CN103013904A - 一种高粱原生质体酶解制备法 - Google Patents

一种高粱原生质体酶解制备法 Download PDF

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李杰勤
王丽华
詹秋文
张俊
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Anhui University of Science and Technology
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Abstract

一种高粱原生质体酶解制备法，属于生物技术领域。高粱种子出苗后，将高粱幼叶切成一定大小，利用酶解液对幼叶细胞壁进行酶解，从而分离出大量高粱原生制体的方法。本方法简便，操作容易，效果好。

Description

一种高粱原生质体酶解制备法
技术领域
一种高粱原生质体酶解制备法属于生物技术领域，更具体的说是一种利用细胞壁裂解酶来裂解高粱幼叶细胞壁来制备大量原生质体的方法。
背景技术
原生质体是指除去细胞壁的细胞或一个被质膜包围的裸露细胞。制备大量的原生质体在植物的基因功能研究方面有非常重要的作用。目前高粱原生质体的制备方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是采用一种酶解的方法大量制备高粱原生质体，制备的原生质体可以用于高粱转基因、基因的瞬时表达等方面。
本发明是这样实现的：
1.       一种高粱原生质体酶解制备法的特征在于，以高粱嫩叶为对象，利用细胞壁消化酶来消化细胞壁释放原生质体，它包括①高粱幼苗制备，②幼叶处理，③酶解，④过滤残渣，⑤原生质体悬浮5个步骤。
2.       所述的5个步骤的具体过程如下：
①     高粱幼苗制备：选取饱满的高粱种子，种入营养钵，28℃培养10天。
②     幼叶处理：剪取高粱的幼叶2g左右，用单面刀片将叶片切成1mm长。
③     酶解：将切好的叶片放入到已加入10mL酶解液的三角瓶中，锡箔纸盖好瓶口放入28℃摇床，转速80rpm，酶解3小时。倒掉酶解液，加入新的酶解液10ml，快速摇匀30秒，再放入28℃摇床，转速80rpm，酶解1小时。（酶解液配方：0.645M甘露醇，10mM 氯化钾，1mM 氯化钙，8mM 2-吗啉乙磺酸，PH5.5，0.3%纤维素酶和0.6%的离析酶R-10）。
④     过滤残渣：用200目尼龙布过滤解离后的叶片残渣，滤液转入50mL离心管，90 G离心5分钟。
⑤     原生质体悬浮：倒掉上清液，加入500μL悬浮液，轻轻摇动离心管悬浮原生质体，即可得大量的原生质体细胞（悬浮液配方：0.6M 甘露醇，15mM氯化钙，4mM 2-吗啉乙磺酸，PH5.7）。
本发明的有益效果：利用本方法制备的高粱原生质体量大，且制得的原生质体细胞完整性好，细胞死亡少，方法简单。
具体实施方式：
下面结合具体实例对本发明进行进一步的描述。
实施例1：高粱Tx623B原生质体的制备
1.        高粱幼苗制备：选取饱满的高粱品系Tx623B的种子，种入营养钵，28℃培养10天。
2.        幼叶处理：剪取高粱的幼叶2g，将叶片切成1mm长。
3.       酶解：将切好的叶片放入到已加入10mL酶解液的三角瓶中，锡箔纸盖好瓶口放入28℃摇床，转速80rpm，酶解3小时。倒掉酶解液，加入新的酶解液10ml，快速摇匀30秒，再放入28℃摇床，转速80rpm，酶解1小时。（酶解液配方：0.645M甘露醇，10mM 氯化钾，1mM 氯化钙，8mM 2-吗啉乙磺酸，PH5.5，0.3%纤维素酶和0.6%的离析酶R-10）。
4.       过滤残渣：用200目尼龙布过滤解离后的叶片残渣，滤液转入50mL离心管，90 G离心5分钟。
5.       原生质体悬浮：倒掉上清液，加入500μL悬浮液，轻轻摇动离心管悬浮原生质体，即可得大量的原生质体细胞（悬浮液配方：0.6M 甘露醇，15mM氯化钙，4mM 2-吗啉乙磺酸，PH5.7）。
经检测，通过以上步骤在得到的原生质体数量达到107个左右，细胞完整性好，完全满足实验需求。

Claims (7)

1.一种高粱原生质体酶解制备法的特征在于，以高粱嫩叶为对象，利用细胞壁消化酶来消化细胞壁释放原生质体，它包括①高粱幼苗制备，②幼叶处理，③酶解，④过滤残渣，⑤原生质体悬浮5个步骤。
2.根据权利要求1所述的高粱原生质体酶解制备法，其特征在于，所述的高粱幼苗制备的做法是：选取饱满的高粱种子，种入营养钵，28℃培养10天。
3.根据权利要求1所述的高粱原生质体酶解制备法，其特征在于，所述的幼叶处理的做法是：剪取高粱的幼叶2g左右，将叶片切成1mm长。
4.根据权利要求1所述的高粱原生质体酶解制备法，其特征在于，所述的酶解的做法是：将切好的叶片放入到已加入10mL酶解液的三角瓶中，锡箔纸盖好瓶口放入28℃摇床，转速80rpm，酶解3小时。
5.倒掉酶解液，加入新的酶解液10ml，快速摇匀30秒，再放入28℃摇床，转速80rpm，酶解1小时。
6.根据权利要求1所述的高粱原生质体酶解制备法，其特征在于，所述的过滤残渣的做法是：用200目尼龙布过滤解离后的叶片残渣，滤液转入50mL离心管，90 G离心5分钟。
7.根据权利要求1所述的高粱原生质体酶解制备法，其特征在于，所述的原生质体悬浮的做法是：倒掉上清液，加入500μL悬浮液，轻轻摇动离心管悬浮原生质体，即可得大量的原生质体细胞。
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