CN111979173B

CN111979173B - 一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法

Info

Publication number: CN111979173B
Application number: CN202010880629.5A
Authority: CN
Inventors: 沈祥陵; 曾弓剑; 陆业磊; 周超; 张德春; 吕阳; 韩少鹏
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: Hubei Suogan Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN111979173A

Abstract

本发明公开了一种以高粱BTx623幼苗为材料，以酶解法获得大量高粱原生质体及使用聚乙二醇介导法对高粱原生质体进行转化的方法。具体步骤包括：一、挑选饱满的高粱种子，消毒后种于培养基中；二、选取生长良好的高粱幼苗，去除叶和根，保留中间叶鞘部分，用刀片切成细条，在甘露醇溶液中预处理后加入酶解液进行酶解；三、酶解结束后，利用离心法富集原生质体，并重悬；四、利用聚乙二醇介导法转化所得原生质体。本发明建立了稳定高效的高粱原生质体分离及转化体系，该方法快速高效、转化率高，能够用于目的基因表达、蛋白质亚细胞定位和蛋白质互作等，为高粱的遗传改良和基因功能组研究提供了一个有力的工具。

Description

一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法

技术领域

本发明涉及一种高梁原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法。

背景技术

高粱是一年生禾本科C₄植物，可作为食用、饲用、酿造和生物能源等方面，具有广泛的适应性和良好的抗逆性，在全世界和我国各地均广泛种植，具有较高的经济价值和研究价值。然而高粱存在转化难、再生难等问题，利用常规遗传转化技术对其进行转化，如农杆菌侵染法，存在效率低、再生难和周期长等难点，限制了高粱的遗传改良和功能基因组研究的发展。

植物原生质体是植物细胞去除细胞壁后裸露的细胞，具有容易摄取外源核酸片段的特性。自1960年Cocking等首次利用纤维素酶粗制剂，从番茄根尖中分离出大量的原生质体以来，多种植物如拟南芥、水稻、玉米、烟草等都建立了原生质体分离系统。植物瞬时表达是一种将目标基因转入靶细胞，并在短时间内使外源基因高效表达的技术。；利用原生质体易于摄取外源基因的特性，为植物瞬时表达技术的应用提供了良好的实验系统。在植物原生质体中进行瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到靶细胞基因组中，被广泛应用于蛋白的亚细胞定位、基因瞬时表达、蛋白质互作、启动子活性等多种植物基因功能研究中。目前高粱缺少稳定高效的原生质体瞬时表达体系，因此建立高粱原生质体制备及转化体系对高粱的遗传转化、基因功能研究是具有重要意义的。本发明利用高粱幼苗成功建立了稳定、高效、快速的高粱原生质体瞬时表达体系，克服了高粱难以转化的问题，为在高粱中进行遗传育种和基因功能组研究提供了一个有力的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种高粱原生质体的制备方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种高粱原生质体的制备方法，包括如下步骤：

（1）挑选饱满的高粱种子消毒后接种于MS培养基中，移至组培室中培养；

（2）选取步骤（1）中培养良好的幼苗，取其中间叶鞘部分，用刀片迅速切成条状，放入装有甘露醇溶液的容器中进行预处理；

（3）移除甘露醇，加入酶解液，避光，置于摇床上低速震荡，真空处理20-90 min后继续酶解高粱材料；

（4）酶解结束后，对高粱原生质体进行分离纯化，得到高活力的高粱原生质体。

步骤（2）中所述甘露醇溶液预处理为：在切成细条的高粱材料中加入0.5-0.7 M的甘露醇溶液，避光，质壁分离20-30 min。

步骤（3）中所述酶解液的配置方法为：称取甘露醇、纤维素酶和离析酶，加入吗啉乙磺酸溶液及双蒸水，在50-55℃水浴锅中孵育后冷却到室温，经过滤再加入CaCl₂溶液、β-巯基乙醇和小牛血清蛋白即可得到酶解液。

所述酶解液中各组分的最终浓度为：甘露醇0.5-0.7 M、纤维素酶0.5-2wt%、离析酶0.15-0.75 wt %、吗啉乙磺酸8-12 mM、 CaCl₂ 0.5-3 mM、β-巯基乙醇3-8 mM、小牛血清蛋白0.05-0.2 wt %。

所述原生质体分离包括如下步骤：将酶解液用200目的尼龙网初步过滤，将收集的滤液在2-4℃下、离心，移除上清，用W5溶液重悬原生质体即可。

W5溶液中包括吗啉乙磺酸、NaCl、KCl、CaCl₂、双蒸水；其最终浓度分别为吗啉乙磺酸2-3 mM、NaCl 150-160 mM、KCl 2-8 mM、CaCl₂ 120-130 mM。

本发明的又一技术方案是将制备得到的高粱原生质体进行原生质体转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在离心管中加入质粒和原生质体，再加入PEG-Ca溶液，吸打混匀，室温、避光、静置孵育；

（2）加入W5溶液，吸打混匀，终止转化，即得转化子。

所述的PEG-Ca溶液包括甘露醇、聚乙二醇、CaCl₂、双蒸水；其中最终浓度为甘露醇0.3-0.8 M、聚乙二醇25-50wt%、CaCl₂ 80-120 mM。

所述的W5溶液中包括吗啉乙磺酸、NaCl、KCl、CaCl₂、双蒸水；其最终浓度分别为吗啉乙磺酸2-3 mM、NaCl 150-160 mM、KCl 3-8 mM、CaCl₂ 120-130mM。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明建立并优化了高粱原生质体瞬时表达体系，该方法简单、快速、高效，所制备原生质体的浓度可达到10⁷个/ml，活力在90%以上，转化率可达到60%以上，能用于蛋白质的亚细胞定位、蛋白质互作和启动子活性分析等植物功能基因组的研究。

附图说明

图1 组织培养12天的高粱幼苗。

图2 将高粱幼苗的茎切成细条状。

图3 将切好的高粱材料移入三角瓶中并加入酶解液。

图4 实施例3的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。

图5 实施例4的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。

图6 实施例5的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。

图7 实施例6的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。

图8 实施例8中荧光显微镜下检查原生质体的转化率（A为明场，B为荧光，C为明场与荧光的叠加，比例尺=75μm）。

图9 实施例9中荧光显微镜下检查原生质体的转化率（A为明场，B为荧光，C为明场与荧光的叠加，比例尺=75μm）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1、高粱种子的消毒和培育

挑选饱满干净的高粱种子，置于干净的玻璃瓶中，加少量洗洁精，自来水流水冲洗1 h，转入无菌超净工作台，用75%酒精消毒2 min，无菌水清洗2次，每次1min，用0.1%的升汞（含0.1%吐温-20）浸泡消毒20 min，无菌水清洗5次，每次约2 min，尽量将种子上的生汞残留清洗干净，清洗完成后将种子接种到含有1/2 MS培养基的玻璃瓶中，移至组织培养室，26℃每日光照16 h培养12天备用（图1）。

1/2 MS培养基（1L）：1/2 MS粉末、蔗糖3 %、Agar 1 %、pH值5.8。

实施例2、质粒（35S：：GFP）大提

本发明使用的质粒采用QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒提取和纯化，具体方法如下：

将大肠杆菌DH5α（含构建好的载体）在含卡那霉素的LB培养基上划线涂板，37℃静置培养过夜。取3 ml LB培养基（含卡那霉素）到10 ml离心管中，挑取A步骤中的单菌落到离心管中，37℃ 220rpm震荡培养过夜。吸取1 ml菌液到250 ml LB培养基（含卡那霉素）中，37℃ 220rpm震荡培养过夜。取培养好的菌液（OD值=2-4），4℃ 6000×g离心15 min，去上清，加10 ml P1（含RNase A 100 μg/ml）溶液让菌体重悬，用移液枪吸打溶液，直到菌块均匀溶解于P1溶液为止。加10 ml P2溶液，轻轻上下颠倒4-6次，室温静置5 min，此时溶液变得澄清。加10 ml已在4℃中预冷的P3溶液，轻轻颠倒4-6次，此时出现大量白色沉淀，冰上静置20min后于4℃温度下20000×g离心30 min，收集上清到干净的50 ml离心管中，注意不要吸取到沉淀。在平衡柱（QIAGEN-tip）中加入2×10 ml QBT溶液，利用重力让QBT溶液自然流出。将收集的上清液加入到平衡柱中，利用重力让滤液自然流出，使用2×10 ml QC溶液清洗平衡柱中的质粒，利用重力让QC溶液自然流出。加入15 ml QF溶液到平衡柱中，利用重力让QF溶液自然流出，收集滤液到干净的50 ml离心管中。在离心管中加入0.7倍QF溶液体积的异丙醇，在-20℃冰箱中静置1 h沉淀质粒。取出50 ml离心管，15000×g，4℃离心30min后移除上清，加入5 ml预冷的70%乙醇，15000×g，4℃离心10 min后移除上清，自然风干后加入100μl的双蒸水或TE缓冲液溶解质粒，测定浓度后置于-20℃冰箱保存。

实施例3、高粱原生质体的分离1

选取培养12天的高粱组培幼苗，迅速去除叶和根，取其茎约1-2 g，用锋利的刀片将其切成0.5-1 mm的碎片（每次需更换新的刀片，图2），迅速浸泡到装有0.6 M甘露醇溶液的100 ml三角瓶中，避光静置30 min进行质壁分离。将甘露醇移除后加入10 ml酶解液（图3），混匀后避光放入真空装置，室温下置于摇床上维持40 rpm的振荡，抽真空1 h后继续酶解4h。酶解结束后调整摇床速度至80 rpm维持10 min，加入等体积的W5溶液后继续摇10min，用200目的尼龙网过滤酶解液到50 ml的离心管中，收集滤液后4℃ 800 rpm离心3min，弃上清，加入0.5 ml W5溶液重悬，置于冰上30 min后备用。该实施例得到的高粱原生质体活力在95%以上，原生质体浓度为1×10⁷个/ml（图4）。

W5溶液（50 ml）：0.2 M吗啉乙磺酸（PH 5.7）0.5 ml、5 M NaCl 1.54 ml、2 M KCl0.125 ml、1 M CaCl₂ 6.25 ml、双蒸水41.585 ml。

酶解液（10 ml）：0.2 M 吗啉乙磺酸（PH 5.7）0.5 ml、0.8 M甘露醇7.5 ml、1 MCaCl₂0.01 ml、β-巯基乙醇0.003 ml、小牛血清蛋白（10%）0.1 ml、纤维素酶0.1 g、离析酶0.025 g、双蒸水1.89 ml。先加MES、甘露醇、双蒸水、纤维素酶和离析酶，55 ℃水浴锅孵育10 min，冷却后用0.22 μm的过滤器除菌后，加入CaCl₂、β-巯基乙醇和小牛血清蛋白。

实施例4、高粱原生质体的分离2

步骤同实施例3的步骤，仅调整酶解液中纤维素酶为0.15 g、离析酶为0.375 g。经活力检测，该实施例得到的高粱原生质体活力在50%左右，原生质体浓度为7×10⁶个/ml（图5）。

实施例5高粱原生质体的分离3

步骤同实施例3的步骤，仅调整抽真空时间为20 min。该实施例得到的高粱原生质体活力在80%左右，原生质体浓度为5×10⁶个/ml（图6）。

实施例6高粱原生质体的分离4

步骤同实施例3的步骤，仅调整抽真空1 h后继续酶解7 h。该实施例得到的高粱原生质体活力在60%左右，原生质体浓度为2×10⁶个/ml（图7）。

实施例7原生质体的计数和活力检测

原生质体得率：使用0.1 mm血细胞记数板统计原生质体浓度，取分离纯化后的原生质体悬浮液10 μl，滴加在计数板的计数室上，在普通光学显微镜下镜检。0.1 mm血细胞计数板的中间计数室体积为1 mm×1 mm×0.1 mm，计数室分两种，一种为16中格，每个中格有25小格，一种为25中格，每中格有16小格，但总的小格数都为400个，计数室为16中格的统计左上、左下、右上和右下4个中格的原生质体，25中格的统计左上、左下、右上、右下和正中5个中格的原生质体数量。

最后原生质体数(个/ml) = 100小格内细胞个数/100×400×10⁴×稀释倍数或者原生质体数(个/ml) = 80小格内细胞个数/80×400×10⁴×稀释倍数。

原生质体活力检测：取100 μl原生质体加入二乙酸荧光素（FDA）母液（二乙酸荧光素母液: 5 mg FDA溶于1 ml丙酮）2 μl混合均匀，使FDA终浓度为0.01%，室温静置5 min。在荧光显微镜下检查，具有活力的原生质体在紫外光激发下能够发出荧光，计算原生质体存活率。

原生质体活力=黄绿色荧光原生质体数/原生质体总数×100%。

实施例8原生质体的转化1

用MMG溶液将原生质体浓度调整到2×10⁵个/ml，在2 ml离心管中加入10 μg质粒，再加入100 μl原生质体和110 μl PEG-Ca溶液，混匀后室温避光静置10 min，加入440 μl的W5溶液终止反应，4℃条件下800 rpm离心3 min，去除上清，再加入500 μl WI溶液，转移到预先用胎牛血清（FBS）润湿过的24孔培养板中，室温避光培养16-24 h。在荧光显微镜下观察原生质体中绿色荧光蛋白（GFP）的表达结果。原生质体转化效率（%）=（发出绿色荧光的原生质体数目/所有原生质体数）×100%。该实施例的转化效率达到60%以上（图8）。

MMG溶液（10 ml）：0.2 M 吗啉乙磺酸（PH 5.7）0.2 ml、0.8 M甘露醇7.5 ml、1 MMgCl₂ 0.15 ml、双蒸水2.15 ml。

WI溶液（10 ml）：0.2 M 吗啉乙磺酸（PH 5.7）0.2 ml、0.8 M甘露醇7.5 ml、2 MKCl 0.02 ml、双蒸水2.28 ml。

PEG-CaCl₂溶液（1 ml、30% m/v）：0.8 M甘露醇0.55 ml、聚乙二醇4000 0.3 g、1 MCaCl₂ 0.1 ml、双蒸水0.05 ml。

实施例9原生质体的转化2

步骤同实施例9，仅PEG-CaCl₂溶液中PEG4000的浓度调整为40%（m/v），则转化效率在20-30%（图9）。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种高粱原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）挑选饱满的高粱种子消毒后接种于1/2MS培养基中，移至组培室中，26℃每日光照16 h培养12天备用；

（2）选取步骤（1）中培养良好的幼苗，取其茎部分，用锋利的刀片将其切成0.5-1 mm的碎片，放入装有甘露醇溶液的容器中进行预处理；

（3）移除甘露醇，加入酶解液，避光，置于摇床上低速震荡，抽真空1 h后继续酶解4h；酶解液的配方为0.2 M pH 5.7吗啉乙磺酸0.5 ml、0.8 M甘露醇7.5 ml、1 M CaCl₂0.01 ml、β-巯基乙醇0.003 ml、10%小牛血清蛋白0.1 ml、纤维素酶0.1 g、离析酶0.025 g、双蒸水1.89 ml；先加吗啉乙磺酸、甘露醇、双蒸水、纤维素酶和离析酶，55 ℃水浴锅孵育10 min，冷却后用0.22 μm的过滤器除菌后，加入CaCl₂、β-巯基乙醇和小牛血清蛋白；

2.根据权利要求1所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述甘露醇溶液预处理为：在切成0.5-1 mm的碎片的高粱材料中加入0.5-0.7 M的甘露醇溶液，避光，质壁分离20-30 min。

3.根据权利要求1所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，所述原生质体分离包括如下步骤：将酶解液用200目的尼龙网初步过滤，将收集的滤液在2-4℃下、离心，移除上清，用W5溶液重悬原生质体即可。

4.根据权利要求3所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，W5溶液的组成为吗啉乙磺酸、NaCl、KCl、CaCl₂、双蒸水；其最终浓度分别为吗啉乙磺酸2-3 mM、NaCl 150-160mM、KCl 2-8 mM、CaCl₂ 120-130 mM。

5.采用权利要求1-4任一项所述方法制备得到的高粱原生质体进行原生质体转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在离心管中加入质粒和原生质体，再加入30% m/v PEG-CaCl₂溶液1 ml，吸打混匀，室温、避光、静置孵育；PEG-CaCl₂溶液：0.8 M甘露醇0.55 ml、聚乙二醇4000 0.3 g、1 MCaCl₂ 0.1 ml、双蒸水0.05 ml；

（2）加入W5溶液，吸打混匀，终止转化，即得转化子。

6.根据权利要求5所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，W5溶液的组成为吗啉乙磺酸、NaCl、KCl、CaCl₂、双蒸水；其最终浓度分别为吗啉乙磺酸2-3 mM、NaCl 150-160mM、KCl 3-8 mM、CaCl₂ 120-130mM。