CN103013905B - 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法 - Google Patents

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本发明文件公开了一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法，属于生物技术领域。苏丹草种子出苗后，将苏丹草幼叶和茎切成一定大小，利用抽真空酶解的方法对幼叶和茎的细胞壁进行酶解，从而分离出大量苏丹草原生制体的方法。利用本方法可以便捷、快速地制备出大量细胞完好的苏丹草原生质体。

Description

一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法
技术领域
一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法属于生物技术领域，更具体的说是一种利用细胞壁裂解酶在真空环境下裂解苏丹草幼叶和茎的细胞壁从而制备大量原生质体的方法。
背景技术
原生质体是指除去细胞壁的细胞或一个被质膜包围的裸露细胞。大量制备原生质体是细胞组织培养和植物基因功能研究的重要基础。苏丹草原生质体的制备方法目前尚无报道，苏丹草原生质体的制备方法的建立有利于苏丹草相关研究的进一步开展。
发明内容
本发明的目的是采用一种真空酶解的方法大量制备苏丹草的原生质体，制备的原生质体可以用于苏丹草的转基因和基因功能等方面的研究。
本发明是这样实现的：
1. 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法的特征在于，以苏丹草嫩叶和茎为对象，利用细胞壁消化酶在真空环境下消化细胞壁释放原生质体，它包括①苏丹草幼苗准备，②幼叶和茎的处理，③抽真空酶解，④原生质体解离，⑤过滤残渣和⑥原生质体悬浮6个步骤。
2.上述的6个步骤是这样进行的：
①苏丹草幼苗准备：选取饱满的苏丹草种子，种入营养钵，25℃培养8天。
②幼叶和茎的处理：剪取苏丹草的幼叶和茎1g左右，将幼叶和茎切成约1mm长。
③抽真空酶解：将切好的幼叶和茎放入已加入10mL酶解液的三角瓶中，真空环境（-0.1MPa ）1小时，取出后用锡箔纸盖好三角瓶口放入28℃摇床，转速40rpm，酶解3小时。
④原生质体解离：倒掉酶解液，加入解离液10ml，28℃摇床，转速为80rpm，解离1小时。
⑤过滤残渣：用200目尼龙布过滤解离后的苏丹草叶片残渣，滤液转入50mL离心管，90 G离心3分钟。
⑥原生质体悬浮：倒掉上清液，加入300μL悬浮液，轻轻摇动离心管悬浮原生质体，即可得大量的原生质体细胞。
本发明的有益效果：利用真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法可以快捷、大量地制备出苏丹草的原生质体，而且本方法制备的原生质体细胞完整性好，细胞死亡少，方法简便。
具体实施方式：
下面结合具体实例对真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法进行进一步的描述。
实施例1：苏丹草S722原生质体的制备
1.苏丹草幼苗准备：选取饱满的苏丹草S722的种子，种入营养钵，25℃培养8天。
2.幼叶和茎的处理：剪取苏丹草S722的幼叶和茎1g，用刀片将叶片切成约1mm长。
3.抽真空酶解：将切好的茎、叶放入已加入10mL酶解液的三角瓶中，真空环境（-0.1MPa ）1小时，取出后用锡箔纸盖好三角瓶口放入28℃摇床，转速40rpm，酶解3小时。（酶解液配方：0.645M甘露醇，10mM 氯化钾，1mM 氯化钙，8mM 2-吗啉乙磺酸，PH5.5，1.5%纤维素酶和0.3%的离析酶R-10）。
4.原生质体解离：倒掉酶解液，加入解离液10ml，28℃摇床，转速为80rpm，解离1小时（解离液配方：154mM 氯化钠，125mM 氯化钙，5mM氯化钾，2mM 2-吗啉乙磺酸,PH 5.7 ）。。
5. 过滤残渣：用200目尼龙布过滤解离后的苏丹草叶片残渣，滤液转入50mL离心管，90 G离心3分钟。
6.原生质体悬浮：倒掉上清液，加入300μL悬浮液，轻轻摇动离心管悬浮原生质体，即可得大量的原生质体细胞（悬浮液配方：0.6M 甘露醇，15mM氯化钙，4mM 2-吗啉乙磺酸，PH5.7）。
经检测，通过以上步骤在得到的原生质体数量达到107个以上，且细胞完整性好，完全满足实验需求。

Claims (1)

1.一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的方法，其特征在于，以苏丹草嫩叶和茎为对象，利用细胞壁消化酶在真空环境下消化细胞壁释放原生质体，它包括①苏丹草幼苗准备，②幼叶和茎的处理，③抽真空酶解，④原生质体解离，⑤过滤残渣和⑥原生质体悬浮6个步骤；具体操作步骤如下：
①苏丹草幼苗准备：选取饱满的苏丹草种子，种入营养钵，25℃培养8天；
②幼叶和茎的处理：剪取苏丹草的幼叶和茎1g，将叶片切成1mm长；
③抽真空酶解：将切好的茎、叶放入已加入10mL酶解液的三角瓶中，置于-0.1MPa真空环境1小时，取出后用锡箔纸盖好三角瓶口放入28℃摇床，转速40rpm，酶解3小时；
④原生质体解离：倒掉酶解液，加入解离液10ml，28℃摇床，转速为80rpm，解离1小时；
⑤过滤残渣：用200目尼龙布过滤解离后的苏丹草叶片残渣，滤液转入50mL离心管，90 G离心3分钟；
⑥原生质体悬浮：倒掉上清液，加入300μL悬浮液，轻轻摇动离心管悬浮原生质体，即可得大量的原生质体细胞；
本方法还具有以下特征：
①酶解液的配方为：0.645M甘露醇，10mM 氯化钾，1mM 氯化钙，8mM 2-吗啉乙磺酸，pH5.5，1.5%纤维素酶和0.3%的离析酶R-10；
②解离液的配方为：154mM 氯化钠，125mM 氯化钙，5mM氯化钾，2mM 2-吗啉乙磺酸，pH 5.7；
③悬浮液的配方为：0.6M 甘露醇，15mM氯化钙，4mM 2-吗啉乙磺酸，pH5.7。
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