CN106256907A - 梨PuADH1基因、分离克隆及表达分析的方法、亚细胞定位方法及其应用 - Google Patents

梨PuADH1基因、分离克隆及表达分析的方法、亚细胞定位方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种梨PuADH1基因、分离克隆及表达分析的方法、亚细胞定位方法及其在提高果实香气中的应用，梨PuADH1基因，来自于梨树品种‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员，从香气浓郁的‘南果梨’果实中获得了与香气合成相关的基因，证明其可能参与番茄果实香气合成，从而扩展了果实香气合成的分子调控途径，另外，克隆香气浓郁的梨品种中有关香气合成的基因可能在很大程度上提高果实香气品质，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

Description

梨PuADH1基因、分离克隆及表达分析的方法、亚细胞定位方法 及其应用
一、技术领域
本发明涉及一种梨PuADH1基因及其在提高果实香气中的应用，尤其是一种涉及从‘南果梨’中分离、克隆得到一个果实香气相关的乙醇脱氢酶（ADH）家族成员PuADH1基因及其应用。
二、背景技术
香气是重要的果实品质指标之一。果实浓郁的香气能引导人们的消费趋向，随着人们生活水平的提高和对果品需求层次的提升，果实香气品质研究也越来越受到重视（Muna et al., 2013）。
梨是一种重要的世界性水果，世界梨栽培品种可分为东方梨（主要包括砂梨、白梨、秋子梨）和西洋梨两大类。中国是东方梨的生产中心，在世界梨产业中占有十分重要的地位，而我国主栽的白梨、砂梨系统品种绝大多数香味较淡，在很大程度上影响了其品质的全面提升，香气淡已成为阻碍我国鲜梨进入国际市场的重要原因。‘南果梨’果实香气十分浓郁，为梨果实香气育种和研究提供了宝贵试材。
研究人员已从梨果实中检测到醛类、醇类、酯类、萜类、烃类及含硫化合物等300余种挥发性物质（Rapparini F et al., 2010）。目前，人们对果实挥发性香气物质的合成路径已经基本明确，即营养物质（如脂肪酸、氨基酸、糖）在生物酶催化下衍生而成（Muna et al., 2013）。根据参与生物合成反应的前体物质不同，合成途径可分为脂肪酸途径、氨基酸途径和萜类途径等（陈发兴等，2010）。脂肪酸途径是包括梨在内的大多数植物香气物质形成的主要来源（Rodríguez et al., 2013；Qin et al., 2014）。脂肪酸途径包括α-氧化、β-氧化、γ-氧化和脂氧合酶（LOX）途径，可合成大多数的酯类、短链醛和醇类化合物。
果实香气物质合成的关键酶包括：醇酰基转移酶（AAT）、脂氧合酶（LOX）、乙醇脱氢酶（ADH）、丙酮酸脱羧酶（PDC）等。
乙醇脱氢酶（ADH）是果实醇类挥发性化合物形成的关键酶，催化相应醇和醛之间的可逆转化。1982年研究人员（Gerlach et al., 1982）首次从玉米幼根中克隆到一个ADH基因，命名为ADH1基因，目前ADH基因己经从多种果树中克隆得到。王绍华（2010）从成熟香蕉果实中克隆到2个ADH基因MaADH1和MaADH2，MaADH2含有典型的ADH基因结构域，可能在香蕉生长发育中起作用。ADH基因的表达受多种因素调控，ADH基因以动态调控的方式参与果实香气合成，如番茄ADH2基因的过表达通过增加醇（尤其是3Z-己烯醇）的含量，提高果实香气（Speirs et al., 1998）。Tesnière等（2000）从生长发育期葡萄果实中克隆到3个ADH基因VvADH1、VvADH2、VvADH3，Northern杂交表明VvADH2基因在葡萄浆果转熟期时表达量开始显著上升，且ADH活性随之上升，1-MCP处理表明VvADH2的表达和ADH的活性可能受乙烯调控。
对于果实香气合成代谢机理的研究，将有助于提高其香气品质，更关系到梨果实综合品质的提高，提升我国梨产业竞争力，具有重要的科学意义和应用价值。。
基于现有的技术问题、技术特征和技术效果，做出本发明的申请技术方案。
三、发明内容
本发明的客体是一种梨PuADH1基因：
本发明的客体是一种梨PuADH1基因的在提高果实香气中的应用：本发明的客体是一种梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法：
本发明的客体是一种梨PuADH1基因亚细胞定位方法。
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种梨PuADH1基因及其在提高果实香气中的应用，因此从香气浓郁的‘南果梨’果实中获得了与香气合成相关的基因，证明其可能参与番茄果实香气合成，从而扩展了果实香气合成的分子调控途径，另外，克隆梨中有关香气合成的基因很大程度上提高果实香气品质，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：梨PuADH1基因，来自于果树梨‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员。
本发明的优选技术方案，属于ADH家族成员， cDNA开放阅读框（ORF）1683bp，编码561个氨基酸；经Blast分析，Aldehyde dehydrogenase family 3 member I1蛋白属于ALDH-SFsuperfamily 家族，其与苹果ADH氨基酸同源性较高；编码氨基酸理论分子量为137.826kDa，理论等电点为4.99，原子组成为C5088H8495N1683O2129S328，总原子数为17723；该蛋白由4种氨基酸组成，总平均疏水性为0.745，脂质指数为 29.95，说明该蛋白是亲水性蛋白；其不稳定系数为40.74，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。
本发明的优选技术方案，含有所述PuADH1基因的宿主菌。
本发明的优选技术方案，克隆所述PuADH1基因cDNA序列的引物对，
F：5′- CCCCCGGGATGAAAGGCCTCTGCATTGA-3′；
R：5′-CGGGATCCTCATTTAGACCATCCAATCAG-3′。
本发明的优选技术方案，对所述PuADH1基因的进一步研究表明，该基因在促进番茄果实香气合成中的应用。
本发明的优选技术方案，含有所述PuADH1基因的重组表达载体。
本发明的优选技术方案，重组表达载体优选以pRI101为出发载体，用T4连接酶将目的基因定向连接到pRI101载体Xma I 和BamH I位点上，构建重组表达载体PRI101-PuADH1。
本发明的优选技术方案，所述的重组表达载体在促进番茄果实香气中的应用。
本发明的优选技术方案，一种梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法，其步骤为：
从‘南果梨’果实中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PuADH1基因全长，
RNA抽提使用Trizol试剂盒，抽提1μg总RNA样品经1U Dnase，第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒，扩增基因引物对为：
PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；
PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’；
用RT-PCR方法扩增‘南果梨’PuADH1基因编码的序列全长，25 µl反应体系包括：200 ngcDNA，1×缓冲液即ransStart FastPfu Buffer，l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶即TransStart FastPfu DNA Polymerase，1.0 µM上述引物，
反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min。产生一条特异条带产物，经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收纯化的DNA溶液与pMD-19T载体进行连接、转化及鉴定，具体方法参照按照分子克隆实验手册进行。
本发明的优选技术方案，一种梨PuADH1基因亚细胞定位方法，其步骤：
用大肠杆菌菌株为E.coli March（Invitrogen），农杆菌菌株为GV3101，用于转化拟南芥，入门载体为pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen），目标载体为GW-GFP，
2.1表达载体转化农杆菌
(1)从-80 ℃取出 GV3101 感受态细胞（200 µL），冰上解冻，立即加1-5 µL 质粒DNA，
(2)冰上放置5 min，
(3)液氮中冷冻 5 min，
(4)37℃水浴5 min，
(5)加入无抗生素的 YEP 液体培养基 1 mL，28 ℃摇床培养 2 h，
(6)4000 rpm，室温下离心5 min，收集菌体，用100 µLYEP 溶液重新悬浮菌体，
(7)将菌液均匀涂布于YEP固体选择培养基上，28 ℃静置培养 2-3 d，
(8)长出菌落后，挑取单菌落划线于含抗生素的YEP 固体平板上，48 h后进行菌落 PCR鉴定，
2.2拟南芥叶肉原生质体的制备及转化
按照拟南芥叶肉原生质体的制备方法和PEG 介导的转化过程的方法，转化后培养16 h的原生质体用激光共聚焦扫描隧道显微镜进行观察，原生质体的制备过程如下：
(1)取温室环境中健康生长的、大小合适的拟南芥叶子，用胶带撕掉叶子的下表皮，暴露叶肉细胞，将叶肉细胞朝向酶解液放于培养皿中，
酶解液的配方如下：
Cellulase R10 1 %
Macerozyme R10 0.25 %
甘露醇 0.4 M
CaCl2 100 mM
KCl 20 mM
BSA 0.1 %
MES 20 mM
用 1 M的KOH调 PH至 5.7，酶解液需要现配现用，
(2)培养皿放于摇床上，光下40 rpm降解2 h左右，镜检可见大量的原生质体即可，
(3)收集原生质体，100 g 离心 3 分钟，弃上层液体，
(4)冰预冷的 W5 solution 漂洗原生质体2次，100 g 离心3 min，弃上清，
W5 solution 的配方如下：
NaCl 154 mM
CaCl2 125 mM
KCl 5 mM
葡萄糖 5 mM
MES 2 mM
用 1 M 的KOH调 PH 至 5.7，4 ℃冰箱中，可以保存一周，
(5)将原生质体悬浮于W5 solution 中，置于冰上冷却 30 min，此时可进行原生质体密度计数，
(6)100 g 离心 3 min，收集原生质体，重悬于 Mmg solution 中，保证原生质体的终浓度为 2-5×105细胞/m L，
Mmg solution 的配方如下：
甘露醇 0.4 M
Mg Cl2 15 mM
MES 4 mM
用 1 M 的KOH调 PH 至 5.7，保存于 4 ℃冰箱中备用，
原生质体的转化过程如下：
（1）室温下，取 200 L Mmg solution，其中包含大约 105个原生质体，加入 30 g 需要转化的质粒，
（2）加等体积现配的 PEG solution，混合好的液体室温放置 5 min，PEG solution 的配方如下：
PEG 4000 40 % (w/v)
Ca Cl2 0.1 M
甘露醇 0.2 M
（3）5 min后缓慢加入 1 mL W5 solution，轻缓混合，
（4）100 g 离心 1 min，用 W5 solution 洗 2 次，最后用 200 L 左右的 W5solution重悬，铺于用 1 %的 BSA 润洗过的12 孔板中，
（5）在全光照条件下，培养 16 h，即可观察，
2.3激光共聚焦扫描隧道显微镜观察及图像处理
荧光双标记材料观察所用的显微镜为LSM780（Zeiss），其余材料均使用 TCS SP5（Leica）显微镜进行观察。荧光双标记观察的光路为双通道，GFP 激发光波长为 505 nm，接受光波长范围为 505-550 nm，RFP 激发光波长为 545 nm，接受光波长范围为575-650 nm。得到的图片进行 Pearson coefficients 分析，以确定荧光蛋白的共定位情况，
2.4亚细胞定位检测
将带有GFP标记融合蛋白转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦扫描隧道显微镜观察蛋白的定位情况。通过荧光定位的观察分析，说明基因定位情况，
为了确定PuADH1基因编码蛋白在细胞中发挥功能的具体位置，构建了基因与绿色荧光蛋白（GFP）的融合表达载体，利用农杆菌介导将带有GFP标记的融合蛋白转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦扫描隧道显微镜观察蛋白的定位情况。
在本技术方案中，PuADH1基因为重要技术特征，在梨PuADH1基因及其在提高果实香气中的应用的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的专利文献进行解释和理解。
四、附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的PuADH1基因的cDNA全长及编码的氨基酸：
图2为PuADH1基因在‘南果梨’果实成熟后熟过程中的表达：
图3 为拟南芥原生质体介导的PuADH1基因亚细胞定位：
BF:明场; GFP:绿色荧光蛋白
图4 为PuADH1基因在番茄中的遗传转化体系：
图5 为转基因番茄植株DNA的提取和PCR检测：
图6为野生型番茄和转基因番茄形态表型。
五、具体实施方式
根据审查指南，对本发明所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语应当理解为不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。其步骤是：
PuADH1基因分离克隆及表达分析
从‘南果梨’果实中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PuADH1基因全长。
RNA抽提使用Trizol试剂盒，抽提1μg总RNA样品经1U DNase。第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒，扩增基因引物对为：
PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；
PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’；
用RT-PCR方法扩增‘南果梨’PuADH1基因编码的序列全长。25 µl反应体系包括：200 ngcDNA，1×缓冲液（ransStart FastPfu Buffer），l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶（TransStartFastPfu DNA Polymerase）（前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司），1.0 µM上述引物。反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min。产生一条特异条带产物，经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收纯化的DNA溶液与pMD-19T载体（TaKaRa公司）进行连接、转化及鉴定，具体方法参照按照分子克隆实验手册进行，
测序结果表明，克隆的PuADH1基因全长为1683 bp，其核苷酸序列如图1所示，BLAST的结果分析证明从梨中新得到的基因为一个ADH基因家族成员，申请人将这个基因命名为PuADH1。
为分析PuADH1基因在果实香气合成过程是否有所响应，采用实时定量PCR分析该基因在‘南果梨’果实成熟后熟过程的表达模式。结果表明，该基因在梨果实成熟后熟过程中高度表达如图2。
在本实施例中，Trizol试剂盒购自TakaRa，1U DNase 购自Thermo公司。PuADH1基因亚细胞定位
本实验用大肠杆菌菌株为E.coli March（Invitrogen），农杆菌菌株为GV3101，用于转化拟南芥。入门载体为pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen）。目标载体为GW-GFP。
2.1表达载体转化农杆菌
(1)从-80 ℃取出 GV3101 感受态细胞（200 µL），冰上解冻，立即加1-5 µL 质粒DNA。
(2)冰上放置5 min。
(3)液氮中冷冻 5 min。
(4)37℃水浴5 min。
(5)加入无抗生素的 YEP 液体培养基 1 mL，28 ℃摇床培养 2 h。
(6)4000 rpm，室温下离心5 min，收集菌体，用100 µLYEP 溶液重新悬浮菌体。
(7)将菌液均匀涂布于YEP固体选择培养基上，28 ℃静置培养 2-3 d。
(8)长出菌落后，挑取单菌落划线于含抗生素的YEP 固体平板上，48 h后进行菌落PCR 鉴定
2.2拟南芥叶肉原生质体的制备及转化
拟南芥叶肉原生质体的制备参照（Wu et al., 2009）的方法，PEG 介导的转化过程参照（Yoo et al., 2007）的方法。转化后培养16 h的原生质体用激光共聚焦扫描隧道显微镜进行观察。原生质体的制备过程如下：
(1)取温室环境中健康生长的、大小合适的拟南芥叶子，用胶带撕掉叶子的下表皮，暴露叶肉细胞，将叶肉细胞朝向酶解液放于培养皿中。
酶解液的配方如下：
Cellulase R10 1 %
Macerozyme R10 0.25 %
甘露醇 0.4 M
CaCl2 100 mM
KCl 20 mM
BSA 0.1 %
MES 20 mM
用 1 M的KOH调 PH至 5.7，酶解液需要现配现用。
(2)培养皿放于摇床上，光下40 rpm降解2 h左右，镜检可见大量的原生质体即可。
(3)收集原生质体，100 g 离心 3 分钟，弃上层液体。
(4)冰预冷的 W5 solution 漂洗原生质体2次，100 g 离心3 min，弃上清。
W5 solution 的配方如下：
NaCl 154 mM
CaCl2 125 mM
KCl 5 mM
葡萄糖 5 mM
MES 2 mM
用 1 M 的KOH调 PH 至 5.7，4 ℃冰箱中，可以保存一周。
(5)将原生质体悬浮于W5 solution 中，置于冰上冷却 30 min，此时可进行原生质体密度计数。
(6)100 g 离心 3 min，收集原生质体，重悬于 Mmg solution 中，保证原生质体的终浓度为 2-5×105细胞/m L。
Mmg solution 的配方如下：
甘露醇 0.4 M
Mg Cl2 15 mM
MES 4 mM
用 1 M 的KOH调 PH 至 5.7，保存于 4 ℃冰箱中备用。
原生质体的转化过程如下：
（1）室温下，取 200 L Mmg solution，其中包含大约 105个原生质体。加入 30 g 需要转化的质粒。
（2）加等体积现配的 PEG solution，混合好的液体室温放置 5 min。PEGsolution 的配方如下：
PEG 4000 40 % (w/v)
Ca Cl2 0.1 M
甘露醇 0.2 M
（3）5 min后缓慢加入 1 mL W5 solution，轻缓混合。
（4）100 g 离心 1 min，用 W5 solution 洗 2 次，最后用 200 L 左右的 W5solution重悬，铺于用 1 %的 BSA 润洗过的12 孔板中。
（5）在全光照条件下，培养 16 h，即可观察。
2.3激光共聚焦扫描隧道显微镜观察及图像处理
荧光双标记材料观察所用的显微镜为LSM780（Zeiss），其余材料均使用 TCS SP5（Leica）显微镜进行观察。荧光双标记观察的光路为双通道，GFP 激发光波长为 505 nm，接受光波长范围为 505-550 nm，RFP 激发光波长为545 nm，接受光波长范围为575-650 nm。得到的图片进行 Pearson coefficients 分析，以确定荧光蛋白的共定位情况（French et al., 2008）。
2.4亚细胞定位检测
将带有GFP标记融合蛋白转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦扫描隧道显微镜观察蛋白的定位情况。通过荧光定位的观察分析，说明基因定位情况。
为了确定PuADH1基因编码蛋白在细胞中发挥功能的具体位置，构建了基因与绿色荧光蛋白（GFP）的融合表达载体，利用农杆菌介导将带有GFP标记的融合蛋白转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦扫描隧道显微镜观察蛋白的定位情况。结果表明，PuADH1基因定位在细胞质中如图3。
在本实施例中，原生质体制备及转化的无机药品均购自Sigma 公司，CellulaseR10 和Macreozyme R10 均购于Yakult Pharmaceutical 公司。
植物转化超表达载体的构建
以‘南果梨’总RNA反转录cDNA为模板，克隆PuADH1基因的ORF全长。双酶切连接植物过表达载体pRI101。以烟草花叶病毒强启动子35S启动该基因的过量表达。将构建好的载体转入农杆菌LBA4404，保存备用。
番茄的遗传转化及转化植株分子鉴定
根癌农杆菌介导的番茄遗传转化具体步骤：
4.1 番茄播种
取饱满无病的番茄种子（micro-TOM），用75 %乙醇消毒2 min，用无菌水冲洗2遍。4 %次氯酸钠消毒15 min（置于摇床上震荡，转速为180rpm），无菌水冲洗3-4遍，用尖头镊子在组培瓶中的MS培养基上进行播种。在暗处生长4-5 d，待发芽后，转移到光下培养2-3天即可切子叶。将番茄子叶切成1 cm左右的小段，正面朝上平铺在平板（直径9 cm）MS培养基上，加玉米素和IAA（玉米素终浓度为5 mg/L，IAA 浓度为0.2 mg/L），转移至暗处进行培养。
4.2活化农杆菌
取5微升保存的农杆菌菌液，转移到20 ml LB液体培养基中，加卡那霉素50 mg/L、利福平50 mg/L。摇床上（28 ℃，200 rpm）培养2 d。取1 ml菌液加到20 ml 液体LB（含卡那霉素、利福平和乙酰丁香酮）中，摇菌约5-6 h（一般6 h左右菌液呈现金黄色即可）。
4.3转化侵染
20 ml液体MS中加1 ml活化的农杆菌菌液（若菌液比较清可加2 ml）。将切好的子叶加入侵染液，侵染不超过15 min。用灭菌滤纸吸干菌液，转到共培养MS培养基上（玉米素终浓度为2 mg/L，IAA 浓度为0.5 mg/L）暗培养2 d。转到分化培养基（玉米素终浓度为5 mg/L，IAA浓度为 0.2 mg/L，CB浓度为100 mg/L，卡那浓度为50 mg/L）上，光暗交替下培养（25℃，光10 h，暗14 h）。
4.4转基因植株的获得
培养的番茄子叶上分化出茎尖生长点后，将生长点切下，转移到组培瓶中继续培养。生长点生长至3 cm时，转移到生根培养基中（MS，IAA 0.1 mg/L，CB 250 mg/L）促其生根。待其生根并长至瓶口高度时，转移到育苗基质中炼苗。炼苗完成后，取样提取DNA，通过PCR验证转基因如图4和图5。
转基因植株的表型观察及香气测定
5.1转基因植株表型观察
比较了超表达‘南果梨’果实PuADH1基因的番茄植株、果实和野生型番茄植株、果实的形态表型差异，结果表明，过表达PuADH1基因番茄植株和果实形态表型较对照没有明显的改变，结果如图6所示。
5.2 转基因番茄叶片和果实香气成分的测定
番茄果实和叶片香气成分测定按照Tieman的方法。将番茄果实切成0.5 cm×0.5 cm的小块，称取100 g左右装入玻璃管。称取50g左右番茄叶片，整片塞入玻璃管，并避免机械伤。用带孔橡胶塞密封玻璃管，Super Q柱吸附1 h左右。吸附结束后往Super Q柱上添加5 µL的3-壬酮作为内标，用150 µL二氯甲烷洗脱Super Q柱。样品用于GC-MS检测，GC-MS运行和检测按照Schmelz的方法。
表1 转基因番茄叶片和果实挥发性物质变化（μg/g）
表1结果表明，超表达PuADH1基因使番茄叶片和果实挥发性香气物质发生了显著变化。转PuADH1基因番茄叶片香气物质总量较对照增加了53.27 %，其中醇类、酯类、烯烃类分别较对照提高了85.41%、60.44 %、55.18 %。转PuADH1基因番茄果实香气总量较对照提高了103.84 %，其中醇类增加最为显著，增加了332.32 %，醛类增加了104.87 %，酯类增加了61.26 %，烯烃类增加了45.39 %。
梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法和PuADH1基因亚细胞定位方法都是以南果梨’果实为基础，在梨PuADH1基因应用上具有重要的作用。
上述实施例只是本发明所提供的梨PuADH1基因及其在提高果实香气中的应用的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。
PuADH1基因的cDNA全长及编码的氨基酸
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Claims (10)

1.一种梨PuADH1基因，其特征是：梨PuADH1基因，来自于梨树品种‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员。
2.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是： 属于ADH家族成员， cDNA开放阅读框（ORF）1683bp，编码561个氨基酸；经Blast分析，Aldehyde dehydrogenase family 3member I1蛋白属于ALDH-SFsuperfamily 家族，其与苹果ADH氨基酸同源性较高；编码氨基酸理论分子量为137.826kDa，理论等电点为4.99，原子组成为C5088H8495N1683O2129S328，总原子数为17723；该蛋白由4种氨基酸组成，总平均疏水性为0.745，脂质指数为 29.95，说明该蛋白是亲水性蛋白；其不稳定系数为40.74，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。
3.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是：含有所述PuADH1基因的宿主菌。
4.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是：克隆所述PuADH1基因cDNA序列的引物对，
F：5′- CCCCCGGGATGAAAGGCCTCTGCATTGA-3′；
R：5′-CGGGATCCTCATTTAGACCATCCAATCAG-3′。
5.一种梨PuADH1基因的在提高果实香气中的应用，对所述PuADH1基因的进一步研究表明，该基因在促进番茄果实香气合成中的应用。
6.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是：含有所述PuADH1基因的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的梨PuADH1基因，其特征是：重组表达载体优选以pRI101为出发载体，用T4连接酶将目的基因定向连接到pRI101载体Xma I 和BamH I位点上，构建重组表达载体PRI101-PuADH1。
8.一种梨PuADH1基因的在提高果实香气中的应用，所述的重组表达载体在促进番茄果实香气中的应用。
9.一种梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法，其特征是：其步骤：从‘南果梨’果实中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PuADH1基因全长，
RNA抽提使用Trizol试剂盒，抽提1μg总RNA样品经1U Dnase，第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒，扩增基因引物对为：
PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；
PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’ ；
用RT-PCR方法扩增‘南果梨’PuADH1基因编码的序列全长，25 µl反应体系包括：200 ngcDNA，1×缓冲液即ransStart FastPfu Buffer，l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶即TransStart FastPfu DNA Polymerase，1.0 µM上述引物，
反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min,
产生一条特异条带产物，经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收纯化的DNA溶液与pMD-19T载体进行连接、转化及鉴定，具体方法参照按照分子克隆实验手册进行。
10.一种梨PuADH1基因亚细胞定位方法，其步骤：
用大肠杆菌菌株为E.coli March（Invitrogen），农杆菌菌株为GV3101，用于转化拟南芥，入门载体为pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen），目标载体为GW-GFP，
2.1表达载体转化农杆菌
(1)从-80 ℃取出 GV3101 感受态细胞（200 µL），冰上解冻，立即加1-5 µL 质粒DNA，
(2)冰上放置5 min，
(3)液氮中冷冻 5 min，
(4)37℃水浴5 min，
(5)加入无抗生素的 YEP 液体培养基 1 mL，28 ℃摇床培养 2 h，
(6)4000 rpm，室温下离心5 min，收集菌体，用100 µLYEP 溶液重新悬浮菌体，
(7)将菌液均匀涂布于YEP固体选择培养基上，28 ℃静置培养 2-3 d，
(8)长出菌落后，挑取单菌落划线于含抗生素的YEP 固体平板上，48 h后进行菌落 PCR鉴定，
2.2拟南芥叶肉原生质体的制备及转化
按照拟南芥叶肉原生质体的制备方法和PEG 介导的转化过程的方法，转化后培养16 h的原生质体用激光共聚焦扫描隧道显微镜进行观察，原生质体的制备过程如下：
(1)取温室环境中健康生长的、大小合适的拟南芥叶子，用胶带撕掉叶子的下表皮，暴露叶肉细胞，将叶肉细胞朝向酶解液放于培养皿中，
酶解液的配方如下：
Cellulase R10 1 %
Macerozyme R10 0.25 %
甘露醇 0.4 M
CaCl2 100 mM
KCl 20 mM
BSA 0.1 %
MES 20 mM
用 1 M的KOH调 PH至 5.7，酶解液需要现配现用，
(2)培养皿放于摇床上，光下40 rpm降解2 h左右，镜检可见大量的原生质体即可，
(3)收集原生质体，100 g 离心 3 分钟，弃上层液体，
(4)冰预冷的 W5 solution 漂洗原生质体2次，100 g 离心3 min，弃上清，
W5 solution 的配方如下：
NaCl 154 mM
CaCl2 125 mM
KCl 5 mM
葡萄糖 5 mM
MES 2 mM
用 1 M 的KOH调 PH 至 5.7，4 ℃冰箱中，可以保存一周，
(5)将原生质体悬浮于W5 solution 中，置于冰上冷却 30 min，此时可进行原生质体密度计数，
(6)100 g 离心 3 min，收集原生质体，重悬于 Mmg solution 中，保证原生质体的终浓度为 2-5×105细胞/m L，
Mmg solution 的配方如下：
甘露醇 0.4 M
Mg Cl2 15 mM
MES 4 mM
用 1 M 的KOH调 PH 至 5.7，保存于 4 ℃冰箱中备用，
原生质体的转化过程如下：
（1）室温下，取 200 L Mmg solution，其中包含大约 105个原生质体，加入 30 g 需要转化的质粒，
（2）加等体积现配的 PEG solution，混合好的液体室温放置 5 min，PEG solution 的配方如下：
PEG 4000 40 % (w/v)
Ca Cl2 0.1 M
甘露醇 0.2 M
（3）5 min后缓慢加入 1 mL W5 solution，轻缓混合，
（4）100 g 离心 1 min，用 W5 solution 洗 2 次，最后用 200 L 左右的 W5solution重悬，铺于用 1 %的 BSA 润洗过的12 孔板中，
（5）在全光照条件下，培养 16 h，即可观察，
2.3激光共聚焦扫描隧道显微镜观察及图像处理
荧光双标记材料观察所用的显微镜为LSM780（Zeiss），其余材料均使用 TCS SP5（Leica）显微镜进行观察,
荧光双标记观察的光路为双通道，GFP 激发光波长为 505 nm，接受光波长范围为505-550 nm，RFP 激发光波长为 545 nm，接受光波长范围为575-650 nm,
得到的图片进行 Pearson coefficients 分析，以确定荧光蛋白的共定位情况，
2.4亚细胞定位检测
将带有GFP标记融合蛋白转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦扫描隧道显微镜观察蛋白的定位情况,
通过荧光定位的观察分析，说明基因定位情况，
为了确定PuADH1基因编码蛋白在细胞中发挥功能的具体位置，构建了基因与绿色荧光蛋白（GFP）的融合表达载体，利用农杆菌介导将带有GFP标记的融合蛋白转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦扫描隧道显微镜观察蛋白的定位情况。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795839A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 中国科学院成都生物研究所 一种石斛单细胞悬浮培养的方法
CN109355246A (zh) * 2018-11-21 2019-02-19 河南农业大学 一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用
CN115896137A (zh) * 2022-12-01 2023-04-04 沈阳农业大学 一种南果梨PuAAT基因、其过表达载体及应用
CN115945191A (zh) * 2023-02-10 2023-04-11 江南大学 一种氧化铟负载的单原子催化剂及其制备方法与应用
GB2614770A (en) * 2022-01-18 2023-07-19 Northeast Inst Of Geography And Agroecology Enzymolysis solution for preparing protoplast of lonicera caerulea L. preparation method and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101756312A (zh) * 2009-12-11 2010-06-30 辽宁石油化工大学 一种南果梨保肝解酒剂微胶囊化饮料的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101756312A (zh) * 2009-12-11 2010-06-30 辽宁石油化工大学 一种南果梨保肝解酒剂微胶囊化饮料的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XM_009357588.1: "predicted: pyrus x bretschneideri aldehyde dehydrogenase family 3 member H1-like (LOC103946793),transcript variant X1,mRNA", 《NCBI》 *
密森: "番茄果实主要芳香物质含量和营养品质组成变化的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795839A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 中国科学院成都生物研究所 一种石斛单细胞悬浮培养的方法
CN108795839B (zh) * 2018-07-02 2022-02-11 中国科学院成都生物研究所 一种石斛单细胞悬浮培养的方法
CN109355246A (zh) * 2018-11-21 2019-02-19 河南农业大学 一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用
CN109355246B (zh) * 2018-11-21 2022-02-11 河南农业大学 一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用
GB2614770A (en) * 2022-01-18 2023-07-19 Northeast Inst Of Geography And Agroecology Enzymolysis solution for preparing protoplast of lonicera caerulea L. preparation method and use thereof
CN115896137A (zh) * 2022-12-01 2023-04-04 沈阳农业大学 一种南果梨PuAAT基因、其过表达载体及应用
CN115945191A (zh) * 2023-02-10 2023-04-11 江南大学 一种氧化铟负载的单原子催化剂及其制备方法与应用
CN115945191B (zh) * 2023-02-10 2023-10-27 江南大学 一种氧化铟负载的单原子催化剂及其制备方法与应用

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