CN107267461A - 一种可大量产生柚皮苷的烟草细胞、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可大量产生柚皮苷的细胞，其为表达了柑橘1,2‑RhaT酶的烟草细胞，所述1,2‑RhaT酶的序列如SEQ ID NO:1所示，还涉及所述可产生柚皮苷的细胞的制备方法及应用。上述细胞在培养过程中添加柚皮素后，可进行柚皮苷的大量生物合成。

Description

一种可大量产生柚皮苷的烟草细胞、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物合成领域，更特别地，涉及一种可大量产生柚皮苷的愈伤组织细胞、其制备方法及应用。

背景技术

柚皮苷为柑橘中主要的苦味物质，主要存在于葡萄柚、柚、酸橙、枳等的果皮、果肉和种子中，具有明显的抗炎、抗过敏、抗氧化和抗癌等功能，还能有效长期地预防心血管等疾病。在柚皮苷的生物合成途径中，1,2-鼠李糖转移酶基因(1,2-RhaT)是关键基因。

然而，并非在任何植物里面转入1,2-鼠李糖转移酶基因皆可使其产生柚皮苷。本课题组利用同源序列法从凤凰柚中克隆出一个1,2-鼠李糖转移酶基因(Cm1,2-RhaT)，将其转入山金柑，得到两棵转基因植株并开花结果，对Cm1,2-RhaT转基因山金柑果实中的类黄酮进行HPLC检测，在野生型和Cm1,2-RhaT转基因山金柑的果实中均检测不到柚皮苷(如图1所示)。

由于工业方式难以合成Cm1,2-RhaT酶的催化底物UDP-鼠李糖，因此，需要找到一种含有1,2鼠李糖转移酶的催化底物的合适的宿主细胞，将1,2-鼠李糖转移酶基因转入这样的宿主中，表达出有功能的1,2-鼠李糖转移酶，从而使其生产柚皮苷。

发明内容

BY2烟草(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)由于其不含叶绿素，颜色亮黄而得名，它由Kato等人在1972年分离得到。BY2烟草细胞悬浮体系是一种非常重要并且用途广泛的细胞系，该细胞系不仅生长迅速，一周内可增殖80-100倍，而且具有高度同一性，它能够提供大量生长状态较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

烟草悬浮细胞转化外源基因不需提取原生质体，通过和农杆菌侵染液的共培养可使外源基因的转化率稳定在50％以上；此外，悬浮培养的BY2细胞转接传代操作简单，生长周期短，可以省去植物种植的时间；除此之外，BY2烟草细胞不含叶绿素，转化外源基因的同时可在载体中加入GFP基因，可通过表达模式和细胞定位来初步验证基因的功能。这使BY2烟草细胞悬浮体系成为细胞生物学和分子生物学研究的良好材料。

发明人尝试将Cm1,2-RhaT转入BY2细胞中，出乎意料地发现，在培养基中添加柚皮素后，转基因的BY2细胞能够产生大量柚皮苷。

基于此，本发明提供了一种可大量产生柚皮苷的细胞，其为表达了柑橘1,2-RhaT酶的烟草细胞，所述1,2-RhaT酶的序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个优选实施方案中，所述烟草细胞是BY2细胞。

本发明还提供了一种制备上述可大量产生柚皮苷的细胞的方法，将编码柑橘1,2-RhaT酶的基因导入所述烟草细胞中，所述编码1,2-RhaT酶的基因的序列为SEQ ID NO:2所示序列或其同义突变体。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

S1：将所述编码1,2-RhaT酶的基因克隆到表达载体中，得到带有所述编码1,2-RhaT酶的基因的表达框的载体；

S2：将所述带有编码1,2-RhaT酶的基因的表达框的载体导入所述烟草细胞中，得到所述可产生柚皮苷的细胞。

在一个优选实施方案中，通过农杆菌来介导所述带有编码1,2-RhaT酶的基因的表达框的载体导入到所述烟草细胞中。

在一个优选实施方案中，所述表达载体为质粒pH7WG2D。

在一个优选实施方案中，所述农杆菌为农杆菌GV3101菌株。

本发明还提供了上述可产生柚皮苷的细胞在获得柚皮苷中的应用。

本发明还提供了一种获得柚皮苷的方法，包括以下步骤：

1)将所述可产生柚皮苷的细胞在加有柚皮素的培养基中培养，得到细胞培养物；

2)从步骤1)培养得到的所述细胞培养物中提取柚皮苷。

在一个优选实施方案中，步骤1)中对所述可产生柚皮苷的细胞的培养为悬浮培养。

在一个优选实施方案中，步骤1)中的培养基中所添加的柚皮素浓度为10mg/mL。

在一个实施方案中，步骤1)中培养所述可产生柚皮苷的细胞的培养基可为含有1mg/L 2,4-D的液体MS培养基(pH 5.8)。

本发明的表达了1,2-RhaT酶的烟草细胞在培养过程中添加柚皮素后，可进行柚皮苷的大量生物合成。

附图说明

图1为野生型山金柑和Cm1,2-RhaT转基因的山金柑果实的类黄酮HPLC图谱；

图2为野生型BY2愈伤和Cm1,2-RhaT转基因的BY2愈伤的荧光显微镜照片；

图3为对转化子中的Cm1,2-RhaT基因的PCR检测电泳图；

图4为野生型BY2细胞和Cm1,2-RhaT转基因的BY2细胞在加有柚皮素的培养基中悬浮培养后的类黄酮HPLC图谱，其中1号峰为柚皮素-7-O-二葡萄糖苷，2号峰为柚皮苷，3号峰为樱桃苷，4号峰为柚皮素-7-O-丙二酰葡萄糖苷；

图5为野生型BY2细胞和Cm1,2-RhaT转基因的BY2细胞在加有柚皮素的培养基中悬浮培养后的类黄酮LC-MS图谱，其中1号峰为柚皮素-7-O-二葡萄糖苷，2号峰为柚皮苷，3号峰为樱桃苷，4号峰为柚皮素-7-O-丙二酰葡萄糖苷；

图6为推测的转基因BY2细胞中柚皮素及其衍生物的代谢途径。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.超表达载体的构建

用Primer Premier 5.0软件设计扩增基因全长的引物(Fw：ATGGATACCAAGCATCAAG(SEQ ID NO:3)；Rv：TTATTCAGATTTCTTGACAAGCTG(SEQ ID NO:2))，以凤凰柚cDNA为模板，扩增出Cm1,2-RhaT基因全长。然后回收连接，转化到大肠杆菌Trans5α中，选择测序正确的菌液提取质粒。得到的质粒采用Gateway的方法构建超表达载体,所用载体为pH7WG2D。仍然选取测序正确的菌液提取质粒，转入农杆菌GV3101菌株中，对农杆菌菌液做PCR阳性检测，选取阳性的农杆菌菌液加等体积60％的甘油，保存于-80℃冰箱备用。

2.转化BY2细胞

用生长状态良好的BY2烟草愈伤进行悬浮培养，继代一次后即可达到分散均一的状态。使用继代一次后的悬浮细胞做为转化外源基因的材料。在第4天时制备好农杆菌侵染液，采用共培养的方法进行外源基因的转化，具体方法是，取5mL烟草悬浮细胞于无菌小皿，加入100μl的农杆菌侵染液，吸打搅拌均匀，在28℃条件下静置暗培48h。然后用新的MS液体培养基冲洗共培物3-4次，尽可能将农杆菌冲洗干净，然后将悬浮细胞均匀涂在含400μg/mL头孢和50μg/mL潮霉素的固体MS筛选平板上，置于28℃黑暗条件下培养，其中头孢有抑制农杆菌生长的作用，潮霉素起到筛选阳性克隆的作用。大约3-4周可长出单克隆细胞团，然后将其转移到新的含有相同抗生素的筛选平板上传代几次，即可得到较多的转基因愈伤材料，也可以把愈伤重新转移到液体MS培养基中悬浮，制得转基因悬浮细胞系。

3.转基因愈伤的阳性检测

因为实验所用载体pH7WG2D自带GFP基因，并且BY2烟草愈伤不含叶绿素(Langbecker et al 2004)，使用GFP时能避免自发荧光的干扰，因此在体视显微镜下观察转基因愈伤并和野生型做对比，结果如图2所示，在紫外光条件下，转基因愈伤可激发GFP荧光，而野生型愈伤不激发任何荧光，因此，通过体视显微镜的观察可初步筛选阳性愈伤。此外，提取转Cm1,2-RhaT基因愈伤的DNA，用PCR的方法验证转基因愈伤的阳性，结果如图3所示，野生型BY2烟草愈伤组织细胞中无Cm1,2-RhaT基因，而在转入Cm1,2-RhaT基因的烟草愈伤组织细胞中，只要是通过抗生素筛选出来的愈伤团，几乎都呈阳性，说明转化BY2烟草悬浮细胞的阳性率较高。

4.柚皮苷的检测

分别悬浮野生型和Cm1,2-RhaT转基因型愈伤，继代时准确称取鲜重为1g的愈伤组织细胞于50mL三角瓶，加入20mL培养基悬浮培养，尽量保证每瓶初始愈伤组织细胞量一致。在对数增长期(第4天)加入50μl柚皮素(柚皮素浓度为10mg/mL，配制方法为将粉末状的底物溶于二甲亚砜，配制终浓度为10mg/mL)，继续悬浮培养两天后冻干样品，用HPLC检测类黄酮，并用LC-MS对所检测出的化合物进行定性。如图4所示，野生型烟草愈伤组织细胞本身没有类黄酮代谢物，这为底物添加实验提供了良好的研究基础；在野生型和Cm1,2-RhaT转基因悬浮愈伤组织细胞中分别添加柚皮素之后，均生成了大量产物，为了对产物进行准确定性，进行了LC-MS检测，结果如图4所示，通过质荷比、保留时间及二级离子碎片确定1号峰为柚皮素-7-O-二葡萄糖苷(m/z:597.18,RT:9.207min,msms:597.18,435.13,273.07)；2号峰为柚皮苷(m/z:581.18,RT:9.856min,msms:581.18,419.13,273.07)；3号峰为樱桃苷(m/z:435.13,RT:10.016min,msms:435.13,273.07)；4号峰为柚皮素-7-O-丙二酰葡萄糖苷(m/z:521.13,RT:10.916min,msms:521.13,273.07)。在野生型悬浮细胞中添加柚皮素后形成了樱桃苷、柚皮素-7-O-二葡萄糖苷和柚皮素-7-O-丙二酰葡萄糖苷，说明野生型烟草本身含有有活性的7-O-葡萄糖苷转移酶(7-GlcT)和7-O-二葡萄糖苷转移酶(7-dGlcT)及酰基转移酶(AcyT)。在Cm1,2RhaT转基因悬浮细胞中添加柚皮素之后，樱桃苷转化成柚皮苷，并且酰基化的柚皮素含量也明显降低，由此可见，在BY2烟草悬浮细胞中超表达Cm1,2RhaT基因后，使代谢流量更多转向柚皮苷的合成。

根据对Cm1,2-RhaT基因的功能验证(图5)可知，在野生型BY2烟草愈伤组织细胞中有7-GlcT、7-dGlcT和AcyT酶，因此，在Cm1,2-RhaT转基因烟草悬浮体系中，添加柚皮素后的代谢途径如图6所示，在Cm1,2RhaT转基因悬浮细胞中添加柚皮素之后，柚皮素首先在7-GlcT酶的作用下形成樱桃苷，接着在7-dGlcT酶、1,2RhaT酶和AcyT酶的催化下分别生成柚皮素-7-O-二葡萄糖苷、柚皮苷和柚皮素-7-O-丙二酰葡萄糖苷。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种可大量生产柚皮苷的细胞、其制备方法及应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 凤凰柚

<400> 1

Met Asp Thr Lys His Gln Asp Lys Pro Ser Ile Leu Met Leu Pro Trp

1 5 10 15

Leu Ala His Gly His Ile Ala Pro His Leu Glu Leu Ala Lys Lys Leu

20 25 30

Ser Gln Lys Asn Phe His Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Asn Asn Leu

35 40 45

Gln Ser Phe Gly Arg Asn Val Glu Lys Asn Phe Ser Ser Ser Ile Gln

50 55 60

Leu Ile Glu Leu Gln Leu Pro Asn Thr Phe Pro Glu Leu Pro Ser Gln

65 70 75 80

Asn Gln Thr Thr Lys Asn Leu Pro Pro His Leu Ile Tyr Thr Leu Val

85 90 95

Gly Ala Phe Glu Asp Ala Lys Pro Ala Phe Cys Asn Ile Leu Glu Thr

100 105 110

Leu Lys Pro Thr Leu Val Met Tyr Asp Leu Phe Gln Pro Trp Ala Ala

115 120 125

Glu Ala Ala Tyr Gln Tyr Asp Ile Ala Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu

130 135 140

Ser Ala Val Ala Cys Ser Phe Leu Leu His Asn Ile Val Asn Pro Asn

145 150 155 160

Leu Lys Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Asp Tyr Gln Asp Arg Glu Ser Lys

165 170 175

Asn Ile Asn Tyr Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gly Thr Leu Asn Lys

180 185 190

Asp Arg Phe Leu Lys Ala Phe Glu Leu Ser Cys Lys Phe Val Phe Ile

195 200 205

Lys Thr Ser Arg Glu Ile Glu Ser Lys Tyr Leu Asp Tyr Phe Pro Ser

210 215 220

Leu Met Gly Asn Glu Ile Ile Pro Val Gly Pro Leu Ile Gln Glu Pro

225 230 235 240

Thr Phe Lys Glu Asp Asp Thr Lys Ile Met Asp Trp Leu Ser Gln Lys

245 250 255

Glu Pro Arg Ser Val Val Tyr Ala Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Pro

260 265 270

Ser Lys Asp Glu Ile His Glu Ile Ala Ser Gly Leu Leu Leu Ser Glu

275 280 285

Val Asn Phe Ile Trp Ala Phe Arg Leu His Pro Asp Glu Lys Met Thr

290 295 300

Ile Glu Glu Ala Leu Pro Gln Gly Phe Ala Glu Glu Ile Glu Arg Asn

305 310 315 320

Asn Lys Gly Met Ile Val Gln Gly Trp Val Pro Gln Ala Lys Ile Leu

325 330 335

Arg His Gly Ser Ile Gly Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp Gly Ser

340 345 350

Val Val Glu Gly Met Val Phe Gly Val Pro Ile Ile Gly Val Pro Met

355 360 365

Ala Tyr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Lys Val Val Val Asp Asn Gly Met

370 375 380

Gly Met Val Val Pro Arg Asp Lys Ile Asn Gln Arg Leu Gly Gly Glu

385 390 395 400

Glu Val Ala Arg Val Ile Lys His Val Val Leu Gln Glu Glu Ala Lys

405 410 415

Gln Ile Arg Arg Lys Ala Asn Glu Ile Ser Glu Ser Met Lys Lys Ile

420 425 430

Gly Asp Ala Glu Met Ser Val Val Val Glu Lys Leu Leu Gln Leu Val

435 440 445

Lys Lys Ser Glu

450

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> 凤凰柚

<400> 2

atggatacca agcatcaaga taagccaagc attctcatgt taccatggct agctcatggg 60

cacatagctc cacaccttga acttgccaag aagctttcac agaaaaactt ccacatatat 120

ttctgctcta ctcccaacaa tctacaatcc ttcggcagaa atgttgaaaa aaacttctca 180

tcttcaatac aactcataga actgcaactt cccaatacat tccctgaact tccttcacaa 240

aatcagacca caaaaaacct tcctccccat cttatttata ctctcgtggg agcatttgaa 300

gatgcaaaac ctgctttttg caacatcttg gagacgctta aaccaaccct tgttatgtat 360

gatttgttcc aaccatgggc agcagaggca gcttaccagt atgacatagc tgctattttg 420

ttcttaccct tatctgcagt agcctgctct ttcttgctgc acaatatcgt aaatcccaac 480

ctgaaatacc ctttctttga atctgattac caagatagag aaagcaagaa catcaattac 540

ttcctgcatc ttactgccaa tggcacctta aacaaagaca ggttcttaaa agctttcgaa 600

ctatcttgca aatttgtgtt catcaaaaca tcaagagaga ttgaatccaa gtacttggat 660

tattttcctt ctttaatggg aaatgaaata attccagtag ggcctctaat ccaagaacct 720

accttcaagg aagatgatac aaagatcatg gactggctga gccaaaagga gcctcgttca 780

gtcgtgtatg catcctttgg cagtgagtac tttccttcca aggatgaaat acatgagata 840

gctagtgggt tattgctcag cgaggttaat tttatatggg ctttcagatt acatcctgat 900

gaaaaaatga ctatcgagga ggcactgcct cagggctttg ctgaggagat tgaaaggaat 960

aataagggaa tgatagtaca aggttgggtt ccgcaggcta aaattttaag gcatggaagc 1020

atcggcggat ttttgagtca ttgtggttgg ggctcggtgg ttgaggggat ggttttcggg 1080

gtaccaatca taggtgtgcc aatggcatat gagcagccaa gcaatgccaa ggtggtggtt 1140

gacaatggta tgggcatggt cgttccaaga gataagatca atcaaagact tggaggagag 1200

gaggtggcga gggtcattaa acatgttgtg ctgcaagaag aagcgaagca aataagaaga 1260

aaagctaatg aaattagtga gagtatgaag aagatagggg acgcagagat gagtgtggtg 1320

gtggagaagc tgctgcagct tgtcaagaaa tctgaataa 1359

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggatacca agcatcaag 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttattcagat ttcttgacaa gctg 24

Claims (10)

1.一种可产生柚皮苷的细胞，其特征在于，为表达了1,2-RhaT酶的烟草愈伤组织细胞，所述1,2-RhaT酶的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的可产生柚皮苷的细胞，其特征在于，所述烟草细胞是BY2细胞。

3.根据权利要求1或2所述的可产生柚皮苷的细胞，其特征在于，所述细胞为愈伤组织细胞。

4.一种制备权利要求1或2所述的可产生柚皮苷的细胞的方法，其特征在于，将编码1,2-RhaT酶的基因导入所述烟草细胞中，所述编码1,2-RhaT酶的基因的序列为SEQ ID NO:2所示序列或其同义突变体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将所述编码柑橘1,2-RhaT酶的基因克隆到表达载体中，得到带有所述编码1,2-RhaT酶的基因的表达框的载体；

S2：将所述带有编码柑橘1,2-RhaT酶的基因的表达框的载体导入所述烟草细胞中，得到所述可产生柚皮苷的细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，通过农杆菌来介导所述带有编码柑橘1,2-RhaT酶的基因的表达框的载体导入到所述烟草细胞中。

7.权利要求1或2所述的可产生柚皮苷的细胞在获得柚皮苷中的应用。

8.一种获得柚皮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1或2所述的可产生柚皮苷的细胞在加有柚皮素的培养基中培养，得到细胞培养物；

2)从步骤1)培养得到的所述细胞培养物中提取柚皮苷。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)中对所述可产生柚皮苷的细胞的培养为悬浮培养。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养基中所添加的柚皮素浓度为柚皮素浓度为10mg/mL。