CN101161816B

CN101161816B - 双价抗虫基因的植物表达载体构建及其转基因植物获得方法

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Publication number: CN101161816B
Application number: CN2007101060777A
Authority: CN
Inventors: 刘桂珍; 周长生; 陈凌娜; 陈正华
Original assignee: Beijing Changle Ersheng Gene Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Boda Wanxing Technology Co., Ltd.
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2027-05-31
Also published as: CN101161816A

Abstract

本发明涉及一种来源于反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)的苋菜凝集素(Amaranthus retroflexus agglutinin，简称ARA)基因与来源于苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的基因序列—Bt(Bacillus thuringiesis，简称Bt)的基因序列，将两个基因，构建到同一植物表达载体中，并将该双价抗虫基因的植物表达载体转入到植物中，及其转基因植物获得的方法。

Description

双价抗虫基因的植物表达载体构建及其转基因植物获得方法

发明领域

本发明涉及一种来源于反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)的苋菜凝集素(简称ARA)基因与来源于苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的基因序列——Bt(Bacillus thuringiesis，简称Bt)的双价抗虫基因的植物表达载体构建及其转基因植物获得的方法。本发明通过克隆一种反枝苋凝集素基因(ARA)的核苷酸序列与人工合成的Bt杀虫蛋白基因，将两个杀虫基因，构建到同一植物表达载体中，并分别由韧皮部特异表达启动子(BSP)驱动ARA基因在韧皮部特异表达，由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动Bt基因在植物体内组成型表达，该双价抗虫基因在植物体内的表达对同翅目和鳞翅目昆虫具良好的毒杀效果，用该双价抗虫基因还可缓解昆虫对杀虫蛋白抗性的增加。本发明将双价抗虫基因构建的植物表达载体转入植物细胞，获得了抗同翅目和鳞翅目害虫的转基因植物，使产量显著高于非转基因植物，本发明为植物虫害防治提供了新的基因资源。

背景技术

植物凝集素是一类具有高度糖结合活性的蛋白，存在于许多植物的种子和营养器官中。第一个植物凝集素是在蓖麻籽中发现，到目前为止，已经发现了许多种不同的植物凝集素，在生理生化及分子生物学水平对它们进行了许多研究，特别是近年来，对多种植物凝集素进行了蛋白质晶体结构的研究，并对植物凝集素的生物学功能有了更深的认识。植物凝集素具有对鳞翅目，特别是对同翅目蚜虫，飞虱，叶蝉等刺吸式口器害虫及一些微生物有防效(Huesing，J.E.Rice and stinging nettle lectins：insecticidalactivity similar to wheat germ agglutinin.phytochemistry，1991，266：789～793.Gzapla，TH.Effects of plant lectins on the larval development ofeuropean core borer and southern corn rootworm.Econ，1990，83：2480～2485.Powell，K.S.An timetabolic effects of plant lectins and plant and fungalenzymes on the nymphal stages of two important rice pests.Nilaparvata lugensand Nephotettix cinciteps.Entomo Exp.Appl.，1993，66：119～126.Rahbe，Y.Protein toxicity to aphids：an in vitro test on Acyrthosiphon pisum.Entomol.Exp.Appl.，1993，67：149～160.Hilder，V.A.A Novel Mechanism ofInsect Resistance Engineering into Tobacco.Nature，1987，330：160～163.Gatehouse A M R，Davidion G M，Stewart J N，et al.Concanavalin A inhibitsdevelopment of tomato moth(Lacanobia oleracea)and peach-potato aphid(Myzus persocae)when expressed in transgenic potato plants[J].MoluecularBreeding，1999，5：1153～165.Rahbe，Y.Toxicity of lectins and processing ofingested proteins in the pea aphid Acyrthosiphon pisum.Entomol.Exp.Appl.，1995，76：143～155.)，对环境无污染，稳定性好及对高等动物相对安全等优点，成为防治病虫害的又一重要研究对象。根据Gatehouse等(Gatehouse，A.M.R.Insecticidal Properties of Plant Lectins：Their Potential in PlantProtection.In Pusztai，Biomedical Perspectives，1995：35～37.)将植物凝集素定义为一种能够与特异单糖或多糖化合物可逆结合的非免疫性球蛋白。目前，已从豆科，茄科，禾本科，百合科，石蒜科，苋科等植物中发现了1000多种植物凝集素。根据结构的不同和结合糖的特异性可以把植物凝集素分为七个蛋白家族(Peumans，W.J.，Isolation and partial characterization of asmall chitin-binding lectin from mistletoe.FEBS Letter，1996，392，261～265.)，它们分别为豆科类凝集素、单子叶植物结合甘露糖凝集素、结合几丁质凝集素、2-型核糖体失活蛋白、Jacalin凝集素、葫芦科韧皮部凝集素、苋菜类凝集素。在正常情况下，植物凝集素仅作为储存蛋白而不表现任何特异活性，即行使其内源功能；一旦植物受到微生物，昆虫等动物的危害，植物凝集素就会从植物的受害细胞释放出来，目前已发现的凝集素主要有雪花莲凝集素，豌豆外源凝集素，麦胚凝集素，苋菜凝集素以及核糖体失活蛋白等，对植物病虫害都具有一定防治效果。

苋菜类凝集素是一种来源于苋菜Amaranthus种子的凝集素，与其它植物凝集素无论是氨基酸序列还是三维空间结构上均不同。基于目前的数据，Amaranthin被认为是该类凝集素家族的典型。其它的苋属植物如刺苋、繁穗苋、千穗谷、反枝苋等都含有与Amaranthin类似的凝集素。由于在其它植物中没有发现与Amaranthin相似的凝集素，因此Amaranthin被认为是一类小的凝集素家族。在国内外的报道中有千穗谷苋菜(Amaranthushypochondriacus)凝集素基因、雪花莲凝集素基因及尾穗苋(Amaranthuscaudatus)凝集素基因都具有防治蚜虫的效果。本发明所用的供体资源是反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)属苋科一年生草本植物，生于农田、路边或荒地，适应性极强，未发现有蚜虫危害。因此，本发明以野生的反枝苋为材料进行抗蚜基因的克隆，为植物抗虫基因工程提供了新的高效的抗虫基因源。本发明不仅与前人所用供体不同，而且所克隆的凝集素基因的核苷酸序列也有一定差别。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiesis，简称Bt)是一种革兰氏阳性土壤杆菌。在不良环境下，苏云金芽孢杆菌伴随内生孢子的形成可产生一至几个伴孢晶体，该晶体含有对许多昆虫有毒杀作用的δ一内毒素(δ-endotoxin)，也称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。它们是一类分子量130—160KD的蛋白质，在昆虫中肠碱性和还原性环境下，蛋白被降解成60KD左右的活性小肽，从而导致昆虫中毒死亡。在过去的几十年中，苏云金芽孢杆菌作为一种微生物杀虫剂一直被广泛应用于防治农作物、蔬菜和森林害虫。但由于这种细菌农药存在着成本高，在植物叶面存留时间短(易受风吹、雨淋而散落)等缺点，自八十年代以来国内外纷纷开展了克隆Bt杀虫蛋白基因，并通过转基因技术培育抗虫植物的研究工作。已有3种转Bt杀虫蛋白基因的作物(棉花、玉米、马铃薯)得到商业化推广。从目前的研究来看，Bt基因应用于抗虫转基因作物经历了四个发展阶段，第一代Bt转基因植物诞生于八十年代中期，几乎都使用了野生型的Bt基因或3’端缺失的Bt基因(Fischhoff等Biotechnology，1987，5：807—803)。但由于野生型基因富含AT序列以及微生物偏爱的密码，在植物中的表达量较低，所得到的转基因植物抗虫效果并不理想。第二代转基因植物所使用的Bt基因一般都经过了人工改造，在不改变氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行部分改造或重新合成，选用植物偏爱的密码，去除原序列中在植物体内的不稳定原件，使毒蛋白基因的表达水平和杀虫效果有了很大提高。第三代Bt转基因植物是将不同种类的、与昆虫中肠上皮细胞膜受体具有非竞争性结合关系的Bt基因或Bt基因与其他来源的抗虫基因构建成二价体或多价体转化植物，以及以及获得昆虫难以产生抗性和提高杀虫力的效果。第四代转基因植物是借助于国际上出现的一种新型基因转化技术，即叶绿体转化而获得的。这种转化技术具有定点整合、高效表达、遗传稳定、原核基因无需改造等诸多优点。纵观Bt转基因的研究历史可以看出，来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因无论是其野生型或其改造型在培育抗虫作物方面均具有重要应用价值。一般根据Bt基因的杀虫范围和基因序列同源性划分为六大类：CryI主要作用于鳞翅目，CryII主要作用于鳞翅目和双翅目，CryIII主要作用于鞘翅目，CryIV主要作用于双翅目，CryV主要作用于鳞翅目和鞘翅目，同一类杀虫蛋白基因根据其蛋白质氨基酸序列的同源性差异又可分为许多亚类，例如，CryIA(a)、CrylA(b)、CryIA(c)等。

就目前生产应用的情况来看，如转入Bt杀虫基因的棉花，其目标昆虫是棉铃虫和红铃虫等害虫，大面积和长期使用后，昆虫已对抗虫棉的杀虫蛋白产生适应性或抗性，这不仅会使抗虫棉的应用受到影响，而且会影响Bt农药制剂的防虫效果。为了解决这个问题，就必须不断改进基因，使昆虫来不及产生适应性或难以产生适应性；或种植少量非转基因棉花，以延缓昆虫产生抗性。本发明利用一种新的双价抗虫基因即能够延缓昆虫对杀虫蛋白产生抗性的效果。

发明内容

一方面，本发明提供了编码来源于反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)的苋菜凝集素的基因ARA，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列，或为在严紧杂交下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交且具有相同功能的序列。优选地，所述在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交的序列为SEQ ID NO：9所示的序列。同时，本发明还提供了ARA基因编码的苋菜凝集素，并且优选地，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所述的序列。

另一方面，本发明提供了编码Bt杀虫蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列，或为在严紧杂交下与SEQ ID NO：3所示的序列杂交且具有相同功能的序列。优选地，所述在严紧杂交条件下与SEQ IDNO：3所示的序列杂交的序列为SEQ ID NO：10所示的序列。同时，本发明还提供了该基因编码的Bt杀虫蛋白，并且，优选地，其氨基酸序列为SEQID NO：4所示的序列。

在用于本文中时，术语“严紧杂交条件”对于本领域的普通技术人员而言是可以基于常识，结合具体的情况确定的。优选地，该杂交条件为：

建立Southern杂交体系的缓冲液需要含有30％(V/V)去离子的甲酰胺、0.6M的NaCl、0.04M磷酸钠(pH7.4)、2.5mM EDTA(pH8.0)、7％SDS、放射性标记的变性探针(杂交液终浓度为1×10⁶—2×10⁶cpm/ml)。42℃杂交16小时。杂交反应结束后，室温下用2×SSC/0.1％SDS洗膜两次，然后用2×SSC/0.1％SDS于55℃洗膜一次。使用较大体积的浸泡及洗膜溶液；在使用前确信其温度适当。

本发明还涉及在SEQ ID NO：1或3所示的核苷酸序列基础上进行一个或多个(优选几个，更优选个)核苷酸的保守性置换、缺失、添加或修改(优选置换)后所得到的具有相同功能的核苷酸序列。本领域的普通技术人员基于说明书的教导，结合本领域的公知常识，完全可以容易地确定经过上述修饰后的核苷酸序列。具体地，在ARA基因中，以下发生8个位置碱基的突变，不改变其功能：其中在166由A→G、168和173由C→T、367由C→G、473和827由T→C、491和604由G→C，突变后的序列参见SEQ ID NO：9，其与ARA核苷酸序列(SEQ ID NO：1)同源性为98.8％。在Bt基因中，以下发生5个位置碱基的突变，不改变其功能：其中在470由T→C、867由A→T、1112和1817由T→C、1281由C→T，突变后的序列参见SEQ ID NO：10，其与Bt核苷酸序列(SEQ ID NO：4)同源性为99.7％。

另外，本发明还提供表达载体，其包含上述编码来源于反枝苋(Amaranthus retroflexusL.)的苋菜凝集素的基因和编码上述Bt的蛋白的基因的任一种。优选地，其同时包含选自上述两种基因。并且，更优选地，上述两种基因处于不同启动子的控制之下，并且最优选所述编码Bt的基因处于花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，编码ARA的基因处于韧皮部特异表达启动子控制下。

同时，本发明还涉及包含上述表达载体的宿主细胞。优选地，其是保藏号为CGMCC No.2067的大肠杆菌细胞。

另外，本发明还提供一种培育抗同翅目及鳞翅目害虫的转基因植物的方法，其中包含将上述编码ARA或Bt的基因整合到植物基因组中。优选地，上述两种基因处于不同启动子的控制之下。优选地，编码Bt的基因处于花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，编码ARA的基因处于韧皮部特异表达启动子控制下。

优选地，其中所述同翅目害虫选自蚜虫；所述鳞翅目害虫选自棉铃虫；所述植物是单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物选自玉米、水稻，所述双子叶植物选自棉花、油菜、大豆。并且更优选地，所述植物是棉花。

本发明所述的表达载体，即双价抗虫基因的植物表达载体，是将反枝苋凝集素基因(ARA)基因与人工合成的一种新的杀虫蛋白基因(Bt)基因构建到同一个植物表达载体中，该载体可将双价基因同时转入受体植物，使植物同时具有抗同翅目害虫及抗鳞翅目害虫的特性。植物表达载体构建的过程是：第一步将在原核表达载体上的Bt基因的核苷酸序列，先插入到植物表达载体pBI121的多克隆位点上，取代其上面的GUS基因，得到pBI-Bt，Bt杀虫蛋白基因被花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子所驱动，并含有NOS转录终止子，转入植物后实现组成型表达。第二步将在原核表达载体上的ARA基因的核苷酸序列，插入到植物表达载体pBI121的多克隆位点上，取代其上面的GUS基因，得到pBI-ARA，然后将已经过本实验室鉴定功能的、位于一种植物表达载体上的维管束特异启动子BSP经限制性酶切后，取代植物表达载体pBI-ARA上的35S启动子，以BSP启动子驱动ARA基因在植物中实现维管束特异表达。第三步将构建好的BSP-ARA-NOS表达盒酶切后连接到pBI-Bt上，得到(pBI-Bt-ARA)双价抗虫基因的植物表达载体。

本发明所构建的表达载体可适于双子叶植物的表达或适于单子叶植物的表达。所述的双子叶植物包括：棉花、油菜、大豆等，所述的单子叶植物包括：玉米、水稻等。本领域的普通技术人员可以理解基于公知常识及需要可以选择适于双子叶植物及单子叶植物的表达载体。具体地，本发明所使用的表达载体具有植物选择标记NPTII基因(新霉素磷酸转移酶基因)，使携带该基因菌体或植物具有卡那霉素抗性。

具体地，本发明将该双价抗虫基因用于棉花细胞转化，转基因棉花的抗虫性和产量均优于非双价抗虫基因棉花。

本发明的双价抗虫基因不仅能增加对蚜虫的抵抗性，而且Bt基因的表达，赋予植物对鳞翅目害虫的抵抗性，能降低昆虫适应性的变异。

本发明将915bp的反枝苋凝集素基因(ARA)与1842bp的杀虫蛋白基因构建在同一植物表达载体上，其所用Bt cryI A(C)杀虫蛋白基因的核苷酸序列是经过设计后，再进行化学合成，合成的Bt杀虫蛋白基因，在不改变氨基酸序列的前提下，选用植物偏爱的密码子，去除原序列中在植物体内的不稳定原件，使毒蛋白基因的表达水平和杀虫效果有了很大提高，经改造合成的序列共1842个核苷酸，翻译后形成含有614个氨基酸的一种杀虫蛋白质。鉴于目前在生产上广泛应用的Bt基因之间的结构均十分相似，虽然对昆虫具有一定毒杀作用，但随着昆虫的遗传变异，将会对现有的Bt基因产生抗性或使农药失效。本发明目的是提供一种新的杀虫蛋白基因，旨在延缓昆虫对杀虫蛋白产生的抗性，更好发挥杀虫基因的抗虫效果，通常Bt基因的表达对蚜虫是无效的，防治蚜虫仍然是一项繁重而耗资的任务。因此，本发明所提供的双价抗虫基因就能解决这一难题。双价抗虫基因的表达产物对同翅目和鳞翅目昆虫有良好的毒杀作用。据许多报道认为苋菜凝集素对人类等高等动物是安全的，而无任何毒副作用。

附图说明：

图1：双价抗虫基因植物表达载体结构图。

图2：ARA基因PCR图，其中1.Marker；2.外显子1；3.外显子2；4.ARA基因全长。

图3：载体pUCm-T-ARA PCR检测图，其中1.Marker；2-3：ARA PCR产物。

图4：载体pUCm-T-ARA酶切检测图，其中1.Marker；2-4：ARA酶切产物。

图5：载体pET-ARAPCR检测图，其中1.Marker；2-3：ARAPCR产物。

图6：载体pET-ARA酶切检测图，其中1.Marker；2-3：NdeI+SacI酶切结果。

图7：ARA基因表达载体pET-ARA构建流程图。

图8：重组质粒pET-ARA大肠杆菌表达产物SDS-PAGE分析，其中1，7：蛋白质Marker；2-6：分别为pET28a/E.coli BL21诱导3.0h、2.0h、1.0h、0.5h和未诱导的样品。8-12.：分别为pET-ARA/E.coli BL21诱导3.0h、2.0h、1.0h、0.5h的样品。

图9：重组质粒pET-Bt大肠杆菌表达产物SDS-PAGE分析，其中1-5：分别为pET28a/E.coli BL21诱导0.5h、1.0h、2.0h、3.0h和未诱导的样品；6：蛋白质Marker；7：pET-Bt/E.coli BL21未诱导的样品；8-11：分别为pET-Bt/E.coli BL21诱导0.5h、1h、2.0h、3h的样品。

图10：载体pBI-Bt PCR检测图，其中1：.Marker；2、3：pBI-Bt PCR产物。

图11:载体pBI-Bt酶切检测图，其中1.Marker；2、3：pBI-Bt酶切产物。

图12：载体pBI-ARA PCR检测图，其中1：.Marker；2、3：pBI-Bt-ARAPCR产物。

图13：载体pBI-ARA酶切检测图，其中1.Marker；2、3：pBI-ARA酶切产物。

图14：由某植物表达载体酶切下BSP启动子检测图，其中1.Marker；2、3：BSP酶切产物。

图15：重组质粒pBI-BSP-ARA用PCR检测，其中1：.Marker；2.ARA基因PCR扩增检测；3.BSP启动子PCR扩增检测。

图16：重组质粒pBI-BSP-ARA用酶切检测，其中1.Marker；2.ARA基因酶切；3.BSP启动子酶切；4.BSP-ARA总体酶切。

图17：重组质粒pBI-Bt-ARA中ARA基因PCR检测，其中1：.Marker；2、3：ARAPCR产物。

图18：重组质粒pBI-Bt-ARA中Bt基因PCR检测，其中1：.Marker；2、3：Bt PCR产物。

图19：Bt基因表达载体pBI-Bt构建流程图。

图20：ARA基因和Bt基因双价植物表达载体pBI-Bt-ARA构建流程图。

图21：T1代转化植株卡那霉素检测，图中显示植株为抗卡那植株。

图22：非转化植株卡那霉素检测，图中显示植株为不抗卡那植株。

图23：转基因棉花抗棉铃虫性鉴定，其中左：转基因棉花叶片；右：非转基因棉花叶片(CK)。

图24转基因棉花的Bt基因PCR检测，其中1：Marker；2：阳性对照；3-4：转基因棉花植株PCR扩增结果，显示Bt基因的存在；5：阴性对照。

图25转基因棉花的ARA基因PCR检测，其中1：Marker；2：阳性对照；3-4：转基因阳性植株基因组DNA，显示ARA基因的存在；5：阴性对照。

图26转基因棉花总DNA酶切电泳图，其中1为Maker2～8为转基因植株。

图27转基因棉花Southern杂交结果，其中1为非转基因植株(阴性对照)，2～7为转基因植株。

图28：转基因棉花离体叶片的抗蚜试验，左侧为非转基因棉花叶片(CK)；右侧为转基因棉花叶片。

如下所述，将本发明的双价抗虫基因ARA和Bt插入植物表达载体pBI121，转化大肠杆菌DH5α菌株，得到的重组菌株pBI121-Bt-ARA于2007年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2607。

具体实施方式

下面通过参考实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员应当理解，下述实施例仅是用于举例说明本发明的目的，其不应被以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

实施例1 反枝苋凝集素基因克隆、原核表达载体构建及原核表达产物杀虫效果实验

本研究根据同一科属中基因高度同源的特点，从北京郊区路边旱地采集野生苋菜经鉴定为反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)，将反枝苋种子经无菌培养后从叶片中分离出总DNA，通过重叠序列设计的引物与聚合酶链反应(PCR)技术，以总DNA为模板分别扩增到两个外显子，再以两个外显子的回收产物为模板进一步进行PCR扩增，完成两个外显子的体外拼接，获得完整的基因编码区序列，将其连接到pUCm-T载体上，酶切的条带及DNA序列分析表明克隆的片段长度为915bp，包含了完整的外源凝集素的编码序列。我们从多个克隆中筛选出一个与报道序列最为接近的克隆，他们之间核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别是98.8％和98.4％。

1.反枝苋凝集素基因克隆

本研究根据同一科属中基因高度同源的特点，从北京郊区路边旱地采集野生苋菜经鉴定为反枝苋(Amaranthus retroflexusL.)，将反枝苋种子经无菌培养后从叶片中分离出总DNA，通过重叠序列设计的引物与聚合酶链反应(PCR)技术，以总DNA为模板分别扩增到两个外显子，再以两个外显子的回收产物为模板进一步进行PCR扩增，完成两个外显子的体外拼接，获得完整的基因编码区序列，将其连接到pUCm-T载体上，酶切的条带及DNA序列分析表明克隆的片段长度为915bp，包含了完整的外源凝集素的编码序列。我们从多个克隆中筛选出一个与报道序列最为接近的克隆，他们之间核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别是98.8％和98.4％。

具体实施方法如下

1.1材料

1.1.1菌种与质粒

大肠杆菌BL21菌种、E.coli DH5α菌种及感受态细胞均购自北京鼎国生物技术公司，载体质粒pET28a和pBI121(其具有终止子NOS)为Novagen公司产品，pUCm-T载体购自上海生工公司，载体质粒pBIBGC携带有韧皮部特异表达启动子BSP，由甘肃亚盛集团博士后科研工作站提供。

1.1.2工具酶

所用的限制性内切酶，T₄DNA连接酶等购自Takara公司。

1.1.3 DNA marker，DNA凝胶回收试剂盒，购自天为时代生物技术有限公司，琼脂糖，Tris饱和酚(pH>7.5)、均购自北京鼎国生物技术公司。常用试剂：氯仿、无水乙醇、异丙醇、异戊醇等常用试剂购自北京化学试剂厂。

1.2反枝苋总基因组DNA的提取和检测

1.2.1反枝苋基因组总DNA的提取方法

(1)称取0.5克新鲜的反枝苋叶片，置于预冷的研钵中，用液氮研磨至粉末，转入7ml离心管中；

(2)加入2.5ml65℃预热的CTAB提取缓冲液，轻轻摇匀；

(3)65℃保温30分钟，期间温柔摇动三至四次，取出离心管自然冷却至室温；

(4)用等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提两次，温和混匀，每次在室温下10000rmp/min离心10分钟；

(5)取上清转移至一洁净的离心管中，加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温下放置15分钟；

(6)10000rmp/min离心10分钟，弃上清；

(7)用2ml70％乙醇洗涤沉淀两次，室温下微干，溶于500-700μl TE缓冲液中；

(8)加入终浓度为50μg/ml的RNase，37℃保温1小时；

(9)用等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提两到三次，温和混匀，每次在室温下10000rmp/min离心10分钟；

(10)用等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提两到三次，温和混匀，每取上清液加入终浓度为0.2-0.4mol/LNaCl，2倍体积的无水乙醇，放置1小时左右，12000rmp/min离心10分钟；

(11)用70％乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后溶于50-100μl TE中备用。

1.2.2DNA完整性的检测

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性。

1.2.3ARA基因片段的获得

通过重叠序列设计的引物与聚合酶链式反应(PCR)，获得ARA的表达序列。设计的四条引物分别为：

AP1：5’-GCGCATATGATGGCGGGATTACCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)

Nde I酶切位点

AP2：

5’-CGCTACACTAACAAATATTTGGTTAGGTGGTCCCCCAATCATTAT-3’(SEQ IDNO：6)

AP3：

5’-ATAATGATTGGGGGACCACCTAACCAAATATTTGTTAGTGTAGCG-3’(SEQ IDNO：7)

AP4：5’-CGCGTCGACTCATTAGTTGTTGGATCCCA ATTC-3’(SEQ ID No：8)

Sac I酶切位点

其中AP2和AP3为45bp的碱基重叠，二者完全互补。

首先以总DNA0.5μl为模板，分别以AP1+AP2和AP3+AP4为引物扩增到外显子1和2，再以外显子1和2的回收产物各0.5μl为模板，以AP1+AP4为引物进行第三次PCR扩增，得到完整的ARA基因表达序列，基因大小为0.9kb左右(如图2所示)，序列如SEQ ID NO：1所示。

PCR反应体系(50μl)

(1)ddH₂O 36.0μl

(2)10×PCR Buffer 5.0μl

(3)dNTPs 3.0μl

(4)上游引物(SEQ ID NO：5)(10pmol/μl) 2.5μl

(5)下游引物(SEQ ID NO:8)(10pmol/μl) 2.5μl

(6)模板(基因组DNA) 0.5μl

(7)Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μl

PCR反应程序

首先94℃，3分钟；然后进行30个循环，每个循环为94℃，1分钟，50℃，50秒，72℃，1分20秒；然后72℃，10分钟，最后放置于4℃。

1.3 目的基因与克隆载体pUCm-T载体的连接

将PCR扩增获得的0.9kb左右的目的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后同pUCm-T载体连接，连接体系10μl(T载体1μl，ARA基因片段5μl，T₄DNA连接酶缓冲液1μl，T₄DNA连接酶1μl，ddH₂O2μl)，将连接产物混合后于16℃水浴过夜，第二天用连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，经过氨苄青霉素抗性筛选获得重组子。

1.4 大肠杆菌感受态的制备及连接产物的转化

按照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社)的描述，制备大肠杆菌感受态细胞DH5α，并以5μl连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞。

1.5 小量碱裂解法提取质粒

按照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社)的描述，以小量碱裂解法提取转化连接产物的大肠杆菌感受态细胞的质粒DNA。

将质粒少量抽提后，电泳筛选，酶切及PCR鉴定，其鉴定体系如下。1.5.1重组质粒的酶切鉴定体系：

重组子用Nde I和SacI双酶切鉴定。在0.2ml的离心管中，依次加入下列各组分(20μl体系)：

(1)ddH₂O 8.0μl

(2)质粒 10.0μl

(3)10×buffer 2.0μl

(4)Nde I 0.5μl

(5)SacI 0.5μl

(如图4所示)

1.5.2重组质粒的PCR鉴定体系：

(1)ddH₂O 17.8μl

(2)10×PCR Buffer 2.5μl

(3)dNTPs 2.0μl

(4)上游引物(SEQ ID NO：5)(10pmol/μl) 1.0μl

(5)下游引物(SEQ ID NO：8)(10pmol/μl) 1.0μl

(6)模板(质粒DNA) 0.2μl

(7)Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μl

(如图3所示)

取检测正确的克隆进行序列测定得到没有发生终止突变的重组子命名为pUCm-T-ARA。

2.反枝苋凝集素基因原核表达载体的构建(如图7所示)及原核表达产物杀虫效果实验

用NdeI/SacI分别双酶切pUCm-T-ARA和原核表达载体pET28a，并用凝胶纯化回收试剂盒进行纯化，将酶切回收的目的基因ARA和载体pET28a按5:1(体积比)进行连接。反应体系10μl，16℃连接过夜。用连接产物转化上述制备的感受态大肠杆菌(DH5α)，经卡那霉素抗性筛选及质粒少量抽提，电泳筛选，酶切鉴定，得到阳性重组子pET28a-ARA(如图5-6所示)。

将鉴定正确的重组子提取质粒后，用2μl质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(转化方法同DH5α)，以便将克隆的反枝苋凝集素基因进行原核表达，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分析。

2.1 表达产物的制备

(1)分别从鉴定过的质粒转化平板上挑取一个单菌落接种到2ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中，37℃，280rpm振荡培养到OD₆₀₀为0.5左右；

(2)分别取此培养菌液，按1％体积接种到新的两瓶LB液体培养基中，以相同的培养条件振荡培养；

(3)振荡培养3小时后，使培养菌液的OD₆₀₀达到0.5左右；

(4)各取1ml尚未诱导的培养物于1.5ml离心管中，在剩余的菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L(IPTG stock100mmol/L)，进行诱导培养；

(5)分别在培养0.5、1.0、2.0和3.0h(连同未经过诱导培养的共5支离心管)，各取1ml培养物；

(6)立即在室温下，12000g离心1min，弃掉上清液；

(7)将每份沉淀悬浮于100μl1×SDS凝胶上样缓冲液中，在95℃水浴中煮5min，然后保存在0℃直到所有样品都已制备齐后上样进行蛋白电泳。

2.2 聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)

按照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社)的描述，进行SDS-PAGE电泳。一般每个加样孔上样15.0μl，其中一个加样孔为标准分子量Marker(分子量标准购自天为时代生物技术有限公司)。(如图8所示)

2.3 ARA杀虫蛋白基因原核表达产物杀虫效果实验

通过对pET28a/E.coli BL21和pET28a-ARA/E.coli BL21的生长克隆菌的生长动态测定结果来看，在工程菌摇到3小时的时候，两个样品的OD600值均在0.5左右，所以确定这个时间为开始诱导的时间。在加入诱导剂IPTG之后，菌液浓度也呈上升的趋势，到了5.5小时后开始逐渐下降，所以将诱导最终时间确定为3小时。各克隆菌分别在IPTG诱导后的4个时间段(诱导0.5h、1.0h、2.0h和3.0h)取样，离心收集菌体，再用上样缓冲液裂解菌体离心后取上清液进行SDS-PAGE电泳。从电泳图谱上可以看出，经IPTG诱导后，pET28a-ARA/E.coli BL21表达出分子量为36kDa的特异蛋白，(如图8所示)，与理论计算的分子量大小相符。随着诱导时间的延长，表达蛋白的积累量也增加。这说明pET28a-ARA基因在微生物中能够表达，而且阅读框架完整，未发生提前终止现象。各取500ml对照细菌和重组细菌的诱导培养物经离心收集菌体，蒸馏水洗涤抽干，再30ml蒸馏水重悬，超声波处理，稀释两倍后将菌液滴加在培养基的表面上，饲喂蚜虫(中国农科院植物保护研究所)，25℃喂养72小时后统计死亡率并求出校正死亡率。[校正死亡率＝(处理的平均死亡率一对照的平均死亡率)/对照的平均存活率×100％]。每个处理重复三次，会发现含有ARA杀虫蛋白基因的重组细菌对蚜虫有较强的杀伤力(见表1)。

表1 ARA杀虫蛋白基因表达产物对蚜虫的杀虫活性

处理	接种幼虫数	死亡幼虫数	死亡率％	校正死亡率％
					对照	70	3	4.3	-
重组菌	70	65	92.86	92.71₃₀

实施例2 Bt基因人工合成、原核表达载体的构建及原核表达产物杀虫效果实验

1.Bt 杀虫蛋白基因的人工合成及其原核表达载体的构建

1.1Bt 杀虫蛋白基因的人工合成

本发明的Bt杀虫蛋白基因为人工合成，这一新的人工合成Bt基因是参照Bt cryI A(C)杀虫蛋白基因的核苷酸序列设计改造后合成的，本发明合成的Bt杀虫蛋白基因(SEQ ID NO：3)，在不改变氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行部分改造，选用植物偏爱的密码子，去除原序列中在植物体内的不稳定原件，经改造合成的序列共1842个核苷酸，经翻译形成含有614个氨基酸的一种杀虫蛋白质。根据人工设计的Bt基因序列，按区段进行基因片段合成，然后将各区段进行连接。本发明通过人工合成的Bt杀虫蛋白基因与国内前人人工合成的Bt杀虫蛋白基因的核苷酸序列比对同源性为80.12％，与改造的cryI A(C)Bt杀虫蛋白基因序列比对同源性为82.41％，与Bt cryI A(C)原核苷酸序列的同源性为83.12％。在本发明中，人工合成的Bt杀虫蛋白基因与他人合成或改造的Bt杀虫蛋白基因核苷酸序列有所不同，这一新的人工合成Bt杀虫蛋白基因对鳞翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用，使Bt毒蛋白基因的表达水平和杀虫效果有了很大提高。

1.2Bt 杀虫蛋白基因原核表达载体的构建

如上所述的方法，利用限制性内切酶SalI和HindIII将人工合成的Bt基因克隆到pUCm-T载体中，获得pUCm-T-Bt。用SalI和HindIII双酶切pUCm-T-Bt和原核表达载体pET28a分别回收目的片段，并用凝胶回收试剂盒进行纯化，将酶切回收的目的基因Bt和载体pET28a按5:1(体积比)进行连接。反应体系10μl，16℃连接过夜。用连接产物转化上述制备的感受态的大肠杆菌(DH5α)，经卡那霉素抗性及质粒少量抽提，电泳筛选，酶切鉴定，得到阳性重组子pET28a-Bt。将Bt杀虫蛋白基因进行原核表达，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果表明，表达蛋白符合目标大小为67kD左右。(如图9所示)(实验步骤和方法同反枝苋凝集素ARA的构建)

2.Bt 杀虫蛋白基因原核表达产物杀虫效果实验

同ARA基因原核产物抗虫检测方法，各取500ml照细菌和重组细菌对的诱导培养物经离心收集菌体，蒸馏水洗涤抽干，再30ml蒸馏水重悬，超声波处理，稀释两倍后将菌液滴加在培养基的表面上，用二铃棉铃虫(中国农科院植物保护研究所)进行饲喂试验，25℃喂养72小时后统计死亡率并求出校正死亡率。每个处理重复三次，结果改良的Bt杀虫蛋白基因的重组细菌对棉铃虫有较强的杀伤力(见表2)。

表2 Bt杀虫蛋白基因表达产物对棉铃虫的杀虫活性

处理	接种幼虫数	死亡幼虫数	死亡率％	校正死亡率10％
					对照	80	2	2.5	-
重组菌	80	75	93.58	93.42

实施例3 ARA和Bt双价抗虫基因植物表达载体的构建

1.由韧皮部特异启动子BSP驱动的表达载体的构建

1.1具有Ca35S-ARA-NOS表达单元的ARA基因植物表达载体pBI-ARA的构建

用BamHI对pBI121进行单酶切，然后用Klenow大片段进行补平，回收补平产物；再用SacI酶切，回收酶切产物中的大片段，弃去GUS基因所在的小片段。用NdeI对pUCm-T-ARA进行单酶切，然后用Klenow大片段进行补平，回收补平产物；再用SacI酶切回收目的片段ARA。将回收的ARA基因片段和pBI121酶切回收的大片段连接，导入感受态E.coliDH5α，筛选重组子克隆，并对重组子进行PCR鉴定和酶切鉴定，将鉴定正确的重组子命名为pBI-ARA。

1.1.1 目的片段的补平和回收反应如下

(1)单酶切反应(反应体系40μl)

①ddH₂O 15.0μl

②质粒 20.0μl

③10×buffer 4.0μl

④BamHI(或NdeI) 1.0μl

37℃酶切4hr左右。

(2)酶切完全后，将酶切产物纯化回收，分别进行酶切产物的Klenow大片段的补平处理：

①向反应体系中加入下列溶液：

回收产物 22.0μl

10×Klenow buffer 3.0μl

dNTP mixture 2.0μl

Klenow Fragment 2.0μl

②37℃反应30min；

③75℃水浴加热5min灭活Klenow大片段。

(3)将Klenow大片段补平处理过的单酶切产物回收后，分别加入SacI完成第二个酶切反应，反应体系为40μl，如下：

①回收产物 35.0μl

②10×buffer 4.0μl

③SacI 1.0μl再37℃酶切4hr左右，电泳回收目的片段，以pET28-ARA的连接反应体系进行连接、转化并进行鉴定。

重组子的PCR及酶切鉴定体系同前pUCm-T-ARA的鉴定体系。酶切时由于Klenow大片段的处理使pBI121上的BamHI位点不再可用，利用载体上的另一位点XbaI，于是用限制性内切酶XbaI和SacI进行双酶切鉴定是否ARA基因正确的连接到载体pBI121。PCR及酶切鉴定结果如图12-13。

1.2 具有BSP-ARA-NOS表达单元的ARA基因植物表达载体pBI-BSP-ARA的构建

用HindIII和XbaI对pBI-ARA进行双酶切后回收大片段，弃去Ca35S启动子所在的小片段；同时用HindIII和XbaI对植物表达载体pBIBGC进行双酶切，回收860bp左右的BSP基因片段，将回收的BSP基因片段和pBI-ARA酶切回收的大片段连接，导入感受态E.coli DH5α，筛选重组子克隆，并对重组子进行PCR鉴定和酶切鉴定，将鉴定正确的重组子命名为pBI-BSP-ARA。重组子的PCR及酶切鉴定体系同前pUCm-T-ARA的鉴定体系。酶切鉴定用HindIII和XbaI。鉴定结果如图15-16。

2.含Bt基因的植物表达载体pBI-Bt的构建(如图19)

2.1用HindIII单酶切pET28-Bt，及用Sac I单酶切pBI121酶切体系：100μl

A：用HindIII单酶切pET28-Bt B：用Sac I单酶切pBI121

质粒pET28-Bt 40μl 质粒pBI121 40μl

10×M buffer 5μl 10×L buffer 5μl

HindIII 1μl Sac I 1μl

ddH₂O 4μl ddH₂O 4μl

2.2回收pET28-Bt(HindIII)和pBI121(SacI)单酶切的产物，溶于20μlTE中，用Klenow大片段进行补平。

补平体系：50μl

单酶切产物 20μl

10×M buffer 5μl

dNTP 3μl

Klenow酶 1μl

ddH₂O 22μl

2.3 回收Klenow补平液，每管回收20μl，进行第二次酶切。

酶切体系：50μl

补平液 24μl

10×Mbuffer 5μl

BamH I 1μl

ddH₂O 24μl

2.4 电泳回收pET28-Bt小片段(1842bp)和pBI121大片段(13000bp)(见图11)。

2.516℃过夜连接

连接体系10μl

目的片段 3.5μl 4μl

载体片段 3.5μl 2μl

T4ligase 1μl 1μl

10×buffer 1μl 1μl

ddH₂O 1μl 2μl

转化后，挑单克隆，通过PCR扩增得到1800bp左右的片段(见图10)3.ARA和Bt双价抗虫基因植物表达载体pBI-Bt-ARA的构建(如图20)

3.1单酶切pBI-Bt(ClaI)，单酶切pBI-BSP-ARA(EcoRI)

酶切体系：100ul

A：单酶切pBI-Bt(ClaI) B：单酶切pBI-BSP-ARA(EcoRI)

质粒pBI-Bt 40μl 质粒pBI-ARA 40μl

10×M buffer 5μl 10×H buffer 5μl

Cla I 1μl EcoR I 1μl

ddH₂O 4μl ddH₂O 4μl

3.2回收pBI-Bt(ClaI)和pBI-BSP-ARA(EcoRI)单酶切的产物，电泳回收后溶于20μlTE中。

3.3 Klenow大片段补平

补平体系：50μl

质粒 20μl

10×M buffer 5μl

dNTP 3μl

Klenow酶 1μl

ddH₂O 22μl

3.4 回收Klenow补平液，每管溶于20μlTE中，进行第二次酶切。

酶切体系：50μl

质粒 24μl

10×M buffer 5μl

HindIII 1μl

ddH₂O 24μl

3.5电泳回收pBI-BSP-ARA小片段(2053bp)和pBI-Bt大片段(14345bp)

3.6连接16℃过夜连接

连接体系: 10μl

目的片段 3.5μl 4μl

载体片段 3.5μl 2μl

T4ligase 1μl 1μl

10×buffer 1μl 1μl

ddH₂O 1μl 2μl

挑取白色单菌落在kan抗性的液体培养基中振荡培养后，用碱裂解法小量提取质粒，因限制性酶切位点经Klenow补平后无法再利用，对质粒进行PCR扩增检测分别得到900bp(ARA基因)和1800bp左右(Bt基因)的片段，如图17-18，证实已将ARA基因及Bt基因正确克隆到表达载体pBI上，获得双价抗虫基因表达载体，其结构如图1所示。

实施例4 ARA基因和Bt基因双价抗虫基因对棉花进行遗传转化

1.材料

1.1.ARA基因和Bt基因双价抗虫基因植物表达载体的获得

将实施例3中所述双价抗虫基因表达载体转化大肠杆菌DH5α，获得的重组菌pBI121-Bt-ARA于2007年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2067。PCR鉴定表明构建的植物表达载体正确，如图17-18所示。

1.2.转化受体：供试材料为棉花优良品种(新疆自治区种子站提供)

2.方法

2.1.采用激光微束穿刺法对棉花进行遗传转化

2.1.1.植物材料的准备：取棉花授粉后40-50天的棉桃剥取幼胚作为转基因材料。

2.1.2.重组菌质粒DNA的提取和纯化：质粒的提取用碱性裂解法，纯化用PEG法(Sambrook等，1989)。

2.1.3.试验材料的处理方法

摘取棉花授粉后40-50天的棉桃，用75％酒精表面消毒3-5min，然后在无菌条件下取出幼胚，用高渗液浸泡幼胚2-3h。高渗液配制(参考G.Weber，S.Monajembashi，J.Wolffrum et al..Genetic change include in higherplant cell by a laser microbeam.Physiology Planlarum，1990，79：190-193)的方法其成分是10mmol/L Tris，pH7.2，0.7mol/L山梨糖醇。然后去掉高渗液，加入新鲜的MS培养液洗一次，置于Rose小室中，加入100μl质粒DNA(浓度为100μg/ml)，封闭小室。

2.1.4.激光微束照射条件

激光微束照射装置为Nd-YAG四倍脉冲激光显微照射系统。它的输出波长有1.06μm、0.53μm、0.35μm、0.26μm。照射时使用波长0.35μm，脉宽15ns，输出能量大于2mJ。光斑直径0.5-1.0μm。

2.1.5.激光照射后材料的培养方法

激光照射的幼胚转入分化培养基：MS基本培养基+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+VB₁1.0mg/L+KT1.0mg/L+活性炭2g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH5.8。在25-26℃培养箱中暗培养2-3天，然后转入光照培养室(温度25-28℃，光强2000Lx，每天光照时间10-12h)，待幼胚发育成正常的小苗后，转入生根培养基诱导生根：MS基本培养基+生根粉1.0mg/L+活性炭2.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH值5.8。当小苗长至4-5cm时，选根系发达、健壮的棉苗移至花盆中，收获T₀代种子。(所用试剂购于北京化学试剂厂)

2.2.利用改良的花粉管通道法对棉花进行遗传转化

现有的花粉管通道法，一般分为注射法和滴加法。注射法是在授粉后一定时间，即在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将外源DNA用微量注射器注入具有花粉管通道的组织上或组织内部，使DNA进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。滴加法也是在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将花柱切断，将外源DNA滴加在切面上，进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。

选用健壮的棉花植株，对于进行切除上部子房壁和使该切面与待转化的质粒DNA溶液接触操作时的环境温度，最好是在15-25℃。温度过高，花柱、子房组织中DNA酶的活性强，对外源DNA的破坏作用强，这样难以得到有效转化；温度过低，花粉管生长受阻，授精延迟。所用的质粒DNA溶液最好为溶解于TE缓冲液中，质粒DNA的浓度最好为200-300μg/ml。

切除上部子房壁是指切除子房上壁顶端至子房腔上边缘(不切破子房腔)的组织，形成面积大于花柱横切面的切口。子房上部做出切面以后，即可将待转化的质粒DNA溶液滴加到该切面上，质粒DNA的用量为10-15μl。由于在这一操作过程中容易受到自然因素或人为因素如风力、露水、伤流、人为触碰等，造成所供DNA溶液受到蒸发、稀释、遗漏等不确定性因素的影响，最好在滴加转化的DNA溶液时采取防渗漏措施。

采用的子房顶部切面渗入DNA的方法，切口面积大，缩短了外源DNA通过植物组织进入胚囊的距离，增加了使用的DNA溶液体积，也避免了离层组织对DNA渗入的障碍，从而使DNA渗入通畅，到达胚囊的DNA较多，接受DNA的胚囊数较多，转化率高，结实率高，不确定因素较少，可重复性好。

利用改良的花粉管通道法对棉花进行遗传转化后，通过自然结实获得转化种子。

实施例5 对转基因棉花株系的鉴定

1.转基因棉花株系的抗Kan鉴定及抗虫性测定

将转基因植株进行卡那霉素(Kan)抗性鉴定。待小苗长出2—3片真叶时，用0.2％卡那霉素(美国AMRESCO公司产品)涂抹叶片，5—6天后观察结果。抗Kan的叶片无反应；不抗Kan的叶片变黄。(如图21-22所示)选取抗Kan的棉苗进行抗虫性(棉铃虫，来源于中国农业科学院植物保护研究所)测定，转化植株表现出明显的抗虫性，抗虫效果显著，而非转基因棉花(CK)则不抗虫，虫害严重。(如图23所示)

2.转基因棉花的分子生物学鉴定

2.1.转基因棉花的PCR检测

用改良的CTAB法(参考Fu Rongzhong，Sun Yongru，Jia Shirong etal..Experiment and Technology Manual of Plant Genetics.Beij ing：ChneseScinece and Techonolgy Press，1994.132in chinese)提取棉花总DNA，取1μl(约200ng)总DNA，分别用引物(引物采用植物表达载体构建时设计的引物)进行PCR扩增，扩增反应的条件为：

(1)94℃预变性3min；

(2)94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，完成30个循环；

(3)72℃延伸10min。

取10μl PCR产物，在0.8％Agarose胶上电泳检测，转基因阳性的植株在PCR结果中分别有同阳性对照大小一样的0.9kb和1.8kb左右的条带，如图24-25所示。

2.2.转基因棉花的Southern杂交分析

2.2.1棉花DNA的大量提取

(1)提取细胞核

取2g棉花叶片液氮中充分研磨后，加入10ml用冰预冷的DNA核提取缓冲液(0.35M蔗糖，0.1M Tris-HCL(pH8.0)，0.005M EDTA(pH8.0)，2％(w/v)PVP40，0.1％(w/v)二乙基二硫氨基甲醇，0.2％巯基乙醇，0.5％Triton-X-100，pH7.5)，混匀，4000rpm，4℃离心20min，弃上清。

(2).核裂解

在沉淀中加入4ml核裂解缓冲液(0.1M Tris-HCL(pH8.0)，1.4M NaCl，0.02M EDTA(pH8.0)，2％CTAB，2％(w/v)PVP40，0.1％(w/v)二乙基二硫氨基甲醇，0.2％巯基乙醇，0.5％Triton-X-100)重悬沉淀，放于65℃水浴20—30min。

(3)植物DNA的获得

在样品中加入5ml氯仿：异戊醇(24：1)反复颠倒离心管进行抽提，4000g室温离心5-10min，将上清移到另一个管中，加入0.6体积的异丙醇，10000rpm离心10min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于适量TE中，65℃水浴10-30min，离心，去除沉淀，得到的植物核DNA溶液进行下一步酶切。

2.2.2.棉花总DNA酶切，电泳

取约20μg棉花总DNA，在500μl体系中加入15μl(150units)的HindIII，将酶、缓冲液和DNA反应系统混匀，37℃酶切过夜。然后，加入1/10体积的3M NaAc(PH5.5)及两倍体积的95％乙醇，置-70℃15min，12000rpm离心5min沉淀DNA，70％乙醇清洗DNA，将DNA置空气中干燥。用适量超纯水重新溶解酶切的DNA，电泳之前，将DNA置于65-70℃加热10min。0.8％琼脂糖电泳，电压为100V。(如图26所示)。

2.2.3转膜、探针标记和杂交

(1)转膜

①双蒸水冲洗凝胶2遍。

②将凝胶浸没于0.2mol/L HCI，脱嘌呤5min。

③.双蒸水冲洗一遍。

④将凝胶浸没于中和液中中和三次，每次轻摇15min。

⑤.双蒸水冲洗一遍。

⑥在20×SSPE吸印液中，用滤纸吸印法转膜过夜，吸印完毕，将杂交膜在2×SSC溶液中浸泡10min，包裹于滤纸中，80℃烤膜固定2h。

⑦杂交膜可直接用于杂交或用保鲜膜包裹，4℃保存备用。

(2)探针标记、

①取5μg质粒pBI-Bt-ARADNA，分别用EcoRI和XbaI，用SacI和XbaI作双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分片断，从凝胶片上取1.8kb和0.9kb的目的片断，经DNA纯化回收试剂盒纯化回收后，用于探针标记。探针标记按“Dig DNA Labeling and Detection Kit”提供的程序进行。

②在微量离心管中加入1ug的模板DNA，然后加入无菌水使终体积为16ul；

③将模板DNA在沸水中变性10min，然后置于冰上迅速冷却；

④在管中加入4ul地高辛高效标记混合物，混匀并短暂离心；

⑤37℃温育1h；

⑥在反应液中加入2ul0.2M EDTA并在65℃保温10min终止反应；

⑦将制备好的探针保存在—15℃～—25℃备用。

(3)杂交

①预杂交

在杂交盒中，放入杂交尼龙膜，加入地高辛杂交液，使淹没杂交膜，65℃轻摇保温30～60min。

②杂交

取8μl地高辛标记的探针在沸水中变性5min，并迅速置于冰上，取杂交盒，倒去预杂交液，加入地高辛杂交液和探针的混合物，使淹没杂交膜，65℃轻摇过夜。

③洗膜

a.室温下，用2×SSC，0.1％SDS各洗一次，每次5min。

b.68C，用0.1×SSC，0.1％SDS各洗一次，每次5min，并轻轻摇动。

④检测

a.洗膜后，将杂交膜在马来酸缓冲液中洗1至5分钟。

b.加入100ml1×封阻液，反应30min。

c.用1×封阻液将抗地高辛的碱性磷酸酶偶联物稀释(1：10000)到75mU/ml，使膜与20ml抗体溶液反应30min。

d.加入100ml马来酸缓冲液洗膜共2次，每次15min。

e.加入20ml检测缓冲液，平衡2～5smin。

f.加入10ml新配制的显色液，放入暗室，显色过程中勿震荡。

g.16h后，显色反应结束，将膜曝光20min。

h.得到理想的条带强度后，50ml清水洗膜，停止反应。

i.照相，记录结果。

Southern杂交结果显示，所检测的6个植株有1-2个特异的杂交带，非转基因植株没有杂交带。这样初步证明了6个植株中有反枝苋凝集素基因ARA和Bt基因的插入，其插入的拷贝数有的为1，有的为2。(如图27所示)

3.转基因棉花的抗虫试验

3.1.转基因棉花的抗蚜试验

当转基因棉花和非转基因棉花长到3-4片真叶时，取PCR检测阳性的植株中层叶片，插到装有20ml无糖的MS固体培养基的100ml容积培养瓶中，在植物光照培养箱中进行培养。培养条件为每日光照16hr，温度25℃；黑暗8hr，温度22℃。每个培养瓶中放置一片叶片，用软毛笔小心接入3只一龄桃蚜(Myzus persicae)，(从田间棉花植株上采集)隔日记录每片叶片上所有蚜虫的数量，直至第十二天。抗蚜试验重复两次。按下式计算各参试植物对蚜口密度增长的抑制百分数：蚜口密度抑制％＝(对照植株虫数-参试植株虫数)/对照植株虫数×100％。

转基因棉花的抗蚜试验结果表明，转pBI-Bt-ARA植株对蚜虫密度有明显的抑制作用，平均能抑制蚜口密度约46.2％，有些植株有强的抗蚜活性，最高可抑制83％的蚜口密度。转基因棉花的虫试结果显示，在转基因棉花上的蚜虫数目明显少于非转基因棉花叶片，转基因棉花具有较好的抑制蚜虫繁殖的作用，(如图28所示)。田间蚜害调查，转基因株系的抗蚜性达到50％左右，现蕾期转基因棉花对棉蚜的抑制率一般高于苗期。但对蚜虫的毒杀作用不明显。

3.2.转基因棉花抗棉铃虫性鉴定

本发明对转基因棉花进行了多代抗棉铃虫性鉴定，并送交中国农业科学院植物保护研究所进行抗棉铃虫性鉴定。供试棉花在试验田种植，对照品种为GH—BR—8。试验小区随机区组排列，播后地膜覆盖，以利棉花出苗。试验区生长期不使用任何农药，不打顶，不摘边心，其它为常规管理。棉种在4月28日播种。

3.2.1.转基因棉花植株抗棉铃虫性室内鉴定

分别在蕾期采取植株顶部展开的第3片棉叶，采用双重皿鉴定方法参考棉花品种抗棉铃虫性评价技术规范(中国农业科学院植物保护研究所提供)判别抗性水平。

供试棉铃虫(中国农业科学院植物保护研究所提供)：为1龄幼虫，即从卵孵化后在人工饲料上饲养2天的幼虫。双重皿鉴定方法：将棉叶放在双重皿内(大叶放一片，小叶放2片)，每皿接一龄虫幼虫10头，重复6次，皿底用湿滤纸或用小湿棉球将叶柄的伤口捆紧保持棉叶在供试期内不干。接虫后将双重皿封严，防比幼虫逃逸和保持皿内湿度。放入26—28℃的养虫室或培养箱中，6天后检查死亡结果，并且计算校正死亡率。

3.2.2.棉花品种抗棉铃虫性田间网室鉴定

鉴定方法：采用罩笼接虫法，通过对棉株受害调查，以蕾铃受害率与对照品种相比较评定鉴定材料的抗虫性级别。供试棉铃虫为初孵幼虫，接在棉株顶部，每株8头，每品系30株。接虫期为开花结铃期。接虫后第7—10天和15—20天两次调查各材料的被害铃数，健铃数。计算铃受害百分率和铃受害减退率(X)。

3.2.3.室内鉴定结果(校正死亡率％)

株系编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											效正死亡率	87.71	95.62	91.58	92.76	94.33	93.23	75.29	68.71	74.29	72.35

参照转基因品种抗棉铃虫性评定标准(中国农业科学院植物保护研究所提供)，1、2、3、4、5、6号属于高抗级别，7、8、9、10号属于抗级别。

3.2.4.田间网室鉴定结果

株系编号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

铃受害减退率(X)	85	91	89	89	90	86	69	62	69	61
											抗虫级别	高抗	高抗	高抗	高抗	高抗	高抗	抗	抗	抗	抗

综合室内和田间结果：1、2、3、4、5、6号属于高抗级别，7、8、9、10属于抗级别。

对转双价抗虫基因的棉花经多代抗虫性鉴定，抗虫效果显著，抗虫性稳定。经PCR检测，Southern杂交验证本发明中的ARA基因和Bt基因均已整合到棉花基因组中，并能够高效表达，稳定遗传。

IB074009-序列表

SEQUENCE LISTING

<110>北京长乐尔生基因技术有限责任公司

<120>双价抗虫基因的植物表达载体构建及其转基因植物获得方法

<130>IB074009

<160>10

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>918

<212>DNA

<213>反枝苋(Amaranthus retroflexusL.)

<400>1

<210>2

<211>304

<212>PRT

<213>反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)

<210>3

<211>1842

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>613

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

<210>7

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

<210>9

<211>915

<212>DNA

<213>反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)

<400>9

<210>10

<211>1842

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

Claims

1.编码来源于反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)的苋菜凝集素的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列，或为在严紧杂交下与SEQ IDNO：1所示的序列杂交且具有相同功能的序列。

2.按照权利要求1所述的编码来源于苋菜凝集素的基因，其中在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交的序列为SEQ ID NO：9所示的序列。

3.权利要求1或2所述的基因编码的苋菜凝集素。

4.按照权利要求3所述的苋菜凝集素，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所述的序列。

5.表达载体，其包含选自权利要求1或2所述的基因。

6.权利要求5的表达载体，其还包含编码Bt杀虫蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示 _的序列或为在严紧杂交下与SEQ ID NO：3所示的序列杂交且具有相同功 _能的序列

7.权利要求6的表达载体，其中在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：3所示的序列杂交的序列为SEQ ID NO：10所示的序列。

8.按照权利要求6或7所述的表达载体，其中所述编码Bt杀虫蛋白的基因编码的Bt杀虫蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列。

9.权利要求8所述的表达载体，其中所述权利要求1或2的基因与权利要求6或7所述的编码Bt杀虫蛋白的基因处于不同启动子的控制之下。

10.权利要求9所述的表达载体，其中权利要求6或7所述的编码Bt杀虫蛋白的基因处于花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，所述权利要求1或2的基因处于韧皮部特异表达启动子控制下。

11.一种宿主细胞，其包含权利要求5-10任一项的表达载体。

12.权利要求11的宿主细胞，其是保藏号为CGMCC No.2067的大肠杆菌细胞。

13.一种培育抗同翅目及鳞翅目害虫的转基因植物的方法，其中包含将权利要求1或2以及权利要求6或7任一项所述的编码Bt杀虫蛋白的基因整合到植物基因组中。

14.按照权利要求13所述的方法，其中所述权利要求1或2的基因与权利要求6或7所述的编码Bt杀虫蛋白的基因处于不同启动子的控制之下。

15.按照权利要求14所述的方法，其中权利要求6或7所述的编码Bt杀虫蛋白的基因处于花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，所述权利要求1或2的基因处于韧皮部特异表达启动子控制下。

16.按权利要求13-15任一项所述的方法，其中所述同翅目害虫选自蚜虫，所述鳞翅目害虫选自棉铃虫。

17.按权利要求13-15任一项所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

18.按权利要求17所述的方法，其中所述单子叶植物选白玉米、水稻，所述双子叶植物选自棉花、油菜、大豆。

19.按权利要求18所述的方法，其中所述植物是棉花。