CN115838744B - 一种山桐子1，2rhat基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种山桐子1，2RHAT基因及应用。本发明提供了一种山桐子1，2RHAT基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明通过山桐子广靶数据，发现一种味极苦的物质‑柚皮苷，并克隆了它的关键合成基因1,2RHAT，为改善山桐子油口感提供了理论支持。

Description

一种山桐子1，2RHAT基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种山桐子1，2RHAT基因及应用。

背景技术

山桐子(Idesiapolycarpa)是杨柳科山桐子属下的一个种，其果实和种子含油量达到干重占比的43.6％。山桐子油富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸(刘春雷，江连洲，于殿宇，等.山桐子油提取工艺的研究及脂肪酸组成分析[J].食品科技，2012，000(002):192-195.)，还含有一些脂溶性维生素E、β–谷甾醇和角鲨烯等(Czernichow S，Thomas D，Bruckert E.[N-6fatty acids and cardiovascular health:dietary intakerecommendations].[J].Médecine SciencesM/s，2011，27(6-7):614.)，对人体而言具备降血脂、降血压、抵抗炎症等多方面的复合作用(Sangiovanni JP，Chew E Y.Theroleofomega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of theretina[J].Progress inRetinal&Eye Research，2005，24(1):87-138.)。因此山桐子油是一种理想的木本食用油，但其苦味素的存在极大的制约了其推广和食用。

山桐子油气味较重、入口苦涩，其苦味主要来源于“山桐子苦味素”。日本学者三好英夫等(三好英夫.关于山桐子树皮中所含的苦味物质[J].大阪市医疗中心杂志，1960，9.)最早从山桐子树皮中分离出了一种名为idesiin的苦味物质。

从目前研究结果来看，该分离物质是一种混合物质；久保田尚志等(久保田尚志.山桐子叶片中一种苦味成分的结构[J].东京植物学杂志，1966，79.)提取了这种苦味混合物质，并将其分离为有强烈苦味的物质，主要成分被命名为idesin。现在去除山桐子油苦味的方法多基于理化手段，主要以食用乙醇为萃取溶剂，以油醇旋液分离器为提取装置(吴斌，付卓锐，杨凌，等.山桐子油溶剂萃取脱酸工艺研究[J].广东化工，2014，41(17):2.)，实现山桐子油的脱苦。但实际生产过程中，这种方法生产成本较高，能耗较大且生产应用价值低。

为了探索山桐子中是否还有其他的苦味物质，通过其雌雄花叶的广泛靶向代谢数据发现一种相对含量在前3％的名为柚皮苷的苦味物质，全称是柚皮苷-7-O-新橙皮苷，属于黄酮类(贾冬英.柚皮苷提取纯化及其络合改性研究[D].四川大学，2002.)。柚皮苷代谢通路中包括早期类黄酮生物合成酶，合成了柚皮苷等常见类黄酮，柚皮苷通过7-O-葡萄糖苷转移酶(7-O-Glucosyltransferase，7-Glct)作用形成樱桃苷，再通过1，2-鼠李糖基转移酶(1，2rhamnosyltransferase，1，2Rhat)的作用最终形成柚皮苷(陈嘉景，彭昭欣，石梅艳，等.柑橘中类黄酮的组成与代谢研究进展[J].园艺学报，2016，43(2):17.)。

因此，如何克隆得到编码山桐子中合成柚皮苷关键酶1，2-鼠李糖基转移酶的相关基因，并验证关键合成基因的相关功能，以改善山桐子油的口感，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于筛选出山桐子中其它潜在的苦味物质；目的之二在于克隆了柚皮苷(结构式如图1所示)关键合成基因1，2-鼠李糖基转移酶，并提供CDS序列；目的之三在于验证了关键合成基因的功能，为改善山桐子油口感提供了理论支持。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种山桐子1，2RHAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的山桐子1，2RHAT基因编码的山桐子中合成柚皮苷关键酶1，2-鼠李糖基转移酶，所述1，2-鼠李糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示

本发明还进一步的提供了一种表达载体，包括初始载体和所述的山桐子1，2RHAT基因。

本发明还提供了一种宿主，转化或转染有所述的表达载体；

优选的，所述宿主为微生物。

本发明还进一步的提供了所述的山桐子1，2RHAT基因、所述的柚皮苷合成关键酶1，2-鼠李糖基转移酶、所述的表达载体、所述的宿主在合成柚皮苷中的应用。

本发明还进一步的提供了一种沉默载体，包括原始烟草脆裂病毒载体和所述的山桐子1，2RHAT基因。

本发明还提供了一种沉默重组菌，转化或转染有所述的沉默载体。

本发明还进一步的提供了所述的沉默载体、所述的沉默重组菌在降低山桐子油的柚皮苷含量中的应用。

本发明还提供了合成柚皮苷的方法，表达所述的山桐子1，2RHAT基因。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过山桐子广靶数据，发现一种味极苦的物质-柚皮苷，并克隆了它的关键合成基因1,2RHAT，为改善山桐子油口感提供了理论支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为柚皮苷结构式；

图2为不同植物组织中柚皮苷含量；

图3为TRV1和TRV2模式图(目标基因和PDS的位置)；

图4为Vigs侵染后叶片表型；

图5为对照组及实验组叶片1，2Rhat基因qPCR结果；

图6为对照组及实验组叶片中柚皮苷含量。

具体实施方式

本发明提供了一种山桐子1，2RHAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的山桐子1，2RHAT基因编码的山桐子中合成柚皮苷关键酶1，2-鼠李糖基转移酶，所述1，2-鼠李糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还进一步的提供了一种表达载体，包括初始载体和所述的山桐子1，2RHAT基因。

本发明还提供了一种宿主，转化或转染有所述的表达载体；

在本发明中，所述宿主为微生物，优选为大肠杆菌。

本发明还进一步的提供了所述的山桐子1，2RHAT基因、所述的柚皮苷合成关键酶1，2-鼠李糖基转移酶、所述的表达载体、所述的宿主在合成柚皮苷中的应用。

本发明还进一步的提供了一种沉默载体，包括原始烟草脆裂病毒载体和所述的山桐子1，2RHAT基因。

本发明还提供了一种沉默重组菌，转化或转染有所述的沉默载体。

本发明还进一步的提供了所述的沉默载体、所述的沉默重组菌在降低山桐子油的柚皮苷含量中的应用。

本发明还提供了一种合成柚皮苷的方法，表达所述的山桐子1，2RHAT基因。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

高效液相色谱法定量检测山桐子各组织中的柚皮苷含量

取山桐子幼叶、老叶、红色果实、橘色果实和青色果实、根以及新疆杨叶片的新鲜样品各0.1g左右，用组织研磨仪磨成粉末，加入含有1ml 80％甲醇溶液的EP管中，超声仪超声10min后在4℃中静置1～2h。取出样品在离心机中以18000rcf高速离心10min，取上清，过滤膜后即得待测提取液。

通过液相色谱定量检测各提取液中柚皮苷的含量(图2：山桐子组织中柚皮苷含量)，测定结果计算后可知柚皮苷在山桐子幼叶中含量最高达到1045ng/g，山桐子根中含量最少仅为355.9ng/g果实中含量相对较高，且伴随果实成熟含量逐步增加。

新疆杨与山桐子同属于杨柳科，但其叶片却没有明显的苦涩口感，故以其为阴性对照。结果显示新疆杨成熟叶片中的柚皮苷含量极低，约为山桐子幼叶的1/33。

实施例2

在山桐子中通过VIGS沉默1,2RHAT

将NCBI(HTTPS://WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/)中下载得到的柚子1，2RHAT序列(JQ217381.1)作为查询序列，利用BLASTP软件在山桐子基因组中比对获得1，2RHAT候选基因及其CDS序列。

取60MG山桐子健康植株，使用赛默飞试剂盒提取山桐子RNA，后使用宝生物反转录试剂盒反转录RNA获得CDNA，以CDNA为模板，使用VIGS引物PCR扩增(程序：预变性95℃，5MIN；变性95℃，30S；退火55℃，30S；延伸72℃，30S；循环34次；72℃，5MIN)。

山桐子1,2RHAT基因VIGS引物F：GCAGGGGTTGAACAAAGGTA(如SEQ ID NO.3所示)

山桐子1,2RHAT基因VIGS引物R：ATGGATGCCACAAGTAGGAG(如SEQ ID NO.4所示)

山桐子1,2RHAT基因VIGS+载体连接引物F:CTTCTTCCTTCACT CTCGAGGCAGGGGTTGAACAAAGGTA(如SEQ ID NO.5所示)(在VIGS引物基础上加入XHOI酶切位点以及载体上的重组同源片段)

山桐子1,2RHAT基因VIGS+载体连接引物R:CTTCGGGACATGCCCGGGC CTCGAGATGGATGCCACAAGTAGGAG

(如SEQ ID NO.6所示)(在VIGS引物基础上加入XHOI酶切位点以及载体上的重组同源片段)

山桐子PDS基因VIGS引物F：CAAGGCAGCTTCTAAGAAAT(如SEQ ID NO.7所示)

山桐子PDS基因VIGS引物R：ATGAGTGCATTGAACTTGGG(如SEQ ID NO.8所示)

山桐子PDS基因VIGS+载体连接引物F：CGGGGTACCCCGCAAGGCAGCTTCTAAGAAAT(如SEQ ID NO.9所示)(在VIGS引物基础上加入KPNI酶切位点)

山桐子PDS基因VIGS+载体连接引物R：CCCGCTCGAGCGGATGAGTGCATTGAACTTGGG(如SEQ ID NO.10所示)(在VIGS引物基础上加入XHOI酶切位点)

回收PCR产物，使用VIGS+载体连接引物进行第二次PCR扩增，回收产物。

本VIGS实验使用烟草脆裂病毒，载体用KPNI、XHOI限制性内切酶酶切，并回收载体骨架，与第二次PCR回收的产物进行连接，转入5Α大肠杆菌内，于抗性培养基(含有50MG/L卡那霉素的LB固体培养基)上进行筛选，分别构建含有1,2RHAT基因沉默片段的载体和PDS基因沉默片段的载体(PDS沉默后，植株叶片出现发白表型)。

挑取阳性大肠杆菌菌落，提取质粒，验证序列是否正确。将提取的质粒转化农杆菌GV3101菌株，在抗性培养基(含有50MG/L卡那霉素，40MG/L利福平，50MG/L庆大霉素的YEP固体培养基)上进行筛选。挑取阳性菌株扩大培养并保存(图3为TRV1和TRV2载体模式图)。

准备好阳性农杆菌菌株，其中TRV2-PDS-1,2RHAT重组质粒包含1,2RHAT基因片段(对照组为TRV2空载体以及TRV2-PDS，处理组含有PDS片段和目标基因片段，以便于后续筛选阳性苗)，在28℃摇床中于YEP液体培养基(含有50MG/L卡那霉素，40MG/L利福平，50MG/L庆大霉素)中进行扩大培养至对数生长期(液体由暗红色开始变为橙色后继续培养2小时左右即可)。

将扩大培养的农杆菌菌株分装至50ML无菌离心管中，于离心机中以5000RPM的转速离心10MIN，弃去管中液体，保留菌体，向离心管中加入20ML事先配置好的MMA溶液1(10MM氯化镁，10MM MES，20ΜM乙酰丁香酮)，充分震荡混匀，将离心管于28℃摇床中二次孵育3-4个小时。将二次孵育后的菌体从摇床中取出，用MMA溶液2(10MM氯化镁，10MM MES，200ΜM乙酰丁香酮)对菌液进行稀释至OD600值约为0.8～1.0，备用。

取子叶完全张开，无真叶长出的山桐子健康幼苗，在浸染前用干净的剪刀在两片子叶上各剪下一小块组织以使幼苗形成伤口。将幼苗放在玻璃杯或组培瓶中，分别向其中加入等体积的含有TRV1和TRV2的农杆菌菌液，使菌液完全浸没幼苗，后置于真空泵上抽真空25MIN再取出，用滤纸吸干菌液，将幼苗移栽至土壤后转移至温室在16H光照/8H黑暗，光照强度为4500LUX的条件下生长，用于后续柚皮苷含量检测的实验。

生长期间，观察对照组和实验组的表型，对照组中TRV2空载体处理的幼苗真叶不会变白，而TRV2-PDS处理后的幼苗真叶会变白；处理组TRV2载体上有PDS基因和目标基因的片段，在幼苗生长出真叶后，基因沉默成功的阳性苗幼苗叶片会白化，选取此类幼苗进行后续实验(图4VIGS侵染后叶片表型)。

实施例3

QPCR结果证明VIGS处理后1,2RHAT表达量降低

挑选正常对照组及叶片白化的幼苗的白色叶片，进行RNA提取并反转录成CDNA，以山桐子UBQ10为内参引物，进行QPCR检测沉默基因的表达量(图5对照组及实验组叶片1，2RHAT基因QPCR结果)。

QPCR引物，以下所有引物序列方向均为5′-3′：

表1 QPCR引物

(如SEQ ID NO.11～14所示)

实施例4分析测试结果表明柚皮苷含量降低

挑取白化叶片，称取0.1g，冷冻干燥后研磨成极细粉末，加入1ml 80％甲醇，超声提取10min，随后4℃静置1～2h。在离心机中用18000rcf高速离心10min，取上清过有机滤膜，用液相质谱检测柚皮苷含量。结果表明1,2RHAT经过VIGS处理后，柚皮苷含量显著降低，证实了Ip1,2RHAT是柚皮苷合成的关键基因(图6：对照组及实验组叶片中柚皮苷含量)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种山桐子1，2RHAT基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的山桐子1，2RHAT基因编码的山桐子中合成柚皮苷关键酶1，2-鼠李糖基转移酶，所述1，2-鼠李糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的山桐子1，2RHAT基因、如权利要求2所述的柚皮苷合成关键酶1，2-鼠李糖基转移酶在合成山桐子柚皮苷中的应用。