CN102260690B - 一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，包括以下步骤：(1)制备重组载体pFastBac Dual-polh-helicase；(2)将重组载体pFastBac Dual-polh-helicase转化进E.coliDH10BmBacmid感受态细胞内，在培养板上培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，从阳性菌斑中提取重组BmBacmid-polh-helicaseDNA；(3)将上述重组BmBacmid-polh-helicaseDNA转染到家蚕培养细胞，收集培养细胞上清，获得重组病毒BmEoNPV；(4)每将重组病毒注射，纯化得到重组病毒多角体。将上述重组核型多角体病毒喷洒在茶叶树叶面上，可防止茶尺蠖对茶叶树的危害，而且该方法成本低、生产易控。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中重组病毒的构建，具体涉及对家蚕核型多角体病毒进行基因重组构建基因工程病毒的方法。
背景技术
茶尺蠖(Ectropis oblique)，又称拱拱虫、量寸虫、吊丝虫，是茶树的主要害虫，该虫属鳞翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)。幼虫食叶，暴发时可将成片茶园食成光杆，致茶叶减产60%以上，严重影响成茶品质。
以往防治茶尺蠖的基本方法为加强预测预报和农业防治，人工捕杀，科学使用化学农药。但是长期大量使用化学农药，致使害虫抗药性增强，天敌数目减少，造成害虫的再猖獗和爆发危害，由于农药的使用、导致环境污染、茶叶中农药残留增加、品质下降。为解决这个问题，许多专家开始研究用生物农药来防治茶树害虫，其中昆虫病毒是其中比较常用的一种。
茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EcobNPV) 是茶尺蠖的病原性天敌，可通过食下在虫体内迅速增殖，使其染病死亡。因此，EcobNPV 可以作为生物杀虫剂用于茶尺蠖的防治。利用自然饲料(茶树鲜叶)或利用菊花作为饲料，在室内饲喂茶尺蠖，通过接种EcobNPV使茶尺蠖染病，从患病的虫体中收集EcobNPV。
用上述方法繁殖EcobNPV具有明显不足：茶尺蠖人工饲养技术不成熟，难以大规模饲养，因此通过人工饲养茶尺蠖繁殖的病毒数量满足不了茶尺蠖生物防止的要求，且该法生产EcobNPV的成本很高。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种制备能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的方法，以一种低成本、易控制的方法大量提供能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，包括以下步骤：
(1) 制备包含茶尺蠖核型多角体病毒的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh的重组载体，得到重组载体pFastBacDual-polh-helicase；
(2) 将重组载体pFastBacDual-polh-helicase转化进E. coli DH10 BmBacmid 感受态细胞内，在培养板上培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，从阳性菌斑中提取重组BmBacmid-polh-helicaseDNA；所述培养板含：卡那霉素、庆大霉素、四环素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基硫代-β-D半乳糖苷；所述阳性菌斑为白色菌落；
(3) 将上述重组BmBacmid-polh-helicase DNA转染到家蚕培养细胞，培养4～6天，收集培养细胞上清，获得P1代重组病毒BmEoNPV；采用P1代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞，培养4～6天，收集培养细胞上清，获得P2代重组病毒BmEoNPV；
(4) 每头5龄家蚕注射1～2微升P2代重组病毒BmEoNPV，发病后，纯化重组病毒多角体，即得所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
上述技术方案中，所述重组载体pFastBacDual-polh-helicase的制备方法包括以下步骤：
(a) 以茶尺蠖核型多角体病毒EcobNPV的DNA为模板，采用PCR扩增法扩增出EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进pMD19-T载体，获得质粒pMD19-helicase；
(b) 分离带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh，克隆进pFastBacDual载体，获得质粒pFastBac Dual-polh；
(c) 双酶切质粒pMD19-helicase，回收EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进载体pFastBacDual-polh，获得重组载体pFastBacDual-polh-helicase。
上述技术方案中，步骤(a)中，PCR扩增法中涉及的引物可根据GenBank已登录的EcobNPV全基因组序列(登录号为DQ837165)，在病毒解螺旋酶基因两端分别设计，优选地，所述引物包括：
SEQ ID No. 1：Eo-Helicase1：GAACTAGTATGATTGGTGTAATCGT (下划线示Spe I位点)；SEQ ID No. 2：Eo-Helicase2：CACTGCAGACTTTGCA CGTAGTTTGTGTATATG (下划线示Pst I位点)；步骤(c)中，双酶切质粒pMD19-helicase的步骤中，采用的用SpeI和PstI内切酶。
上述技术方案中，步骤(b)中，分离带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh的方法选自以下两种方法中的任何一种：
(一) 用限制性内切酶SalⅠ酶切家蚕核型多角体病毒BmNPV的DNA，回收含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段polh，该片段大小约为1.4 kb；
或者，(二) 通过PCR体外扩增的方法从家蚕核型多角体病毒的DNA中克隆含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段polh。
本发明同时要求保护采用上述制备方法制得的能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
本发明同时要求保护上述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒作为防治茶尺蠖的生物杀虫剂的应用。
因此，本发明同时要求保护一种防治茶尺蠖的生物杀虫剂，所述防治茶尺蠖的生物杀虫剂的主要活性成分为上述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
在实际应用中，将上述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒喷洒在茶叶树叶面上，可防止茶尺蠖对茶叶树的危害。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．用本发明的技术方案构建的重组病毒BmEoNPV既能感染家蚕又能感染茶尺蠖；用家蚕生产能感染茶尺蠖重组核型多角体病毒可以满足生物防治对大量病毒的需求。
2．用本发明技术方案生产的重组病毒BmEoNPV成本低、生产易控。
附图说明
图1是实施例一中PCR扩增出的EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段(约5.0kb)的电泳图；其中，M为DNA 标准分子量；1为PCR产物；
图2是实施例一中pMD19-helicase的鉴定；其中，M为DNA 标准分子量，1为pMD19-helicase DNA 用Spe I和Pst I双酶切后电泳；
图3是实施例一中pFastBacDual-polh-helicase的鉴定；其中M为DNA 标准分子量，1为pFastBacDual-polh-helicase DNA用BamH I酶切后的电泳；
图4是实施例一中P1代重组病毒BmEoNPV的PCR鉴定；其中，M为DNA 标准分子量；1为以重组质粒pFastBacDual-polh-helicase为模板，2为P1代重组病毒BmEoNPV DNA为模板；
图5是实施例一中P2代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞4－6天后的细胞变化；可见细胞变圆，细胞核中形成多角体。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：能感染茶尺蠖重组核型多角体病毒的构建，包括如下步骤，
1. 根据GenBank已登录的EcobNPV全基因组序列(登录号为DQ837165)，在病毒解螺旋酶基因两端分别设计引物：
SEQ ID No. 1：Eo-Helicase1：GAACTAGTATGATTGGTGTAATCGT(下划线示Spe I位点)，
SEQ ID No. 1：Eo-Helicase2：CACTGCAGACTTTGCACGTAGTTTGTGTATATG(下划线示Pst I位点) ，
2. 以EcobNPV DNA为模板，用Eo-Helicase1、 Eo-Helicase1引物进行PCR扩增，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱参见图1。将扩增出的EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段(约5.0kb)，克隆进pMD19-T（TAKARA公司产品）载体，获pMD19-helicase；
pMD19-helicase的鉴定结果参见图2。pMD19-helicase DNA用Spe I和Pst I双酶切可切出约5.0kb的条带。
3. 按常规方法，提取BmNPV-DNA，用SalⅠ酶切后，回收SalⅠ片段（含有完整的多角体蛋白基因及启动子，约1.4kb），克隆进pFastBacDual（Iinvitrogen公司产品）的Sal I位点，获得质粒pFastBac Dual-polh；
4. pMD19-helicase用SpeI和PstI双酶切，电泳，胶回收长度约为5.0kb的片段，连接至载体pFastBacDual-polh的SpeI和PstI位点，获得质粒pFastBacDual-polh-helicase；
pFastBacDual-polh-helicase的鉴定结果参见图3。pFastBacDual-polh-helicase DNA 经BamH I酶切，可切出了2800bp左右和9000bp左右的条带，与预想的片段大小相同，说明所得到的质粒为正确的重组质粒。
5. pFastBac Dual-polh-helicase转化E. coli DH10BmBacmid（转化方法可参见：Cuiping Cao等， Development of a rapid and efficient BmNPV baculovirus expression system for application in mulberry silkworm, Bombyx mori. RESEARCH COMMUNICATIONS. 2006, 91(12):1692-1697)感受态细胞，涂布于含卡那霉素（kan, 50μg/m），庆大霉素（Gen, 7μg/ml），四环素（Tet, 10μg/ml），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal, 100μg/ml）和异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG, 40μg/ml）筛选平板上，倒置培养皿，37℃培养至少48h，并把平板放置4℃冰箱直至看到明显的白斑。
6. 用灭菌牙签挑取白斑单菌落，然后在含Kan (50μg/ml)，Gen (7μg/ml)，Tet (1 0μg/ml)的3ml液体细菌培养基，37℃震荡培养至对数生长期，提取BmBacmid-polh-helicase基因组DNA。
7. 取4μg 重组BmBacmid-polh-helicase DNA 与8μl 脂质体混合后，转染1×106/ml的家蚕培养细胞，27℃培养4－6天，细胞出现明显病变，并有多角体形成。收集发病细胞上清，获P1代重组病毒BmEoNPV。
P1代重组病毒BmEoNPV的鉴定参见图4。以P1代重组病毒BmEoNPV DNA 为模板，Bm Polh-Hel-1(SEQ ID No. 3：5’-GATCTTCGGCAACCATGTAG-3’)和Bm Polh-Hel-2(SEQ ID No. 4：5’-CGTGTTATCGAGGAGCG-3’)为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出700bp左右的条带，与理论值相符，表明重组病毒BmEoNPV被正确构建。
8. P1代重组病毒BmEoNPV 10微升，感染1×106/ml的家蚕培养细胞，27℃培养4－6天，收集发病细胞上清，获P2代重组病毒BmEoNPV。
P2代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞4－6天后的细胞变化参见图5。细胞出现明显病变，并可观察到有多角体形成。
9. 将P2代重组病毒BmEoNPV以每头5龄家蚕注射1－2微升，25℃正常饲养，发病后，纯化重组病毒多角体。
实施例二：实施例一获得的重组病毒BmEoNPV的应用
将实施例一获得的重组病毒多角体，配制108多角体/ml的病毒液，喷洒在茶叶树上，并将野外捕捉到的3－4龄茶尺蠖放养在喷洒过重组病毒多角体茶树，自然取食，一周后，茶尺蠖的自然感染死亡率达63%。
核苷酸和/或氨基酸序列表
<110> 溧阳市民生农业科技园有限公司
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<120> 一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法
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<213> 人工合成
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gaactagtat gattggtgta atcgt 25
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cactgcagac tttgcacgta gtttgtgtat atg 33
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<400> 4
cgtgttatcg aggagcg 17
Claims (5)
1.一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备包含茶尺蠖核型多角体病毒的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh的重组载体，得到重组载体pFastBacDual-polh-helicase；
重组载体pFastBacDual-polh-helicase的制备方法包括以下步骤：
(a) 以茶尺蠖核型多角体病毒EcobNPV的DNA为模板，采用PCR扩增法扩增出EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进pMD19-T载体，获得质粒pMD19-helicase；
(b) 分离带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh，克隆进pFastBacDual载体，获得质粒pFastBac Dual-polh；
(c) 双酶切质粒pMD19-helicase，回收EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进载体pFastBacDual-polh，获得重组载体pFastBacDual-polh-helicase；
(2) 将重组载体pFastBacDual-polh-helicase转化进E. coli DH10 BmBacmid 感受态细胞内，在培养板上培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，从阳性菌斑中提取菌株中的重组Bacmid 基因组DNA；
(3) 将上述重组BmBacmid-polh-helicase DNA转染到家蚕培养细胞，培养4～6天，收集培养细胞上清，获得P1代重组病毒BmEoNPV；采用P1代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞，培养4～6天，收集培养细胞上清，获得P2代重组病毒BmEoNPV；
(4) 每头5龄家蚕注射1～2微升P2代重组病毒BmEoNPV，发病后，纯化重组病毒多角体，即得所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
2. 根据权利要求1所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，所述培养板含：卡那霉素、庆大霉素、四环素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基硫代-β-D半乳糖苷。
3. 采用权利要求1所述制备方法制得的能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
4. 权利要求1所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒作为防治茶尺蠖的生物杀虫剂的应用。
5. 一种防治茶尺蠖的生物杀虫剂，其特征在于，所述防治茶尺蠖的生物杀虫剂的主要活性成分为权利要求4所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
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