CN105219693A - 一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法。以湘豆3号大豆幼嫩叶片为材料，通过控制质壁分离时间，纤维素酶Onozuka？R-10、半纤维素酶Hemicellulase、离析酶Macerozyme？R-10及果胶酶Pectolyase？Y-23的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离湘豆3号大豆叶片原生质体最适合的条件。本发明所述方法获得的游离原生质体数量多，活性较高，且用于亚细胞定位效果较好，是一种简便、快捷分离湘豆3号大豆叶片原生质体的方法。

Description

一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法
技术领域
本发明涉及一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物基因型对原生质体的分离影响很大，湘豆3号大豆是我们研究的主要大豆材料，但有关湘豆3号大豆原生质体分离的方法尚未见报道。我们以大豆品种湘豆3号的幼嫩叶片为材料，建立了湘豆3号叶片原生质体分离体系，此发明将为我们开展基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位研究提供重要的技术支持。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法。
技术方案：本发明通过调节质壁分离时间、酶种类及配比、酶解液中甘露醇浓度、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离湘豆3号大豆叶片原生质体最适宜的因素。其目的是这样实现的，一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法，具体包括以下实施方式。
（1）样品筛选：取10-30d苗龄的湘豆3号大豆幼苗上完全展开的幼嫩叶片，要求叶片健壮且大小适中，清洗叶片表面，除去灰尘杂质。
（2）将清洗的叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液的培养皿中黑暗条件下进行质壁分离，所述的质壁分离液为CPW（细胞原生质体清洗液）+13%甘露醇。
（3）将经过质壁分离后的叶片细条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上黑暗条件下进行酶解，一段时间后发现酶解液中已无完整叶片细条，而溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体；其中所述的酶解液为CPW+0.1%MES+0.5%纤维素酶OnozukaR-10+0.8%半纤维素酶Hemicellulase+0.8%离析酶MacerozymeR-10+0.4%果胶酶PectolyaseY-23。
根据上述方法，其特征在于，所述材料优选湘豆3号大豆幼嫩叶片。
根据上述方法，其特征在于，步骤（2）中的质壁分离时间优选2h。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液组合优选CPW+0.1%MES+0.5%纤维素酶OnozukaR-10+0.8%半纤维素酶Hemicellulase+0.8%离析酶MacerozymeR-10+0.4%果胶酶PectolyaseY-23+甘露醇。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中酶解液中的甘露醇浓度优选10%。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液pH优选6.0。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解时间优选6h。
有益效果：本方法简单实用，分离材料易于获得；酶解方法简单，获得的原生质体数量多且活性高。本项技术将为基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位重要技术支持。
附图说明
图1湘豆3号大豆叶片原生质体示意图。
图2和台盼蓝染色后的湘豆3号大豆叶片原生质体示意图。
图3湘豆3号大豆叶片原生质体用于亚细胞定位示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实验材料：10-30d的湘豆3号大豆幼嫩叶片或成熟苗上的幼嫩叶片。
实施例中，CPW溶液的配方为。
实施例中，W5溶液的配方为。
实施例中，MMG溶液的配方为。
实施例中，WI溶液的配方为。
将W5溶液、MMG溶液及WI溶液用KOH调pH至5.7，121℃灭菌20min，4℃保存备用。
原生质体分离。
（1）取幼嫩湘豆3号大豆叶片，用自来水清洗干净后用纯水清洗，备用。
（2）将步骤上述湘豆3号大豆幼嫩叶片切成0.5-1mm的细条，置于质壁分离液（CPW+13%甘露醇）中，室温、黑暗条件下进行质壁分离，用镊子辅助使叶片完全浸入溶液中。质壁分离2h。
（3）将步骤（2）中的叶条转移至酶解液中、温度27℃、转速为45rpm、黑暗条件下酶解6h，酶解液成分为：细胞原生质体清洗液CPW+10%甘露醇+0.1%MES+0.5%纤维素酶OnozukaR-10+0.8%半纤维素酶Hemicellulase+0.8%离析酶MacerozymeR-10+0.4%果胶酶PectolyaseY-23，pH为6.0。
（4）将步骤（3）中分离得到的叶片原生质体进行检测：取10μL原生质体溶液加入2μL0.4%的台盼蓝染液混合均匀，用血球计数板制片后置于光学显微镜下观察，视野中未被染色的为活的原生质体，被染成蓝色的为失去活力的原生质体。原生质体产量（原生质体产量=25个方格内原生质体总数/0.1×1000×10个/g·FW）为1.75×107个/g·FW，存活率为82.86%。
原生质体转化。
（5）用三层75μm的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，冰上静置30min以上，待溶液分层。
（6）吸取中层10mL的原生质体，用10mLW5溶液洗涤（200g离心2min，弃上清），2-3次，即获得较为纯净的原生质体。
（7）原生质体转化：以PEG为媒介，将带有35S驱动的绿色荧光蛋白GFP的质粒pA7转化进入原生质体：转化体系如下：15μL质粒，100μL原生质体用MMG溶液溶解，115μL40%的PEG-CaCl2；室温放置10-20min，然后加入400-440μLW5溶液以终止反应；200g离心2min，去上清；再加入1mLWI溶液悬浮原生质体，于28℃黑暗条件下培养12-24小时。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速高效制备湘豆3号大豆叶片原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤。
（1）样品筛选：取10-30d苗龄的湘豆3号大豆幼苗上完全展开的幼嫩叶片，要求叶片健壮且大小适中，清洗叶片表面，除去灰尘杂质。
（2）将清洗的叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液的培养皿中黑暗条件下进行质壁分离，所述的质壁分离液为CPW（细胞原生质体清洗液）+13%甘露醇。
（3）将经过质壁分离后的叶片细条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上黑暗条件下进行酶解，一段时间后发现酶解液中已无完整叶片细条，而溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体；其中所述的酶解液为CPW+0.1%MES+0.5%纤维素酶OnozukaR-10+0.8%半纤维素酶Hemicellulase+0.8%离析酶MacerozymeR-10+0.4%果胶酶PectolyaseY-23。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述材料为湘豆3号大豆幼嫩叶片。
3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的质壁分离时间为2h。
4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液组成为CPW+0.1%MES+0.5%纤维素酶OnozukaR-10+0.8%半纤维素酶Hemicellulase+0.8%离析酶MacerozymeR-10+0.4%果胶酶PectolyaseY-23+甘露醇。
5.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中酶解液中的甘露醇浓度为10%。
6.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液pH为6.0。
7.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解时间为6h。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106818480A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 上海交通大学 一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法
CN109370976A (zh) * 2018-12-20 2019-02-22 江苏省农业科学院 马蔺叶肉原生质体及其制备方法
CN109554327A (zh) * 2018-11-14 2019-04-02 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种阳春砂叶肉原生质体分离纯化的方法
CN112391370A (zh) * 2019-08-13 2021-02-23 北京林业大学 一种制备油松针叶原生质体的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671648A (zh) * 2009-09-30 2010-03-17 中国科学院新疆理化技术研究所 雪莲原生质体的分离和培养方法
CN102120981A (zh) * 2010-11-30 2011-07-13 河南科技大学 一种牡丹原生质体的提取方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671648A (zh) * 2009-09-30 2010-03-17 中国科学院新疆理化技术研究所 雪莲原生质体的分离和培养方法
CN102120981A (zh) * 2010-11-30 2011-07-13 河南科技大学 一种牡丹原生质体的提取方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘建福等: "《细胞工程》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 *
张晓丽等: "药用植物青天葵叶片原生质体的制备与纯化", 《安徽农业科学》 *
张晓可等: "大豆幼苗根和叶片原生质的分离与纯化", 《大豆科学》 *
邓红梅等: "黄瓜幼苗子叶原生质体的分离纯化及融合条件优化研究", 《北方园艺》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106818480A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 上海交通大学 一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法
CN109554327A (zh) * 2018-11-14 2019-04-02 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种阳春砂叶肉原生质体分离纯化的方法
CN109554327B (zh) * 2018-11-14 2022-07-01 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种阳春砂叶肉原生质体分离纯化的方法
CN109370976A (zh) * 2018-12-20 2019-02-22 江苏省农业科学院 马蔺叶肉原生质体及其制备方法
CN112391370A (zh) * 2019-08-13 2021-02-23 北京林业大学 一种制备油松针叶原生质体的方法
CN112391370B (zh) * 2019-08-13 2023-02-07 北京林业大学 一种制备油松针叶原生质体的方法

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