CN109355246A

CN109355246A - 一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用

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Publication number: CN109355246A
Application number: CN201811394334.6A
Authority: CN
Inventors: 史勇; 金维环; 陈彦惠; 任真真; 刘姣姣; 王林会
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109355246B

Abstract

本发明公开了一种拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，具体步骤如下：剪取3‑5周的拟南芥叶片用无弹性的纸质胶带或布质胶带固定叶片的上表皮和下表皮；轻轻撕掉叶片下表皮的无弹性的纸质胶带或布质胶带，将剪好的叶片放入含有酶解液的培养皿中；将放有叶片的培养皿置于摇床中培养30‑90min或者直至绝大部分或全部原生质体从叶片上脱离下来为止；将含有原生质体的酶解液转移到圆底离心管中，离心收集原生质体；用预冷的W5溶液清洗原生质体，用W5溶液重悬原生质体并在冰上放置最少30分钟。本发明将原生质体置于黑暗条件下培养，有效解决了光照培养引起的细胞死亡和凝聚现象，能极大的提高转化效率。

Description

一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用。

背景技术

植物原生质体是指去掉细胞壁但仍然保持活力的细胞团。由于缺少细胞壁的保护和支撑作用，原生质体可以吸收微生物、细胞器和核酸等大分子物质，这使它成为一种基础理论研究中重要的多用途细胞体系，在植物病毒、植物生理和作物育种研究上都有应用。从不同组织和植株分离的原生质体保留了原来的生理活性和调节功能，代谢方式和生理环境更接近细胞在整株植株上的状态，提供了比细菌、酵母菌、昆虫和哺乳类动物细胞更好的细胞体系用于植物研究，是细胞壁再生、细胞分化与分裂、胚胎形成、细胞器摄入、病毒侵染、生物与非生物胁迫、信号转导、细胞膜透性及离子转运、蛋白亚细胞定位、基因功能验证等研究的良好材料，随着基因组、蛋白组和代谢组学的发展，原生质体在基础研究上的用途还在不断扩展。

原生质体的制备效率受植物类型、器官差异、材料的预处理与否及处理方式、材料的年龄、酶解温度、震荡的方式和强度、渗透压调节物质的种类和浓度、离子的类型和PH等的影响。目前，拟南芥和烟草叶片原生质体的制备方法比较成熟，禾本科植物的原生质体制备方法相对滞后但是也日趋完善。制备原生质体的材料一般选取代谢活跃的组织或器官，如幼茎、叶鞘、叶片、根尖、根毛、子叶、胚轴、茎尖、愈伤组织、体细胞胚等。最近，Chen等又建立了玉米珠心原生质体的制备和转化体系，并将珠心原生质体用于细胞程序性死亡的研究。

目前，拟南芥叶肉细胞原生质体应用最广泛，其主要用于蛋白质亚细胞定位、蛋白活性检测、蛋白互作、基因调节，光信号转导等研究中。拟南芥叶肉细胞原生质体之所以能广泛应用的原因有：1）相对其他器官，叶片产量丰富；2）与未分化的悬浮细胞原生质体相比，叶肉细胞原生质体保留了大部分叶部细胞的特点；3）植株生长和原生质体短期培养不需要无菌的环境；4）不需要培养悬浮细胞等耗时的操作。

传统拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法相对比较成熟，但是也有一定缺陷。例如：1）原生质体的制备效率和转化效率受植株生长环境的影响，所以要严格控制植株的生长环境。短日照和弱光环境能提高原生质体的制备和转化效率；2）原生质体的制备过程需要将拟南芥叶片切成0.5-2mm的条状，切口处的细胞很容易被破坏，且在细胞壁酶解过程中需要真空处理，进一步加大了对细胞的机械损伤；3）需要4-5个小时才能得到可供转化的原生质体，耗时长。为此，Wu等人改进了传统的拟南芥原生质体制备方法，用Tape-Arabidopsis Sandwich 方法（在此称为“胶带法”）极大的提高了拟南芥叶肉细胞原生质体的制备效率。但是胶带法制备及转化原生质体在实验耗材的准备、原生质体制备的时间、转化过程都可以进一步优化和改进，特别是Wu等人的方法存在光照培养条件容易造成细胞体死亡和凝聚，原生质体转化操作很难大批量操作等缺陷。

传统的拟南芥原生质体制备方法对拟南芥材料的生长环境、植株年龄、生理状态有较高的要求，制备过程要对叶片进行切割和真空处理，对叶肉细胞造成很大的物理伤害，整个过程需要4-6个小时。Wu等人发明了一种新的方法-胶带法制备拟南芥叶肉细胞原生质体，该方法不受植株年龄、生长环境、生理状态等的限制，同时新的方法不需要对叶片进行切割和真空处理，减少了叶肉细胞的机械损伤，细胞组织碎片少，省去了酶解后对细胞进行过滤的步骤。更重要的是胶带法可以在1个小时之内完成原生质体的制备，与传统方法4-6个小时相比，极大地节省了实验时间。但是Wu等人的原生质体制备及转化方法也存在着缺陷，如原生质体在光照培养培养条件容易死亡和凝聚，转化效率低以及难大批量操作等。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，具体步骤如下：

（1）剪取3-5周的拟南芥叶片用无弹性的纸质胶带或布质胶带固定叶片的上表皮和下表皮；

（2）轻轻撕掉叶片下表皮的无弹性的纸质胶带或布质胶带，用剪刀减掉下表皮未被撕掉的叶片部分和不含叶片的胶带部分，将剪好的叶片放入含有酶解液的培养皿中；

（3）将放有叶片的培养皿置于35-45转每分钟的摇床中培养30-90min或者直至绝大部分或全部原生质体从叶片上脱离下来为止；

（4）将含有原生质体的酶解液转移到圆底离心管中，90-110 xg离心2-4分钟收集原生质体；用预冷的W5溶液清洗原生质体，用W5溶液重悬原生质体并在冰上放置最少30分钟。

所述酶解液的配方为：1% cellulase R10，0.25% macerozyme R10，0.4mol/L 甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES，10 mmol/L CaCl₂，0.1% BSA，pH=5.7。

所述W5溶液的配方为：154 mmol/L NaCl，125 mmol/LCaCl₂，5mmol/L KCl，2mmol/L MES，5mmol/L葡萄糖，pH=5.7。

一种按照上述的制备方法制备得到的拟南芥叶肉细胞原生质体。

如上述的拟南芥叶肉细胞原生质体在将外源基因转入该拟南芥叶肉细胞原生质体进行表达的应用。

拟南芥叶肉细胞原生质体在将外源基因转入该拟南芥叶肉细胞原生质体进行表达的应用，具体步骤如下：

（1）将拟南芥叶肉细胞原生质体90-110xg条件下离心1-2分钟，弃掉上清，用新配制的MMg溶液重悬并将浓度调整到3 x10⁵-5x10⁵个细胞/ml；

（2）将载有目的基因的质粒加入到离心管底部，然后加入步骤（1）所得的MMg溶液，使质粒与原生质体充分混匀，质粒与原生质体的质量个数比为5-20μg质粒/2x10⁴-5x10⁴个原生质体；

（3）加入等体积新配制的PEG4000溶液，反转离心管使原生质体悬液与PEG4000溶液混合均匀，在室温下放置5-30分钟；

（4）90-110xg条件下离心1-2分钟，收集原生质体，转化后的原生质体用W5溶液漂洗；

（5）用W5溶液重悬原生质体并转移到24孔板上，于20-23℃下培养14-18h，然后检测目的基因是否表达，并确定表达产物的亚细胞定位情况。

所述步骤（5）中，24孔板的孔用0.5-0.8ml 1%的BSA溶液浸泡至少30分钟，然后倒掉BSA溶液。

所述MMg溶液的配方为：0.4 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl₂，4 mmol/L MES，pH=5.7。

所述PEG4000溶液的配方为：40% PEG4000 （m/v），0.2 mol/L甘露醇，0.1 mol/LCaCl₂。

相对于现有技术，本发明测试了多种常用胶带，发现无弹性的普通纸质和步质胶带均可用于拟南芥叶肉细胞原生质体的制备，扩宽了实验耗材的来源，降低了成本；在叶片来源丰富的前提下，可以通过增加叶片的用量来减少酶解时间，20-30分钟即可得到足量用于实验的原生质体；PEG处理在5-30分钟内都具有良好的转化效果，一定时间内，处理时间长短对转化效率的影响并不明显；将原生质体置于黑暗条件下培养，有效解决了光照培养引起的细胞死亡和凝聚现象，能极大的提高转化效率。另外，由于拟南芥叶肉细胞原生质体可以保存48个小时，我们发现新制备的原生质体在冰水混合物保温的W5溶液中保存24小时后再进行转化，仍然可以有很高的转化率，所以对于大批量的转化实验或第一天转化后结果不理想的情况下，可以利用第一天制备的原生质体继续或重复试验。

附图说明

图1是胶带法制备的拟南芥叶肉细胞原生质体。A）3~5周的拟南芥植株，其叶片作为拟南芥叶肉细胞原生质体材料的来源；B）上表皮用胶带固定的拟南芥叶片；C）上表皮和下表皮分别用不同胶带固定的叶片；D）下表皮随胶带一起被去除，露出叶肉细胞的叶片，上表皮仍然被胶带固定；E)经酶解60分钟的叶片，其叶脉不能被酶解，所以清晰可见；F）正在酶解的叶片；G）酶解60~90分钟的叶肉细胞原生质体；H）光学显微镜检测原生质体的形态。酶解完全且活性正常的原生质体呈较完美的球形；I）用血球计数板在光学显微镜下计量原生质体的浓度。

图2是不同材质胶带去除拟南芥叶片下表皮的效果。A-C、D-F和G-I分别为用布质、纸质和塑料胶带固定上表皮（A、D、G）、上、下表皮（B、E、H）和下表皮被撕掉后露出叶肉细胞的叶片和仍然被胶带固定的下表皮（C、E、I）。叶片的上下表皮均可以用同一种胶带固定。

图3是带有细胞核标记的RFP重组蛋白在胶带法所制备的拟南芥叶肉细胞原生质体中的瞬时表达。编码RFP-VirD2NLS的载体用PEG转化法导入到原生质体中。A）RFP信号通道；B）白光信号通道；C）A和B融合的通道。红色，RFP荧光信号。

图4是GFP蛋白在胶带法所制备的拟南芥叶肉细胞原生质体中的瞬时表达。编码GFP的载体用PEG转化法导入到原生质体中。A）GFP信号通道；B）白光信号通道；C）A和B融合的通道。绿色，GFP荧光信号。

图5是带有细胞核标记的RFP重组蛋白和GFP蛋白同时在胶带法所制备的拟南芥叶肉细胞原生质体中的瞬时表达。编码RFP-VirD2NLS和GFP的载体用PEG转化法导入到原生质体中。A）RFP信号通道；B）GFP信号通道；C）白光信号通道；D）A、B、C融合的通道。

图6是20μg质粒对2x10⁴-5x10⁴个原生质体的转化效率。A）RFP信号通道；B）白光信号通道；C）A和B融合的通道。红色，RFP荧光信号。

图7是不同质粒用量对原生质体（2x10⁴-5x10⁴）的转化效率。

图8是原生质体在光照条件下培养16小时死亡和聚集结块。

具体实施方式

本发明中所用的步质胶带、普通纸质和塑料胶带均为市售。

实验例

1. 材料与方法

1.1 拟南芥植株的种植

野生型拟南芥（Col-0）（Arabidopsis thaliana）种子用10%次氯酸钠溶液（含0.1%SDS）消毒12分钟，瞬时离心倒掉次氯酸钠溶液，经无菌水清洗5次后转移到MS培养基（含100mg/ml Timentin）上培养。10天后将萌发的拟南芥幼苗移植到含营养土（营养土：蛭石：珍珠岩=3:1:1）的培养钵中并用保鲜膜覆盖，置于培养箱中培养，培养条件为：16h光照/8h黑暗，光照强度为10000 LUX，光、暗条件下温度分别为22±1℃和20±1℃，相对湿度80%。两天后揭掉保鲜膜，继续培养3周。

1.2主要溶液的配方及配制方法

酶解液（pH=5.7）：1% cellulase R10，0.25% macerozyme R10, 0.4mol/L 甘露醇，20mmol/L KCl，20 mmol/L MES，10 mmol/L CaCl₂，0.1% BSA，pH=5.7。配制过程中先将各成分配成母液，将前5种成分混合，然后55℃水浴10分钟，冷却后加入后两种成分，并调节pH=5.7,用0.45μm滤器过滤后备用。

W5溶液：154 mmol/L NaCl，125 mmol/LCaCl₂，5mmol/L KCl，2 mmol/L MES，5mmol/L葡萄糖，pH=5.7。溶液配制完后用0.2μm的过滤器过滤除菌。

MMg溶液：0.4 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl₂，4 mmol/L MES，pH=5.7。溶液配制完后用0.2μm的过滤器过滤除菌。

PEG4000溶液：40% PEG4000 （m/v），0.2 mol/L甘露醇，0.1 mol/L CaCl₂。配制时先加入所有成分混匀，然后置于65℃水浴锅中直至完全溶解。（为了充分溶解PEG，该溶液最好在使用前1h配制完成，配好的溶液可在室温下放置5天，但是新配置的PEG4000溶液转化效率相对较高）

1.3拟南芥原生质体的制备

1）剪取4周的拟南芥叶片用用布质胶带、普通纸质胶带和塑料胶带分别固定叶片的上表皮和下表皮固定过程一定要轻柔，避免破坏叶肉细胞。

2）轻轻撕掉叶片背面的布质胶带、普通纸质胶带或塑料胶带，用干净的剪刀减掉下表皮未被撕掉的叶片部分和不含叶片的胶带部分，将剪好的叶片放入含有20mL 酶解液的培养皿中（90mm × 1.5mm）。

3）将放有叶片的培养皿置于40 rpm的摇床（20℃）中培养直至绝大部分原生质体从叶片上脱离下来为止。

4）将含有原生质体的酶解液转移到50 ml的圆底离心管中，100 xg离心3分钟收集原生质体（eppendorf 5810R，加速和减速速度设为0）。用10ml预冷的W5溶液清洗两次，清洗操作一定要柔和，避免破坏原生质体。用5ml的W5溶液重悬原生质体并在冰上放置30分钟。在此期间内用血球计数器计数并测算原生质体的浓度（若原生质体的浓度过高，可以将原生质体稀释10-20倍后再测算浓度）。

1.4原生质体的转化

1）将制备的原生质体在100xg条件下离心1分钟，弃掉上清，用新配制的MMg溶液重悬并将浓度调整到4×10⁵个细胞/ml。

2）将20μl质粒DNA（5-50μg）（本实验原生质体的转化载体为：表达2x35S-RFP-VirD₂NLS的pSAT6载体；表达35S-GFP的pBI121载体）加入到5 ml的离心管底部（如果用多个质粒共同转化，需将转化的质粒预混合），然后加入200μl MMg溶液（含有6x10⁴-10x10⁴个原生质体细胞），轻弹离心管底部使质粒与原生质体充分混匀，质粒与原生质体的用量比为5-50μg质粒/2×10⁴-5×10⁴个原生质体。

3）加入等体积（220μl）新配制的PEG4000溶液，缓慢轻柔的反转离心管使原生质体悬液与PEG4000溶液混合均匀，在室温下放置5-30分钟。

4）100xg条件下离心1分钟收集原生质体，转化后的原生质体用2ml W5溶液漂洗2次。

5）用0.6 ml W5溶液重悬原生质体并转移到24孔板上培养（24孔板的孔用0.5ml1%的BSA浸泡30分钟，然后倒掉BSA溶液）。将原生质体于20℃下培养15h，然后用激光共聚焦显微镜检测荧光信号。荧光信号检测在Zeiss LSM 710激光共聚焦显微镜上进行。荧光蛋白RFP的激发光和接收光波长分别使用561 nm和595 nm，GFP的激发光和接收光波长分别使用488 nm和507 nm。

注意：为了避免破环原生质体，在转移原生质体悬液时需用钝头的移液器枪头（或将枪头的顶端用剪刀剪去一部分）。

2. 结果

2.1拟南芥叶肉细胞原生质体的制备

取4周的拟南芥植株（图1A）的叶片，上、下表皮分别用布质胶带或纸质胶带（图1B、C）固定，然后轻轻撕掉布质胶带或纸质胶带，同时叶片下表皮也随胶带被撕掉，露出叶肉细胞（图1D），然后将叶片放入酶解液中（图1F），60分钟后叶肉细胞基本上被酶解完全，只留下叶脉和透明的上表皮以及没有撕掉下表皮导致未被酶解的叶片部分（图1E，1G）。得到的原生质体位于酶解液的底部。光学显微镜检结果显示完整原生质体的比例在90-95%以上（图1H）。

一般情况下，60分钟足以使绝大部分叶肉细胞原生质体化，但是如果叶片材料充足，可以准备大量叶片进行酶解，叶片的总面积可以大于培养皿的面积，在酶解过程中有震荡操作，所有的叶片都可以充分的接触酶液。由于叶片量充足，不需要每片叶所有的叶肉细胞都原生质体化，20-30分钟的酶解时间就可以得到足够用于实验的原生质体。

用于固定叶片的Time Tape和Magic Tape两种胶带在国内代理商较少，很难买到，而且价格相对昂贵，限制了该方法的应用。本实验尝试了多种胶带，发现普通的纸质和布质胶带都可以用于固定叶片和撕取叶片下表皮，但是有弹性的塑料胶带容易将叶片撕裂，所以不宜选用（图2）。

2.2原生质体的转化

将酶解得到的原生质体纯化后置于冰上30分钟后进行转化，同时用血球计数器计量原生质体的浓度（图1-I）。

荧光蛋白标记常用于蛋白亚细胞定位的研究。本实验中我们用采用PEG法将带有细胞核定位的RFP荧光蛋白表达盒载体（pSAT6-2x35S-RFP-VirD₂NLS）和带有GFP荧光蛋白表达盒的载体（pBI121-35S-GFP）对所制备的原生质体进行转化，转化后的原生质体在激光共聚焦显微镜下镜检。单个载体转化结果表明，带有细胞核定位信号的RFP蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中（图3），GFP则在细胞质和细胞核中都有分布（图4）。在蛋白互作的研究中，常常需要将两个或多个载体导入到同一个原生质体中，为了检测胶带法制备的原生质体对多质粒转化的可行性和转化效果，本实验用上述两个荧光蛋白表达载体共同转化拟南芥原生质体，结果表明RFP和GFP同时在一个原生质体内表达且定位于相应的亚细胞区域，说明胶带法所制备的原生质体可以成功用于双质粒的转化（图5）。

Wu等人的质粒用量为20-40μg质粒/2x10⁴-10x10⁴个原生质体，对质粒浓度的要求高，对低拷贝的质粒提取提出了很高的要求。为此，本实验以带有细胞核定位的RFP荧光蛋白表达盒载体（pSAT6-2x35S-RFP-VirD₂NLS）为表达载体，以5、10、20、30、40、50μg质粒/2×10⁴-5×10⁴个原生质体设计浓度梯度，研究质粒用量对转化效率的影响。结果表明5μg质粒的转化效率在30-40%，随着浓度的增大，转化效率逐渐升高，10μg、20μg质粒的转化效率分别达到80%、（图6）和90%以上，再增加用量，转化效率基本不再增加或增加很小（图7）。

在转化过程中，Wu等人在加入PEG溶液5分钟后加入W5溶液漂洗，终止转化反应。由于原生质体很容易破碎，操作过程要轻柔，平均一个反应的操作需要1分钟，所以一次最多做5个反应，效率极低。本实验将PEG诱导的转化反应时间以5、8、10、15、20、30分钟设置时间梯度，结果发现在所使用的所有时间段内都可以得到很好的转化效果，转化效率差异不大。

在Wu等的方法中，原生质体培养在光照条件下进行。本实验发现在光照条件下原生质体容易死亡和发生聚集结块（图8），虽然可以得到少数转化成功的细胞，但是转化率低。这可能与由于光照会引起细胞膜损伤，导致原生质体活性下降有关。所以本实验将原生质体置于黑暗条件下培养，有效的解决了细胞死亡和聚集结块问题（图6）。

3.结论

针对以上问题，本实验在实验耗材的准备、原生质体制备的时间以及转化过程作了优化和改良：1）Wu等人实验中所用的Time Tape和Magic Tape在国内很难买到而且价格昂贵，本实验测试了多种常用胶带，发现无弹性的普通纸质和步质胶带均可用于拟南芥叶肉细胞原生质体的制备，扩宽了实验耗材的来源，降低了成本；2）Wu等人的方法酶解拟南芥叶肉细胞的时间为60-90分钟，本研究发现在叶片来源丰富的前提下，可以通过增加叶片的用量来减少酶解时间，20-30分钟即可得到足量用于实验的原生质体；3）Wu等人的方法在转化过程中质粒用量为20-40μg质粒/2×10⁴-10×10⁴个原生质体，如此大的用量对低拷贝的质粒提取是一个很大的挑战，我们通过浓度梯度实验发现，5μg质粒/2×10⁴-10×10⁴的转化效率即可达到30-40%。即使考虑不同质粒对转化效率的影响，5μg质粒也足以满足对蛋白亚细胞定位和互作的研究。4）在转化过程中，5分钟的PEG处理时间对于大批量的转化操作来说是一个很大的挑战，本实验表明，PEG处理在5-30分钟内都具有良好的转化效果，一定时间内，处理时间长短对转化效率的影响并不明显；5）由于光照可以对细胞膜造成损伤，引起原生质体活性下降，本实验将原生质体置于黑暗条件下培养，有效解决了光照培养引起的细胞死亡和凝聚现象，能极大的提高转化效率。另外，由于拟南芥叶肉细胞原生质体可以保存48个小时，我们发现新制备的原生质体在冰水混合物保温的W5溶液中保存24小时后再进行转化，仍然可以有很高的转化率，所以对于大批量的转化实验或第一天转化后结果不理想的情况下，可以利用第一天制备的原生质体继续或重复试验。

经改良后的胶带法可以以更经济的耗材、更短的时间制备原生质体、更容易的转化操作和更高的转化率转化拟南芥原生质体。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（4）将含有原生质体的酶解液转移到圆底离心管中，90-110 xg离心2-4分钟收集原生质体；用预冷的W5溶液清洗原生质体2次，用W5溶液重悬原生质体并在冰上放置最少30分钟。

2. 根据权利要求1所述的拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，其特征在于：所述酶解液的配方为：1% cellulase R10，0.25% macerozyme R10，0.4mol/L 甘露醇，20 mmol/LKCl，20 mmol/L MES，10 mmol/L CaCl₂，0.1% BSA，pH=5.7。

3. 根据权利要求1所述的拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，其特征在于：所述W5溶液的配方为：154 mmol/L NaCl，125 mmol/LCaCl₂，5mmol/L KCl，2 mmol/L MES，5mmol/L葡萄糖，pH=5.7。

4.一种按照权利要求1-3任一所述的制备方法制备得到的拟南芥叶肉细胞原生质体。

5.如权利要求4所述的拟南芥叶肉细胞原生质体在将外源基因转入该拟南芥叶肉细胞原生质体进行表达的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体步骤如下：

（5）用W5溶液重悬原生质体并转移到24孔板上，于黑暗条件下、20-23℃培养14-18h，然后检测目的基因是否表达，并确定表达产物的亚细胞定位情况。

7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤（5）中，24孔板孔用0.5-0.8ml1%的BSA溶液浸泡至少30分钟，然后倒掉BSA溶液。

8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述MMg溶液的配方为：0.4 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl₂，4 mmol/L MES，pH=5.7。

9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述PEG4000溶液的配方为：40% PEG4000（m/v），0.2 mol/L甘露醇，0.1 mol/L CaCl₂。