CN116103337B - 一种农杆菌介导的西番莲遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种农杆菌介导的西番莲遗传转化方法，本发明将单芽预培养1~3 d，然后取茎尖作为受体，放入侵染培养基中侵染；接种至共培养基中暗培养5~7 d，然后在静止培养基中培养，经过茎枝培养，获得转化茎枝，初步筛选出阳性植株，切取阳性单茎枝的顶芽进行二次培养，鉴定并获得阳性转基因植株。本发明建立了以茎尖为转化受体，未经愈伤培养阶段而由茎枝培养方式直接获得转基因苗的西番莲遗传转化体系，该体系提高了转化受体的存活率和转化效率，幼苗遗传性状稳定，生根快，缩短了转化周期和转基因育种时间。为创制具有优良性状的西番莲新品种，解决我国西番莲产业问题奠定基础和提供技术参考。

Description

一种农杆菌介导的西番莲遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物生物学技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的西番莲遗传转化方法。
背景技术
西番莲（学名：Passiflora caeruleaL.）是西番莲科西番莲属多年生草质藤本植物，现广泛种植于热带和亚热带地区。遗传转化方法是利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞，以实现遗传物质的定向重组的方法，是现代遗传育种的重要途径。植物遗传转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法等多种方法，其中农杆菌介导的遗传转化是目前植物基因转化中的主要方法之一。农杆菌介导转化技术是将目的基因插入到T-DNA区，通过农杆菌的感染实现目的基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。该方法具有转化频率高、单拷贝转化等优点，已经在大豆、小麦、水稻等多种植物中使用，但针对多年生草质藤本植物的报道不多，而对于西番莲的相关报道更是鲜见。
由于不同植物的农杆菌介导的遗传转化方法并不通用，且转化受体、预培养、农杆菌OD600值、侵染时间、共培养等多种因素都会对西番莲遗传转化的成功与否产生重要影响，目前在农杆菌介导的西番莲遗传转化方面还存在转化率低、转化周期长等诸多不足。因此，有必要对农杆菌介导的西番莲遗传转化方法进行优化，以期解决转化率低、转化周期长等问题，为西番莲抗病毒、抗病菌、抗虫和抗旱等基因工程研究提供技术支撑。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提出一套稳定、转化效率高的西番莲遗传转化方法，可以快速地获得转基因植株。
本发明技术方案主要包括以下内容：
一种农杆菌介导的西番莲遗传转化方法，包括以下步骤：
取无菌西番莲组培苗，剪取单芽，将单芽置于预培养基中预培养1~3 d，然后取茎尖作为受体，刺伤受体后直接放入侵染培养基中侵染；
将被侵染的受体接种至共培养基中黑暗培养5~7 d，然后用抑菌培养基将受体表面的农杆菌洗脱干净，最后接种至静止培养基中培养。
进一步说明，转化受体是提高遗传转化效率的重要因素之一。转化受体不同其转化周期不同，转化效率也截然不同。转化受体可以是叶片、愈伤组织、茎段、胚轴等组织细胞，通常以叶片受体居多。以叶片受体进行西番莲遗传转化，在进行农杆菌介导转化后需脱分化形成愈伤组织，之后经过再分化诱导不定芽产生，或直接从叶表面形成不定芽，但这两种途径的不定芽获得率均较低，且转化周期较长，经农杆菌侵染后的转化受体褐化率较高，导致转化率降低。以愈伤组织为受体，遗传转化初期需要经过潮霉素逐步筛选抗性愈伤组织的培养阶段，从农杆菌侵染愈伤组织至产生转基因幼苗需要约 7～9个月时间，转化周期长，培养过程中细胞可能发生变异，遗传性状不稳定。本发明以无菌西番莲的幼苗茎尖为转化受体，转化效率最高且能够快速得到转基因西番莲苗。
优选的，所述预培养基为含有6-苄氨基嘌呤和吲哚丁酸的MS培养基；所述侵染培养基为含有农杆菌菌体、6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸和乙酰丁香酮AS的MS培养基；所述共培养基为含有6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸和乙酰丁香酮的MS培养基；所述抑菌培养基为含有6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸和抑菌剂的MS培养基；所述静止培养基为含有吲哚丁酸和抑菌剂的MS培养基。
所述抑菌剂为羧噻吩青霉素钠-棒酸钾（Timentin，简称Tim）和/或噻孢霉素（Cephalothin，简称Cep）。
优选的，所述预培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸（IBA） 1~3 mg/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；
优选的，所述侵染培养基为含有农杆菌菌体、6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L、乙酰丁香酮100~300 μmol/L和糖20~50 g/L的MS培养基；
优选的，所述共培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L、乙酰丁香酮 100~300 μmol/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；
优选的，所述抑菌培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸 1~3 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾200~500 μmol/L和糖20~50 g/L的MS培养基；
优选的，所述静止培养基为含有吲哚丁酸1~3 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾200~500 μmol/L或噻孢霉素300 μmol/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基。
更优选的，所述预培养基为含有6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸 1.5 mg/L、糖30 g/L和琼脂粉8.0 g/L的MS培养基；
更优选的，所述侵染培养基为含有农杆菌菌体、6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸1.5 mg/L 、乙酰丁香酮200 μmol/L和糖30 g/L的MS培养基；
更优选的，所述共培养基为含有6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸 1.5 mg/L、乙酰丁香酮 200 μmol/L、糖30 g/L和琼脂粉8.0 g/L的MS培养基；
更优选的，所述抑菌培养基为含有6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸 1.5 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾300 μmol/L和糖30 g/L的MS培养基；
更优选的，所述静止培养基为含有吲哚丁酸1.5 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾或噻孢霉素300 μmol/L、糖30 g/L和琼脂粉8.0 g/L的MS培养基。
更优选的，所述侵染培养基的制备方法为：将OD600值为0.7~1.0的农杆菌菌液离心，弃上清液，利用悬浮培养基重悬菌体，添加100~300 μmol/L乙酰丁香酮至悬浮培养基中，恒温震荡培养1 h，获得OD600值仍为0.7~1.0的侵染培养基；其中所述悬浮培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L 和糖20~50 g/L的MS培养基。
优选的，侵染的时间为15~60 min。
优选的，所述茎尖为长度2~5 mm的茎尖。茎尖受体长度为2~5 mm时，遗传转化效果较好。当茎尖长度较小时，褐化率高，且存活的茎尖分生组织生长极其缓慢甚至不长，造成转基因苗培育时间长，获得率低。当茎尖长度过大时，受体转化率较低。同时茎尖本身对抗生素具有较强的抗性，因此在实验中会见到嵌合体的现象，而且茎尖越大出现嵌合体的可能性越大。
优选的，所述侵染为通过摇床震荡辅助侵染，摇床温度28 ℃，转速150 r/min。
优选的，转化的目的基因包括GUS和/或GFP基因。
进一步的，所述农杆菌介导的西番莲遗传转化方法还包括以下步骤：静止培养基培养之后，当转化茎尖生长至高度2~5 cm小茎枝时，利用组织化学GUS染色法初步筛选获得的阳性茎枝的茎尖，将阳性茎枝的茎尖接种至所述静止培养基中培养，通过PCR鉴定分析筛选获得转基因植株。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
本发明以西番莲的茎尖（2~5 mm）为转化受体，采用农杆菌介导法将GUS/GFP基因导入茎尖组织中，经过茎枝培养，获得高度2~5 cm的转化茎枝，利用组织化学GUS染色法，初步筛选出受体组织呈蓝色转化茎枝，切取初筛的阳性单茎枝的茎尖进行二次培养，通过PCR鉴定分析剔除假阳性转基因茎枝，获得具有目的基因条带的阳性转基因植株。本发明建立了以茎尖为转化受体，未经愈伤培养阶段而由茎枝培养方式直接获得转基因苗的西番莲遗传转化体系，该体系一是提高了转化受体的存活率和转化效率，二是解决了受体萌芽率较低问题，避免了细胞可能因分化发生变异的问题；三是缩短了转化周期和转基因育种时间。为创制具有优良性状的西番莲新品种，解决我国西番莲产业问题奠定基础和提供技术参考。
附图说明
图1 前期叶片转化受体GUS活性检测。
图2 茎尖转化受体的叶片GUS活性检测。
图3 初筛阳性植株的PCR鉴定。
图4 预培养时间与转化效率关系图。
图5 农杆菌介导西番莲茎尖受体的转化过程。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实验例1 转化参数优化与确定
为确定预培养时间、农杆菌OD600值、侵染时间和共培养时间对遗传转化效率的影响，前期以叶片为转化受体设计了16个试验处理（遗传转化过程与下述1.4节类似）。根据16个处理侵染转化受体后利用组织化学GUS染色分析转化效果，结果显示不同参数组合对GUS基因瞬时表达率均有显著差异，其中Y10处理组的转化受体中GUS基因稳定表达率最高（为0.37），其次是Y9处理组（表1）。不同处理GUS染色检测结果差异明显，蓝色越深，说明GUS基因在叶片中表达量越高；Y4处理叶片蓝色的着色最深，GUS基因表达量较高，Y6处理次之；但转化率以Y10处理最高（图1）。综上所述以Y10和Y4参数组合作为较优参数。
表1 叶片转化受体的GUS活性检测
Figure SMS_1
实施例1农杆菌介导的西番莲遗传转化方法
取无菌西番莲组培苗，剪取长度约2 cm单芽在预培养基PM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中预培养2 d，然后剪取其长度为2~5mm的茎尖作为受体，刺伤受体后直接放入侵染培养基IM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+农杆菌菌体，pH值6.0）中，再放置于28 ℃，150 r/min的摇床中以震荡辅助侵染茎尖受体，侵染时间60 min；用无菌滤纸吸干转化受体表面菌液，并将转化受体接种至共培养基CM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中于28 ℃黑暗培养5 d，用抑菌培养基BM（MS+ 6-BA 1.0mg/L+ IBA 1.5 mg/L+Tim 300 μmol/L +糖30 g/L，pH值6.0）将转化受体表面的农杆菌洗脱干净，无菌滤纸吸干后接种至静止培养基RM（MS+ IBA 1.5 mg/L +Tim 300 μmol/L (或Cep 300 μmol/L) +糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中，在28 ℃，16 h/8 h昼夜交替，光照强度1500~3200 lx条件下培养30 d，筛选鉴定，获得转基因植株。
所述侵染培养基的制备方法为：将OD600值为0.7的农杆菌菌液置于28 ℃，3500 r/min条件下离心10 min，弃上清液，利用悬浮培养基（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L+糖30 g/L）重悬菌体，添加200 μmol/L乙酰丁香酮至悬浮培养基中，28 ℃、转速150 r/min震荡培养1 h，获得OD600值仍为0.7~1.0的侵染培养基。
所述农杆菌为含有GUS/GFP基因的pCMBIA-1304载体的根癌农杆菌菌株。
实施例2农杆菌介导的西番莲遗传转化方法
取无菌西番莲组培苗，剪取长度约2 cm单芽在预培养基PM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中预培养1 d，然后剪取其长度为2~5mm的茎尖作为受体，刺伤受体后直接放入侵染培养基IM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+农杆菌菌体，pH值6.0）中，再放置于28 ℃，150 r/min的摇床中以震荡辅助侵染茎尖受体，侵染时间60 min；用无菌滤纸吸干转化受体表面菌液，并将转化受体接种至共培养基CM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中于28 ℃暗培养7 d，用抑菌培养基BM（MS+ 6-BA 1.0mg/L+ IBA 1.5 mg/L+Tim 300 μmol/L +糖30 g/L，pH值6.0）将转化受体表面的农杆菌洗脱干净，无菌滤纸吸干后接种至静止培养基RM（MS+ IBA 1.5 mg/L +Tim 300 μmol/L (或Cep 300 μmol/L) +糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中，在28 ℃，16 h/8 h昼夜交替，光照强度1500~3200 lx条件下培养30 d，筛选鉴定，获得转基因植株。
所述农杆菌为含有GUS/GFP基因的pCMBIA-1304载体的根癌农杆菌菌株。
所述侵染培养基的制备方法为：将OD600值为0.7的农杆菌菌液置于28 ℃，3500 r/min条件下离心10 min，弃上清液，利用悬浮培养基（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L +糖30 g/L）重悬菌体，添加200 μmol/L乙酰丁香酮至悬浮培养基中，28 ℃、转速150 r/min震荡培养1 h，获得OD600值仍为0.7~1.0的侵染培养基。
实施例3农杆菌介导的西番莲遗传转化方法
取西番莲组培苗，剪取长度约2 cm单芽在预培养基PM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA1.5 mg/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中预培养3 d，然后剪取其长度为2~5 mm的茎尖作为受体，刺伤受体后直接放入侵染培养基IM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+农杆菌菌体，pH值6.0）中，再放置于28 ℃，150 r/min的摇床中以震荡辅助侵染茎尖受体，侵染时间15 min；用无菌滤纸吸干转化受体表面菌液，并将转化受体接种至共培养基CM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中于28 ℃暗培养7 d，用抑菌培养基BM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+Tim 300 μmol/L +糖30 g/L，pH值6.0）将转化受体表面的农杆菌洗脱干净，无菌滤纸吸干后接种至静止培养基RM（MS+ IBA 1.5 mg/L +Tim 300 μmol/L (或Cep 300μmol/L) +糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中，在28 ℃，16 h/8 h昼夜交替，光照强度1500~3200 lx条件下培养30 d，筛选鉴定，获得转基因植株。
所述侵染培养基的制备方法为：将OD600值为0.7的农杆菌菌液置于28 ℃，3500 r/min条件下离心10 min，弃上清液，利用悬浮培养基（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L +糖30 g/L）重悬菌体，添加200 μmol/L乙酰丁香酮至悬浮培养基中，28 ℃、转速150 r/min震荡培养1 h，获得OD600值仍为0.7~1.0的获得侵染培养基。
所述农杆菌为含有GUS/GFP基因的pCMBIA-1304载体的根癌农杆菌菌株。
在其他实施例中，所述预培养基可以为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；所述侵染培养基可以为含有农杆菌菌体、6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L、乙酰丁香酮100~300 μmol/L和糖20~50 g/L的MS培养基，配制侵染培养基时所使用的农杆菌菌液的OD600值为0.7~1.0，配制后的侵染培养基的OD600值仍为0.7~1.0；所述共培养基可以为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L、乙酰丁香酮 100~300 μmol/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；所述抑菌培养基可以为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸 1~3 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾200~500 μmol/L和糖20~50 g/L的MS培养基；所述静止培养基可以为含有吲哚丁酸1~3 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾或噻孢霉素 200~500 μmol/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基。
实验例2：
1 茎尖受体遗传转化方法
1.1 实验材料
实验材料来源于中国热带农业科学院海口实验站西番莲育种与高效栽培课题组前期培养的西番莲离体无菌苗，载体是含有GUS和GFP标记基因的pCAMBIA-1304 载体，工程菌菌株为根癌农杆菌。
1.2 工程菌菌株的PCR验证及活化
吸取200 μL甘油保存的农杆菌菌液，加入至3 mL YEP液体培养基（含Kan、Rif ）中，在温度28 ℃，转速180 r/min条件下经12~15 h培养至呈浑浊状态；用无菌水稀释菌液，并将菌液在YEP固体培养基（含Kan、Rif）上划线，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养2~3 d，获得单菌落，挑取单菌落用无菌水稀释后吸取10 μL进行PCR验证。目的单菌落稀释液加入至小体积（0.5~1.0 ml）的YEP液体培养基（含Kan、Rif）中，于28 ℃恒温摇床震荡培养24 h后更换至大体积的YEP液体培养基（20~200 ml以上）中，并分别培养至OD600值为0.7、1.0。
1.3 侵染培养基的制备
将上述OD600值为0.7、1.0的农杆菌菌液置于28 ℃，3500 r/min条件下离心10min，弃上清液，利用悬浮培养基SM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+糖30 g/L，pH值6.0）重悬菌体，添加200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）至SM培养基中，在28 ℃，100 r/min恒温摇床中震荡继续培养1 h，获得OD600值为0.7~1.0的侵染培养基IM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA1.5 mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+菌体，pH值6.0），备用。
1.4 茎尖受体的遗传转化方法
取前期培养获得的无菌西番莲组培苗，剪取长度约2 cm单芽在预培养基PM（MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中预培养2 d，然后剪其长度为2~5 mm的茎尖作为转化受体，刺伤后直接放入侵染培养基IM中，再放置于28 ℃，150 r/min的摇床中以震荡辅助侵染茎尖受体，侵染时间分别是15 min、60 min；用无菌滤纸吸干受体表面菌液，并将转化受体接种至共培养基CM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5mg/L +AS 200 μmol/L+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中于28 ℃暗培养5 d，用抑菌培养基BM（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L+Tim 300 μmol/L +糖30 g/L，pH值6.0）将转化受体表面的农杆菌洗脱干净，无菌滤纸吸干后接种至静止培养基RM（MS+ IBA 1.5 mg/L +Tim 300 μmol/L (或Cep 300 μmol/L)+糖30 g/L+琼脂粉8.0 g/L，pH值6.0）中，在28℃，16 h/8 h昼夜交替，光照强度1500~3200 lx条件下培养30 d，观察转化受体的生长情况并统计其存活率。
存活率=存活茎尖数/每组处理茎尖总数×100%
2 转化受体阳性植株的鉴定
2.1 转化受体阳性植株的初步筛选
当转化茎尖生长至高度约3 cm（2~5 cm）的小茎枝时，剪取其顶端新萌发的嫩叶（从顶端往下数第一、二片展开叶）用无菌水冲洗后将嫩叶完全浸泡于GUS染色试剂溶液中，于37 ℃恒温水浴锅中避光10~24 h静置，用体积浓度70%的乙醇脱色2-3次，如果脱色不彻底可用体积浓度90%酒精重复一次，当叶片无叶绿素，叶色透明，叶脉清晰可见时放在湿润滤纸上置于体视显微镜下观察，以阴性对照材料呈白色为对照组。白色背景上的蓝色组织即为GUS表达部位。
GUS稳定表达率=GUS表达的植株数/组织化学GUS染色的植株总数×100%
2.2 初筛阳性植株的PCR鉴定
切取上述初步筛选获得的阳性茎枝的茎尖（5~10 mm）接种至PM培养基中培养，当新茎尖长至3~5 cm的茎枝时剪取其顶端新生嫩叶（即从顶端往下数第一、二片展开叶），利用CTAB法提取上述叶片DNA，根据载体上GFP基因序列设计引物，扩增的目的片段大小为1700 bp，PCR反应体系为10 μL，DNA模板1 μL，上下引物1 μL，2×PCR Master Mix 1 μL；反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃复性1 min 30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min；同时以未转化茎尖长成的茎枝叶片DNA为阴性对照，工程菌质粒携带的GFP基因为阳性对照。将上述不同组织的DNA扩增产物滴入1%琼脂糖凝胶中进行电泳跑胶，获取的DNA条带在凝胶成像系统中观察、鉴定和分析条带大小，统计具有目的条带的PCR阳性植株，获得茎尖受体的转化率。
转化率=PCR阳性植株数/被侵染茎尖总数×100%
3 结果与分析
3.1 农杆菌的PCR验证
将前期甘油保存的农杆菌活化后取的单菌落稀释液1 μL进行PCR验证，获得含有GUS/GFP基因的pCMBIA-1304载体的农杆菌菌株。
3.2 茎尖受体的遗传转化分析
3.2.1 茎尖再生与转化效果分析
基于前期叶片转化实验获得的较优参数，以农杆菌OD600值0.7、1.0和侵染时间15min、60 min为水平因素设计实验（表2）。结果显示，利用农杆菌介导转化GUS/GFP基因导入茎尖（2~5 mm）受体组织中，受体与农杆菌共培养5 d后，其存活率分别为76.7%和80.0%（表2）；在RM培养基上茎尖受体未被诱导生出丛生芽而是发挥顶端优势向上生长形成单茎枝，在培养21 d后，长度5.0 mm的茎尖受体形成平均长度23 mm的茎枝，长度3.0 mm的茎尖形成平均长度17.2 mm茎枝，长度2.0 mm的茎尖形成平均长度11.5 mm茎枝。在以叶片为受体的遗传转化实验中，经过2个月以上的脱分化和再分化，叶片受体存活仅为8.9%；以茎尖为受体的存活率极显著高于叶片受体。叶片转化受体出芽率仅0.038%，且被侵染后的叶片表面农杆菌附着浓度较多，且与培养基接触面积较大，导致农杆菌繁衍速度较快，对叶片受体的毒害作用增加，导致转化率无法准确统计。而以茎尖为受体的遗传转化体系，除了较高的存活率，其生长速度快，阳性植株检测和筛选速度快、简捷，且获得阳性茎枝可同时扩繁和生根，缩短了转基因育种周期，避免了愈伤组织分化带来细胞变异的影响及转基因工作的繁琐步骤。
因此，茎尖受体长度为2~5 mm时较为合理，效果较好。当茎尖长度较小时，褐化率高，且存活的茎尖分生组织生长极其缓慢甚至不长，造成转基因苗培育时间长，获得率低。当茎尖长度过大时，受体转化率较低。同时茎尖本身对抗生素具有较强的抗性，因此在实验中会见到嵌合体的现象，而且茎尖越大出现嵌合体的可能性越大。
表2无菌西番莲茎尖遗传转化试验
Figure SMS_2
3.2.2 茎尖受体阳性植株的初步筛选
待转化受体长成3 cm小茎枝时，剪取其新生叶进行组织化学GUS活性检测。结果显示，被化学组织染色的嫩叶中部分新生嫩叶呈蓝色，推测gus基因已成功转入茎尖受体中，并在形成的小茎枝中复制表达，其瞬时表达率为5%~15%。因此，初步认为农杆菌中载体的T-DNA区已整合到转化受体中，获得初筛阳性茎枝。
3.2.3 阳性植株的PCR分析与鉴定
获得的初筛阳性茎枝经过PCR反应分析发现，在S1处理的存活植株中获得9株含GUS/GFP基因的阳性植株，其次是S2处理存活植株中获得7株含GUS/GFP基因的PCR阳性植株，二者转化率分别为30%和23.3%；图3为其部分标记基因引物的条带；转化率最低的是S3处理，为10%（表3）。获得的PCR阳性植株经过3~4代的茎尖培养，PCR反应显示仍有目的条带，说明获得的PCR阳性植株中目的基因已经稳定表达，无嵌合体存在。
表3 PCR阳性植株的转化率分析
Figure SMS_3
3.2.4 预培养时间对转化效率的影响
研究发现，切离母体的茎芽在预培养基上随着预培养时间增加，在预培养2 d时，其转化效率16%，为最高值，在预培养3 d后下降（图4）。预培养是利用外植体离体时细胞并不处于感受态，在体外培养被诱导呈感受态的阶段；感受态细胞是能对胞外信号做出反应的一种细胞状态；利用含激素可诱生茎枝的培养基可使外植体细胞最快产生感受态；处于感受态的细胞和组织，用标准的生长调节剂处理就会使细胞或组织重新进入细胞周期，增强T-DNA整合到受体细胞DNA中的机率。且预培养农杆菌的侵染存活率更高。
3.2.5静止培养对受体组织存活率的影响
在遗传转化研究中，需要添加适量的抗生素浓度进行抗性植株的筛选。本研究在共培养之后采用静止培养，即培养基不加潮霉素而是分别添加适量的2种抑菌剂以抑制农杆菌的毒害作用，避免了潮霉素对转化受体毒害的影响，以减少阳性转化受体死亡率，提高转化效率的精确性。
本研究前期叶片受体转化实验结果发现，未添加潮霉素进行压力筛选的处理，在静止培养30 d后，叶片愈伤存活率为77.9%，随着培养时间延长，转化受体数量不变，转化率不受影响；而添加适量浓度的潮霉素进行抗性筛选培养21 d后，由于潮霉素和农杆菌的双重毒害作用下，转化受体存活率64%，且随着筛选时间增加，叶片愈伤出现生长发育缓慢或逐渐褐化死亡的情况，造成转化受体数量减少，阳性受体死亡的不确定性增加，转化率降低的误差增加。
3.2.6 共培养时间对转化效率的影响
农杆菌介导转化的过程是农杆菌通过伤口侵染受体并将载体上的T-DNA整合到植物基因组中的过程。共培养时间过长，农杆菌菌株过度繁殖，使受体材料缺氧甚至受到侵害严重而软腐、褐化死亡；时间过短，农杆菌菌株载体上的T-DNA无法充分整合到植物体内，转化效率降低。因此，基于前期实验结果，本研究设计共培养时间为5~7 d。
本实验结果表明，无菌单芽预培养2 d，取茎尖（2~5 mm）为受体，在农杆菌OD600值为0.7，侵染时间为15~60 min，以摇床震荡（28 ℃，150 r/min）为辅助侵染，共培养为7 d的条件下，可在1~2个月内生产出转基因茎枝，转基因茎枝可生根培养获得转基因植株，也可诱导腋芽生长形成一丛茎枝，分开丛枝再培养扩繁，能更快地获得更多转基因苗，提高转基因植株的获得率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种农杆菌介导的西番莲遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
取无菌西番莲组培苗，剪取长度2cm的单芽，将单芽置于预培养基中预培养1~3 d，然后剪取长度2~5 mm的茎尖作为受体，经注射针头刺伤茎尖后直接放入侵染培养基中震荡侵染；所述侵染为通过摇床震荡辅助侵染，摇床温度28 ℃，转速150 r/min；侵染的时间为15~60 min；
将侵染后的受体接种至共培养基中暗培养5~7 d，然后用抑菌培养基将受体表面的农杆菌洗脱干净，最后接种至静止培养基中培养；
静止培养基培养之后，当转化茎尖生长至高度2~5 cm小茎枝时，初步筛选获得阳性茎枝的茎尖，将阳性茎枝的茎尖接种至所述静止培养基中培养，经PCR鉴定并获得转基因植株；
转化的目的基因包括GUS和/或GFP基因；
所述预培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸 1~3 mg/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；
所述侵染培养基为含有农杆菌菌体、6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L 、乙酰丁香酮100~300 μmol/L和糖20~50 g/L的MS培养基；
所述共培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L、乙酰丁香酮 100~300 μmol/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；
所述抑菌培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸 1~3mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾200~500 μmol/L和糖20~50 g/L的MS培养基；
所述静止培养基为含有吲哚丁酸1~3 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾或噻孢霉素200~500 μmol/L、糖20~50 g/L和琼脂粉6~10 g/L的MS培养基；
所述侵染培养基的制备方法为：将OD600值为0.7~1.0的农杆菌菌液离心，弃上清液，利用悬浮培养基重悬菌体，添加100~300 μmol/L乙酰丁香酮至悬浮培养基中，震荡培养，获得OD600值仍为0.7~1.0的侵染培养基；其中所述悬浮培养基为含有6-苄氨基嘌呤0~1.5 mg/L、吲哚丁酸1~3 mg/L 和糖20~50 g/L的MS培养基。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的西番莲遗传转化方法，其特征在于，
所述预培养基为含有6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸 1.5 mg/L、糖30 g/L和琼脂粉8.0 g/L的MS培养基；
所述侵染培养基为含有农杆菌菌体、6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸1.5 mg/L 、乙酰丁香酮200 μmol/L和糖30 g/L的MS培养基；
所述共培养基为含有6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸1.5 mg/L、乙酰丁香酮 200 μmol/L、糖30 g/L和琼脂粉8.0 g/L的MS培养基；
所述抑菌培养基为含有6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、吲哚丁酸 1.5 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾300 μmol/L和糖30 g/L的MS培养基；
所述静止培养基为含有吲哚丁酸1.5 mg/L、羧噻吩青霉素钠-棒酸钾300 μmol/L或噻孢霉素300 μmol/L、糖30 g/L和琼脂粉8.0 g/L的MS培养基。
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的西番莲遗传转化方法，其特征在于，农杆菌菌液OD600值为1.0时，侵染的时间为60 min。
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