CN113652390B - 一种紫薇原生质体的制备方法 - Google Patents

一种紫薇原生质体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113652390B
CN113652390B CN202111108086.6A CN202111108086A CN113652390B CN 113652390 B CN113652390 B CN 113652390B CN 202111108086 A CN202111108086 A CN 202111108086A CN 113652390 B CN113652390 B CN 113652390B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzymolysis
protoplast
leaves
crape myrtle
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111108086.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113652390A (zh
Inventor
潘会堂
刘洁茹
池秀凤
冯露
程堂仁
王佳
张启翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN202111108086.6A priority Critical patent/CN113652390B/zh
Publication of CN113652390A publication Critical patent/CN113652390A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113652390B publication Critical patent/CN113652390B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01011—Pectinesterase (3.1.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02002—Pectate lyase (4.2.2.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及植物原生质体技术领域，具体涉及一种紫薇原生质体的制备方法。本发明针对紫薇提供原生质体的制备方法，该方法以紫薇叶片为材料，将紫薇叶片去除下表皮，将去除下表皮的叶片在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体。该方法能够高效地从紫薇叶片中提取获得原生质体，制备的原生质体具有较高的完整性和活性，为紫薇的分子育种提供了基础。

Description

一种紫薇原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及植物原生质体技术领域，具体涉及一种紫薇原生质体的制备方法。
背景技术
原生质体是指去除细胞壁后，由质膜包围的具有生活力的植物细胞。原生质体易于制备，且分离提纯后可以在合适的条件下生存数天，仍具有活细胞的一切特征，并具有一定的繁殖能力。由于没有细胞壁，原生质体可以摄入包括细胞核、细胞器基因组或外源DNA片段等遗传物质，是一种非常好的瞬时表达系统，也是研究基础生命科学及作物育种改良的理想实验材料。目前大量物种均已分离出原生质体，分布于40余科，160余属中，主要为茄科、豆科、禾本科、菊科和蔷薇科，但这些物种间原生质体分离的条件各不相同，物种之间的差异性较大。
紫薇(Lagerstroemia indica)作为夏季开花的木本植物，具有花期长、花量大、抗逆性强等优良品质，且近年来也培育了很多株型各异的新品种，因此紫薇是园林应用中重要的资源，但由于其木本植物的属性，在分子育种方面受到很大的限制，尤其是遗传转化体系建立困难，无法获得转基因植株。鉴于原生质体在分子育种方面的优良性质，在紫薇中分离原生质体是对其后续分子研究及培育新品种的重要基础。
目前未见从紫薇中成功分离出原生质体的现有技术，开发高效的紫薇原生质体的制备方法对于紫薇的分子育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种紫薇叶肉原生质体的制备方法。本发明的另一目的是提供用于紫薇原生质体制备的酶解液及其应用。
本发明以紫薇叶片为材料制备紫薇叶肉原生质体，针对紫薇的种属特点以及叶片的结构等特点，开发一种针对紫薇叶片材料的原生质体制备方法。由于不同植物的细胞结构等存在较大差异，采用其他植物的原生质体分离方法进行紫薇叶片的处理，较难得到较高的原生质体数量，且得到的原生质体的完整性和活性也不佳。因此，需要针对紫薇叶片开发其特异性的原生质体制备方法。本发明在研发过程中发现，与其他处理植物叶片的方法(如切丝等)相比，将紫薇叶片的下表皮去除得到叶肉，对叶肉进行酶解处理并分离原生质体的方法能够显著提高分离得到的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种紫薇叶肉原生质体的制备方法，该方法包括：将紫薇叶片去除下表皮，将去除下表皮的叶片在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体。
具体地，紫薇叶片的处理方法为：将新鲜的紫薇叶片轻微失水萎蔫，然后将上表皮固定，撕去下表皮，得到去除下表皮的叶片。
优选地，将新鲜的紫薇叶片放置在25℃的遮光气候箱内处理20-30min，使叶片轻微失水萎蔫。
上述叶片轻微失水萎蔫以叶片开始变软失水但未出现边缘卷曲为标准。
上述方法中，上表皮的固定可采用胶带固定。
本发明中，所述紫薇叶片优选为紫薇开展幼嫩叶片。更优选为轻微遮光处理的紫薇幼嫩开展叶片，一般为当年枝条修剪后萌发出的幼嫩枝条上的叶片。
以上所述的方法中，所述酶解液包括质量比为1：(0.5-0.6)：(0.3-0.4)的纤维素酶、离析酶和果胶酶。与使用其他酶及其组合相比，采用上述配比的纤维素酶、离析酶和果胶酶能够显著提高紫薇叶肉的酶解效率，进而提高原生质体的数量。
本发明进一步通过对酶解液中酶的种类和浓度、甘露醇的浓度等进行优化，同时在酶解液中添加BSA(牛血清蛋白)和DTT(二硫苏糖醇)，显著提高了原生质体的制备效率以及制备的原生质体的数量，同时也能够较好地保证原生质体的渗透压稳定性、完整性和活性。
优选地，所述酶解液包括如下组分：纤维素酶1％、离析酶0.5％、果胶酶0.4％、甘露醇0.6M、KCl 15-25mM、pH为5.5-5.8的MES(2-吗啉乙磺酸)15-25mM、CaCl2 5-15mM、BSA0.05-0.15％(质量体积百分比)和DTT 3-6mM。
本发明使用的酶解液可仅由上述组分组成。更优选地，酶解液的组成如下：纤维素酶1％、离析酶0.5％、果胶酶0.4％、甘露醇0.6M、KCl 20mM、pH为5.7的MES 20mM、CaCl210mM、BSA 0.1％和DTT 5mM。
本发明优选使用的纤维素酶为纤维素酶R-10，优选使用的离析酶为离析酶R-10。
优选地，所述酶解的条件为：在25±2℃的黑暗条件下酶解5-6h。
上述酶解可在转速为50-60rpm的摇床上进行。
本发明发现，将酶解时间控制在上述范围内能够较好地保证原生质体的完整性和活性，低于上述酶解时间，会导致原生质体的数量降低，而更长的酶解时间容易破坏原生质体的完整性并降低其活性。
在上述酶解前，先将放入去除下表皮的叶片的酶解液遮光抽真空25-35min，再置于25±2℃的黑暗条件下酶解。遮光抽真空处理可使叶片与酶解液更充分地接触。
在上述酶解后，将所述酶解溶液过65-75μm的筛网得到所述酶解产物。优选使用70μm的筛网。
具体地，收集可滤过所述筛网大小的成分，以500-700rpm离心4-6min后得到原生质体沉淀，以W5溶液进行洗涤。
优选地，在上述酶解产物中加入W5溶液洗涤1-3次，所述W5溶液包括如下组分：NaCl 150-160mM、CaCl2 120-130mM、KCl 3-7mM和pH为5.5-5.8的MES 1-3mM。
优选使用的W5溶液组成如下：NaCl 154mM、CaCl2 125mM、KCl 5mM和MES 2mM(pH5.7)。
所述洗涤采用离心的方法分离，所述离心的转速为500-700rpm，时间为4-6min。
具体地，洗涤过程包括用W5溶液轻轻重悬原生质体沉淀，以500-700rpm离心5min，弃上清，收集管底的原生质体。
在洗涤后还可将得到的原生质体进行冷处理，所述冷处理为以W5溶液重悬原生质体，静置于冰上25-35min。
在上述洗涤或上述冷处理后，将得到的原生质体重悬于悬浮液中，悬浮液包括如下组分：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
上述经悬浮液重悬的原生质体可直接用于遗传转化。
本发明提供一种酶解液，其包括如下组分：纤维素酶1％、离析酶0.5％、果胶酶0.4％、甘露醇0.6M、KCl 15-25mM、pH为5.5-5.8的MES 15-25mM、CaCl2 5-15mM、BSA 0.05-0.15％和DTT 3-6mM。
上述酶解液可仅由以上所述的组分组成。
上述酶解液适合用于紫薇叶肉的酶解并制备原生质体。
本发明提供所述酶解液在制备紫薇原生质体中的应用。优选地，所述原生质体为叶肉原生质体。
本发明的有益效果在于：本发明针对紫薇提供原生质体的制备方法，该方法以紫薇叶片为材料，将紫薇叶片去除下表皮，将去除下表皮的叶肉在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体。该方法能够高效地从紫薇幼嫩叶片中提取获得完整的原生质体，分离所得原生质体的数量可达2.8×106个/g·FW(紫薇叶片鲜重)，且原生质体具有较高的完整性和活性。该方法为紫薇的分子育种提供了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例2中紫薇叶片的处理方式，其中，左图为去除下表皮的状态(实施例1)，右图为切成细丝的状态(对比例2)。
图2为本发明实施例1中提取的紫薇原生质体在10倍镜下的图片。
图3为本发明实施例1中提取的紫薇原生质体在10倍镜下FDA染色后的图片。
图4为本发明对比例1中提取的紫薇原生质体在20倍镜下血球计数板中方格内的图片。
图5为本发明对比例3中提取的紫薇原生质体在10倍镜下的图片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的纤维素酶为纤维素酶R-10，购自上海源叶生物科技有限公司，货号为S10043-25g；使用的离析酶为离析酶R-10，购自上海源叶生物科技有限公司，货号为S10082-10g；使用的果胶酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号为S10007-25g。
实施例1
本实施例提供一种紫薇原生质体的制备方法，具体步骤如下：
(1)取紫薇当年生枝条修剪后萌发出的幼嫩枝条上的叶片，清洗后擦干，将紫薇叶片放置在25℃的遮光气候箱内处理20-30min，使叶片轻微失水萎蔫，以叶片开始变软失水但未出现边缘卷曲为标准，将处理后叶片的上表皮用胶带固定后，将下表皮撕下，上表皮朝上放入酶解液中(图1)；
酶解液组成为：纤维素酶1％、离析酶0.5％、果胶酶0.4％、0.6M甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH5.7)、10mM CaCl2、0.1％BSA和5mM DTT；
(2)将步骤(1)得到的盛有酶解液和紫薇叶肉的培养皿开盖遮光抽真空30min，然后将抽真空后的酶解液遮光放置在25℃、转速为50rpm的摇床上酶解5h，得到酶解溶液；
(3)将步骤(2)得到的酶解溶液用70μm的细胞筛过滤到50ml的离心管中，以500rpm水平离心5min，弃上清得到原生质体沉淀；向离心管中加入15ml W5溶液，500rpm水平离心5min，弃上清，重复2次；将清洗后的原生质体沉淀以4℃预冷的W5溶液重悬，置于冰上30min；
W5溶液组成成分为：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES(pH5.7)；
(4)将步骤(3)得到的冷处理的原生质体离心后弃上清，用适量重悬液重悬，得到提纯后的原生质体；
重悬液组成成分为：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
制备得到的原生质体的镜检结果如图2所示，将制备得到的原生质体进行计数：以血球计数板进行计数，原生质体数量约为2.8×106个/g·FW(紫薇叶片鲜重)。
使用荧光素双醋酸脂(FDA)检测原生质体活力，以丙酮溶解FDA粉末，配制成工作浓度1mg/ml的FDA溶液，吸取原生质体20μl，加入FDA工作液2μl，混匀后滴在载玻片上，在荧光显微镜下观察活性(图3)，结果显示，制备得到的原生质体具有较高的活性。
对比例1
本对比例提供一种紫薇原生质体的制备方法，具体步骤如下：
(1)取紫薇当年生枝条修剪后萌发出的幼嫩枝条上的叶片，清洗后擦干，将紫薇叶片放置在25℃的遮光气候箱内处理20-30min，使叶片轻微失水萎蔫，以叶片开始变软失水但未出现边缘卷曲为标准，将处理后叶片的上表皮用胶带固定，将下表皮撕下，上表皮朝上放入酶解液中；
酶解液的组成为：2％纤维素酶、0.5％离析酶、0.6M甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH5.7)、10mM CaCl2、0.1％BSA和5mM DTT；
(2)将步骤(1)得到的盛有酶解液和紫薇叶肉的培养皿开盖遮光抽真空30min，然后将抽真空后的酶解液遮光放置在25℃、转速为50rpm的摇床上酶解5h，得到酶解溶液；
(3)将步骤(2)得到的酶解溶液用70μm的细胞筛过滤到50ml的离心管中，以500rpm水平离心5min，弃上清得到原生质体沉淀；向离心管中加入15ml W5溶液，500rpm水平离心5min，弃上清，重复2次；将清洗后的原生质体沉淀以4℃预冷的W5溶液重悬，置于冰上30min；
W5溶液的组成成分为：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mMKCl和2mM MES(pH5.7)；
(4)将步骤(3)得到的冷处理的原生质体离心后弃上清，用适量重悬液重悬，得到提纯后的原生质体；
重悬液的组成成分为：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
将制备得到的原生质体在20倍镜下进行观察(图4)，并以血球计数板进行计数，原生质体数量约为1.12×106个/g〃FW。
对比例2
本对比例提供一种紫薇原生质体的制备方法，具体步骤如下：
(1)取紫薇当年生枝条修剪后萌发出的幼嫩枝条上的叶片，清洗后擦干，用手术刀片将叶片切成长约3cm、宽0.5-1cm的细丝状，将叶片放入酶解液中(图1)；
酶解液的组成为：2％纤维素酶、0.5％离析酶、0.6M甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH5.7)、10mM CaCl2、0.1％BSA和5mM DTT。
(2)将步骤(1)得到的盛有酶解液和紫薇叶片的培养皿开盖遮光抽真空30min，然后将抽真空后的酶解液遮光放置在25℃、转速为50rpm的摇床上酶解5h，得到酶解溶液；
(3)将步骤(2)得到的酶解溶液用70μm的细胞筛过滤到50ml的离心管中，以500rpm水平离心5min，弃上清得到原生质体沉淀；向离心管中加入15ml W5溶液，500rpm水平离心5min，弃上清，重复2次；将清洗后的原生质体沉淀以4℃预冷的W5溶液重悬，置于冰上30min；
W5溶液的组成成分为：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES(pH5.7)。
(4)将步骤(3)得到的冷处理的原生质体离心后弃上清，用适量重悬液重悬，得到提纯后的原生质体；
重悬液的组成成分为：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
将制备得到的原生质体进行计数：以血球计数板进行计数，原生质体数量为4.8×105个/g·FW。
对比例3
本对比例提供一种紫薇原生质体的制备方法，具体步骤如下：
(1)取紫薇当年生枝条修剪后萌发出的幼嫩枝条上的叶片，清洗后擦干，用手术刀片将叶片切成长约3cm、宽0.5-1cm的细丝状，将叶片放入酶解液中；
酶解液的组成成分为：2％纤维素酶、0.5％离析酶、0.6M甘露醇、20mM KCl、20mMMES(pH5.7)、10mM CaCl2、0.1％BSA和5mM DTT。
(2)将步骤(1)得到的盛有酶解液和紫薇叶片的培养皿开盖遮光抽真空30min，然后将抽真空后的酶解液遮光放置在25℃、转速为50rpm的摇床上酶解5h，得到酶解溶液；
(3)将步骤(2)得到的酶解溶液用40μm的细胞筛过滤到50ml的离心管中，以500rpm水平离心5min，弃上清得到原生质体沉淀；向离心管中加入15ml W5溶液，500rpm水平离心5min，弃上清，重复2次；将清洗后的原生质体沉淀以4℃预冷的W5溶液重悬，置于冰上30min；
W5溶液的组成成分为：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES(pH5.7)。
(4)将步骤(3)得到的冷处理的原生质体离心后弃上清，用适量重悬液重悬，得到提纯后的原生质体；
重悬液的组成成分为：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
镜检发现几乎无法观察到正常的原生质体，多数为细胞碎片和杂质(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种紫薇原生质体的制备方法，其特征在于，包括：将新鲜的紫薇叶片轻微失水萎蔫后，将上表皮固定，撕去下表皮，得到去除下表皮的叶片，将去除下表皮的叶片在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体；
所述酶解液由如下组分组成：纤维素酶1%、离析酶0.5%、果胶酶0.4%、甘露醇0.6M、KCl15-25mM、pH为5.5-5.8的MES 15-25mM、CaCl2 5-15mM、BSA 0.05-0.15%和DTT 3-6mM；
所述酶解的条件为：在25±2℃的黑暗条件下酶解5-6h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫薇叶片为紫薇开展幼嫩叶片。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将放入去除下表皮的叶片的酶解液遮光抽真空25-35min，再置于25±2℃的黑暗条件下酶解。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述酶解溶液过65-75μm的筛网得到所述酶解产物。
5.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述酶解产物中加入W5溶液洗涤1-3次；
所述W5溶液包括如下组分：NaCl 150-160mM、CaCl2 120-130mM、KCl 3-7mM和pH为5.5-5.8的MES 1-3mM。
6.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述洗涤采用离心的方法分离，所述离心的转速为500-700rpm，时间为4-6min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将洗涤后的原生质体重悬于悬浮液中，所述悬浮液包括如下组分：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
CN202111108086.6A 2021-09-22 2021-09-22 一种紫薇原生质体的制备方法 Active CN113652390B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111108086.6A CN113652390B (zh) 2021-09-22 2021-09-22 一种紫薇原生质体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111108086.6A CN113652390B (zh) 2021-09-22 2021-09-22 一种紫薇原生质体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113652390A CN113652390A (zh) 2021-11-16
CN113652390B true CN113652390B (zh) 2023-08-11

Family

ID=78484028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111108086.6A Active CN113652390B (zh) 2021-09-22 2021-09-22 一种紫薇原生质体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113652390B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114214305B (zh) * 2022-01-18 2023-05-09 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用
CN114807007B (zh) * 2022-04-27 2023-08-22 江西农业大学 猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454447A (zh) * 2006-06-01 2009-06-10 教会高等教育科研与病人护理协会 与细胞pH相关的植物核酸及其用途
CN105026567A (zh) * 2013-01-11 2015-11-04 佛罗里达大学研究基金公司 提高植物生长和产量的材料和方法
CN105861414A (zh) * 2016-06-15 2016-08-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种紫花苜蓿原生质体的制备方法
KR20170087260A (ko) * 2016-01-20 2017-07-28 한국원자력연구원 아관목형 또는 분화용 배롱나무 변종식물
CN112779266A (zh) * 2019-11-06 2021-05-11 青岛清原化合物有限公司 在生物体内创制新基因的方法及应用
CN113249344A (zh) * 2020-02-07 2021-08-13 山东舜丰生物科技有限公司 抗除草剂突变蛋白、核酸及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454447A (zh) * 2006-06-01 2009-06-10 教会高等教育科研与病人护理协会 与细胞pH相关的植物核酸及其用途
CN105026567A (zh) * 2013-01-11 2015-11-04 佛罗里达大学研究基金公司 提高植物生长和产量的材料和方法
KR20170087260A (ko) * 2016-01-20 2017-07-28 한국원자력연구원 아관목형 또는 분화용 배롱나무 변종식물
CN105861414A (zh) * 2016-06-15 2016-08-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种紫花苜蓿原生质体的制备方法
CN112779266A (zh) * 2019-11-06 2021-05-11 青岛清原化合物有限公司 在生物体内创制新基因的方法及应用
CN113249344A (zh) * 2020-02-07 2021-08-13 山东舜丰生物科技有限公司 抗除草剂突变蛋白、核酸及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱栗琼.大花紫薇大小孢子的发生及雌雄配子体的发育.植物研究.2018,第38卷(第2期),全文. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113652390A (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113652390B (zh) 一种紫薇原生质体的制备方法
CN109355246B (zh) 一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用
CN111235087B (zh) 一种棉花原生质体制备方法
AU2020103127A4 (en) A soybean leaf protoplast separation method for subcellular localization
CN107267549B (zh) 一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法
CN112048464B (zh) 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法
CN110846270A (zh) 小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法
CN114214264B (zh) 一种草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法
CN115247145A (zh) 一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法
CN113897330A (zh) 一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法和应用
CN112980766A (zh) 一种棉花下胚轴单细胞的分离方法
CN111979173B (zh) 一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法
WO2024077899A1 (zh) 一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法
CN112063576A (zh) 一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法
CN112442476A (zh) 一种绣球原生质体制备及瞬时转化的方法
CN113249296B (zh) 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法
CN111718887A (zh) 一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用
CN102002498B (zh) 一种韧皮部特异性启动子及其应用
CN111718886A (zh) 一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用
Khentry et al. Protoplast isolation and culture of Dendrobium Sonia “Bom 17”
CN110358722B (zh) 一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法
JPH0434395B2 (zh)
CN113403254B (zh) 一种蜡梅原生质体的制备方法
Cocking et al. The isolation of protoplasts
CN110669718A (zh) 一种落羽杉根，茎，叶原生质体分离、纯化及瞬时高效转化的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant