CN115094086A - 一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法 - Google Patents

一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法 Download PDF

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Abstract

一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，将待转化的播娘蒿花序浸泡于含有悬浮农杆菌的渗透培养基中，然后及时吸干花序上多余的渗透培养基，可避免花序死亡，大大提高转化成功率。将转化植株获得的T1种子在含有羧苄青霉素钠的1/2MS培养基上进行筛选，能有效抑制农杆菌的生长，保证筛选的有效性，获得转基因植株。该方法操作简单有效，实验周期短，可快速获得转基因播娘蒿，从种子到获得T1转基因植株仅需要2‑3个月的时间。本发明的方法为播娘蒿的基因导入或敲除等功能研究提供技术支持，为播娘蒿重要基因的功能解析提供参考。

Description

一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法。
背景技术
播娘蒿[Descurainia sophia(L.)]属十字花科一年生或越年生药用草本植物，主要分布于东北、河北、内蒙古、山东、河南、浙江、甘肃等地。播娘蒿干燥成熟的种子称为南葶苈子，味辛、苦，性大寒，具有止咳平喘、消肿利尿、强心之功效，临床应用十分广泛。化学成分研究表明，南葶苈子中含有槲皮素、山柰素、异鼠李素以及它们的苷等黄酮类化合物，均与南葶苈子止咳化痰、泻肺平喘，治疗各种类型心衰等多方面临床疗效密切相关，是南葶苈子中重要的有效成分。
当前遗传转化技术发展迅速，并全面推动了育种技术的升级，已在多种药用植物品种创新中发挥了重要作用，比如枸杞，黄芪等。目前，药用植物主要依赖叶片、下胚轴等外植体进行遗传转化并获得转基因株系，但这种遗传转化体系在操作上比较复杂和耗时，因为要经过组织培养和植株再生过程，该过程需要数月的时间且操作繁琐，受到很多因素和培养条件的限制，可能会产生的对植物基因型的依赖和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响。浸花法转化是利用植物材料花序与农杆菌接触，在活体条件下完成可遗传细胞的转化，并通过对后代的筛选获得转化株系，已成功应用于十字花科的白菜，诸葛菜，拟南芥等。
目前，关于播娘蒿的研究较少，仅涉及药用成分、药理方面的研究，还未有播娘蒿遗传转化体系的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行播娘蒿的遗传转化。为解决上述技术问题，本发明提供了一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，通过农杆菌介导快速获得转基因播娘蒿。本发明第一次成功构建了播娘蒿的遗传转化体系，且方法简单有效，实验周期短，从种子到获得T1转基因植株仅需要2-3个月的时间。
本发明提供的一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，包括如下步骤：
(1)将含有目的基因及抗性筛选基因的重组表达载体导入农杆菌中，并用渗透培养基悬浮；
(2)利用浸花法进行转化：将播娘蒿花序浸泡于所述含有悬浮农杆菌的渗透培养基中；
(3)用滤纸将所述播娘蒿花序上多余的渗透培养基吸干；
(4)将侵染后的播娘蒿植株经过暗处理后正常培养至结种；
(5)将步骤(4)中转化后的植株采取单株收种，得到T1代种子，将所述种子在含有抗生素的1/2MS培养基上萌发培育，筛选得到具有抗性的植株；
(6)通过进一步检测目的基因确认抗性植株是否转化成功。
其中步骤(1)中的农杆菌为GV3101，渗透培养基含有表面活性剂和蔗糖，表面活性剂为Silwet L-77，最佳浓度为100-500μL/L；蔗糖最佳浓度为50-60g/L。
步骤(2)中含有悬浮农杆菌的渗透培养基的OD600值为0.6-0.8。
步骤(2)中侵染过程中，需将每个花序浸泡到渗透培养基中45-60秒，步骤(4)中侵染后的播娘蒿植株需要暗处理10-12小时。
步骤(5)中的抗生素使用浓度为50-100mg/L。
本发明的优点和有益效果：
本发明首先成功建立起一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，浸花法通常在花序浸泡渗透培养基之后，为保持一定湿度，将花序用纸袋或保鲜膜包裹保湿并进行暗处理。我们的研究发现，这样操作往往造成花序上多余的农杆菌悬浮液与花序过长时间接触，从而对植物细胞造成伤害，导致花序腐烂死亡，降低转化率甚至转化失败。在本发明的研究中，在播娘蒿浸泡含有悬浮农杆菌的渗透培养基之后，及时用滤纸将多余的渗透培养基吸干，再进行后续操作，可以使浸泡后的花序更好地发育，提高转化效率。浸花法在筛选T1抗性植株时，会在1/2MS培养基中添加表达载体筛选基因的抗生素。
我们发现，T1种子会携带农杆菌从而对1/2MS培养基造成污染，严重影响种子的萌发生长，无法筛选出抗性植株。我们向1/2MS培养基中添加了羧苄青霉素钠，目的是抑制农杆菌的生长，保证筛选的有效性，获得转基因植株。
本发明提供的方法操作简单有效，实验周期短，从种子到获得T1转基因植株仅需要2-3个月的时间。本发明的方法为播娘蒿的基因导入或敲除等功能研究提供技术支持，为播娘蒿重要基因的功能解析提供参考。
附图说明
图1是处于最佳转化时期的播娘蒿植株照片。
图2是pCAMBIA1301质粒图谱。
图3是潮霉素抗性培养基上获得的抗性植株。
图4是播娘蒿pCAMBIA1301-GUS转化后所得抗性植株GUS染色的结果，其中，A-C：阴性对照；D-F：pCAMBIA1301-GUS抗性植株。
图5是实施例中PCR检测T1抗性植株hyg基因的电泳结果图。
图6是播娘蒿PW1211-YFP转化后所得抗性植株观察荧光的结果，其中，A-B：白光下阴性对照的叶片和根尖组织；C-D：白光下卡那霉素抗性幼苗的叶片和根尖组织；E-F：绿色荧光下阴性对照的叶片和根尖组织；G-H：绿色荧光下卡那霉素抗性幼苗的叶片和根尖组织。
具体实施方式
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
用于克隆转化的大肠杆菌感受态细胞为Trans5α，购自于北京全式金生物技术公司。
下述实施例中LB培养基由10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物和10g的氯化钠加入蒸馏水并定容至1000mL组成。
实施例1
(1)含有潮霉素和GUS筛选基因的载体的制备
pCAMBIA1301质粒载体含有GUS染色基因，卡那霉素和潮霉素抗性标记基因(图2)。
pCAMBIA1301质粒转入大肠杆菌，挑单克隆检测正确后转入农杆菌。
(2)转入农杆菌
将上述步骤(1)中检测正确的单克隆接种到含有100mg/L卡那霉素的灭菌LB培养基中，同时将pRK2013接种到含有100mg/L卡那霉素的灭菌LB培养基中，以上两种菌在37℃，220rpm条件下过夜培养；农杆菌GV3101接种到含有100mg/L利福平的灭菌LB培养基中，在28℃，220rpm条件下过夜培养。用三亲杂交法将表达载体接种到农杆菌中。
(3)悬浮农杆菌
将步骤(2)中含有表达载体的农杆菌接种到5mL含有100mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB培养基中，在28℃，220rpm条件下过夜培养。用移液枪吸取1mL菌液至100mL含有100mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB培养基中，在28℃，220rpm条件下过夜培养至菌液OD600值约为0.6。将100mL菌液在6000rpm条件下离心10分钟，弃掉上清，用少量50g/L的蔗糖溶液将菌重悬起来，再用50g/L的蔗糖溶液将菌液稀释至OD600值为0.6。在稀释后的菌液中加入300μL/L的Silwet L-77，得到含有悬浮农杆菌的渗透培养基。
(4)侵染播娘蒿
选择生长状态良好处于初花期的播娘蒿作为待转化植株，去除果荚和已开放的花朵(图1)，将播娘蒿植株的花序浸入到含有悬浮农杆菌的渗透培养基中，一个花序侵染时间为45秒，侵染完成后花序上多余的渗透培养基用滤纸吸干，再将播娘蒿植株在黑暗条件下培养10小时。然后将播娘蒿在正常条件下(16小时光照/8小时黑暗)培养至收获种子。
实施例2
(1)抗性植株获得
将实施例1中转化后的植株采取单株收种，得到T1代种子，充分干燥后将其在含有100mg/L潮霉素和100mg/L羧苄青霉素钠的1/2MS培养基上萌发培育，筛选得到具有抗性的转基因植株(图3)。
(2)抗性植株的GUS染色
取抗性植株的叶片、花序、种子等组织，加入配置好的GUS染色工作液直至浸没待染组织，然后用锡箔纸包起来，放置于37℃，染色12h。然后用70％酒精多次脱色，直至完全脱色，结果如附图4所示。
(3)抗性植株的PCR检测
对表现出潮霉素抗性的植株，对hyg基因进行检测。植株基因组DNA的提取采用CTAB法，PCR扩增引物序列如下：
引物1：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT
引物2：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC
利用引物1和引物2以抗性植株基因组DNA为模板，扩增hyg基因，扩增体系为：
双蒸水：3μL；
2×Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞公司)：5μL；
引物1：0.5μL；
引物2：0.5μL；
基因组DNA模板：1μL；
PCR反应条件为：
预变性：94℃，5分钟；
变性：94℃，20秒；
退火：58℃，15秒；
延伸：72℃，1分钟；
35个循环后72℃，3分钟。
反应结束后，对PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到500bp左右的目的片段(图5)。实验结果呈阳性，证明hyg和GUS基因已经整合到播娘蒿基因组中，得到T1转基因植株。
实施例3
(1)制备含卡那霉素和绿色荧光筛选标记基因质粒的农杆菌
表达载体PW1211质粒带有抗卡那霉素基因Kan和绿色荧光蛋白基因YFP，将PW1211质粒转入大肠杆菌，将检测正确的单克隆接种到含有50mg/L大观霉素的灭菌LB培养基中，同时将pRK2013接种到含有50mg/L卡那霉素的灭菌LB培养基中，以上两种菌在37℃，220rpm条件下过夜培养；农杆菌GV3101接种到含有50mg/L利福平的灭菌LB培养基中，在28℃，220rpm条件下过夜培养。利用三亲杂交法将表达载体转入农杆菌GV3101中。
(2)含有PW1211质粒农杆菌的培养、悬浮
将步骤(1)中检测正确的单克隆接种到5mL含有50mg/L利福平和50mg/L大观霉素的LB培养基中，在28℃，220rpm条件下过夜培养。用移液枪吸取1mL菌液至100mL含有50mg/L利福平和50mg/L大观霉素的LB培养基中，在28℃，220rpm条件下过夜培养至菌液OD600值约为0.8。将100mL菌液在6000rpm条件下离心10分钟，弃掉上清，用少量60g/L的蔗糖溶液将菌重悬起来，再用60g/L的蔗糖溶液将菌液稀释至OD600值为0.8。在稀释后的菌液中加入500μL/L的Silwet L-77，得到含有悬浮农杆菌的渗透培养基。
(3)侵染播娘蒿
选择生长状态良好处于初花期的播娘蒿作为待转化植株，去除果荚和已开放的花朵(图1)，将播娘蒿花序浸入到含有悬浮农杆菌的渗透培养基中，一个花序侵染时间为60秒，侵染完成后花序上多余的渗透培养基用滤纸吸干，再将播娘蒿植株在黑暗条件下培养12小时。然后将播娘蒿在正常条件下(16小时光照/8小时黑暗)培养至收获种子。
(4)抗性植株获得
将转化后的植株采取单株收种，得到T1代种子，充分干燥后将其在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L羧苄青霉素钠的1/2MS培养基上萌发培育，筛选得到具有抗性的转基因植株。
(5)转基因植株的检测
取抗性植株的叶片、根等组织，于荧光显微镜下观察有无绿色荧光，结果如附图6所示。卡那抗性植株具有荧光，而野生型植株没有荧光，证明我们成功获得转基因播娘蒿。

Claims (10)

1.一种改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有目的基因及抗性筛选基因的重组表达载体导入农杆菌中，并用渗透培养基悬浮；
(2)利用浸花法进行转化：将播娘蒿花序浸泡于所述含有悬浮农杆菌的渗透培养基中；
(3)用滤纸将所述播娘蒿花序上多余的渗透培养基吸干；
(4)将侵染后的播娘蒿植株经过暗处理后正常培养至结种；
(5)将步骤(4)中转化后的植株采取单株收种，得到T1代种子，将所述种子在含有抗生素的1/2MS培养基上萌发培育，筛选得到具有抗性的植株；
(6)通过进一步检测目的基因确认抗性植株是否转化成功。
2.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的农杆菌菌株为GV3101。
3.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的渗透培养基包含表面活性剂Silwet L-77和蔗糖。
4.根据权利要求3所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，所述的表面活性剂Silwet L-77的浓度为100-500μL/L。
5.根据权利要求3所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，所述的蔗糖的浓度为50-60g/L。
6.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的含有悬浮农杆菌的渗透培养基OD600值为0.6-0.8。
7.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的播娘蒿花序浸泡时间为45-60秒。
8.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的侵染的播娘蒿植株暗处理时间为10-12小时。
9.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的抗生素包含羧苄青霉素钠及表达载体所含的筛选基因抗生素。
10.根据权利要求1所述的改进的浸花法转化播娘蒿的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的抗生素的使用浓度为50-100mg/L。
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