CN102174571B - 利用人工合成的抗菌肽基因培育抗萎病棉花的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用人工合成的抗菌肽基因培育抗萎病棉花的方法。它将人工合成的抗菌肽基因整合入陆地棉栽培种，实现抗菌肽基因spCEMA在转基因棉花中组成型表达，提高棉花对黄萎病的抗病能力。本发明融合了抗病效果好的CEMA基因，但又能克服体内表达CEMA蛋白对植物细胞的毒害作用，在提高植物抗病性的同时又不影响植物的生长发育。本发明通过组成型表达人工合成的抗菌肽基因spCEMA，能将黄萎病菌控制在一定范围内，或阻止其在植株内的进一步生长，达到抗黄萎病的目的，培育抗黄萎病棉花新资源。应用这一方法可以获得病情指数小于10左右的转基因抗黄萎病棉花。

Description

利用人工合成的抗菌肽基因培育抗萎病棉花的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及利用一种人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法。

技术背景

棉花不仅是世界上最重要的天然纤维作物，也是我国关系国计民生的重要物资，棉花产业对我国纺织工业乃至整个国民经济发展都具有举足轻重的作用。但是，棉花黄萎病自1935 年传入我国以来，对我国棉花生产的危害逐年加重。黄萎病已成为当前棉花实现高产、稳产的主要限制因素。该病属土传维管束病害，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、病原菌存活时间久，是棉花生产中最具毁灭性的病害之一。更重要的是我国主栽的陆地棉品种缺乏高抗黄萎病的种质资源，生产上一直没有找到能根治的措施，因此，黄萎病被称为棉花生产的“癌症”。生产实践证明，选育和推广抗病品种，是防治黄萎病最经济有效，而且是唯一有效的途径（顾本康等，1996）。

历经几十年的努力，利用常规育种手段，我国获得了一些对黄萎病具有一定抗病能力的地方品种，但是由于黄萎病菌变异快、小种多，具有明显的致病力分化，针对黄萎病菌这种特性的广谱抗性棉花品种基本没有，因此在一个地区表现为抗病的棉种，到不同生理和地理条件下，就出现抗病性丧失的现象。另一方面，陆地棉栽培种内高抗黄萎病的抗源缺乏，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基本没有进展。为此，解决生产中抗黄萎病资源缺乏的问题和寻找新的抗病育种方法已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花生产中黄萎病造成的巨大损失。

随着分子生物学的发展，利用基因工程分离、克隆和转化抗性基因，不仅可以定向性地改良植物的抗病性，而且基因型来源丰富，不受抗源亲缘关系限制，育种周期短，理论上不存在性状负相关连锁，一次克隆亦可用于多次转化。因此，采用生物技术等多种育种方法，加快抗黄萎病育种进程成为必然。

抗菌蛋白或多肽（AMP，antimicrobial protein or peptide）是一类由生物产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，广泛分布于动物、植物和微生物中，具有抗菌谱广、抗菌活性高和抗性持久等特点。另外，抗菌肽的抗菌机制特别，多以在膜上形成孔道导致细胞内容物泄漏的方式摧毁病原菌，致使病原菌难以产生抗性（Yeaman等，2003）。因此，利用抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性受到广泛关注。植物抗病分子育种策略中，利用来自植物的抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性是最常用的方法之一，因为植物来源的抗菌肽转入植物中更易于受体植物的识别和整合。但是植物来源的抗菌肽转入植物后病原菌易产生抗性或具有病原特异性，因此，要获得对不同生理小种的黄萎病菌具有广谱和持久抗性相对比较困难。而人工合成的非植物源的抗菌蛋白或抗菌肽却能克服植物源抗菌肽的这种不足，但是这类抗菌蛋白或抗菌肽可能会严重影响植物的生长发育。比如，郭余龙等（2003）利用基因枪将抗菌肽基因CEMA转入棉花，转基因棉花叶片呈黄绿相间的条纹状，电镜扫描结果显示，CEMA抗菌肽严重影响叶绿体片层结构。

发明内容

本发明的一个目的是提供既能提高植物的抗病性，又不影响植物生长发育的一种人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病转基因棉花的方法。

本发明培育抗黄萎病棉花的方法，采用的技术方案是：一种利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，将人工合成的抗菌肽基因整合入陆地棉栽培种，实现抗菌肽基因spCEMA在转基因棉花中组成型表达，提高棉花对黄萎病的抗病能力。

　　进一步，所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，包括如下步骤：

步骤1：将CaMV35S启动子控制抗菌肽基因spCEMA的表达元件可操作地插入植物表达载体p5中，构建植物表达载体p5-spCEMA；

步骤2：将上述植物表达载体转入宿主根癌农杆菌，获得转化体；

步骤3：通过转化体将植物表达载体整合入棉花基因组，然后，经过Km抗性愈伤和胚性愈伤的诱导获得体胚，体胚成苗后获得抗黄萎病的spCEMA转基因棉花植株； 

步骤4：转基因棉花经室内抗病鉴定和筛选获得对黄萎病抗性的提高，表达适量的转基因棉花材料。

再进一步，步骤3获得的转基因棉花再经过后代性状分离筛选，获得抗病性状稳定遗传的纯合型转基因棉花。

本发明是利用根癌农杆菌介导法将CaMV35S组成型启动子控制spCEMA基因的重组植物表达载体p5-spCEMA导入棉花细胞中，经组织培养、转基因植物分子验证、基因表达检测，以及室内室外的抗病鉴定和筛选获得对黄萎病抗性提高的转基因棉花。

本发明的有益效果在于，利用基因工程技术首先构建了组成型启动子CaMV35S控制抗菌肽基因spCEMA的植物表达载体，然后将这些植物表达载体转入棉花基因组。

spCEMA是人工合成的一种新的抗菌肽基因，融合了抗病效果好的CEMA基因，但又能克服体内表达CEMA蛋白对植物细胞的毒害作用，在提高植物抗病性的同时又不影响植物的生长发育。本发明通过组成型表达人工合成的抗菌肽基因spCEMA，能将黄萎病菌控制在一定范围内，或阻止其在植株内的进一步生长，达到抗黄萎病的目的，培育抗黄萎病棉花新资源。培育的转基因棉花材料对落叶型和非落叶型黄萎病病情指数小于10，可较非转基因棉花对照降低90%以上。

本发明利用组成型启动子CaMV35S控制抗菌肽基因spCEMA，达到抗菌肽基因在转基因棉花植株内组成型表达，筛选基因表达适量抗病效果好的株系，有效控制棉花黄萎病菌在植株内的进一步侵染和扩展，达到抗黄萎病的目的。

本发明方法简便易行，效果显著，获得的抗黄萎病棉花材料可以为棉花抗黄萎病育种提供新的资源，服务于棉花生产，并产生巨大的经济效益。

附图说明

图1是p5-spCEMA表达载体构建流程图。

图2是p5双元植物表达载体改造图谱。

图3是转基因棉花叶柄和叶片组织GUS化学染色结果；

A和B：转基因棉花植株叶片和叶柄；C和D：野生型棉花植株叶片和叶柄。

图4是spCEMA转基因棉花PCR检测结果；

M: Marker2000；1: 野生型植株对照；2: 质粒阳性对照；3-12: spCEMA转基因棉花植株；13: 水对照；黑色箭头示150bp的特异扩增带。

图5是转基因棉花中spCEMA基因转录表达的RT-PCR检测；

1：转基因非纯合株系中分离的GUS阴性非转基因植株（null）；2-7：spCEMA转基因棉花植株； spCEMA: 以转基因和GUS阴性植株cDNA为模板扩增spCEMA基因的结果；HIS3: 以转基因和GUS阴性植株cDNA为模板扩增HIS3基因的结果； RNA as template: 以RNA为模板扩增HIS3基因的结果。spCEMA基因扩增30个循环，HIS3基因扩增20个循环。

图6是人工气候室接种落叶型黄萎病菌15d，spCEMA转基因棉花T₀、T₁和T₂代株系的病情指数；

Null：未纯合转基因棉花株系中分离的非转基因棉花植株；SP-5：组成型表达spCEMA的转基因棉花株系。

图7是人工气候室接种落叶型黄萎病菌15d，spCEMA转基因棉花植株表型。

图8是田间接种落叶型黄萎病菌30d，spCEMA转基因棉花株系的发病率和病情指数；

Null：未纯合转基因棉花株系中分离的非转基因棉花植株；SP-5：组成型表达spCEMA的转基因棉花株系。

图9是田间接种落叶型黄萎病菌30d，spCEMA转基因棉花植株的表型。

图10是田间接种落叶型黄萎病菌的植株生长后期茎内部组织的病情指数；

Null：未纯合转基因棉花株系中分离的非转基因棉花植株；SP-5：组成型表达spCEMA的转基因棉花株系。

图11是田间接种落叶型黄萎病菌的植株生长后期茎内部组织的病症。

图12是田间接种非落叶型黄萎病菌30d，spCEMA转基因棉花的发病率和病情指数；

Null：未纯合转基因棉花株系中分离的非转基因棉花植株；SP-5：组成型表达spCEMA的转基因棉花株系。

图13是田间接种非落叶型黄萎病菌30d，spCEMA转基因棉花的表型。

图14是田间接种非落叶型黄萎病菌的植株生长后期茎内部组织的病情指数；

Null：未纯合转基因棉花株系中分离的非转基因棉花植株；SP-5：组成型表达spCEMA的转基因棉花株系。

图15是田间接种非落叶型黄萎病菌的植株生长后期，spCEMA转基因棉花茎内部组织的病症。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook 和Russell，2001)。

（一）转基因棉花的获得及分子验证：　

1、DNA的提取：

1.1　DNA提取缓冲液：

 (1) 植物DNA提取缓冲液：

CTAB提取液: 100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，20 mmol/L EDTA (pH8.0)， 1.5 mol/L NaCl，2% CTAB (w/v)，4% PVP40 (w/v)和2% 巯基乙醇(v/v)，PVP和巯基乙醇使用前加入。

TE溶液：10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA。

碱裂解法质粒DNA提取缓冲液：

STE溶液：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。

溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)。

溶液II：0.2 mol/L NaOH，1%（w/v）SDS。

溶液III：50 mL 5 mol/L乙酸钾，11.5 mL冰醋酸，28.5 mL水。

　质粒DNA的提取：

根癌农杆菌质粒DNA的提取按卢圣栋方法（1993）略作修改。

取根癌农杆菌菌液1 mL，10,000 r/min离心1 min收集菌体；用200 mL STE溶液重悬菌体后，离心（10,000 r/min, 1 min）收集菌体；加入180 mL溶液I和20 mL溶菌酶后再重悬菌体， 37°C温浴30 min，加入400 mL溶液II，上下颠倒多次，冰浴不超过3 min；再加入300 mL冰预冷的溶液III，上下颠倒多次，冰浴3 min。12,000 r/min、4°C离心10 min，将上清液转入另一离心管中；等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）和等体积的氯仿:异戊醇（24:1）先后各抽提一次；再将上清液转入另一离心管，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置2 min；12,000 r/min、4°C离心10 min收集沉淀DNA，然后用75%的乙醇洗涤沉淀一次；室温干燥，50 mL TE溶解沉淀即得到质粒DNA。

　棉花基因组DNA的提取方法：

采用改良的CTAB法（Doyle, 1987; 肖月华等，2002a）提取棉花组织DNA，方法为:

棉花植株幼嫩叶片组织0.5-1g, 在液氮中迅速研成粉末，加入3 mL 65℃预热的CTAB提取液，快速振荡混匀，65℃水浴30 min，加入1 mL 5 mol/L KAc冰浴20 min。用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次，10,000rpm，4℃离心5min，上清液加入2/3倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置30 min，用玻棒挑出絮状沉淀，并用75%的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗一次，风干后重悬于500 μL TE溶液。加入10mg/mL的RNaseA 2μL，37℃处理1h，然后用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提一次，10,000rpm，4℃离心5min，上清液加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀，离心弃上清液。沉淀用75%的乙醇漂洗，风干, 溶于200 μl TE溶液，-20 ℃保存备用。

、棉花RNA（核糖核酸，即Ribonucleic Acid，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体）的提取：

2.1　RNA提取缓冲液：

CTAB提取缓冲液: 2%CTAB（w/v），2%聚乙烯吡咯烷酮PVP40（w/v），100mmol/L Tris-HCl（pH8.0，DEPC处理的水配制），25mmol/L EDTA，0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0mol/L NaCl，2%巯基乙醇（v/v，使用前加入）。

SSTE溶解液：1mol/L NaCl，0.5%SDS（w/v），10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1.0mmol/L EDTA。

　RNA提取方法：

用CTAB法提取棉花组织的总RNA。取约3g棉花组织新鲜材料，在液氮中迅速研成粉末，装入DEPC水处理的50ml离心管，然后加入15ml 65℃预热的RNA提取液，颠倒混匀后65℃水浴3min，8,000 rpm、4°C 离心10 min，将上清液转入一新的DEPC水处理的50ml离心管，用等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提两次。10,000rpmm，室温离心5min后取上清液，加入1/4体积10 mol/L LiCl溶液，4℃放置6h以上，10,000rpm，4°C 离心10 min，弃上清液，沉淀用500μL SSTE溶解。再用等体积的酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）和氯仿:异戊醇（24:1）各抽提一次，10,000rpm，室温离心5min，上清液加入2倍体积-70°C预冷的无水乙醇，-70°C沉淀30min以上。12,000rpm，4°C 离心10 min，弃上清液，沉淀用200μL的DEPC处理水溶解，非变性凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA质量后，-80°C保存备用。

、spCEMA植物表达载体的构建：

3.1　组成型表达spCEMA基因植物表达载体的构建：

人工合成的spCEMA基因序列与pUC-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆转化子。

以含有NPTII筛选标记基因和GUS报告基因的植物表达载体p5为基本骨架，将spCEMA基因连接入载体的多克隆位点，构建组成型表达的植物表达载体，并命名为p5-spCEMA。p5-spCEMA植物表达载体构建流程图见图1。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作完成。

P5植物表达载体为改选常用的pBI121载体而得，改选的流程图见图2。

　植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404：

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将构建的组成型表达spCEMA基因的植物表达载体P5-spCEMA通过电击转化法导入根癌农杆菌LBA4404。提取农杆菌质粒，并利用HimdⅢ和EcoRⅠ进行双酶切验证，获得农杆菌LBA4404转化子。

、棉花的遗传转化：

4.1 根癌农杆菌介导的棉花遗传转化常用培养基：

基本培养基: MSB（MS 无机盐+B5 有机）（T. Murashige，1962；O.L. Gamborg，1968）；

种子萌发培养基: 1/2 MSB+20g/L 蔗糖+6g/L 琼脂，自来水配制，自然pH；

共培养培养基: MSB+0.5mg/L IAA（吲哚乙酸）+0.1mg/L KT（6-糠氨基嘌呤）+30g/L 葡萄糖+100μmol/L 乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite (Sigma)，pH5.4；

筛选脱菌培养基: MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/L cef(头孢霉素)+30g/L 葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

愈伤诱导培养基: MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km+200mg/L cef +30g/L 葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

胚性愈伤诱导培养基: MSB+0.1mg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2.0g/L Gelrite，pH5.8；

液体悬浮培养基：MSB+1.91g/L硝酸钾 +0.1mg/L KT+30g/L 葡萄糖, pH5.8；

体胚成熟培养基: MSB +15g/L 蔗糖+15g/L 葡萄糖 +0.1mg/L KT+2.5g/L Gelrite，pH6.0；

成苗培养基: SH +0.4g/L活性碳+20g/L 蔗糖，pH6.0。（Schenk & Hildebrandt，1972）

4.2 棉花遗传转化具体操作方法：

(1)转化外植体的获得和农杆菌浸染液的制备：

陆地棉种子去壳，籽仁0.1%升汞灭菌10min，无菌自来水漂洗5-6次后，接种于种子萌发培养基，28℃暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。

转化用农杆菌浸染液的制备：

利用划线法获得整合植物表达载体p5-spCEMA的农杆菌单菌落，然后挑取单菌落接种入附加50mg/L Km和125mg/L Sm（链霉素）10mL液体YEB（5g/L蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH7.0），28℃、200rpm培养过夜，然后按5%的比例将菌液接种入20mL不含抗生素的液体YEB，28℃、200rpm培养至OD600约为0.5。取5mL菌液6000rpm离心5min收集菌体，再用5mL不添加Gelrite共培养液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。

下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导：

外植体用农杆菌浸染液浸染20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。

体胚的诱导和成苗培养：

液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接种入体胚成熟培养基，约15d产生大量的体胚，将其继代入SH培养基，促进体胚进一步成苗。3-4叶的再生苗移栽入温室进行繁殖。

、 spCEMA 转基因棉花的获得和分子验证：

按照4的棉花遗传转化和再生方法，将spCEMA基因转入棉花基因组。历经Km抗性愈伤、胚性愈伤和体胚的诱导，体胚成苗，然后获得spCEMA转基因棉花植株。

转基因植株的GUS组织化学染色：

GUS染色液：500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K₄Fe(CN)₆，1% Triton X-100（V/V），0.01mol/L Na₂EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）。

P5-spCEMA植物表达载体含有35S启动子控制的GUS基因，因此，转基因植株首先可以利用GUS组织化学染色法进行快速鉴定。参照Jefferson（1987）的方法剪取Km抗性幼苗的叶柄和叶片组织少许，分别加入GUS组织化学染色液中，37℃染色2h，然后95%乙醇脱色，至绿色去净。最后出现图3所示的蓝色为转基因阳性植株，否则为非转基因植株。

转基因棉花PCR分析：

以棉花幼嫩叶片为材料，提取转基因植株和野生型植株的总DNA，然后以总DNA为模板，序列1和2为引物扩增spCEMA基因片段。

PCR反应25μl总体系，包括1×PCR buffer，1.5mmol/L的MgCl₂，0.2mmol/L的dNTPs，上下游引物均为0.2μmol/L，25ng DNA，1U Taq DNA聚合酶。

PCR反应参数：94℃预扩增5min，然后94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s；30个循环，最后再72℃延伸10min。扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。部分扩增结果见图4。结果表明，所有经GUS检测为阳性的转基因植株都能扩增获得spCEMA目标特异带。

的RT-PCR分析：

spCEMA转基因棉花植株分别以幼嫩叶片为材料，分别提取转基因和非转基因植株（null）叶片的RNA，按cDNA一链合成试剂盒说明书合成各样品RNA 的一链cDNA，然后以cDNA为模板扩增spCEMA基因的特异片段。spCEMA基因的上下游引物分别为序列1和序列2。以棉花组蛋白HIS3基因为内标。HIS3的引物为序列3和序列4（Zhu YQ等, 2003）。

25μl PCR反应体系包括：1×PCR buffer，1.5mmol/L的MgCl₂，0.2mmol/L的dNTPs，上下游引物均为0.2μmol/L，1μL cDNA，1U Taq DNA聚合酶。

RT-PCR结果表明（图5），转基因棉花植株内spCEMA基因都能有效进行转录表达，而野生型植株幼茎和叶片内都没有检测到spCEMA基因的表达。

（二）转基因棉花的抗病鉴定：

6、转基因棉花对黄萎病的抗病鉴定方法：

6.1抗病鉴定接种用病原菌的制备：

挑取少许固体PD培养基（马铃薯培养基）保存的落叶型和非落叶型黄萎病菌接种入液体PD培养基，180rpm，26℃振荡培养7d，再按10%（菌液/PD培养基）的比例接种入液体PD培养基，180rpm，26℃振荡培养10d，用四层无菌纱布过滤去除菌液中的菌丝及杂质，去离子水调整落叶型黄萎病菌孢子浓度达到10⁸个/ml，非落叶型黄萎病菌孢子浓度达到10⁹个/ml作为接种菌液。

人工气候室内抗病鉴定方法：

T₀代转基因棉花4-6片真叶，其余世代3-4片真叶，生长相对一致的幼苗植株采用伤根灌菌液法接种病原菌。移栽入盆钵慢慢浇灌菌液100mL，尽量让菌液湿润有棉花植株的土壤团，接种两天后浇透水，以保持盆钵内土壤的湿度。接种后于20℃（夜）-25℃（昼），湿度80%以上，14h光照/10h暗培养的光周期条件下生长，接种15d按5级病级标准（0级: 棉花植株外表无病症；1级: 棉株叶片1/3以下显病症；2级: 棉株叶片1/3-2/3显病症；3级: 棉株叶片2/3以上显病症；4级: 棉株叶片全部出现病症，叶片和花蕾脱落严重或植株光杆甚至死亡）统计植株病级，并计算植株的发病率和病情指数。T₀代每次接种均以野生型和空载载体转基因棉花幼苗为对照。其余各世代以野生型和未纯合株系分离的GUS阴性非转基因植株为对照。落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁹个孢子/ml。发病率和病情指数计算公式如下：

6.3 田间病圃抗病鉴定方法：

纯合株系收获的种子播种于苗床， 3-4片真叶幼苗移栽入田间病圃时，采用伤根灌菌液法分别接种落叶型和非落叶型黄萎病菌。按2000株/亩的密度栽种，移栽时每株浇灌黄萎病菌液200ml，尽量让菌液湿透营养团，然后于幼苗周围扶湿润土壤，移栽两天后浇透水，以保证幼苗正常生长。接种25d后统计植株的发病率和病情指数。植株生长后期将茎杆均分为上部、中部和下部三部分，剖杆按5级病级标准（0级: 茎内部无变色；1级: 茎杆变暗褐色部分占剖面的25%以下；2级: 变色部分占50%；3级: 变色部分占70%以上；4级: 茎杆木质部全部变暗褐色）统计茎杆不同部位内部组织的病级，并计算病情指数。以接种分离于未纯合转基因株系的GUS阴性植株和野生型植株为对照，并设置未接种野生型植株对照。接种试验按随机区组排列，试验重复三次，每个重复60株幼苗。落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁹个孢子/ml。

、人工气候室内spCEMA转基因棉花幼苗对黄萎病的抗性：

按照6人工气候室内的抗病鉴定方法，spCEMA转基因棉花未纯合株系植株，分别于人工气候室接种落叶型黄萎病菌进行抗病鉴定和筛选。

人工气候室内，spCEMA转基因株系植株接种落叶型黄萎病菌15d，T₀、T₁和T₂代未纯合株系中分离的非转基因棉花植株的病情指数都达到100，而spCEMA株系SP-5 T₀、T₁和T₂代的病情指数分别为25.0、12.5和18.4，与非转基因棉花对照相比，差异达到极显著水平（P<0.01）（图6）。接种15d，非转基因对照植株严重发病，植株因严重感染落叶型黄萎病菌叶片脱落，而抗病植株叶片没有病症，叶色鲜绿，生长正常（图7）。

转基因棉花株系的病情指数和病症表明，棉花内组成型表达spCEMA基因能显著提高棉花对落叶型黄萎病的抗病性，利用spCEMA基因可培育抗黄萎病的转基因棉花。

、田间spCEMA转基因棉花对落叶型黄萎病的抗性：

8.1 田间spCEMA转基因棉花苗期对落叶型黄萎病的抗性：

按6田间病圃抗病鉴定方法，鉴定spCEMA转基因棉花纯合株系的抗病性。结果显示，3-4片真叶幼苗接种落叶型黄萎病菌30d，分离于未纯合转基因株系的非转基因植株的发病率和病情指数分别为100.0%和95.2；组成型表达spCEMA的转基因棉花株系SP-5的发病率和病情指数分别为10.0%和7.8，与非转基因对照植株相比，差异都达到极显著水平（P<0.01）（图8）。

接种30d植株的表型见图9，非转基因植株因黄萎病菌的感染而严重发病，甚至因严重发病而死亡，而转基因棉花植株叶片病症不明显或轻微发病，植株生长正常。

田间spCEMA转基因棉花生长后期茎内部组织表现的抗性：

收获纤维和种子后将植株茎杆均分为上中下三部分，然后剖杆统计茎内部组织的病情指数，结果显示（图10），非转基因棉花植株茎下部、中部和上部的病情指数分别为100.0、95.7和87.5；SP-5株系植株分别为12.5、2.5和0.0。与非转基因棉花植株相比，差异都达到极显著水平（P<0.01）。植株生长后期剖杆非转基因棉花植株茎内部的中心维管组织和木质部部分都褐化变色，而转基因棉花植株仅茎下部中心维管组织产生了褐色斑点，周围木质部和中部维管组织都没有褐色病斑产生（图11）。

转基因棉花株系植株苗期的病情指数和病症，植株生长后期茎内部组织的病情指数和变褐的病症表明，棉花内组成型表达spCEMA基因能有效提高棉花对落叶型黄萎病的抗性，利用spCEMA基因可培育抗黄萎病棉花。

、田间spCEMA转基因棉花对非落叶型黄萎病的抗性：

9.1 田间spCEMA转基因棉花苗期对非落叶型黄萎病的抗性：

为明确spCEMA转基因棉花对不同致病菌引起的黄萎病菌的抗性，人工气候室内抗病鉴定和筛选获得的转基因抗病株系，田间接种落叶型黄萎病菌的同时接种非落叶型黄萎病菌，接种30d统计植株的发病率和病情指数。结果表明（图12），接种非落叶型黄萎病菌30d，非转基因棉花对照的发病率和病情指数分别为98.7%和92.3，组成型表达spCEMA的转基因株系SP-5分别为8.1%和5.0，与非转基因对照相比差异都达到极显著水平（P<0.01）。接种30d，非转基因对照全部发病，多数植株叶片都出现了明显的病症，而转基因株系仅个别植株下部叶片有少许病斑，对黄萎病的抗性明显（图13）。

转基因棉花植株接种非落叶型黄萎病菌的发病率、病情指数和病症表明，组成型表达spCEMA基因都能有效提高棉花对非落叶型黄萎病的抗性。

田间spCEMA转基因棉花生长后期茎内部组织表现的对非落叶型黄萎病的抗性：

田间接种非落叶型黄萎病菌的转基因棉花植株生长后期剖杆，根据6的方法统计植株茎内部组织的病情指数。结果表明（图14），非转基因植株生长后期茎下部、中部和上部的病情指数分别为100.0、92.1和89.4；SP-5株系分别为32.1、14.3和0.0。转基因株系不同茎段茎内部组织的病情指数与非转基因对照相比，差异都达到了极显著水平（P<0.01）。植株生长后期，非转基因对照茎不同部位的中心维管组织和木质部部分都褐化变色，而转基因植株仅中心维管组织有轻微变色，上部中心维管组织和周围木质部部分都没有明显的变褐斑点（图15）。

spCEMA转基因棉花植株生长后期茎内部组织的病情指数和褐化变色程度表明，spCEMA转基因棉花对非落叶型黄萎病抗性明显，利用spCEMA基因能有效培育抗黄萎病转基因棉花。

综上，再生植株经严格的分子生物学验证后，4-6片真叶的T₀、T₁和T₂代幼苗分别于人工气候室内接种高浓度的落叶型黄萎病菌，经抗性鉴定和筛选获得抗性提高的株系SP-5，并筛选获得不再分离的纯合转基因株系。纯合株系再于田间接种落叶型和非落叶型黄萎病菌，进一步对转基因棉花的抗性稳定性进行鉴定。

纯合T₃代田间抗病鉴定结果显示，苗期转基因株系与野生型对照相比，接种落叶型和非落叶型黄萎病菌的病情指数都可以较非转基因棉花对照降低90%以上。植株生长后期茎内部组织的病情指数显示，中上部茎内部组织的病情指数与对照相比，都可以降低80%以上。转基因株系植株茎内部组织的变褐现象主要集中在下部茎段的中部维管组织，周围木质部部分没有肉眼可见的病症，而野生型对照植株茎内部各部位都严重褐化。说明在棉花内组成型表达spCEMA可有效抑制棉花黄萎病菌在植株内部滋生，提高棉花对黄萎病的抗性，培育抗黄萎病转基因棉花。

本发明利用CaMV35S启动子控制人工合成的抗菌肽基因spCEMA，实现该基因在转基因棉花中组成型表达，有效提高转基因棉花对落叶型和非落叶型黄萎病的抗性，培育抗黄萎病转基因棉花。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。

序列表：

序列1：转基因棉花内spCEMA基因PCR和RT-PCR扩增上游引物：

5’-TGGCTTGTGCTTCCTTTTC-3’(19bp)。

序列2：转基因棉花内spCEMA基因PCR和RT-PCR扩增下游引物：

5’-CCTTACTTGGTCAACTTCA-3’ (19bp)。

序列3：棉花HIS3基因扩增上游引物：

 5’- GAAGCCTCATCGATACCGTC -3’ (20bp)。

序列4 ：棉花HIS3基因扩增下游引物：

 5’- CTACCACTACCATCATGGC -3’(19bp)。

序列5：spCEMA基因序列(人工合成 168bp)：

1 ATGGAGAAGA AGTCTCTTGC TGGCTTGTGC TTCCTTTTCT TGGTTCTTTT TGTTGCTCAA GAAATTGTGG； 

71 TGACTGAAGC TAAGTGGAAG TTGTTCAAGA AGATCGGTAT CGGTGCTGTT TTGAAGGTTT TGACTACTGG； 

141 ATTGCCAGCT TTGAAGTTGA CCAAGTAA。

Claims (4)

1.利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，将如序列SEQ ID NO:5所示的人工合成的抗菌肽基因spCEMA整合入陆地棉栽培种，实现抗菌肽基因spCEMA在转基因棉花中组成型表达，提高棉花对黄萎病的抗病能力；该方法包括如下步骤：

步骤1：将CaMV35S启动子控制抗菌肽基因spCEMA的表达元件可操作地插入植物表达载体p5中，构建植物表达载体p5-spCEMA；

步骤2：将上述植物表达载体转入宿主根癌农杆菌，获得转化体；

步骤3：通过转化体将植物表达载体整合入棉花基因组，然后，经过Km抗性愈伤和胚性愈伤的诱导获得体胚，体胚成苗后获得抗黄萎病的spCEMA转基因棉花植株； 

步骤4：转基因棉花经室内抗病鉴定和筛选获得对黄萎病抗性的提高，基因表达适量的转基因棉花材料。

2.如权利要求1所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，步骤3获得的转基因棉花再经过后代性状分离筛选，获得抗病性状稳定遗传的纯合型转基因棉花。

3.如权利要求2所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，所述抗病性遗传稳定的纯合型转基因棉花经田间抗病鉴定和筛选获得抗黄萎病的转基因棉花。

4.如权利要求1所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，所述步骤1构建植物表达载体p5-spCEMA，是以含有NPTII筛选标记基因和GUS报告基因的植物表达载体p5为基本骨架，将spCEMA基因连接入载体的多克隆位点构建组成型植物表达载体p5-spCEMA。

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