCGCTAGTATAATTTAAC(划线部分为Asc I酶切位点)，扩增R6Kγ复制子。Zeocin基因以pVgRxR(购买自Invitrogen)为模板扩增，上游引物ZeoT-F：ggcgcgccACGTTTAAACTGGCTGCAGCACGTGT TGACAAT，下游引物ZeoT-R：ggcgcgccACGTTTAAACTGGTCG AGGTCGACCCCCCTCGG(划线部分为Asc I酶切位点)。R6K和ZeoT的PCR产物分别用Asc I酶切后连接获得质粒R6K-ZeoT。
以pUCDM为模板，上游引物Cm-F：ttcggaTACCTGTGACGGAAGAT，下游引物Cm-R：ttcgaaCATTC ATCCGCTTATTATCA(划线部分为BstB I酶切位点)PCR扩增抗性基因Cm。BstB I分别酶切质粒R6K-ZeoT和PCR产物Cm后连接获得R6K-Cm-ZeoT质粒。同源臂Tn7-L和同源臂Tn7-R都以质粒pFBDM(T.J.Richmond赠送)为模板进行扩增。Tn7-L上游引物：AcctaaggcgcgccGAAGATGACGGTTTGT(划线序列为Bsu36I酶切位点，斜体序列为Asc I酶切位点)，下游引物：AgcatgcggatccTAGGAGATCCGAACCAG(划线序列为Sph I酶切位点，斜体序列为BamH I酶切位点)；Tn7-R上游引物：Accttaggcgcgcc CTGCGTAAGCGGGTGT(划线序列为Bsu36I酶切位点，斜体序列为Asc I酶切位点)；下游引物：AgcatgccgcggAGTTGTTCGGTAAATTGT(划线序列为Sph I酶切位点，斜体序列为Sac II酶切位点)。PCR产物Tn7-L克隆到pMD-18T Simple载体(购买自TaKaRa公司)，Sph I和BamH I双酶切后与PCR产物ZeoFRT的Sph I和BamH I双酶切产物相连接，获得质粒Ts-ZeoFRT-Tn7L。质粒pSLfa1180fa(T.J.Richmond赠送，带有两个Asc I位点)用Asc I酶切后回收载体片段，质粒Ts-ZeoFRT-Tn7L和PCR产物Tn7-R用Asc I和BamH I双酶切后回收ZeoFRT-Tn7L和Tn7-R片段。pSLfa1180fa，ZeoFRT-Tn7L和Tn7R三个片段连接获得质粒1180fa-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R。Asc I分别酶切R6K-Cm-ZeoT和1180fa-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R后连接获得质粒R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R。SacII和Avr II双酶切pFBDM获得带有庆大霉素抗性和多克隆位点片段，胶回收后定向克隆到R6KCm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R质粒中，获得阳性克隆命名为pRCDM。
pIRES-gfp经SmaI和XhoI酶切，回收绿色荧光蛋白基因gfp片段，克隆到载体pRCDM得到重组质粒pRCDM-gfp
(2)受体BmDH10BacΔTn7的构建
如图2所示，步骤1中的中间产物质粒R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R带有Tn7-L和Tn7-R同源臂以及Zeocin抗性基因，我们可以用这个质粒来封闭宿主菌DH10B基因组上的attTn7位点。同时Zeocin抗性基因两侧带有FRT序列的，可以很方便的在重组后在基因组中把其缺失掉，而不会对宿主菌产生其他任何影响。
按照Bac-to-Bac实验方法把R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R转座E.coliBmDH10Bac后，涂布转化子于Kanr/Tetr/Zeocinr/X-gal/IPTG的LS固体平板上，37℃培养48小时待蓝白斑明显后挑取数个蓝斑于LS液体培养基(Kanr/Tetr/Zeocinr)中振荡培养。用ZeoFRT引物对菌液进行PCR扩增验证正确后制作化学感受态，把温度敏感型的质粒pcp20(表达FLP重组酶)转化入E.coli BmMultiBac-ZeoFRT菌株，涂布在Kanr/Tetr/Ampr平板，30℃培养过夜后，挑取数个单克隆在LB液体培养基(Kanr/Tetr)中42℃、200rpm振荡培养。以M13通用引物对菌液进行PCR扩增验证可以得到300bp左右的片段，得到含有完整Bacmid且基因组宿主菌基因组attTn7封闭的受体BmDH10bacΔTn7。
(3)重组杆状病毒的获得
按照Bac-to-Bac手册中的方法，重组供体pRCDM-gfp转座到受体BmDH10BacΔTn7感受态中，取合适数量的转化液(约100μl)涂布于Kanr/Gmr/Tetr/X-gal/IPTG LB固体平板上，37℃培养48h后平板上共长出47个单克隆，全部是白斑，随即挑取12个单克隆在液体培养基中37℃、200rpm振荡培养。如图3所示，用M13通用引物进行PCR验证，12个单克隆都扩增出与理论值(3100bp)相符的条带，说明pRCDM-gfp转座BmDH10BacΔTn7可以获得100％的转作效率。
(4)重组杆状病毒DNA的获得及在细胞中的表达
按照常规碱裂解方法从大肠杆菌中制备重组BmBacmid-gfp DNA，使用lipfectin2000将其转染进BmN细胞中。如图4所示，转染后3～5天，置于倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的表达情况。结果表明，转染后第4～5天，有大量的细胞发出绿色荧光。
实施例2：以R6Kγ作为复制子的供体质粒可以提高转座效率
(1)供体质粒pRCDM的构建按照实施例1中的1步骤制作。
(2)重组杆状病毒的获得及转座效率比较
按照Bac-to-Bac手册中的方法，我们将0.1ng供体质粒pRCDM和pFastBac分别转座到BmDH10Bac感受态中，取转化液的1/5(100μl)涂布于Kanr/Gmr/Tetr/X-gal/IPTG LB固体平板上，37℃培养48h待蓝白斑明显后，分别统计每个平板上的白色菌斑和蓝色菌斑的数量，计算转座效率。统计结果显示：(1)pFastBac转座BmDH10Bac：共得到菌落约有300个，其中白斑17个。(2)pRCDM转座BmDH10Bac：共得到菌落约有230个，其中白斑152个。使用以R6Kγ作为复制子的供体质粒可以使转座效率(白斑率)从5.7％提高到66％。
实施例3：封闭宿主菌基因组attTn7的受体可以提高转座效率
(1)受体BmDH10BacΔTn7的构建按照实施例1中的2步骤制作。
(2)重组杆状病毒的获得及转座效率比较
按照Bac-to-Bac手册中的方法，我们将0.1ng供体质粒pFastBac分别转座到受体BmDH10Bac和BmDH10BacΔTn7感受态中，取转化液的1/5(100μl)涂布于Kanr/Gmr/Tetr/X-gal/IPTG LB固体平板上，37℃培养48h待蓝白斑明显后，分别统计每个平板上的白色菌斑和蓝色菌斑的数量，计算转座效率。统计结果显示：(1)pFastBac转座BmDH10Bac：共得到菌落约有300个，其中白斑17个。(2)pFastBac转座BmDH10BacΔTn7：共得到菌落约有260个，其中白斑63个。使用封闭宿主菌基因组attTn7的受体可以使转座效率(白斑率)从5.7％提高到24％。
Claims (1)
1.一种构建重组杆状病毒的方法，其特征在于：该构建方法按下列步骤进行：
(1)构建以R6Kγ作为复制子的供体质粒，所述供体质粒为pRCDM，该质粒含有R6Kγ复制子，两个杆状病毒强启动子p10和polh，两个多克隆位点MCS1和MCS2以及转座同源臂Tn7L和Tn7R，按常规方法引入外源基因；
(2)封闭E.coli BmDH10Bac宿主菌基因组上的attTn7受体位点，获得BmDH10BacΔTn7；其中封闭宿主菌基因组上的attTn7受体位点的质粒为R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R，该质粒含有R6Kγ复制子，Tn7-L和Tn7-R以及两个抗性筛选标记Zeocin和chloramphenicol，其中，Zeocin抗性基因两侧带有FRT序列；
(3)常规方法转化携带外源基因的重组供体质粒pRCDM进入BmDH10BacΔTn7获得含重组Bacmid的阳性克隆；
(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞制备重组杆状病毒。
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