CN112779266A - 在生物体内创制新基因的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程和生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种在无人工DNA模板的前提下，在生物体内创制新基因的方法及应用。所述方法是通过在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。本发明新基因能够改变生物体的生长、发育、抗性、产量等性状，具有重大应用价值。

Description

在生物体内创制新基因的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种在无人工DNA模板的前提下，在生物体内创制新基因的方法及应用。

背景技术

一般来讲，生物体内一个完整的基因表达盒包括启动子、5’非编码区(5’UTR)、编码区(CDS)或非编码RNA区(Non-coding RNA)、3’非编码区(3’UTR)、终止子等多个元件。非编码RNA在RNA水平上就能行使其生物学功能，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA。CDS区域包含外显子和内含子，转录出来的RNA翻译成蛋白之后，不同区段的氨基酸通常会形成不同的结构域(domain)，特异的结构域决定了蛋白的细胞内定位和功能(如核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、DNA结合结构域、转录激活结构域、酶催化中心等)。对于非编码RNA来讲，不同的区段也具有不同的功能。当基因的一个或几个元件发生变化，就会形成一个新的基因，可能产生新的功能。例如蟠桃中的PpOFP1基因上游发生一个1.7Mb的染色体片段倒位事件，形成新的启动子，在果实发育S2期，扁桃果实中PpOFP1表达量显著高于圆桃，可以抑制桃子果实的纵向发育，从而形成蟠桃扁平的表型(Zhou et al.2018.A1.7-Mbchromosomal inversion downstream of a PpOFP1 gene is responsible for flatfruit shape in peach.Plant Biotechnol.J.DOI:10.1111/pbi.13455)。

生物基因组中自然产生新基因需要漫长的进化过程，根据研究，新基因产生的分子机制包括外显子重排、基因复制、逆转座、可移动元件(转座子、反转座子)的整合、基因水平转移、基因融合分裂、从头起源等多种机制，通过新基因起源和功能进化在自然选择作用下在物种中得以保留。已在果蝇、拟南芥、灵长类动物中鉴定出的比较年轻的新基因经计算距今也已有数十万到数百万年历史(Long et al.2012.The origin and evolution ofnew genes.Methods Mol Biol.DOI:10.1007/978-1-61779-585-5_7)。因此在基因工程和生物育种领域，以植物为例，如果希望在植物中引入新的基因(即便是该新基因的所有基因元件均是来自于该物种自身的不同基因)，目前只能通过转基因技术来实现。即在体外将来自不同基因的元件组装在一起，形成新的基因，再将其通过转基因技术转入植物。其特征是新基因的组装需要在体外进行，产生的是转基因作物。

以CRISPR/Cas9等为代表的基因编辑工具，能够高效且精准地在生物体基因组的特定位置产生双链断裂(DSB)，随后通过细胞自身的非同源末端修复或同源重组的机制修复双链断裂，产生定点突变。基因编辑目前的应用主要集中在针对单个基因内部元件的编辑，其中对CDS外显子区域的编辑最为普遍，在外显子上编辑的结果通常会造成基因的移码突变，导致该基因功能的丧失，为此，CRISPR/Cas9等基因编辑工具，也被称为基因敲除(即破坏基因)工具。除了针对CDS区域，对启动子、5’UTR等区域也可以通过敲除的方式，影响该基因的表达量。这些方法都是对现有基因进行突变，没有产生新的基因，因此难以满足一些生产上的需求，例如对多数基因而言，现有的基因编辑技术很难实现基因表达量的上调，也很难定向改变蛋白的亚细胞定位或改变蛋白的功能结构域。也有文献报道在现有基因的上游定点插入一段启动子或增强子的序列能够改变基因的表达模式从而产生新的性状(Luet al.2020.Targeted,efficient sequence insertion and replacement in rice.NatBiotechnol.DOI:10.1038/s41587-020-0581-5)，但这种方法需要提供外源DNA模板，可能受到类似转基因作物的严格监管程序，限制了其应用。

发明简述

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种仅通过在生物体基因组特定位置的组合上同时产生两个以上DNA双链断裂的形式，并且在不提供人工DNA模板的情况下，在生物体内创制新基因的方法和应用。

本发明一方面提供了一种在生物体内创制新基因的方法，包括以下步骤：

在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。

在一具体实施方式中，所述的“至少两个不同的特定位置”，可以位于同一条染色体上，也可以位于不同染色体上。当位于同一条染色体上时，两个特定位置处同时发生DNA断裂后产生的染色体片段经修复后可能发生该片段的删除、倒置或复制加倍等事件；当位于不同染色体上时，两个特定位置处产生的DNA断裂经修复后可能相互连接产生染色体臂的交换事件。这些事件可以通过设计特异的引物进行PCR测序鉴定筛选。

在一具体实施方式中，所述的“至少两个不同的特定位置”，可以在至少两个不同基因上的特定位置，也可以在同一基因上的至少两个不同的特定位置。

在一具体实施方式中，所述的“至少两个不同基因”的转录方向可以相同，也可以不同(相反或相对)。

在一具体实施方式中，所述的“DNA断裂”，是通过将具有靶向特性的核酸酶递送到生物体细胞内与基因组DNA特定位置接触实现的。此种DNA断裂与通过传统技术手段(如辐射或化学诱变)产生的DNA断裂无本质差异。

在一具体实施方式中，所述的“具有靶向特性的核酸酶”包括Meganuclease、Zincfinger nuclease(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas系统。

其中，CRISPR/Cas系统可通过两个以上靶向不同序列的引导RNA在基因组不同的位置上，同时产生两处以上DNA双链断裂；Zinc finger nuclease、TALEN系统可以通过针对两个以上特定位置序列分别设计ZFN蛋白或TALEN蛋白，同时产生两处以上DNA双链断裂。当两个断裂位于同一条染色体上时，可能会发生删除、倒置、加倍等修复结果；当两个断裂位于两条不同的染色体上时，则有可能出现染色体臂的交换。两个DNA断裂处染色体片段的删除、倒置、加倍、交换等能够对不同的基因元件或蛋白结构域重新组合产生新的功能基因。

在一具体实施方式中，所述“具有靶向特性的核酸酶”以DNA形式存在。

在另一具体实施方式中，所述“具有靶向特性的核酸酶”以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。

在一具体实施方式中，将具有靶向特性的核酸酶递送到细胞内的方法选自1)PEG介导的细胞转染的方法；2)脂质体介导的细胞转染的方法；3)电击转化的方法；4)显微注射；5)基因枪轰击；或6)农杆菌介导的转化方法。

所述“基因元件”，包括基因的启动子、5’非编码区(5’UTR)、编码区(CDS)或非编码RNA区(Non-coding RNA)、3’非编码区(3’UTR)和终止子。

在一具体实施方式中，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的CDS或非编码RNA区的组合。

在一具体实施方式中，所述不同基因元件的组合中一个为生物内源强启动子，另外一个为HPPD、EPSPS、PPO或GH1基因编码区。

在另一具体实施方式中，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5’UTR区域和另一基因的CDS或非编码RNA区的组合。

在一具体实施方式中，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异。

在另一具体实施方式中，所述“不同表达模式”为基因表达组织特异性的差异。

在另一具体实施方式中，所述“不同表达模式”为基因表达发育时期特异性的差异。

在另一具体实施方式中，所述不同基因元件的组合为同一基因内相邻基因元件的组合。

所述“蛋白结构域”是指对应于蛋白质特定功能结构域的DNA片段；其包括但不限于核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、磷酸化位点、甲基化位点、跨膜结构域、DNA结合结构域、转录激活结构域、受体激活结构域、酶催化中心等。

在一具体实施方式中，所述不同蛋白结构域的组合为两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域的组合。

在一具体实施方式中，所述“不同亚细胞定位”包括但不限于核定位、胞质定位、细胞膜定位、叶绿体定位、线粒体定位或内质网膜定位。

在另一具体实施方式中，所述不同蛋白结构域的组合为两种不同生物学功能的蛋白结构域的组合。

在一具体实施方式中，所述“不同生物学功能”包括但不限于识别特异DNA或RNA保守序列、激活基因表达、结合蛋白配体、结合小分子信号、离子结合或特异的酶促反应。

在另一具体实施方式中，所述不同蛋白结构域的组合为同一基因内相邻蛋白结构域的组合。

在另一具体实施方式中，所述基因元件和蛋白结构域的组合为同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5’UTR、3’UTR或终止子的组合。

具体而言，可通过染色体片段倒置实现不同基因启动子的互换：当位于同一条染色体的两个基因的方向不同时，分别在两个基因的启动子和CDS之间选择特定位置产生DNA断裂，断口之间的区域发生倒置，即可实现这两个基因启动子的互换，在倒置染色体片段两端产生了两个新的基因。两个基因的方向不同，分为两种情形，一是5’端在内侧，即基因方向相反，二是5’端在外侧，即基因方向相对。基因方向相反的情况下，倒置的是基因的启动子，如图2方案1所示；基因方向相对的情况下，倒置的是基因的CDS区，如图4方案1所示。倒置的区域可以很短，长度小于10kb，之间没有其它基因；倒置的区域也可以很长，达到300kb-3Mb，包含上百个基因。

也可以通过染色体片段加倍创制新的基因：当位于同一条染色体的两个基因的方向相同时，分别在两个基因的启动子和CDS之间选择特定位置产生DNA断裂，断口之间的区域发生复制加倍，会在加倍片段的连接处形成由下游基因启动子和上游基因CDS区融合而成的新基因，如图1方案1和图3所示。加倍区域的长度在500bp-5Mb范围内，可以很短，之间没有其它基因，也可以很长，包含上百个基因。这种方法虽然会给原来的两个基因的启动子和CDS区域间造成点突变，但是这种小范围的点突变一般对基因表达特性影响不大，而启动子替换创造出来的新基因则具有新的表达特性。或者在位于同一基因的蛋白结构域两侧选择特定位置产生DNA断裂，断口之间的区域发生复制加倍，会形成特异功能结构域加倍的新基因。

本发明另一方面提供了一种在生物体内创制新基因的方法，包括以下步骤：

通过在生物体基因组或染色体水平上，至少两个不同的基因上特定位置的DNA产生断裂，实现DNA的转移、加倍、倒置或删除，其中，特定的一个内源基因的元件和另外一个特定基因元件，通过非同源末端(NHEJ)或同源修复的方式连接在一起，形成新基因。

本发明还提供一种采用所述方法获得的新基因。

所述的新基因与原基因相比，或具有不同启动子并因此具有了不同组织或不同强度或不同发育时期的表达特性，或具有了新的氨基酸序列。

所述的“新的氨基酸序列”，即可以是两个以上基因编码区的整体融合，也可以是编码区的部分融合或同一基因部分蛋白编码区的加倍。

在一具体实施方式中，所述新基因为高表达生物内源HPPD、EPSPS、PPO或GH1基因。

本发明另外提供一种包含所述基因的DNA。

本发明另外提供一种利用包含所述基因编码的蛋白或其生物活性片段。

本发明另外提供一种重组表达载体，其包含所述的基因，以及与之可操作地连接的启动子。

本发明另外提供一种包含所述基因的表达盒。

本发明另外提供一种宿主细胞，其中包含有所述的表达盒。优选地，所述宿主细胞是植物细胞、动物细胞或真菌细胞。

本发明另外提供采用所述宿主细胞再生成的生物。

本发明另外提供一种所述的基因在赋予或提高生物体抗性/耐受性性状或生长优势性状上的应用。

本发明另外提供一种组合物，其包含：

(a)两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区或非编码RNA区；

(b)两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5’非编码区和另一基因的编码区或非编码RNA区；

(c)同一基因内相邻基因元件；

(d)两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域；

(e)两种不同生物学功能的蛋白结构域；

(f)同一基因内相邻蛋白结构域；或者，

(g)同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5’非编码区、3’非编码区或终止子。

在一具体实施方式中，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异。

在一另具体实施方式中，所述“不同表达模式”为基因表达组织特异性的差异。

在另一具体实施方式中，所述“不同表达模式”为基因表达发育时期特异性的差异。

在一具体实施方式中，所述“不同亚细胞定位”包括但不限于核定位、胞质定位、细胞膜定位、叶绿体定位、线粒体定位或内质网膜定位。

在一具体实施方式中，所述“不同生物学功能”包括但不限于识别特异DNA或RNA保守序列、激活基因表达、结合蛋白配体、结合小分子信号、离子结合或特异的酶促反应。

在一具体实施方式中，所述的组合物在体内融合。

特别的，本发明还提供了一种不依赖于外源DNA供体片段，在生物体中提高目标内源基因表达水平的编辑方法，包括以下步骤：分别在所述目标内源基因与可选的内源高表达基因的启动子和CDS之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生目标内源基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达内源基因。此种方法命名为敲高内源基因的编辑方法。

在一具体实施方式中，所述目标内源基因与可选的内源高表达基因位于同一染色体上。

在另一具体实施方式中，所述目标内源基因与可选的内源高表达基因位于不同染色体上。

本发明另一方面提供了一种在植物中敲高内源HPPD基因表达的编辑方法，其是将HPPD基因编码区与植物内源强启动子体内融合，形成新的高表达植物内源HPPD基因。即分别在HPPD基因与可选的内源高表达基因的启动子和CDS之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过细胞内修复途径互相连接，产生HPPD基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达HPPD基因。在水稻中，强启动子优选ubiquitin2基因的启动子。

本发明还提供了一种采用所述编辑方法获得的高表达植物内源HPPD基因。

本发明还提供了一种高表达水稻内源HPPD基因具有选自下述的序列：

(1)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的核酸序列或其部分序列或其互补序列；

(2)与(1)限定的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％以上同一性；或

(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列。

本发明另一方面提供了一种在植物中敲高内源EPSPS基因表达的编辑方法，其是将EPSPS基因编码区与植物内源强启动子体内融合，形成新的高表达植物内源EPSPS基因。即分别在EPSPS基因与可选的内源高表达基因的启动子和CDS之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过细胞内修复途径互相连接，产生EPSPS基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达EPSPS基因。在水稻中，强启动子优选TKT基因的启动子。

本发明还提供了一种采用所述编辑方法获得的高表达植物内源EPSPS基因。

本发明还提供了一种高表达水稻内源EPSPS基因具有选自下述的序列：

(1)如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的核酸序列或其部分序列或其互补序列；

(2)与(1)限定的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％以上同一性；或

(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列。

本发明另一方面提供了一种在植物中敲高内源PPO(PPOX)基因表达的编辑方法，其是将PPO基因编码区与植物内源强启动子体内融合，形成新的高表达植物内源PPO基因。即分别在PPO基因与可选的内源高表达基因的启动子和CDS之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过细胞内修复途径互相连接，产生PPO基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达PPO基因。在水稻中，强启动子优选CP12基因的启动子。在拟南芥中，强启动子优选ubiquitin10基因的启动子。

本发明还提供了一种采用所述编辑方法获得的高表达植物内源PPO基因。

本发明还提供了一种高表达水稻内源PPO基因具有选自下述的序列：

(1)如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的核酸序列或其部分序列或其互补序列；

(2)与(1)限定的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％以上同一性；或

(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列。

本发明另外提供一种包含所述HPPD、EPSPS或PPO基因的DNA。

本发明另外提供一种利用包含所述HPPD、EPSPS或PPO基因编码的蛋白或其生物活性片段。

本发明另外提供一种重组表达载体，其包含所述HPPD、EPSPS或PPO基因，以及与之可操作地连接的启动子。

本发明另外提供一种包含所述HPPD、EPSPS或PPO基因的表达盒。

本发明另外提供一种宿主植物细胞，其中包含有所述的表达盒。

本发明另外提供采用所述宿主植物细胞再生成的植物。

本发明另外提供一种生产对于除草剂的抗性或耐受性提高的植物的方法，其中包括将所述的宿主植物细胞再生成植物及其衍生后代。

在一具体实施方式中，所述对于除草剂的抗性或耐受性提高的植物是将宿主植物细胞再生成的植物与野生型杂交通过遗传分离去除外源转基因成分的非转基因株系。

本发明还提供了一种抗除草剂水稻，其中包含上述高表达水稻内源HPPD基因、高表达水稻内源EPSPS基因、高表达水稻内源PPO基因其中之一或其任意组合。

在一具体实施方式中，所述抗除草剂水稻是非转基因的。

本发明另外提供所述高表达植物内源HPPD、EPSPS或PPO基因在提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的相应抑制性除草剂抗性或耐受性上的应用。

本发明另一方面又提供了一种控制植物栽培场所的杂草的方法，其中所述植物包括上述的植物或者通过上述方法制备的植物，所述方法包括对所述栽培场所施用控制杂草有效量的一种或多种HPPD、EPSPS或PPO抑制性除草剂。

本实验室在研究工作中发现，同时进行双靶点或多靶点基因编辑的细胞中，不同靶点处的DNA双链断裂末端有一定的比例产生自发的相互连接，从而产生同一染色体上靶点间片段的删除、倒位或复制加倍事件，以及不同染色体靶点之间的染色体片段交换。有文献报道，这种现象在动植物中普遍存在(Puchta et al.2020.Changing localrecombination patterns in Arabidopsis by CRISPR/Cas mediated chromosomeengineering.Nat Commun.DOI:10.1038/s41467-020-18277-z；Li et al.2015.Efficientinversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and geneclusters by CRISPR/Cas9.J Mol Cell Biol.DOI:10.1093/jmcb/mjv016)。利用这一发现，在目标基因的特定元件附近设计基因编辑靶点组合，引起DNA双链断裂与自发的修复连接，不需要提供外源DNA模板即可在基因组水平上实现不同基因元件的定向组合，从中可能产生有功能的新基因，从而极大加速新基因的产生，在动植物育种和基因功能研究中都有极大的应用潜力。

发明详述

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本文所用术语“基因组”是指存在于生物体的每个细胞或病毒或细胞器中的遗传物质(基因和非编码序列)的全部互补物，和/或从一个亲本作为一个单位(单倍体)遗传的完整染色体组。

术语“基因编辑”是指针对活体有机体的任何遗传信息或基因组的靶向特异性修饰的策略和技术。因此，术语包括基因编码区的编辑，但也包括除基因组的基因编码区之外的区域的编辑。它还包括编辑或改造核(如果存在)以及细胞的其他遗传信息。

术语“CRISPR/Cas核酸酶”可以是基于CRISPR的核酸酶或编码其的核酸序列，包括但不限于：1)Cas9，包括SpCas9，ScCas9，SaCas9，xCas9，VRER-Cas9，EQR-Cas9，SpG-Cas9，SpRY-Cas9，SpCas9-NG，NG-Cas9，NGA-Cas9(VQR)等，2)Cas12，包括LbCpf1，FnCpf1，AsCpf1，MAD7等，或前述基于CRISPR的核酸酶的任何变体或衍生物，优选其中所述至少一个基于CRISPR的核酸酶与相应的野生型序列相比包含突变，使得所获得的基于CRISPR的核酸酶识别不同的PAM序列。如本文所用，“基于CRISPR的核酸酶”是已经在天然存在的CRISPR系统中鉴定的任何核酸酶，其随后从其天然背景中分离，并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的重组构建体，适合作为靶向基因组工程的工具。只要最初的基于野生型CRISPR的核酸酶提供DNA识别，即结合特性，任何基于CRISPR的核酸酶都可以使用并任选重新编程或另外突变以适合本发明的各种实施方案。

术语“CRISPR”指代依赖于成簇规律间隔短回文重复序列途径的序列特异性遗传操纵技术，其不同于RNA干扰在转录水平下调节基因表达。

“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。

“Cas蛋白”或“Cas多肽”是指由Cas(CRISPR-相关的)基因编码的多肽。Cas蛋白包括Cas内切核酸酶。Cas蛋白可以是细菌或古细菌蛋白。例如，本文中的I-III型CRISPR Cas蛋白通常起源于原核生物；I型和III型Cas蛋白可以源自于细菌或古细菌物种，而II型Cas蛋白(即Cas9)可以源自于细菌种类。Cas蛋白包括Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas5、Cas7、Cas8、Cas10、Cas12a、Cas12b或这些的组合或复合物。

“Cas9变体”或“Cas9内切核酸酶变体”是指亲本Cas9内切核酸酶的变体，其中当与crRNA和tracRNA或与sgRNA相缔合时，Cas9内切核酸酶变体保留以下能力：识别、结合DNA靶序列的全部或部分并任选地解旋DNA靶序列的全部或部分、使DNA靶序列的全部或部分产生切口、或切割DNA靶序列的全部或部分。Cas9内切核酸酶变体包括本文所述Cas9内切核酸酶变体，其中所述Cas9内切核酸酶变体不同于亲本Cas9内切核酸酶，其方式为：所述Cas9内切核酸酶变体(当与gRNA复合以形成能够修饰靶位点的、多核苷酸指导的内切核酸酶复合物时)与亲本Cas9内切核酸酶(与相同的gRNA复合以形成能够修饰相同靶位点的、多核苷酸指导的内切核酸酶复合物)相比时具有至少一种改善的特性，例如，但不限于，增加的转化效率、增加的DNA编辑效率、减少的脱靶切割、或其任意组合。

本文所述的Cas9内切核酸酶变体包括当与crRNA和tracrRNA或与sgRNA相缔合时可结合双链DNA靶位点并使双链DNA靶位点产生切口的变体，而亲本Cas内切核酸酶当与crRNA和tracrRNA或与sgRNA相缔合时可在靶位点处结合并使双链断裂(切割)。

“引导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，指代用于靶向特定基因从而采用CRISPR技术进行校正的引导RNA序列，通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而，本领域已知可以设计单一引导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。

术语“单一引导RNA”和“sgRNA”在本文中可互换使用，并涉及两个RNA分子的合成融合，其中包含可变靶向结构域(与tracrRNA杂交的tracr配对序列连接)的crRNA(CRISPRRNA)与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)融合。sgRNA可以包含可与II型Cas核酸内切酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述引导RNA/Cas核酸内切酶复合物可以将Cas核酸内切酶引导至DNA靶位点，使得Cas核酸内切酶能够识别、任选地结合DNA靶位点、并任选地使DNA靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)DNA靶位点。

在某些实施方式中，引导RNA(一个或多个)和Cas9可以作为核糖核蛋白(RNP)复合物递送至细胞。RNP由与gRNA复合的纯化的Cas9蛋白组成，并且在本领域中众所周知RNP可以被有效地递送到多种类型的细胞中，包括但不限于干细胞和免疫细胞(Addgene，Cambridge，MA、Mirus Bio LLC，Madison，WI)。

本文中的原间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)是指与由gRNA/Cas内切核酸酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间隔子)邻近的短核苷酸序列。如果靶DNA序列不邻近合适的PAM序列，则Cas内切核酸酶可能无法成功识别所述靶DNA序列。本文中的PAM的序列和长度可以取决于所使用的Cas蛋白或Cas蛋白复合物而不同。所述PAM序列可以是任何长度，但典型地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长度。

如本文所使用的，术语“生物”，包括动物、植物、真菌、细菌等。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”，包括植物细胞、动物细胞、真菌细胞、细菌细胞等。

在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物，例如：(1)粮食作物：稻属(Oryza spp.)，例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、水稻(Oryza sativa)、光稃稻(Oryza glaberrima)；小麦属(Triticum spp.)，例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(T.Turgidumssp.durum)；大麦属(Hordeum spp.)，例如大麦(Hordeum vulgare)、亚利桑那大麦(Hordeum arizonicum)；黑麦(Secale cereale)；燕麦属(Avena spp.)，例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatuavar.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)；稗属(Echinochloa spp.)，例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、高粱(两色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、黑小麦、玉蜀黍或玉米、粟、稻(rice)、谷子、糜子、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、黍子、荞麦属(Fagopyrum spp.)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、沼生菰(Zizaniapalustris)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、稷(Panicum miliaceum)、龙爪稷(Eleusine coracana)；(2)豆类作物：大豆属(Glycine spp.)，例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)、Soja max)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、豌豆属(Pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、蚕豆属(Vicia)、酸豆(Tamarindus indica)、兵豆(Lens culinaris)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、扁豆属(Lablab)、蚕豆、绿豆、红豆、鹰嘴豆；(3)油料作物：花生(Arachis hypogaea)、落花生属(Arachis spp)、胡麻属(Sesamum spp.)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、大豆(soybean)、油菜(Brassicanapus)、芸苔、芝麻、芥菜(Brassicajuncea)、油菜籽油菜(oilseedrape)、油茶、油棕、油橄榄、蓖麻、欧洲油菜(Brassica napus L.)、卡诺拉油菜(canola)；(4)纤维作物：剑麻(Agave sisalana)、棉属(棉花、海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、红麻、剑麻、蕉麻、亚麻(Linum usitatissimum)、黄麻、苎麻、大麻(Cannabis sativa)、火麻；(5)水果类作物：枣属(Ziziphus spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、葡萄属(Vitis spp.)、越桔属(Vaccinium spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、苹果属(Malus spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、红仔果(Eugenia unifora)、枇杷(Eriobotrya japonica)、龙眼(Dimocarpus longan)、番木瓜(Carica papaya)、椰子属(Cocos spp.)、阳桃(Averrhoacarambola)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、扁桃(Prunus amygdalus)、芭蕉属(Musa spp.)(香蕉)、鳄梨属(Persea spp.)(鳄梨(Persea americana))、番石榴(Psidium guajava)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(油橄榄(Oleaeuropaea))、番木瓜(Caricapapaya)、椰子(Cocos nucifera)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、人心果(Manilkara zapota)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、柑桔树(柑桔属物种(Citrus spp.))、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、荔枝(Litchi chinensis)、茶藨子属(Ribes spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、梨、桃、杏、梅、杨梅、柠檬、金橘、榴莲、橙、草莓(straw berry)、蓝莓、哈密瓜、甜瓜、椰枣、胡桃树、樱桃树；(6)根茎类作物：木薯属(Manihot spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、芋(Colocasia esculenta)、榨菜、洋葱、荸荠、油莎草、山药；(7)蔬菜类作物：菠菜属(Spinacia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、苦瓜属(Momordica spp)、欧芹(Petroselinum crispum)、辣椒属(Capsicum spp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、无头甘蓝(kale)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、小扁豆(lentil)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collardgreens)、西葫芦(squash)、冬瓜(Benincasa hispida)、石刁柏(Asparagus officinalis)、旱芹(Apium graveolens)、苋属(Amaranthus spp.)、葱属(Allium spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、南瓜属(Cucurbita spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、萝卜(Rapbanus sativus)、芸苔属(Brassica)物种(例如例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)、卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)、芥菜、甘蓝、黑芥、油菜籽油菜)、孢子甘蓝、茄科植物(茄子)、甜椒、黄瓜、丝瓜、白菜、油菜、甘蓝、葫芦、韭菜、莲、藕、生菜；(8)花卉作物：小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、美人蕉(Canna indica)、仙人掌属(Opuntia spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、兰花、文殊兰、君子兰、朱顶红、玫瑰、月季、茉莉花、郁金香、樱花、牵牛花、金盏花、荷花、雏菊、康乃馨、矮牵牛花、郁金香、百合、梅花、水仙、迎春、报春、瑞香、山茶、白玉兰、紫玉兰、琼花、君子兰、海棠、牡丹、芍药、丁香、杜鹃、西洋杜鹃、含笑、紫荆、棣棠、锦带花、连翘、云南黄馨、金雀花、仙客来、蝴蝶兰、石斛、风信子、鸢尾、马蹄莲、金盏菊、百枝莲、四季海棠、吊钟海棠、竹节海棠、天竺葵、绿萝；(9)药用作物：红花(Carthamus tinctorius)、薄荷属(Menthaspp.)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、番红花(Crocus sativus)、枸杞、玉竹、黄精、知母、麦冬、贝母、郁金、砂仁、何首乌、大黄、甘草、黄芪、人参、三七、五加、当归、川芎、北柴胡、曼佗罗、洋金花、薄荷、益母草、藿香、黄芩、夏枯草、除虫菊、银杏、金鸡纳树、天然橡胶树、苜蓿、胡椒、板蓝根、白术；(10)原料作物：橡胶、蓖麻(Ricinus communis)、油桐、桑、忽布、桦、桤木、漆树；(11)牧草作物：冰草属(Agropyron spp.)、车轴草属(Trifolium spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、虉草(Phalaris arundinacea)、柳枝稷(Panicum virgatum)、草原草(prairiegrasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)、梯牧草(Phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科(高山嵩草、脚苔草(Carex pediformis)、低苔草)、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫云英、柽麻、田菁、红萍、水葫芦、紫穗槐、羽扇豆、三叶草、沙打旺、水浮莲、水花生、黑麦草；(12)糖料作物：甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))、甜菜(Beta vulgaris)；(13)饮料作物：大叶茶(Camellia sinensis)、茶(Camellia Sinensis)、茶树(tea)、咖啡(咖啡属物种(Coffeaspp.))、可可树(Theobroma cacao)、蛇麻花(啤酒花)；(14)草坪植物：固沙草(Ammophilaarenaria)、早熟禾属(Poa spp.)(草地早熟禾(Poa pratensis)(蓝草))、剪股颖属物种(Agrostis spp.)(剪股颖、匍匐剪股颖(Agrostis palustris))、黑麦草属物种(Loliumspp.)(黑麦草)、羊茅属物种(Festuca spp.)(羊茅)、结缕草属物种(Zoysia spp.)(结缕草(Zoysiajaponica))、狗牙根属物种(Cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、侧钝叶草(Stenotaphrum secunda tum)(圣奥古斯丁草)、雀稗属物种(Paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(Eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(Axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(Bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草属变种物种(Bouteloua var.spp.)(格兰马草)、马唐(Digitariasanguinalis)、香附子(Cyperusrotundus)、短叶水蜈蚣(Kyllingabrevifolia)、阿穆尔莎草(Cyperusamuricus)、加拿大飞蓬(Erigeroncanadensis)、天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)、鸡眼草(Kummerowiastriata)、地锦(Euphorbiahumifusa)、耕地堇菜(Violaarvensis)、白颖苔草、异穗苔草、草皮草(turf)；(15)树木作物：松属(Pinus spp.)、柳属(Salix sp.)、槭树属(Acer spp.)、木槿属(Hibiscus spp.)、桉属(Eucalyptus sp.)、银杏(Ginkgo biloba)、箣竹属(Bambusa sp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、栎属(Quercusspp.)、刺葵属(Phoenix spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、吉贝(Ceiba pentandra)、樟属(Cinnamomum spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、杨、常春藤、白杨、珊瑚树、银杏、栎类、臭椿、木荷、冬青、悬铃木、女贞、大叶黄扬、落叶松、黑荆树、马尾松、思茅松，云南松、南亚松、油松、红松、黑胡桃、柠檬、悬铃木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荆、羊蹄甲、雨树、合欢、龙牙花、刺桐、广玉兰、苏铁、紫薇、针叶树、乔木、灌木；(16)坚果作物：巴西栗(Bertholletia excelsea)、栗属(Castanea spp.)、榛属(Corylus spp.)、山核桃属(Caryaspp.)、核桃属(Juglans spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、开心果、巴旦木以及产生坚果的植物；(17)其他：拟南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、Cadaba farinosa、藻类(algae)、Carex elata、观赏植物、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、薯蓣属(Dioscoreaspp.)、蔗茅属(Erianthus sp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、萱草(Hemerocallisfulva)、百脉根属(Lotus spp.)、Luzula sylvatica、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、黑桑(Morus nigra)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Oleaspp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、欧防风(Pastinaca sativa)、接骨木属(Sambucusspp.)、白芥属(Sinapis sp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、香堇(Viola odorata)等。

在一具体实施方式中，所述植物选自水稻、玉米、小麦、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、谷子、甘蔗、番茄、烟草、木薯、马铃薯、甘薯、白菜、甘蓝、黄瓜、月季、绿萝、西瓜、甜瓜、草莓、蓝莓、葡萄、苹果、柑橘、桃、梨、香蕉等。

如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子)；植物插条(plant cutting)；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。一些植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。

植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单元。如本文所使用的，植物细胞包括原生质体和具有部分细胞壁的原生质体。植物细胞可以是处于分离的单个细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散愈伤组织和培养的细胞)，并且可以是更高级组织单元(例如，植物组织、植物器官、和完整植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞，或者能够再生成完整植物的细胞或细胞的集合。因此，在本文的实施方案中，包含多个植物细胞并能够再生成为整株植物的种子被认为是一种“植物部分”。

如本文所使用的，术语“原生质体”是指细胞壁被完全或部分地除去、其脂双层膜裸露的植物细胞。典型地，原生质体是没有细胞壁的分离植物细胞，其具有再生成细胞培养物或整株植物的潜力。

植物“后代”包括植物的任何后续世代。

“抑制性除草剂耐受性”和“抑制性除草剂抗性”两个术语可以互换使用，均指的是对抑制性除草剂的耐受性和对抑制性除草剂的抗性。“抑制性除草剂耐受性提高”和“抑制性除草剂抗性提高”是指对所述抑制性除草剂的耐受性或抗性与含有野生型基因的植物相比提高。

术语“野生型”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质。

在本发明中，术语“场所”包括栽培本发明植物的场地例如土壤，也包括例如植物种子、植物苗以及长成的植物。术语“控制杂草有效量”指的是除草剂的量足以影响目标杂草的生长或发育，例如阻止或抑制目标杂草的生长或发育，或者杀灭所述杂草。有利地，所述控制杂草有效量不会显著影响本发明植物种子、植物苗或植物的生长和/或发育。本领域技术人员可以通过常规实验确定这样的控制杂草有效量。

术语“基因”包括表达功能性分子(诸如但不限于，特定蛋白质)的核酸片段，包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。

“编码”具体RNA的DNA序列为转录成RNA的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或DNA多核苷酸可编码不翻译成蛋白质的RNA(例如tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；又称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。

“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“生物活性片段”是指从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性的片段。

术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“核苷酸序列”和“核酸序列”均是指DNA或RNA中碱基的排列顺序。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的SEQ ID No.9～SEQ ID No.17所示的DNA片段进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的前述任一序列所示的DNA片段至少75％同一性的核苷酸，且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机序列比对软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。“部分序列”意味着给定序列的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

所述严谨条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

如本发明所用，“表达盒”“表达载体”和“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在植物中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。

本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。

本发明的“高表达基因”是指在特定的组织中表达量高于普通基因的基因。

术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可互换使用，是指包含载体和至少一个插入物的DNA分子。通常出于表达和/或繁殖插入物的目的或出于构建其它重组核苷酸序列而产生重组表达载体。插入物可以可操作的或可以不可操作地连接至启动子序列并且可以可操作的或可以不可操作地连接至DNA调节序列。

“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。植物表达调控元件指的是能够在植物中控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。

调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。

术语“强启动子”是本领域众所周知的并广泛使用的术语，许多强启动子是本领域已知的，或者可以通过常规实验来鉴定。所述启动子的活性高于与野生型生物中待过量表达的核酸分子有效连接的启动子的活性，例如活性比内源基因的启动子更高的启动子。优选地，强启动子的活性比与野生型生物中待过量表达的核酸分子有效连接的启动子的活性高约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或超过1000％。本领域技术人员知晓如何测定启动子活性，并比较不同的启动子的活性。

“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的DNA序列。

如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。

将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质“导入”植物是指用所述核酸或蛋白质转化植物细胞，使得所述核酸或蛋白质在植物细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。

“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入植物基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述植物和其任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入植物细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进植物基因组中。

改变生物体内源基因的表达包括了强度和时空特性两个方面。强度包括调高(即敲高)、调低(即敲低)和调零(即敲除)；时空特异性包括了时间(生育时期)特异性和空间(组织)特异性两种，也包括了诱导性。此外，改变蛋白的靶向性，例如是将定位在细胞质中的蛋白改成叶绿体定位或细胞核定位。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与通过本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然还可在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利以引用的方式并入本文如同每个单独的出版物或专利均确切地和单独地指出以引用的方式并入一样，并且以引用的方式并入本文以公开和描述与出版物所引用的相关的方法和/或材料。任何出版物的引用为其公开在申请日之前并且不应该解释为承认本发明没有资格先于现有发明的这种出版物。此外，所提供的出版日期可与实际出版日期不同，这可能需要独立证实。

除非具体说明或暗示，如本文中所用，术语“一”、“一个/一种”和“所述”表示“至少一个”。本文提到或引用的所有专利、专利申请和出版物整体引入本文作为参考，其引用程度如同单独地个别引用一样。

本发明具有如下优异技术效果：

本发明综合运用了以下两个不同专业领域的信息，开发了在生物体内直接创制新基因的方法，完全改变了原先基因编辑工具的常规用途(即敲除基因)，实现了创制新基因的新用途，特别的，实现了通过基因编辑技术提高目标基因表达量的敲高内源基因的编辑方法。一是基因编辑领域的信息，即当两个以上不同的靶点与Cas9同时靶向生物基因组时，可以出现删除、倒置、加倍或倒置加倍组合等不同情况。二是基因组学领域的信息，即基因组上不同基因的位置，距离，以及基因内不同元件(启动子、5’UTR、编码区(CDS)、不同的结构域区域、终止子等)的具体位置、方向、功能，不同基因的表达特异性信息等。结合这两个不同领域的信息，在两个以上不同基因的特定位置或单个基因内的两个以上特定位置(具体位置由基因组学领域提供)进行切割，通过删除、倒置、加倍、倒置加倍组合或染色体臂的交换等(具体情形由基因编辑领域提供)，形成不同基因元件或功能结构域的新组合，特异地在生物体内创制新基因。

本发明创制的这些新基因是在生物体内自发的DNA修复机制作用下，由两个以上基因的不同元件进行融合或重组从而改变原基因的表达强度、时空特异性、特殊功能结构域等形成的，并不含有外源转基因或者人工合成的基因元件。由于新的基因融合了两种以上不同基因的元件，这极大拓展了基因变异的自由度，会产生更为丰富多样的功能，具有广泛的应用前景。同时，这些新基因与基因编辑载体是不连锁的，通过遗传分离去除载体元件后，即可得到含有新基因的非转基因生物材料用于动植物育种。或者也可以通过mRNA或核糖核酸蛋白复合体(RNP)的递送方式进行非整合的瞬时编辑，创制含有新基因的非转基因生物材料。这个过程是非转基因的，最终得到的编辑材料也不含转基因。在理论和事实上，这些新基因也可以通过传统育种技术(如辐射或化学诱变等)获得，所不同的是，用传统技术进行筛选需要创制数量巨大的随机突变体库并耗费大量时间和成本从中筛选新的功能基因，而本发明能够通过生物信息学分析结合基因编辑技术定向创制新功能基因，大大缩短了育种周期。按照现行的基因编辑生物审批流程，本发明提供的方法在很多国家不受监管。

另外，本发明的新基因创制技术能够用于改变生物体的生长、发育、抗性、产量等多种性状，具有重大应用价值。创制出的新基因或具有新的调控元件(如启动子)从而改变了原基因的表达强度、时空特性等，或具有新的氨基酸序列从而具有了新功能。以农作物为例，改变特定基因的表达可以提高作物对病虫草等有害生物及干旱、水涝、盐碱等非生物胁迫的抗性，也可提高产量，改善品质。以鱼类为例，改变生长激素的表达特性，能够显著改变其生长发育的速度。

附图说明

图1为在水稻中创制新的HPPD基因原理图。

图2为在水稻中创制新的EPSPS基因原理图。

图3为在拟南芥中创制新的PPOX基因原理图。

图4为在水稻中创制新的PPOX基因原理图。

图5为水稻原生质体测试HPPD-duplication方案测序结果。

图6为水稻农杆菌转化载体pQY2091载体图谱。

图7为pQY2091转化水稻潮霉素抗性愈伤检测新基因片段PCR电泳结果。箭头所指为UBI2基因启动子和HPPD编码区融合的新基因PCR条带。数字为不同愈伤样品的编号。M代表DNA Marker，条带大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，2500bp，5000bp，7500bp。

图8为pQY2091转化水稻T0代幼苗检测新基因片段PCR电泳结果。箭头所指为UBI2基因启动子和HPPD编码区融合的新基因PCR条带。数字为不同T0苗的编号。M代表DNAMarker，条带大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，2500bp，5000bp，7500bp。

图9为QY2091 T0代HPPD基因加倍株系双唑草酮抗性测试结果。同一花盆中左侧为野生型金粳818，右侧为HPPD加倍株系。

图10为QY2091 T0代HPPD基因加倍株系HPPD和UBI2基因相对表达量。818CK1，818CK3为两个野生型金粳818对照植株；13M，20M代表QY2091-13，QY2091-20 T0植株的主分蘖叶片样品；13L，20L代表QY2091-13，QY2091-20 T0植株用于除草剂抗性测试的次级分蘖叶片样品。

图11为QY2091 T1代可能的基因型及分子检测引物的结合位点示意图。

图12为QY2091-13、QY2091-20检测HPPD加倍测序结果与预测加倍序列比对。

图13为对QY2091 HPPD加倍株系的T1代进行苗期的除草剂抗性检测结果。

图14为水稻PPO1基因染色体片段倒位可能的编辑事件类型及分子检测引物的结合位点示意图。

图15为EPSPS-inversion检测测序结果。

图16为水稻农杆菌转化载体pQY2234载体图谱。

图17为pQY2234转化水稻潮霉素抗性愈伤检测新基因片段PCR电泳结果。箭头所指为CP12基因启动子和PPO1编码区融合的新基因PCR条带。数字为不同愈伤样品的编号。M代表DNA Marker，条带大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，2500bp，5000bp，7500bp。

图18为QY2234 T0代PPO1基因倒位株系2081抗性测试结果。同一处理剂量下左侧花盆为野生型淮稻5号对照，右侧为PPO1倒位株系。

图19为QY2234 T0代PPO1倒位株系PPO1和CP12基因相对表达量。H5CK1，H5CK2为两个野生型淮稻5号对照植株；252M、304M、329M代表QY2234-252，QY2234-304，QY2234-329 T0植株的主分蘖叶片样品；252L、304L、329L代表次级分蘖叶片样品。

图20为淮稻5号背景的PPO1倒位测序结果与预测倒位序列比对。

图21为金粳818背景的PPO1倒位测序结果与预测倒位序列比对。

图22为对QY2234 PPO1倒位株系的T1代进行苗期的除草剂抗性检测结果。

具体实施方式

以下结合实例，对本发明作进一步说明。下面的说明是采用举例的方式，但是本发明的保护范围不应局限于此。

实施例1在植物中通过诱导染色体片段加倍敲高内源HPPD基因表达的编辑方法-水稻原生质体测试

HPPD是植物合成叶绿素通路中的关键酶，抑制HPPD酶的活性最终导致植物白化失绿而死亡。许多除草剂如硝磺草酮、苯唑草酮等是以HPPD为靶标蛋白的抑制剂，提高植物内源HPPD基因的表达水平应该有助于提升植株对该类除草剂的耐受性。水稻HPPD基因(如SEQID NO:6所示，其中1-1067bp为启动子，其余为表达区)位于水稻2号染色体上。通过生物信息学分析发现HPPD基因下游约338kb处为水稻Ubiquitin2(以下简称为UBI2)基因(如SEQID NO:5所示，其中1-2107bp为启动子，其余为表达区)，UBI2基因与HPPD基因在染色体上的方向相同。根据国际水稻基因组测序计划(International Rice Genome SequencingProject)提供的水稻基因表达谱数据(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)分析，在水稻叶片中UBI2基因表达强度是HPPD基因的3-10倍，UBI2基因启动子是一个组成型表达的强启动子。

如图1所示，方案1通过同时在HPPD和UBI2基因各自的启动子和CDS区之间的位置产生双链断裂，经过筛选鉴定可以获得两个断口之间的区域加倍的事件，UBI2的启动子和HPPD的编码区可融合在一起形成新基因。此外，按照如图1所示的方案2，通过连续两次倒置也可以形成UBI2的启动子和HPPD编码区融合的新基因。首先对图1所示方案在水稻原生质体系统中进行如下测试：

1.首先将水稻HPPD和UBI2基因组DNA序列输入CRISPOR在线工具(http://crispor.tefor.net/)寻找可用的编辑靶点，经在线评分在HPPD和UBI2基因各自的启动子和CDS区之间选择如下靶点进行测试：

其中guide RNA1和guide RNA2位于HPPD基因启动子与CDS区之间，靠近HPPD蛋白起始密码子，guide RNA3和guide RNA4位于UBI2基因启动子与CDS区之间，靠近UBI2蛋白起始密码子。

以pHUE411载体(https://www.addgene.org/62203/)为骨架，按照“Xing HL,DongL,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ.A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327”所述方法，针对上述靶点设计以下引物，进行载体构建。

按上述文献提供的方法，构建如下双靶点组合的基因编辑载体。具体而言，以pCBC-MT1T2质粒(https://www.addgene.org/50593/)为模板分别扩增sgRNA1+3、sgRNA1+4、sgRNA2+3、sgRNA2+4双靶点片段，构建sgRNA表达盒。BsaI酶切pHUE411载体骨架，切胶回收，目的片段经酶切后直接用于连接反应。采用T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的片段，转化连接产物至Trans5α感受态细胞，挑取不同的单克隆测序，测序正确后利用思科捷高纯度质粒小量提取试剂盒抽提质粒，得到重组质粒，分别命名为pQY002065、pQY002066、pQY002067、pQY002068，如下所示：

pQY002065 pHUE411-HPPD-sgRNA1+3含OsHPPD-guide RNA1，guide RNA3组合pQY002066 pHUE411-HPPD-sgRNA1+4含OsHPPD-guide RNA1，guide RNA4组合pQY002067pHUE411-HPPD-sgRNA2+3含OsHPPD-guide RNA2，guide RNA3组合pQY002068 pHUE411-HPPD-sgRNA2+4含OsHPPD-guide RNA2，guide RNA4组合

2.按照如下方法，对上述pQY002065-002068载体制备高纯度、高浓度质粒：

使用Promega中量质粒提取试剂盒(Midipreps DNA Purification System,Promega,A7640)，按操作说明提取质粒。具体步骤为：

(1)向含有卡那霉素的300毫升液体LB培养基中加5毫升大肠杆菌，200rpm，37℃摇菌12–16小时。

(2)将上述菌液置于500毫升离心管中，5,000g离心菌液10分钟，弃上清。

(3)加3毫升细胞重悬液(Cell Resuspension Solution,CRS)重悬细胞沉淀，涡旋混匀。

(4)加3毫升细胞溶解液(Cell Lysis Solution,CLS)，缓慢颠倒混匀时间不宜超过5分钟。

(5)加3毫升中和液(Neutralization Solution)，颠倒混匀，至颜色变清澈透明。

(6)14,000g离心15分钟，如未形成紧实沉淀可再次离心15分钟。

(7)转移上清液至新的50毫升离心管中，避免吸入白色沉淀至离心管中。

(8)加10毫升DNA净化树脂(Purification Resin，用前剧烈摇匀)，混匀。

(9)将Resin/DNA混合液倒入过滤柱中，真空泵负压法(0.05MPa)。

(10)加15毫升洗柱液(Column Wash Solution,CWS)到过滤柱中，抽真空。

(11)加15毫升CWS，重复抽真空一次；溶液全部通过过滤柱后延长抽30s。

(12)切断过滤柱，将其转移至1.5毫升离心管中，12,000g离心2分钟，移除残留液体，将过滤柱转移至新的1.5毫升离心管中。

(13)加200μL预热至70℃的灭菌水，静置2分钟。

(14)12,000g离心2分钟，洗脱质粒DNA；浓度一般在1μg/μL左右。

3.制备水稻原生质体并进行PEG介导转化：

首先准备原生质体用的水稻幼苗，使用的品种为日本晴(Nipponbare)，种子由中国农业大学植物保护学院杂草教研室提供，本实验室扩繁。水稻种子首先去壳，去壳的种子用75％乙醇漂洗1分钟，用5％(v/v)的次氯酸钠处理20分钟，然后用无菌水洗涤5次以上，在超净台中吹干后放在盛有1/2MS培养基的组培瓶中，每瓶可放20粒种子。26℃，12h光照培养10d左右，就可以进行原生质体的制备。

水稻原生质体制备以及PEG介导的转化方法参照“Lin et al.,2018 Applicationof protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis:from single-cell mutationdetection to mutant plant regeneration.Plant Biotechnology Journal https://doi.org/10.1111/pbi.12870”。具体的步骤如下：

(1)选取幼苗叶鞘部分，用锋利的吉利剃须刀片切成约1mm的碎片，放在0.6M甘露醇和MES培养液(配方：0.6M甘露醇，0.4M MES，pH 5.7)中备用。将全部材料切好后转入20毫升酶解液(配方：1.5％Cellulase R10/RS(YaKult Honsha)，0.5％Mecerozyme R10(YaKultHonsha)，0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM MES,pH 5.7，10mM CaCl₂，0.1％BSA，5mMβ-巯基乙醇)中，用锡箔纸包好置于28℃摇床中，50rpm避光酶解约4个小时，最后2分钟将转速提高至100rpm；

(2)酶解结束后，加入等体积的W5溶液(配方：154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，15mM MES)，水平摇动10秒，释放原生质体。酶解后的细胞经300目的筛子过滤后，150g离心5分钟收集原生质体；

(3)再用W5溶液漂洗细胞两次，150g离心5分钟收集原生质体；

(4)用适量的MMG溶液(配方：3.05g/L MgCl₂，1g/L MES，91.2g/L甘露醇)重悬原生质体，原生质体浓度约为2×10⁶cell/mL。

按照如下方法进行原生质体的转化：

(1)取上述200μL MMG重悬的原生质体加入制备好的无内毒素的高质量质粒DNA(10-20μg)，轻弹混匀。

(2)加入等体积的40％(w/v)的PEG溶液(配方：40％(w/v)PEG，0.5M甘露醇，100mMCaCl₂)，轻弹混匀，28℃避光静置15分钟；

(3)诱导转化结束后缓慢加1.5毫升的W5溶液，轻弹混匀细胞，150g离心3分钟收集细胞，重复此步骤一次；

(4)加入1.5毫升W5溶液重悬细胞，置于28℃培养箱中避光培养12-16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48-60小时。

4.进行基因组打靶和新基因产生情况检测：

(1)首先需要提取原生质体DNA。使用CTAB法并进行部分修改，具体的方法如下：原生质体离心后弃上清，加入500μL DNA提取液(配方：CTAB 20g/L，NaCl 81.82g/L，100mMTris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA，0.2％β巯基乙醇)，振荡混匀，置于65℃水浴锅中孵育1小时；水浴后的样品冷却后加入500μL氯仿，颠倒混匀后10,000rpm离心10分钟；取400μL上清转移到一个新的1.5毫升离心管中，加入1毫升70％(v/v)的乙醇放入-20℃沉淀20分钟；用12,000rpm离心15分钟沉淀DNA，待沉淀晾干后加入50μL超纯水溶解，保存于-20℃备用。

(2)使用下表中的检测引物，扩增含有两侧靶位点的片段或预测的UBI2的启动子和HPPD编码区融合产生的片段，PCR产物长度为300-1000bp之间，其中primer8-F+primer6-R组合用于检测染色体片段加倍后中间接头处的融合片段，预期产物长度为630bp。

PCR反应体系如下：

(3)进行PCR反应，一般反应条件是：

(4)对PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示pQY002066和pQY002068转化样品中能够检测到预测的UBI2的启动子和HPPD编码区融合片段630bp阳性条带。

5.将UBI2的启动子和HPPD编码区融合片段阳性样品测序验证，使用OsHPPDduplicated-primer8-F和OsHPPDduplicated-primer6-R引物两端测序，结果如图5所示，显示UBI2基因启动子与HPPD基因表达区能够直接连接，结果表明在pQY002066和pQY002068质粒转化的水稻原生质体基因组DNA中能够检测到水稻UBI2基因启动子与HPPD基因表达区融合的编辑事件，说明通过染色体片段加倍形成新HPPD基因的方案可行，能够创制出强启动子驱动表达的HPPD新基因，定义为HPPD加倍事件。pQY002066载体转化原生质体检测HPPD加倍事件测序结果如SEQ ID NO:9所示；pQY002068载体转化原生质体检测HPPD加倍事件测序结果如SEQ ID NO:10所示。

实施例2通过农杆菌介导转化创制染色体片段加倍敲高内源HPPD基因表达的抗除草剂水稻

1、敲高编辑载体的构建：根据实施例1中原生质体测试的结果，选择编辑效率高的OsHPPD-guide RNA1：5’GTGCTGGTTGCCTTGGCTGC3’和OsHPPD-guide RNA4:5’GAAATAATCACCAAACAGAT3’双靶点组合，参照实施例1构建农杆菌转化载体pQY2091，载体骨架采用pHUE411并进行水稻密码子优化，载体图谱如图6所示。

2、农杆菌转化水稻愈伤：

1)农杆菌转化：取水稻敲高编辑载体pQY2091质粒1μg加入到10μl农杆菌EHA105热击感受态细胞(昂羽生物，货号G6040)，冰上放置5分钟，浸入液氮中速冻5分钟，取出置于37℃热击5分钟，最后放置在冰上5分钟。加入500μl YEB液体培养基(配方：酵母浸膏1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L)，置于28℃、200rpm摇床中培养2～3小时；3500rpm离心30秒收集菌体，将收集的菌体涂布于YEB(卡那霉素50mg/L+利福平25mg/L)平板上，28℃培养箱培养2天；挑取单克隆至液体培养基培养，-80℃保菌。

2)农杆菌的培养：在YEB平板上挑取转化的农杆菌单克隆，加入20毫升YEB液体培养基(卡那霉素50mg/L +利福平25mg/L)，28℃振荡培养至OD600为0.5，5000rpm离心10分钟收集菌落，加入20-40毫升AAM(Solarbio，货号LA8580)液体培养基重悬至OD600为0.2-0.3，再加入乙酰丁香酮(Solarbio，货号A8110)至终浓度200μM，浸染愈伤组织。

3)水稻愈伤组织诱导：转化受体水稻品种为淮稻5号和金粳818，来自江苏淮安市种子市场采购，本实验室扩繁。取800-2000粒干净的水稻种子脱壳，然后用无菌水清洗，直至洗后的水变清澈，再用70％酒精消毒30秒，之后加入30毫升5％次氯酸钠置于水平摇床50rpm振荡20分钟，再用无菌水清洗5次，置于无菌吸水纸，风干种子表面水分，接种于诱导培养基上在28℃下培养愈伤。

诱导培养基配方：4.1g/L N6粉末+0.3g/L水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+2mg/L 2,4-D+3％蔗糖+0.1g/L肌醇+0.5g谷氨酰胺+0.45％植物凝胶，pH 5.8。

4)农杆菌侵染水稻愈伤：选取继代培养10天，直径为3毫米的淮稻5号或金粳818愈伤组织，将愈伤组织收集至50毫升的离心管中；将已调至OD600为0.2-0.3的农杆菌AAM重悬液倒入含有愈伤组织的离心管中，置于28℃、200转/分摇床中侵染20分钟；侵染完毕，倒掉菌液，将愈伤组织放置于无菌滤纸上风干20分钟左右，置于共同培养基平板上共培养，平板上铺有一张含100μM乙酰丁香酮的AAM液体培养基浸湿的无菌滤纸；共培养3天后，清洗去除农杆菌(先用无菌水洗5遍，再用500mg/L的头孢抗生素清洗20分钟)，置于50mg/L潮霉素筛选培养基上筛选培养。

共同培养基配方：4.1g/L N6粉末+0.3g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸+2mg/L 2,4-D+200μM AS+10g/L葡萄糖+3％蔗糖+0.45％植物凝胶，pH 5.5。

3、潮霉素抗性愈伤的分子鉴定和分化出苗：

与常规水稻转化的筛选过程有所不同的是，本发明利用染色体片段加倍后产生的融合片段的特异性引物，在愈伤筛选培养阶段就可以对潮霉素抗性愈伤进行分子鉴定，确定加倍阳性事件，选择含有融合不同基因元件的新基因的愈伤进行分化培养，诱导出苗。具体操作步骤如下：

1)将共培养后的愈伤组织移至筛选培养基进行第一轮筛选(2周)。筛选培养基配方：4.1g/L N6粉末+0.3g/L水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+2mg/L 2,4-D+3％蔗糖+0.5g谷氨酰胺+30mg/L潮霉素(HYG)+500mg/L头孢霉素(cef)+0.1g/L肌醇+0.45％植物凝胶，pH 5.8。

2)第一轮筛选完毕后将新长出的愈伤移至新的筛选培养基进行第二轮筛选(2周)，在此阶段对新长出的直径大于3毫米的愈伤用镊子夹取少量样品，用实施例1所述CTAB法提取DNA进行第一轮分子鉴定，本实施例对pQY2091载体转化的愈伤，选择OsHPPDduplicated-primer8-F(8F)和OsHPPDduplicated-primer6-R(6R)引物对进行PCR鉴定，反应体系与反应条件参照实施例1，共鉴定350个愈伤，在淮稻5号愈伤中未检测到阳性样品，在金粳818愈伤中检出28个阳性样品，其中部分愈伤PCR检测结果如图7所示。

3)PCR鉴定阳性的愈伤移至新的筛选培养基进行第三轮筛选扩大培养；待愈伤直径大于5毫米之后，对扩大培养的愈伤使用8F+6R引物对进行第二轮分子鉴定，挑取二轮鉴定阳性的生长状态良好的黄白色愈伤组织转入分化培养基进行分化，3～4周后可以获得1厘米左右的幼苗；将分化出的幼苗移至生根培养基进行生根培养；将生根完成的幼苗进行炼苗处理后，移至装有土壤的花盆中置温室进行培养。分化培养基配方：4.42g/L MS粉末+0.5g/L水解酪蛋白+0.2mg/L NAA+2mg/L KT+3％蔗糖+3％山梨醇+30mg/L潮霉素+0.1g/L肌醇+0.45％植物凝胶，pH 5.8。生根培养基配方：2.3g/L MS粉末+3％蔗糖+0.45％植物凝胶。

4、HPPD加倍苗(T0代)的分子检测：

29个加倍事件阳性愈伤经二轮分子鉴定后共分化得到403株T0代幼苗，对这403株幼苗继续使用8F+6R引物对进行第三轮分子鉴定，其中56株有阳性条带，阳性苗移入温室培养，其中部分T0苗PCR检测结果如图8所示。

5、HPPD加倍苗(T0代)HPPD抑制剂类除草剂抗性测试：

T0代鉴定加倍事件阳性转化苗移栽到温室的大塑料桶里培育以扩繁T1代种子。在幼苗开始分蘖之后，从生长旺盛的株系中掰取分蘖，分别与野生型对照品种的同期分蘖栽种到同一花盆中，待植株高度达到20厘米左右后，进行除草剂抗性测试。所用除草剂为本公司生产的双唑草酮(CAS号：1622908-18-2)，其田间剂量通常是每亩4克有效成分(4g a.i./mu)。本次实验双唑草酮的剂量设置为2g，4g，8g，32g四个梯度，采用步入式喷雾塔施药。

抗性检测结果如图9所示，施药后5天-7天，野生型对照水稻苗开始显现白化症状，而HPPD加倍事件各株系都保持正常绿色。施药4周之后，野生型水稻苗接近死亡，加倍事件各株系都继续保持绿色，生长正常。测试结果说明HPPD基因加倍株系对双唑草酮的耐受性明显提高。

6、HPPD加倍苗(T0代)HPPD基因相对表达量定量检测：

推测HPPD基因加倍株系对双唑草酮的抗性提升是由于UBI2的强启动子与HPPD基因CDS融合提高了HPPD表达量引起的，因此选择T0代株系QY2091-13，QY2091-20，分别对主分蘖和用于除草剂抗性测试的次级分蘖取样检测HPPD和UBI2基因的表达水平，以野生型金粳818为对照。具体步骤如下：

1)总RNA的提取(Trizol法)：

取新鲜叶片0.1-0.3g，液氮研磨至粉末状，每50-100mg组织加入1毫升Trizol试剂对组织进行裂解；将上述组织的Trizol裂解液转入1.5毫升离心管中，在室温(15-30℃)下放置5分钟；按照每1毫升Trizol后加0.2毫升氯仿的量加入氯仿，盖上离心管盖，在手中用力震荡15秒，在室温下(15-30℃)放置2-3分钟后，12000g(4℃)离心15分钟；去上层水相置于新离心管中，按照每1毫升Trizol加0.5毫升异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15-30℃)放置10分钟后，12000g(2-8℃)离心10分钟；弃上清，按照每1毫升Trizol加1毫升75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2-8℃)离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥30分钟；加入50μl RNase-free水溶解RNA沉淀，通过电泳分析及浓度测定后放于-80℃冰箱保存。

2)RNA电泳分析：

制备浓度为1％的琼脂糖凝胶，然后吸取1μl RNA与1μl 2X Loading Buffer(上样缓冲液)混合后上样，电压设置为180V，电泳时间12分钟，电泳完成后，取出琼脂糖凝胶，在紫外凝胶成像系统中观察片段位置及亮度。

3)RNA纯度检验：

用微量蛋白核酸分析仪测定RNA浓度，较好的RNA OD260/OD280在1.8-2.1之间，低于1.8说明蛋白质污染严重，高于2.1说明RNA降解严重。

4)实时荧光定量PCR

通过专用反转录试剂盒，将提取的总RNA反转录得到cDNA。主要流程为：先测定提取的总RNA浓度，取1-4μg RNA的量用于反转录酶合成cDNA。cDNA于-20℃保存。

①按照下表，在冰上配制RNA模板溶液，置于PCR仪进行变性、退火反应。此过程利于模板RNA的变性以及引物和模板特异性退火，可以提高反转录效率。

表1反转录变性退火反应体系

变性、退火反应条件：

②按表2配制反转录反应体系，合成cDNA：

表2反转录反应体系

合成cDNA反应条件：

③选用水稻的UBQ5基因作为内参基因，以合成的cDNA为模板进行荧光定量PCR。使用表3所列引物，按表4配制反应液。

表3荧光定量引物序列5’-3’

表4实时定量PCR(Real Time PCR)反应液

④按表5实时定量PCR反应步骤进行程序反应，反应程序为40个循环

表5实时定量PCR反应步骤

5)数据处理及实验结果

如表6所示，以UBQ5作为内参，目的基因的Ct值减去UBQ5的Ct值为ΔCt，之后计算2^-ΔCt，代表目的基因的相对表达水平，818CK1，818CK3为两个野生型金粳818对照植株；13M，20M代表QY2091-13，QY2091-20 T0植株的主分蘖叶片样品；13L，20L代表QY2091-13，QY2091-20 T0植株用于除草剂抗性测试的次级分蘖叶片样品。

表6不同基因Ct值及相对表达倍数

结果如图10所示，以水稻UBQ5为内参基因，对OsHPPD和UBI2基因的相对表达量进行测定，结果显示，HPPD加倍株系与野生型相比HPPD表达量明显上升，说明融合的UBI2强启动子确实提高了HPPD的表达水平，形成了一个高表达的HPPD新基因，起到了敲高HPPD基因的作用。UBI2的表达量略有下降，可能是由于在启动子区域的编辑产生的小范围突变对基因表达造成一定影响，我们也确实检测到UBI2靶点处的碱基插入、缺失或小片段删除。与野生型相比UBI2和HPPD表达量明显趋于一致，符合理论预期；其中20M样品的HPPD表达量较野生型CK3组最高提高6倍左右。

以上结果证明，根据原生质体中测试有效的染色体片段加倍方案，通过在农杆菌转化和组培过程中引入多轮分子鉴定，我们能够筛选出发生加倍事件的愈伤和转化苗，并且转化苗中产生的新HPPD基因融合的UBI2强启动子确实提高了HPPD基因的表达水平，能够使植株产生对HPPD抑制剂类除草剂双唑草酮的抗性，最高能达到大田剂量的8倍，创制出了敲高内源HPPD基因的抗除草剂水稻。以此为例，采用实施例1，实施例2的染色体片段加倍技术方案也可对其它需要改变基因表达模式的内源基因引入所需的启动子加以融合创造新基因，在植物中可以通过农杆菌介导转化创制具有所需基因表达模式的新品种。

实施例3染色体片段加倍敲高内源HPPD基因表达抗除草剂水稻株系T1代的分子检测和除草剂抗性测试

野生型水稻基因组中HPPD基因与UBI2基因物理距离为338kb，如图1方案1所示，两者间的染色体片段复制加倍后染色体长度增加了338kb在复制片段的接头处产生了UBI2启动子驱动HPPD CDS区的高表达HPPD新基因。为了确认新基因能否稳定遗传以及染色体片段加倍后对遗传稳定性的影响，我们对HPPD加倍株系的T1代进行了分子检测和除草剂抗性测试。

首先我们观察到加倍事件对T0代植株的育性没有明显影响，所有阳性T0株系都能正常结实。继续选择QY2091-13，QY2091-20株系进行T1代苗种植检测。

1、样品准备：

QY2091-13，共种植36株T1代苗，其中27株生长正常，9株白化。取32株提DNA进行检测，编号1-24为正常苗，编号25-32为白化苗。

QY2091-20，共种植44株T1代苗。其中33株生长正常，11株白化。取40株提DNA进行检测，编号1-32正常苗，编号33-40白化苗。

观察到T1代植株中出现白化苗，推测由于HPPD是植物合成叶绿素通路中的关键酶，双靶点编辑的T0代植株中可能存在染色体片段加倍，删除，倒位，编辑靶点处的小片段突变等多种基因型的嵌合，如果HPPD基因被破坏例如HPPD CDS区被删除，则植株会产生白化表型，设计不同的引物对进行PCR检测可能的基因型。

2、PCR分子鉴定：

1)检测引物序列：序列5’-3’

Primer 8F：TCTGTGTGAAGATTATTGCCACTAGTTC

Primer 6R：GAGTTCCCCGTGGAGAGGT

Test 141-F：CCCCTTCCCTCTAAAAATCAGAACAG

Primer 4R：GGGATGCCCTCCTTATCTTGGATC

Primer 3F:CCTCCATTACTACTCTCCCCGATTC

Primer 7R：GTGTGGGGGAGTGGATGACAG

pg-Hyg-R1：TCGTCCATCACAGTTTGCCA

pg-35S-F：TGACGTAAGGGATGACGCAC

2)上述引物结合位点见图11，其中Primer 8F+Primer 6R用于检测染色体片段加倍后UBI2启动子与HPPD CDS的融合片段，产物长度630bp；Test 141-F+Primer 4R用于检测染色体片段删除事件，产物长度222bp。pg-Hyg-R1+pg-35S-F用于检测编辑载体T-DNA片段，产物长度660bp。

3)PCR反应体系，反应程序和凝胶电泳检测参照实施例1。

3、分子检测结果：

加倍和删除事件的检测结果如表7所示，可见T1代植株中染色体片段加倍事件和删除事件均有分布，不同株系之间比例有差异，QY2091-13中加倍事件的比例29/32高于QY2091-20的21/40，应该是由T0代植株中嵌合比例不同引起的，检测结果说明加倍产生的融合基因是可遗传的。

表7加倍和删除事件的检测结果

对上述T1苗使用pg-Hyg-R1+pg-35S-F引物检测编辑载体T-DNA片段，QY2091-20-17和QY2091-13-7PCR电泳结果为T-DNA片段阴性，纯合加倍，可见加倍事件T1代中能够分离出加倍纯合的非转基因株系。

4、编辑事件测序检测：

对QY2091-20，选择纯合加倍阳性T1代样品1、5、7、11、18、19，对QY2091-13，选择纯合加倍阳性T1代样品1、3、7、9、10、12，测序加倍融合片段，同时扩增左侧HPPD靶点，右侧UBI2样品，送测序检测靶点处的编辑事件。其中Primer 3F+Primer 7R用于检测左侧HPPD靶点编辑事件，野生型对照产物长度481bp；Primer 8F+Primer 4R用于检测右侧UBI2靶点编辑事件，野生型对照产物长度329bp。

1)加倍事件的基因型：

QY2091-13检测HPPD加倍测序结果见SEQ ID NO:18，QY2091-20检测HPPD加倍测序结果见SEQ ID NO:19，如图12所示，与预测的加倍接头序列比对可见，QY2091-13在接头处插入了一个T碱基，QY2091-20在接头处删除了19个碱基，插入和删除都发生在UBI2的启动子区域，对HPPD蛋白编码区无影响。根据实施例2中的HPPD基因表达量检测结果，这些UBI2启动子融合HPPD CDS区的新HPPD基因表达量明显提高。

2)两侧原始HPPD和UBI2靶点处的编辑事件：

两侧靶点处的编辑事件类型更多样，两个株系的HPPD启动子区存在单个碱基的插入，17个碱基的删除，16个碱基的删除三种编辑类型，UBI2启动子区存在7个碱基的插入，3个碱基的删除两种编辑类型。用于检测取样的T1植株均为绿苗，生长正常，说明这些启动子区域的小范围突变对基因功能无明显影响，可以从后代中选育出抗除草剂的水稻品种。

5、T1代幼苗的除草剂抗性测试：

对QY2091 HPPD加倍株系的T1代进行苗期的除草剂抗性测试，将T1代种子进行表面消毒后，在加入1.2μM双唑草酮的1/2MS培养基上萌发，28℃，16小时光照，8小时黑暗培养，以野生型金粳818为对照。

抗性检测结果如图13所示，光照培养10天后，野生型对照水稻苗显现白化症状，基本全部白化，而HPPD加倍事件株系QY2091-7，13，20，22有黄化苗与绿苗的表型分离。根据前述分子检测结果，T1代中存在基因型分离，不加除草剂处理就有白化苗出现，而绿苗在添加1.2μM双唑草酮之后，继续保持绿色，生长正常。该测试结果说明HPPD基因加倍株系对双唑草酮的高抗性能够稳定遗传到T1代。

实施例4通过诱导染色体片段倒位敲高内源PPO基因表达的编辑方法-水稻原生质体测试

水稻PPO1(也称PPOX1)基因(如SEQ ID NO:7所示，其中1-1065bp为启动子，其余为表达区)位于1号染色体上，其下游911kb处为calvin cycle protein CP12基因(如SEQ IDNO:8所示，其中1-2088bp为启动子，其余为表达区)，其方向与PPO1基因相对。根据国际水稻基因组测序计划(International Rice Genome Sequencing Project)提供的水稻基因表达谱数据(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)分析，在水稻叶片中CP12基因表达强度是PPO1基因的50倍，CP12基因启动子是一个在叶片中高表达的强启动子。

如图4所示方案1，通过在两个基因各自的启动子和CDS区域之间同时造成双链断裂，经过筛选，可以获得两个断口之间区域倒置，将PPO1基因的启动子换成了CP12基因的启动子，提升PPO1基因的表达量，进而获得对PPO抑制剂类除草剂的抗性，选育抗除草剂品种。此外按照图4所示方案2，先倒置再加倍，也可以创制由CP12基因的启动子驱动PPO1的新基因。

1、首先将水稻PPO1和CP12基因组DNA序列输入CRISPOR在线工具(http://crispor.tefor.net/)寻找可用的编辑靶点，经在线评分在PPO1和CP12基因各自的启动子和CDS区之间选择如下靶点进行测试：

其中guide RNA1和guide RNA2位于PPO1基因启动子与CDS区之间，靠近PPO1蛋白起始密码子，guide RNA3和guide RNA4位于CP12基因启动子与CDS区之间，靠近CP12蛋白起始密码子。

参照实施例1，以pHUE411为骨架，针对上述靶点设计引物构建双靶点载体：

具体而言，以pCBC-MT1T2质粒(https://www.addgene.org/50593/)为模板分别扩增sgRNA1+3、sgRNA1+4、sgRNA2+3、sgRNA2+4双靶点片段，构建sgRNA表达盒。BsaI酶切pHUE411载体骨架，切胶回收，目的片段经酶切后直接用于连接反应。采用T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的片段，转化连接产物至Trans5α感受态细胞，挑取不同的单克隆测序，测序正确后利用思科捷高纯度质粒小量提取试剂盒抽提质粒，得到重组质粒，分别命名为pQY002095、pQY002096、pQY002097、pQY002098，如下所示：

pQY002095 pHUE411-PPO-sgRNA1+3含OsPPO-guide RNA1，guide RNA3组合pQY002096 pHUE411-PPO-sgRNA2+3含OsPPO-guide RNA2，guide RNA3组合pQY002097pHUE411-PPO-sgRNA1+4含OsPPO-guide RNA1，guide RNA4组合pQY002098 pHUE411-PPO-sgRNA2+4含OsPPO-guide RNA2，guide RNA4组合

2、对上述pQY002095-002098载体制备高纯度、高浓度质粒，具体操作参照实施例1步骤2。

3、制备水稻原生质体并对上述载体进行PEG介导转化，具体操作参照实施例1步骤3。

4、进行基因组打靶和新基因产生情况检测，使用下表中的检测引物进行PCR检测，具体操作参照实施例1步骤4。

其中PPO-R2和CP-R2组合用于扩增染色体片段倒位后右侧产生的CP12启动子驱动PPO1 CDS新基因片段，PPO-F2和CP-F2组合用于扩增倒位后左侧产生的PPO1启动子驱动CP12 CDS新基因片段。双靶点编辑可能产生的基因型及分子检测引物的结合位点如图14所示。

5、PCR和测序结果显示，水稻原生质体转化获得了预期的CP12启动子驱动PPO1表达的新基因，转化的水稻原生质体基因组DNA中能够检测到水稻CP12基因启动子与PPO1基因表达区融合的编辑事件，说明通过染色体片段倒位形成新PPO基因的方案可行，能够创制出强启动子驱动表达的PPO新基因，定义为PPO1倒位事件。其中pQY002095载体转化原生质体检测染色体片段倒置测序结果如SEQ ID NO:15所示；pQY002095载体转化原生质体检测染色体片段删除测序结果如SEQ ID NO:16所示；pQY002098载体转化原生质体检测染色体片段倒置测序结果如SEQ ID NO:17所示。

实施例5通过农杆菌介导转化创制染色体片段倒位敲高内源PPO基因表达的抗除草剂水稻

1、敲高编辑载体的构建：根据原生质体测试的结果，选择编辑效率高的OsPPO-guide RNA1：5’CCATGTCCGTCGCTGACGAG3’和OsPPO-guide RNA4：5’CGGATTTCTGCGT-GTGATGT3’双靶点组合，构建农杆菌转化载体pQY2234，载体骨架采用pHUE411并进行水稻密码子优化，载体图谱如图16所示。

2、农杆菌转化水稻愈伤与二轮分子鉴定：

取pQY2234质粒按实施例2步骤2所述方法转化水稻愈伤，受体品种为淮稻5号和金粳818。在愈伤筛选阶段对潮霉素抗性愈伤进行两轮分子鉴定，选择倒位事件阳性愈伤进行分化。在愈伤分子检测阶段，我们用PPO-R2和CP-R2组合扩增染色体片段倒位后右侧产生的CP12启动子驱动PPO1 CDS新基因片段作为倒位事件阳性标准，对倒位后左侧的CP12新基因在愈伤分化出苗后再予以考虑。共鉴定淮稻5号愈伤734个，其中倒位事件阳性24个，金粳818愈伤259个，其中倒位事件阳性29个。图17显示了金粳818编号192-259愈伤的PCR检测结果。

3、共53个倒位事件阳性愈伤经二轮分子鉴定后共分化得到9个加倍事件阳性愈伤经二轮分子鉴定后共分化得到1875株T0代幼苗，其中淮稻5号背景768株，金粳818背景1107株，对这1875株幼苗继续使用PPO-R2和CP-R2引物对进行第三轮分子鉴定，其中淮稻5号背景有184株有倒位阳性条带，金粳818背景有350株有倒位阳性条带，阳性苗移入温室培养。

4、PPO1倒位苗(T0代)PPO抑制剂类除草剂抗性测试：

QY2234 T0代鉴定倒位事件阳性转化苗移栽到温室的大塑料桶里培育以扩繁T1代种子。阳性苗数量较多，所以选择部分T0苗与生长时期、状态相近的野生型对照品种，待植株高度达到20厘米左右后，直接进行除草剂抗性测试。所用除草剂为本公司生产的高效PPO抑制剂类除草剂

(代号2081，参见专利CN202010281666.4)，本次实验其剂量设置为0.18，0.4，0.6g a.i./mu三个梯度，采用步入式喷雾塔施药。

抗性检测结果如图18所示，施药后3-5天，野生型对照水稻苗从叶尖开始干枯，叶片上出现坏死斑，植株逐渐枯死，而PPO1倒位事件多数株系保持正常生长，叶片未见明显药害。另有部分株系出现药害，可能是由于T0代株系编辑事件的多基因型嵌合，PPO1表达量不高引起的。施药2周之后，野生型水稻苗死亡，倒位事件多数株系继续保持绿色，生长正常。测试结果说明PPO1倒位株系能够明显提升植株对2081的耐受性。

5、PPO1倒位苗(T0代)PPO1基因相对表达量定量检测：

推测PPO1基因倒位株系对2081的抗性提升是由于CP12的强启动子与PPO1基因CDS融合提高了PPO1表达量引起的，因此选择淮稻5号背景的T0代株系QY2234-252，QY2234-304，QY2234-329分别取主分蘖和次级分蘖取样检测PPO1和CP12基因的表达水平，以野生型淮稻5号为对照。具体操作步骤参照实施例2步骤6，选用水稻UBQ5基因作为内参基因，荧光定量引物如下：5’-3’

以UBQ5作为内参，目的基因的Ct值减去UBQ5的Ct值为ΔCt，之后计算2^-ΔCt，代表目的基因相对表达水平，H5CK1、H5CK2为两个野生型淮稻5号对照植株，252M、304M、329M代表QY2234-252，QY2234-304、QY2234-329 T0植株的主分蘖叶片样品，252L、304L、329L代表次级分蘖叶片样品。结果见下表8：

表8不同基因Ct值及相对表达倍数

不同株系PPO1和CP12的相对表达量如图19所示，结果显示，与实施例2中的加倍事件不同的是，倒位事件各个株系间的基因表达水平有明显差异。两个淮稻5号CK组之间CP12的表达量差异很大，可能是苗期生长阶段或不同导致的表达量差异。实验组与H5CK2对照组相比CP12的表达量都有下降趋势，其中252L、329M的PPO1的表达水平明显上升，304L、329LPPO1的表达水平有所提高，而252M、304M PPO1的表达量下降。与染色体片段加倍主要提高基因表达水平不同，染色体片段倒位在左右两侧都产生了新基因，在两侧靶点处可能有发生多种编辑事件，同时转录方向的改变可能对基因表达量也有影响，所以T0代植株是复杂的嵌合体，同一植株的主分蘖和次级分蘖之间的基因表达量可能也有明显差异，从定量PCR的结果来看，PPO1倒位事件有较高比率上调PPO1基因的表达，对倒位事件进行抗除草剂筛选能够从中筛选出高表达PPO1抗除草剂的株系。

以上结果证明，根据原生质体中测试有效的染色体片段倒位方案，通过在农杆菌转化和组培过程中引入多轮分子鉴定，我们能够筛选出发生倒位事件的愈伤和转化苗，并且转化苗中产生的新PPO1基因融合的CP12强启动子确实可以提高PPO1基因的表达水平，能够使植株产生对PPO抑制剂类除草剂2081的抗性，创制出了敲高内源PPO基因的抗除草剂水稻。以此为例，采用实施例4，实施例5的染色体片段倒位技术方案也可对其它需要改变基因表达模式的内源基因引入所需的启动子加以融合创造新基因，在植物中可以通过农杆菌介导转化创制具有所需基因表达模式的新品种。

实施例6染色体片段倒位敲高内源PPO1基因表达抗除草剂水稻株系T1代的分子检测和除草剂抗性测试

野生型水稻基因组PPO1基因与CP12基因物理距离为911kb，如图14所示，两者间的染色体片段倒位后在右侧产生了CP12启动子驱动PPO1 CDS区的高表达PPO1新基因，也有可能发生染色体片段的删除。为了确认新基因能否稳定遗传以及染色体片段倒位后对遗传稳定性的影响，我们对PPO1倒位株系的T1代进行了分子检测和除草剂抗性测试。

首先我们观察到倒位事件对T0代植株的育性没有明显影响，所有阳性T0株系都能正常结实。选择淮稻5号背景的QY2234/H5-851株系T1代进行检测。

1、样品准备：

QY2234/H5-851，共种植48株T1代苗，均生长正常。

2、PCR分子鉴定：

1)检测引物序列：5’-3’

PPO-R2：AAGGCTGGAAGCTGTTGGG

CP-R2：CTGAGGAGGCGATAAGAAACGA

PPO-F2：CGGACTTATTTCCCACCAGAA

CP-F2：AGGTCTCCTTGAGCTTGTCG

pg-Hyg-R1：TCGTCCATCACAGTTTGCCA

pg-35S-F：TGACGTAAGGGATGACGCAC

2)上述引物结合位点见图14，其中PPO-R2+CP-R2用于检测染色体片段倒位后右侧CP12启动子与PPO1编码区融合片段，产物长度507bp；PPO-F2+CP-F2用于检测染色体片段倒位后左侧PPO1启动子与CP12编码区融合片段，产物长度560bp；PPO-F2+PPO-R2用于检测倒位前左侧PPO靶点，野生型对照产物长度586bp；CP-F2+CP-R2用于检测倒位前右侧CP12靶点，野生型对照产物长度481bp。pg-Hyg-R1+pg-35S-F用于检测编辑载体T-DNA片段，产物长度660bp。

3)PCR反应体系及反应条件：

反应体系(10μL体系)：

反应条件：

PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，电压180V，10分钟。

3、分子检测结果：

检测结果如表9所示，共检测48株，其中纯合倒位12株(2/7/11/16/26/36/37/40/41/44/46/47)，杂合倒位21株(1/3/4/5/6/8/9/15/17/20/22/23/24/27/30/31/33/34/39/42/43)，纯合非倒位植株15株(10/12/13/14/18/19/21/25/28/29/32/35/38/45/48)。纯合倒位：杂合倒位：纯合非倒位比例1:1.75:1.25，约合1:2:1，检测结果符合孟德尔遗传定律，说明倒位产生的PPO1新基因是可遗传的。

表9分子检测结果

对上述T1苗使用pg-Hyg-R1+pg-35S-F引物检测编辑载体T-DNA片段，其中16、41电泳结果为T-DNA片段阴性，纯合倒位，可见倒位事件T1代中能够分离出倒位纯合的非转基因株系。

4、编辑事件测序检测：

对倒位事件基因型的检测重点关注右侧新PPO基因的编辑事件，保留PPO1基因蛋白编码框完整的突变类型，对左侧CP12位点编辑事件通过温室和田间表型观察不影响植株正常生长即可保留，以下列出了在倒位事件阳性株系中检测到的编辑事件基因型，无缝代表与预测的倒位后融合片段序列完全一致，淮稻5号为背景的QY2234倒位成功基因型如下：

其中部分测序峰图与序列比对结果见图20。

金粳818为背景的QY2234倒位成功基因型如下：

其中部分测序峰图与序列比对结果见图21。

以上不同新PPO1基因CP12启动子与PPO1编码区融合片段测序结果见SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ IDNO:26。

5、T1代幼苗的除草剂抗性测试：

对QY2234/H5-851 PPO1倒位株系的T1代进行苗期的除草剂抗性测试，以野生型淮稻5号为对照，与倒位株系T1代种子同时种植，幼苗株高达到15厘米后，喷施2081处理，药物浓度设置0.3，0.6，0.9，1.2g a.i./mu四个梯度，培养条件28℃，16小时光照，8小时黑暗。

抗性检测结果如图22所示，施药5天后，野生型对照水稻苗在0.3g a.i./mu剂量下即表现明显药害，从叶尖开始干枯，叶片上出现坏死斑，在0.6g a.i./mu剂量下植株很快枯死。而QY2234/H5-851 T1苗在0.3g a.i./mu剂量下能保持正常生长，叶片未见明显药害，在0.6和0.9g a.i./mu剂量下，部分T1苗出现叶尖干枯的药害表现，但多数T1苗能保持绿色继续生长，而对照基本枯死。在1.2g a.i./mu剂量下，对照已完全死亡，T1苗还有部分能保持绿色继续生长。该测试结果说明PPO1基因倒位株系对2081的抗性能够稳定遗传到T1代。

实施例7在植物中敲高内源EPSPS基因表达的编辑方法

EPSPS是植物中芳香族氨基酸合成通路中的关键酶，是灭生性除草剂草甘膦的靶点。高表达EPSPS基因可以赋予植物对草甘膦的抗性。EPSPS基因(如SEQ ID NO:4所示，其中1-1897bp为启动子，其余为表达区)位于水稻6号染色体上，其上游基因为转酮醇酶transketolase(TKT，如SEQ ID NO:3所示，其中1-2091bp为启动子，其余为表达区)，方向与EPSPS基因相反。TKT基因在叶片中的表达强度是EPSPS基因的20-50倍。如图2所示，通过在两个基因各自的启动子和CDS区域之间同时造成双链断裂，经过筛选，可以获得两个断口之间区域倒置(方案1)，或倒置加倍(方案2)的情形。这两种情形均会将EPSPS基因的启动子换成TKT基因的启动子，提升EPSPS基因的表达量，进而获得对草甘膦的抗性。此外，图2中所示的方案3,4,5也可以分别创制出TKT基因启动子驱动EPSPS的新基因。EPSPS与TKT相邻且方向相对的基因结构在单子叶植物中保守(表10)，在双子叶植物二者也是相邻，方向相同；因此该方法在植物中具有通用性。

表10不同植物中EPSPS基因与相邻的TKT基因的距离

为此，以pHUE411为骨架，以如下靶点为目标：

构建了多个不同的双靶点载体：

pQY002061 pHUE411-EPSPS-sgRNA1+3

pQY002062 pHUE411-EPSPS-sgRNA2+3

pQY002063 pHUE411-EPSPS-sgRNA1+4

pQY002064 pHUE411-EPSPS-sgRNA2+4

pQY002093 pHUE411-EPSPS-sgRNA2+5

pQY002094 pHUE411-EPSPS-sgRNA2+6

(2)使用下表中的相关检测引物，扩增含有两侧靶位点的片段或预测的UBI2的启动子和HPPD编码区融合产生的片段，产物长度为300-1000bp之间。

经过原生质转化，测试结果表明获得了预期倒置的事件，如图15所示，pQY002062载体转化原生质体检测倒置测序结果如SEQ ID NO:11所示；pQY002062载体转化原生质体检测删除测序结果如SEQ ID NO:12所示；pQY002093载体转化原生质体检测倒置测序结果如SEQ ID NO:13所示；pQY002093载体转化原生质体检测删除测序结果如SEQ ID NO:14所示。

将这些载体转至农杆菌中，转化水稻愈伤，获得了含有新EPSPS基因的植株，除草剂生测表明该植株对草甘膦除草剂具有明显的抗性。

实施例8在拟南芥中敲高内源PPO基因表达的编辑方法

原卟啉原氧化酶(PPO)是除草剂的主要靶点之一。高表达植物内源PPO，即可显著提升对PPO抑制剂类除草剂的抗性。拟南芥PPO基因(如SEQ ID NO:1所示，其中1-2058bp为启动子，其余为表达区)位于4号染色体上，其下游1.9M处是ubiquitin10基因(如SEQ IDNO:2所示，其中1-2078bp为启动子，其余为表达区)，并且与PPO基因的方向相同。

如图3所示方案，通过同时在PPO和ubiquitin10基因的启动子和CDS区之间的位置产生双链断裂，经过筛选可以获得两个断口之间区域加倍的事件，即ubiquitin10的启动子和PPO的编码区融合在一起的新基因。此外，按照图1中所示的方案2，也可以创制出ubiquitin10的启动子和PPO的编码区融合在一起的新基因。

为此，以pHEE401E为骨架(https://www.addgene.org/71287/)，针对如下靶点：

按照“Wang ZP,Xing HL,Dong L,Zhang HY,Han CY,Wang XC,Chen QJ.Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygousmutants for multiple target genes in Arabidopsis in a singlegeneration.Genome Biol.2015 Jul 21；16:144.”所述方法，构建双靶点载体：

pQY002076 pHEE401E-AtPPO-sgRNA1+3

pQY002077 pHEE401E-AtPPO-sgRNA1+4

pQY002078 pHEE401E-AtPPO-sgRNA2+3

pQY002079 pHEE401E-AtPPO-sgRNA2+4

按照如下方法转化拟南芥：

(1)农杆菌转化

将构建好的重组质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到重组农杆菌。

(2)农杆菌侵染液的制备

1)挑取活化的农杆菌接种于30毫升YEP液体培养基(含25mg/L Rif和50mg/L Kan)中，28℃200转/分钟振荡培养过夜至OD600值为1.0-1.5左右。

2)6000转/分钟离心10分钟收集菌体，弃上清。

3)用侵染液(无须调节pH)重新悬浮菌体至OD600＝0.8左右备用。

(3)拟南芥转化

1)植株转化之前注意植株是否生长良好，花序茂盛，无胁迫反应，第一次转化株高20cm即可进行。若土壤干燥可适当浇一些水。转化前一天用剪刀将已长出的角果减去。

2)将待转化植株花序浸泡于上述溶液中30秒-1分钟，期间轻轻搅动，浸润后的植株上应该有一层液体膜。

3)转化完成后植株放于黑暗环境中暗培养24小时，然后取出放于正常光照环境下生长。

4)一周以后即可按同样的方法进行第二次转化。

(4)种子收获

待种子成熟后即可进行收获，收获后置于37℃烘箱一周左右烘干种子。

(5)转基因植株的筛选

种子经过消毒液处理5分钟，用ddH₂O洗5遍后均匀铺于MS筛选培养基(含30μg/毫升Hyg、100μg/毫升Cef)上，将培养基放于光照培养箱培养(温度22℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度100—150μmol/m²/s，湿度75％)，一周后选取阳性幼苗移栽至土壤。

(6)T1突变植株的检测

(6.1)基因组DNA提取

1)剪取拟南芥叶片约200mg于2毫升离心管中，加入钢珠，利用高通量组织破碎仪进行叶片研磨。

2)待研磨充分后，加入400μL SDS提取缓冲液，上下颠倒混匀，置于65℃水浴锅中孵育15分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀一次。

3)13000rpm离心5分钟。

4)吸取300μL上清液转移至一新的1.5毫升离心管中，向离心管中加入等体积经过-20℃预冷的异丙醇，将离心管置于-20℃1小时或者过夜。

5)13000rpm离心10分钟，去掉上清液。

6)向离心管中加入500μL 70％乙醇洗涤沉淀，离心后倒掉洗涤液(注意不要倒掉沉淀)，置于室温晾干后，加入30μL ddH₂O溶解DNA，置于-20℃保存DNA。

(6.2)PCR扩增

以提取的T1植株基因组为模板，用检测引物进行靶点片段扩增，吸取5μL扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并经凝胶成像仪成像。剩余产物交由测序公司直接进行测序。

测序结果表明，在拟南芥中成功实现了AtPPO1基因加倍，除草剂抗性测试表明加倍的植株具有对PPO除草剂的抗性。

实施例9在斑马鱼中创制具有新表达特性的GH1基因

鱼类中生长激素(growth hormone；GH)基因，控制其生长发育速度。目前通过转基因技术在大西洋三文鱼中高表达GH基因能够将其生长速度显著提升，具有极大的应用价值，但是经过了数十年才通过审批上市。GH1基因是斑马鱼中的生长激素基因。本发明将斑马鱼中合适的启动子(持续表达、强度适宜、组织特异性适宜)在体内通过删除、倒置、加倍、倒置加倍、染色体转移等方式融合在一起，创造出一个生长迅速的鱼类品种。

说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每篇出版物或专利申请被单独、特别地通过引用并入本文一样。

尽管为清楚理解起见，前述发明已通过举例说明和实施例的方式较为详细地进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改，这样的改变和修改均在本发明的范围之内。

序列表

<110> 青岛清原化合物有限公司

<120> 在生物体内创制新基因的方法及应用

<130> 2

<150> 2019110734061

<151> 2019-11-06

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4439

<212> DNA

<213> 拟南芥 PPO基因(Genbank number AT4G01690序列)

<400> 1

gatattttga tgtcgtatgt atatcaatgt tgttagctgt aaactgtcca atgaaaatcc 60

atttaatatt tggacaaatt attattaggg aaattaatgt aatgtggagt attttatatg 120

aaatgtgtat taatgacgac gaccttactt gatcccggaa gtgtgtatta atttaatcgc 180

ggtgcatcgc tgtccacacg gttgggttca tgcgtacgtg gtatttgctg gcaagtggca 240

gtgaagtttc ttgtttgata ctgtatgttc cattcatgtc tttccctaga tgcatgtttc 300

ttctattttt atatattaat atttttttgt ttttcttatt atgttttctt tccctttgtg 360

aggagaataa ttgcgatacg attatttgtt ttaacagaaa aaagtgaagc gaaaaagatg 420

attcgaagtt tgaagtacga ttaaaatttt tctttttccg gatccgagtt tgatcttctt 480

tagaaacaaa aattatattt gtttagaaag tctgtcagtt gggttttggc ccaattgatt 540

tacctggtag tcagaaatgt aagtgacctg actacccttg acattagtca gaaaacattc 600

taaactcgag ataaacactg tggtagttct ttagaaagaa gtcgactcta aagtactttg 660

gcgtaaaaca aaaaaatttc ccttgaaatt atactttatt tgtttgacat aaatgtttca 720

aatataatct tcttttaatc aatgtagtta aatttttttg atagaagcac gtcagaattt 780

cacactagta atgtataagt ggtaatcatc attgcctaaa acaatgatta attaaaattt 840

tagaattcgt cgtcgacaaa gaatttttct tatgatgaag gttttgtgca taattatgaa 900

cggatccatt tatttcactc taactaggaa tagatgtttg atgggataca agtgaacacg 960

acacaaagta acaaaaattc atttaacgtc acaaattatt ctcaatcgaa tttcgaagta 1020

tcaagaaaaa gggcaattaa aaacgtaatc tcattatgtc tttgaaatct aaattaaaag 1080

ttgagtttat tttaattatt aatttccttt ttgatgatgt aggggatgac aattgacaac 1140

caatttgatt tgaaagatta acataaatca ttttgagcat acatatattg cttaaatcac 1200

acccgtttat ctctaaaaac ctccataatt tatatcagga aaataaatct agttattgat 1260

atcgccatca aatatttttt tcttaaattg tttttttttg ttgttgttga aaatttaatt 1320

agaaagataa gtggacaacg acgcgagaca aagacacaat ctttagggcc ttgagtaaat 1380

tagggacagc ataaacacat gcactagtcc tgtctttatt taattatgtg gtgtttactc 1440

taatgacgtc gctttgatta accaagtggt cataattaat atatcgatcg aattatataa 1500

ttatcataaa tttgaataag catgttgcct tttattaaag aggtttaata aagtttggta 1560

ataatggact ttgacttcaa actcgattct catgtaatta attaatattt acatcaaaat 1620

ttggtcacta atattaccaa attaatatac taaaatgtta attcgcaaat aaaacactaa 1680

ttccaaataa agggtcatta tgataaacac gtattgaact tgataaagca aagcaaaaat 1740

aatgggtttc aaggtttggt tatatatgac aaaaaaaaaa aaaggtttgg ttatatatct 1800

attgggccta taaccatgtt ataacaaatt tgggcctaac taaaataata aaataaacgt 1860

aatggtcctt tttatatttg ggtcaaaccc aactctaaac ccaaaccaaa gaaaaagtat 1920

acggtacggt acacagactt atggtgtgtg tgattgcagg tgaatatttc tcgtcgtctt 1980

ctcctttctt ctgaagaaga ttacccaatc tgaaaaaaac caagaagctg acaaaattcc 2040

gaattctctg cgatttccat ggagttatct cttctccgtc cgacgactca atcgcttctt 2100

ccgtcgtttt cgaagcccaa tctccgatta aatgtttata agcctcttag actccgttgt 2160

tcagtggccg gtggaccaac cgtcggatct tcaaaaatcg aaggcggagg aggcaccacc 2220

atcacgacgg attgtgtgat tgtcggcgga ggtattagtg gtctttgcat cgctcaggcg 2280

cttgctacta agcatcctga tgctgctccg aatttaattg tgaccgaggc taaggatcgt 2340

gttggaggca acattatcac tcgtgaagag aatggttttc tctgggaaga aggtcccaat 2400

agttttcaac cgtctgatcc tatgctcact atggtggtaa gttcttgaaa caatctgatt 2460

cgttaatact gagaacaatg tatttgtgaa ttgtttgatt tgtggattta gccttctctg 2520

tttatggtta gagtaggtag atagtggttt gaaggatgat ttggtgttgg gagatcctac 2580

tgcgccaagg tttgtgttgt ggaatgggaa attgaggccg gttccatcga agctaacaga 2640

cttaccgttc tttgatttga tgagtattgg tgggaagatt agagctggtt ttggtgcact 2700

tggcattcga ccgtcacctc cagtgtgtat tcttacgacc ttttagatca atatgatttt 2760

tagggcttta tgttggtaga atctgctcat gttcttagag tttggcaaag gtgacagggt 2820

cgtgaagaat ctgtggagga gtttgtacgg cgtaacctcg gtgatgaggt ttttgagcgc 2880

ctgattgaac cgttttgttc aggtagagtt atagataaaa cttcatgtga accatttatt 2940

catttagatg tcagcgaatc tgattatcta gcagttttca tttttgttct agtgcaccct 3000

taatgcttta gattttatgc ttttaggtgt ttatgctggt gatccttcaa aactgagcat 3060

gaaagcagcg tttgggaagg tttggaaact agagcaaaat ggtggaagca taataggtgg 3120

tacttttaag gcaattcagg agaggaaaaa cgctcccaag gcagaacgag acccgtgagt 3180

aacatcaaac ttttctgttg cttgggtctt ttgtcccttc atatatatat ttgtaaaaca 3240

actcaacctg cttcttcagg cgcctgccaa aaccacaggg ccaaacagtt ggttctttca 3300

ggaagggact tcgaatgttg ccagaagcaa tatctgcaag gtatccagta cttgtctctc 3360

tctattgttg gaagggaaaa gggaaaaact ttcaaatgtt ttctgaaatc ttttgcactt 3420

tgacagatta ggtagcaaag ttaagttgtc ttggaagctc tcaggtatca ctaagctgga 3480

gagcggagga tacaacttaa catatgagac tccagatggt ttagtttccg tgcagagcaa 3540

aagtgttgta atgacggtgc catctcatgt tgcaagtggt ctcttgcgcc ctctttctgt 3600

aagtttctca ttttgcgaac taggaatttg ctcaaaattc atagattcga caaatatggg 3660

ttcttaaatc gtgtgctgca actgttatct tctcaggaat ctgctgcaaa tgcactctca 3720

aaactatatt acccaccagt tgcagcagta tctatctcgt acccgaaaga agcaatccga 3780

acagaatgtt tgatagatgg tgaactaaag ggttttgggc aattgcatcc acgcacgcaa 3840

ggagttgaaa cattaggtat atatcttgta gttataatcg tcaattatgt caaaatgttc 3900

atagaatctt catgctgttg ctcgtatttc ttcaggaact atctacagct cctcactctt 3960

tccaaatcgc gcaccgcccg gaagaatttt gctgttgaac tacattggcg ggtctacaaa 4020

caccggaatt ctgtccaagg taaaaaacag caaacacttg taacacatct ttattcaacc 4080

aagtaaacct aagaactgat agttttcttc tctctctctc ttttgttttg attccgcagt 4140

ctgaaggtga gttagtggaa gcagttgaca gagatttgag gaaaatgcta attaagccta 4200

attcgaccga tccacttaaa ttaggagtta gggtatggcc tcaagccatt cctcagtttc 4260

tagttggtca ctttgatatc cttgacacgg ctaaatcatc tctaacgtct tcgggctacg 4320

aagggctatt tttgggtggc aattacgtcg ctggtgtagc cttaggccgg tgtgtagaag 4380

gcgcatatga aaccgcgatt gaggtcaaca acttcatgtc acggtacgct tacaagtaa 4439

<210> 2

<211> 3452

<212> DNA

<213> 拟南芥 Ubiquitin10基因(Genbank number AT4G05320序列)

<400> 2

aaacaagact accaatatga tgaactgatg attttttttt tttttttttt ggctcaacaa 60

caaactttcc attcacccat ttatggatac acagtctagc tcaacagagc ttttaaccca 120

aattggtaca atagaataca actttagatc ataattctca aaagaaagag attccttagc 180

tattctatct gccactccat ttccttctcg gcttgtatgc acaagcataa aatcctcaaa 240

cttgctaagt agatacttta tgtcttggat aattggattg agacttgaca agcataactt 300

tcatgtaacc aaagacacaa gttgctgaga atccacctca aaaatgatct tcctataatt 360

gaatcgggat aatgacagca cagcccatct aagagcctcc acttctactt ccagcacgct 420

tcttactttt accacagctc ttgcacctaa ccataacacc ttccctgtat gatcgcgaag 480

cacccaccct aagccacatt ttaatccttc tgttggccat gccccatcaa agttgcactt 540

aacccaagat tgtggtggag cttcccatgt ttctcgtctg tcccgacggt gttgtggttg 600

gtgctttcct tacattctga gcctctttcc ttctaatcca ctcatctgca tcttcttgtg 660

tccttactaa tacctcattg gttccaaatt ccctcccttt aagcaccagc tcgtttctgt 720

tcttccacag cctcccaagt atccaaggga ctaaagcctc cacattcttc agatcaggat 780

attcttgttt aagatgttga actctatgga ggtttgtatg aactgatgat ctaggaccgg 840

ataagttccc ttcttcatag cgaacttatt caaagaatgt tttgtgtatc attcttgtta 900

cattgttatt aatgaaaaaa tattattggt cattggactg aacacgagtg ttaaatatgg 960

accaggcccc aaataagatc cattgatata tgaattaaat aacaagaata aatcgagtca 1020

ccaaaccact tgcctttttt aacgagactt gttcaccaac ttgatacaaa agtcattatc 1080

ctatgcaaat caataatcat acaaaaatat ccaataacac taaaaaatta aaagaaatgg 1140

ataatttcac aatatgttat acgataaaga agttactttt ccaagaaatt cactgatttt 1200

ataagcccac ttgcattaga taaatggcaa aaaaaaacaa aaaggaaaag aaataaagca 1260

cgaagaattc tagaaaatac gaaatacgct tcaatgcagt gggacccacg gttcaattat 1320

tgccaatttt cagctccacc gtatatttaa aaaataaaac gataatgcta aaaaaatata 1380

aatcgtaacg atcgttaaat ctcaacggct ggatcttatg acgaccgtta gaaattgtgg 1440

ttgtcgacga gtcagtaata aacggcgtca aagtggttgc agccggcaca cacgagtcgt 1500

gtttatcaac tcaaagcaca aatacttttc ctcaacctaa aaataaggca attagccaaa 1560

aacaactttg cgtgtaaaca acgctcaata cacgtgtcat tttattatta gctattgctt 1620

caccgcctta gctttctcgt gacctagtcg tcctcgtctt ttcttcttct tcttctataa 1680

aacaataccc aaagagctct tcttcttcac aattcagatt tcaatttctc aaaatcttaa 1740

aaactttctc tcaattctct ctaccgtgat caaggtaaat ttctgtgttc cttattctct 1800

caaaatcttc gattttgttt tcgttcgatc ccaatttcgt atatgttctt tggtttagat 1860

tctgttaatc ttagatcgaa gacgattttc tgggtttgat cgttagatat catcttaatt 1920

ctcgattagg gtttcataga tatcatccga tttgttcaaa taatttgagt tttgtcgaat 1980

aattactctt cgatttgtga tttctatcta gatctggtgt tagtttctag tttgtgcgat 2040

cgaatttgtc gattaatctg agtttttctg attaacagat gcagatcttt gttaagactc 2100

tcaccggaaa gacaatcacc ctcgaggtgg aaagctccga caccatcgac aacgttaagg 2160

ccaagatcca ggataaggag ggcattcctc cggatcagca gaggcttatt ttcgccggca 2220

agcagctaga ggatggccgt acgttggctg attacaatat ccagaaggaa tccaccctcc 2280

acttggtcct caggctccgt ggtggtatgc agattttcgt taaaacccta acgggaaaga 2340

cgattactct tgaggtggag agttctgaca ccatcgacaa cgtcaaggcc aagatccaag 2400

acaaagaggg tattcctccg gaccagcaga ggctgatctt cgccggaaag cagttggagg 2460

atggcagaac tcttgctgac tacaatatcc agaaggagtc cacccttcat cttgttctca 2520

ggctccgtgg tggtatgcag attttcgtta agacgttgac tgggaaaact atcactttgg 2580

aggtggagag ttctgacacc attgataacg tgaaagccaa gatccaagac aaagagggta 2640

ttcctccgga ccagcagaga ttgatcttcg ccggaaaaca acttgaagat ggcagaactt 2700

tggccgacta caacattcag aaggagtcca cactccactt ggtcttgcgt ctgcgtggag 2760

gtatgcagat cttcgtgaag actctcaccg gaaagaccat cactttggag gtggagagtt 2820

ctgacaccat tgataacgtg aaagccaaga tccaggacaa agagggtatc ccaccggacc 2880

agcagagatt gatcttcgcc ggaaagcaac ttgaagatgg aagaactttg gctgactaca 2940

acattcagaa ggagtccaca cttcacttgg tcttgcgtct gcgtggaggt atgcagatct 3000

tcgtgaagac tctcaccgga aagactatca ctttggaggt agagagctct gacaccattg 3060

acaacgtgaa ggccaagatc caggataagg aaggaatccc tccggaccag cagaggttga 3120

tctttgccgg aaaacaattg gaggatggtc gtactttggc ggattacaac atccagaagg 3180

agtcgaccct tcacttggtg ttgcgtctgc gtggaggtat gcagatcttc gtcaagactt 3240

tgaccggaaa gaccatcacc cttgaagtgg aaagctccga caccattgac aacgtcaagg 3300

ccaagatcca ggacaaggaa ggtattcctc cggaccagca gcgtctcatc ttcgctggaa 3360

agcagcttga ggatggacgt actttggccg actacaacat ccagaaggag tctactcttc 3420

acttggtcct gcgtcttcgt ggtggtttct aa 3452

<210> 3

<211> 5159

<212> DNA

<213> 水稻转酮醇酶TKT基因序列(GenBank number LOC4340025)

<400> 3

catgaaccaa agagtcaaat tcaagatggc gtgctgctct tggtcttttg aatgtggcag 60

cagccaggat caatgcatcc taatatatct atgttggctt agtgaatgac taattaaaca 120

caattaaccc cagggatggt cacatgacta ctgatctctt caaactgttt taatttccca 180

tgtcagaatc tacatctgta cgtacaattt aagctctcct tttttttttt ttaaaaaaaa 240

aagacgaggt taaactaact aactaagctt gagcatcttc taatgtagta aggtatataa 300

atcagaagca aaaacaacat caaaactgtt acaaaaacaa gcaaaccata taaataagaa 360

tattccacaa aggtagattc ctgctgaata gattctatgc ccatctgggt ctatcttgtt 420

atttattctc gtgtggctcg gtttcatcat ccatcttggc gaatcacaga aaagagcggt 480

ttgcaattta tatttggttg aaaagaatgg caattttaca tgccaggatc atatacctct 540

gcatctaaaa agttgatttt tttgacccca aattttcaac ataaacatca caatcaacca 600

tggaatgacg ccagaaaaca actgtgacgg cgacgacccc aacatacaca aggagccagg 660

acaatcttta cattattttt atctcttaga aaaaaatatg tcccataaca attttttttt 720

caaaaggctc accagaccac taacaaatag gcgaaaatat ctttaataat atccaatcgt 780

ttcctaccct cttccaacgg ccaggatcat cttgtttgcc atatcaacgg tcatggctga 840

tatcctcatc caccaaccca cctcaccaca cccatcccca cataaaccca gtccatacac 900

gcaaatctaa tcaaaaccac atgtatagct gcagaatata tataacaatt ctatcatata 960

tacatactac aaacttgcac tttattattc caagaattga taccatttcc agcatctttt 1020

ttaaacctaa ctgtagaatt ttgtgaaagc tacaaaatca gtcaggtcaa tgttcatgta 1080

aaacgaacta attctcatca gattagtgtg ctataaacat aagcaaaata tataaagaaa 1140

ttagtaagat cactcctcta tgtgaatatt ttcacacctt tgccaaatat gcataaattt 1200

tttatccaag atgttgcata tacttcctcc gtttcacaat gtaagtcact ctagcatttt 1260

ccacatttat attgatgtta acgaatctag acagtctaga ttcgtgtcta gcttcattaa 1320

catcaatatg aatgtgggaa atgctagaat gacttacatt gtgaaacgga gggagtactt 1380

acctaggtta acatttgtta agtttttttt attgtgtcat attttcatca tttgttgata 1440

atgctatact ttcttttcag tatagactat gtaagtaagt agctatagct tctgttaaaa 1500

caaatgtcag gttttatcta ttatctaaaa acatccaagt taccccctct gcttcatatt 1560

ataagtcgtt tatttttttc ctaatcaaat attgttaatt tcgacaaaat ttatagaaaa 1620

aattaacaac atctaagata ttaaattagt tttattaaat ctaagttgta tatattttga 1680

taatatgatt gttgtgttga aaatactaat atatttttct acatatttag ttaaacttaa 1740

aaaaagtttg ataaaatttt tttaaaggat ttataatata aaaggaggga gtaacatttg 1800

ttaactacaa tataaaaact aatttaaaga tcaaataagt acaataacta ctttataaag 1860

attataggtt caataattgc ggcgaagaaa gtgctcctaa tctcaccagc catggcggct 1920

taggatgctg gtccatgcac catgtccacg tccacaccat agccccctcc tttttattgg 1980

ctacgagtcc ccccaaaacg cacccccaag tctatacata acccatccca tctcccaccc 2040

cacaacctcg ccatctccgc ctctcctcgc caccacacca ctcctctcgc catggccgcg 2100

cactccgtcg ccgccgcgca cgccaccatc gccgcgcgcg cgggtgccgc cgcgccagcg 2160

cccgcgccgc cggagcgcct cgggttccgc ctcagcgcgc tcgccggccg cggcctccgc 2220

tccccgctcc cgcctcgccg cggcgcgcca tcggcgtccg cgtcgcgccg ccgccacaac 2280

aaccgcgtgc gcgcggcggc ggtcgagacg ctcgaggggc aggcggcgac gggggcgctg 2340

ctcgagaagt cggtgaacac gatccggttc ctcgccatcg acgccgtcga gaaggccaac 2400

tcggggcacc ccggcctgcc catggggtgc gcgcccatgg ggcacatcct ctacgacgag 2460

gtcatgcggt acaaccccaa gaacccctac tggttcaacc gcgaccgctt catcctctcc 2520

gccggccacg gctgcatgct ccagtacgcc ctgctccacc tcgccggcta cgacgccgtc 2580

ttggtaagcg cttcccatat ccctttgctc cttgcatctc tctttcgctt ctcgagttgg 2640

ttggtttggg gcggataaat cgggagtagg ttcgtgcaag tttcggatct tgttaggtga 2700

agcagtggaa agtgtggatc ttgactgcta tttttgtgtg gcggcttcgt ttttttccta 2760

gtaaaagtgt gcaccttttc cagtcgtcag agatctgttt agtggaattt aatcttatgt 2820

aatacttcct aggaagatta gttggaagat gctattaagt cgagcaattg ttcactgtaa 2880

attctggagt gatcggtgaa gtgtttaata tggttgactt cagtttcaac tgatttgttc 2940

atcgagcttg ctgtaactat ggccgcatat tgctgcagga ggaggacttg aagcaattca 3000

ggcaatgggg aagcaagact ccaggccatc ccgagaactt cgagacgccc ggagttgaag 3060

ttaccactgg tctgtcatct caactgaagc tcatagcacc tttaagtttc tatgcttgaa 3120

tacatacaga actgaatgtt tcggtttctt gtttggtttc gttctgtagg acctcttggt 3180

cagggtattg caaatgcagt tgggctggcc cttgctgaga agcacctggc tgctcgtttc 3240

aacaagcccg acagcgagat tgttgatcac tacacgtaat ttttttttta tcatgaatac 3300

ctttagtttt cactttagtt atggtggtgc aaccttggta acatgattca tggattttgt 3360

gcagctactg tattttggga gatgggtgcc agatggaggg tatctccaat gaagcttgct 3420

cgttggctgg ccattggggt cttggcaagc tgattgcatt ctatgatgac aaccacattt 3480

ccattgacgg agacacagag attgcattca ctgaggatgt gagtgctcgc tttgaggctc 3540

ttgggtggca tacaatctgg gttaagaatg gaaacgatgg ctatgatgag attcgtgccg 3600

ccattaagga agcaaaggcg gtaactgaca agccaacact aatcaaggtt agattcctgt 3660

acattctgtt atgctgtgtt ttgttataga gcttatcata tttagccaaa atgtactctt 3720

tttaggtgac caccacaatc ggttttggat cacccaacaa ggccaactca tacagcgtcc 3780

acggaagtgc tttgggtacc aaagaggttg aagcaaccag agagaacctt ggatggccct 3840

atgagccatt ctttgtgcct gaggatgtga agaggtttgt ctattgttgt tttggttatc 3900

tgaatgagat gttgaaattt catagcactc accttatggt ttatttgcat gggctgttac 3960

agccactgga gccgccatgt gcctcaaggt gctgcttttg aggctgactg gaatgctaag 4020

ttcgccgagt atgagaagaa gtacccagaa gatgcagcga ccttgaagag cattgtctca 4080

ggggagttgc ctgctggctg ggctgacgct cttcctgtaa gtcttttacc atttctactc 4140

ataacatttg agctggtatg tgaatgatga cattctaatg gtagattact tgatttgtac 4200

agaaatacac tccagagagc cctgcagatg ccaccaggaa tctgtcacag cagtgcttaa 4260

acgcacttgc taaagttgtt cctggtcttc ttggaggaag tgctgatctt gcatcctcca 4320

acatgacatt gcttaagatg ttcggtgact tccagaagga tacgcctgag gagcgcaatg 4380

tccgatttgg agtcagggag catggaatgg gcgccatttg caacggcatt gctctgcaca 4440

gcccaggact cattccatac tgtgctactt tctttgtttt cactgattac atgagagctg 4500

ccatgaggat ctcagccttg tgtgaagccg gagttatcta tgttatgacc catgactcta 4560

ttggtcttgg agaagatggt ccaacccatc agcccattga gcacttggtg agcttccgtg 4620

cgatgcccaa cattctgatg cttcgtcctg ctgatggtaa cgagactgct ggggcataca 4680

aaatcgcggt cctcaacagg aagaggccat ccgtccttgc tctctccagg caaaagcttg 4740

ctcagctgcc tggtacctcg attgagggtg ttgagaaggg tgggtacatc gtctctgaca 4800

actcaactgg caacaagcct gacttcattg tgatgagcac tggctctgaa ctagagattg 4860

tcgccaaggc tgctgatgag ttgaggaagg aggggaagac tgtccgtgtc gtgtcatttg 4920

tttgctggga gcttttcgat gaacagtcgg ctgagtacaa ggagagtgtt ctccctgagg 4980

ctgttactgc aagagtcagc cttgaagcag ggtctactct tggatggcag aagtacgtcg 5040

gaagcaaagg caaggctatt ggcatcgaca aattcggtgc aagtgctcct gctggaaaga 5100

tctaccagga gtatggcatc accgcggaga acgtcatcgc aacagcaaag agcctgtaa 5159

<210> 4

<211> 5164

<212> DNA

<213> 水稻EPSPS基因 (GenBank number LOC4340026)

<400> 4

gctgggtagc ctttcaaagc cccaaaagat tgggtcgggt ctctctttcg gctctcgtcg 60

gtggctgctt cccacaaaga ccgccatcag acgtgaatga actgcaagtc tgcaactacg 120

actccagttg ctatcccctt aaattacttt actactacct ttattctaag ggccggttcg 180

gataattgcc aaaatcaatc gtaccaaatt ttaataatat taggatgaaa taaatatgtt 240

gcgccaaaat tttctactgt tactgaaatt tggtaacaaa ctaaacacaa ccgtatattt 300

atcaatttta ccaaatagtg gtatggttta aaatgacatt aatctaaata ggtcctgaaa 360

tataaaaatg caccaaccat caatgcatgc agttacattc caaagttctc ctaggacaca 420

tatgccatat attttcgatg gatagcctta atgtctgact actctcttca tcgcaacaaa 480

tctaatataa tacaaatctg aataggagct tatataaata tatagtagta gaatatgtca 540

taatattaca gtggtattcc atattggatt tgttgattat agaacgacga aagtatgcgt 600

taacttacaa ggttgtttac attatgacga aatgaagaga aggaacgcac ctactgcgaa 660

gagctcaaca actacttcct ccaaatttcc actcaccaac tgatcaccac caattcactt 720

gtgcagtgcc acctacccaa tttcattcca gtggcgtggt acgtaggttc cgcatgtcag 780

tgtgacaatc gtacggactg ccatgtgtat tgtgttcagg taggtgcact ggtcgtggtc 840

tcaccatctc tcctccagtc gtacggcgcc acgtaggcag tacacgtaga cggccttctt 900

cctcctccct cgagttgagt tggttggtga gagtgagaca ccgacggaac ggaaggagaa 960

ccacgccgct tggatttttc ttttttacct tttcaaattt taatttaaaa aataaaacca 1020

ttttaaaaac ttatcttcaa atacaaatct tttaaaaaca ctaacacgtg acacacagcg 1080

ggcacgtcac ccaaacgggc gtgacaatat tgttttgcca caccaatcca gctggtgtgg 1140

acaaaatgtt catatattga aaataaaatt taaaacaatt tatatttttt atctatatca 1200

ttataaaaat tgaagatgtt tttaccggta ttttgttact catttgtgca tgagtcggtt 1260

tttaagtttg ttcgcttttg gaaatacata tccgtatttg agtatgtttt taagttcgtt 1320

cgttttttga aatacaaaag gaatcgtaaa ataaatctat tttaaaaaac tcgcatgcta 1380

acttgagacg atcgaactgc taattgcagc tcataatttt ccaaaaaaaa atatatccaa 1440

acgagttctt atagtagatt tcaccttaat taaaacatat aaatgttcac ccggtacaac 1500

gcacgagtat ttttataagt aaaattaaaa gtttaaaata aataaaaatc ccgccaccac 1560

ggcgcgatgg taaaaggggg acgcttctaa acgggccggg cacgggacga tcggccccga 1620

acccggccca tctaaccgct gtaggcccac cgcccaccaa tccaactccg tactacgtga 1680

agcgctggat ccgcaacccg ttaagcagtc cacacgactc gactcgactc gcgcactcgc 1740

cgtggtaggt ggcaaccctt cttcctcctc tatttcttct tcttcctccc ttctccgcct 1800

caccacacca accgcaccaa ccccaacccc gcgcgcgctc tcccctctcc cctcccacca 1860

accccacccc atcctcccga cctccacgcc gccggcaatg gcggcgacca tggcgtccaa 1920

cgccgcggct gcggcggcgg tgtccctgga ccaggccgtg gcggcgtcgg cggcgttctc 1980

gtcgcggaag cagctgcggc tgcccgccgc ggcgcgcggg gggatgcggg tgcgggtgcg 2040

ggcgcggggg cggcgggagg cggtggtggt ggcgtccgcg tcgtcgtcgt cggtggcagc 2100

gccggcggcg aaggcggagg agatcgtgct ccagcccatc agggagatct ccggggcggt 2160

tcagctgcca gggtccaagt cgctctccaa caggatcctc ctcctctccg ccctctccga 2220

ggtgagacgc ggatcccttc ctcttgcgtg aattccattt ctggagatga gattttaggg 2280

ggtttattag gtgaggtggc tgtgtttgtg aaatcctagg aattatctct caagtcaatc 2340

taacgatgag atataactga ggttctggtt ttaatcacac actcatataa ccaatttatt 2400

gaaacatttt ggtttggcat aagaaactgc ttacgaaggt atgatatcct cctacatgtc 2460

aggctactaa attttcacga cggtatgatc cactcaaaac aagtttctta acgagtctgg 2520

tgaggtctgt tatgaaattt gtgtaaacta aggcaacttt ggaggtttcg cactgtacca 2580

atgttatgtt tgaacatttt gcaagcagtg ctttctccca aaattatgca attttgaggc 2640

tcctctacat cattataatt ccccaataca ttgctcttta ttcttaatag ctttgatcgc 2700

gaaatttaac attttaattc ttgagctgtt attttgtagc atcagtttat catgagccat 2760

gtttggtact aaatatacaa tcccttgggt ttatttgttt ccaagcatgt cattaactta 2820

tcttaatgtg gacaagaaac tgatgcctgc ttacattgct attatttcaa gcgggtattg 2880

atcctttgac atgtgattga tcattttttt ttctctggtt attagggcac aacagtggtg 2940

gacaacttgc tgaacagtga ggatgttcac tacatgcttg aggccctgaa agccctcggg 3000

ctctctgtgg aagcagataa agttgcaaaa agagctgtag tcgttggctg tggtggcaag 3060

tttcctgttg agaaggatgc gaaagaggaa gtgcaactct tcttggggaa cgctggaact 3120

gcaatgcgac cattgacagc agccgtgact gctgctggtg gaaatgcaac gtatgttttt 3180

ttttttaatg tttatgaaaa tatgtatgga attcatgggg tatgttttat gacctttttc 3240

tttaccatca gttatgtgct tgatggagtg ccacgaatga gggagagacc gattggtgac 3300

ttggttgtcg ggttgaaaca acttggtgcg gatgtcgact gtttccttgg cactgaatgc 3360

ccacctgttc gtgtcaaggg aattggagga cttcctggtg gcaaggttag ttactcctaa 3420

actgcatcct ttgtacttct gtatgcacct caattctttg tcaaccttct gcatttataa 3480

ggaacattct atgatgcaat tcgaccttac actgcacagt aacttgaaat gtttcatgct 3540

taatcaatat gccatattcc tgccaagctc aagcgagcaa tatttgtttg aatttggtac 3600

catatttttg tatatttggg cattcctttt tggtcttgat gtcttctttt gaattagcat 3660

ttaactgaat tacactcaac aggttaagct ctctggttcc atcagcagtc agtacttgag 3720

tgccttgctg atggctgctc ctttggccct tggggatgtg gagatcgaaa tcattgacaa 3780

actaatctcc attccttacg ttgaaatgac attgagattg atggagcgtt ttggtgtgaa 3840

ggcagagcat tctgatagtt gggacagatt ctatattaag ggagggcaga agtacaagta 3900

agcttctacc tgccttactg agctgaatta ttcgggtgtt tatgattaac tccctaaact 3960

aacccttttt cttttctttg gcattgacag atctcctgga aatgcctatg ttgaaggtga 4020

tgcctcaagc gcgagctatt tcttggctgg tgctgcaatc actggaggca ctgtgacagt 4080

tcaaggttgt ggtacgacca gtttgcaggt ataactgtag tgcctgtttt gacattctac 4140

cgtttagtca agtttagtca gtagtcacat attcagaata tagcacaatc tgtattatgc 4200

cactgttaat caaatacgct tgacctagag agtgctatat accctagctt aatcttcaaa 4260

ctaaacagtt ctcttgtggc ttgctgtgct gttatgttcc ctgacctaca tgttaatatt 4320

acagggtgat gtcaaatttg ctgaggtact tgagatgatg ggagcaaagg ttacatggac 4380

tgacaccagt gtaaccgtaa ctggtccacc acgtgagcct tatgggaaga aacacctgaa 4440

agctgttgat gtcaacatga acaaaatgcc tgatgttgcc atgacccttg ccgttgttgc 4500

actcttcgct gatggtccaa ctgctatcag agatggtaaa cattaaggcc tattatacct 4560

gttctatcat actagcaatt actgcttagc attgtgacaa aacaaataac caaactttct 4620

tcaaaataac ttagaaatat aagaaaggtt cgttttgtgt ggtaaacagt actactgtag 4680

tttcagctat gaagtttgct gctggcaatt ttctgaacgg tttcagctaa attgcatgtt 4740

tgttcatcat acttatccat tgtcttccac agtggcttcc tggagagtaa aggaaaccga 4800

aaggatggtt gcaattcgga ccgagctaac aaaggtaaat tcattaggtc ccgtgtcctt 4860

tcattcttca agtagtttgt tcataagttg aattctcctt caatgatgtt taaattcatc 4920

atcttctttt ttggtgttgt gccagctggg agcatcggtt gaagaaggtc ctgactactg 4980

catcatcacc ccaccggaga agctgaacat cacggcaatc gacacctacg atgatcacag 5040

gatggccatg gccttctccc tcgctgcctg cgccgacgtg cccgtgacga tcagggaccc 5100

tggttgcacc cgcaagacct tccccaacta cttcgacgtt ctaagcactt tcgtcaggaa 5160

ctga 5164

<210> 5

<211> 3481

<212> DNA

<213> 水稻ubiquitin2基因(GenBank number LOC4328390 )

<400> 5

gaaatcaaaa gggaaatgca ccatcttata tctccagttt atatgaacag attggataag 60

atcataagat caagtggttt atattatttt gaggaatata acatggattc atcctaatca 120

ctcgtctagg cagtatgtgt attcatgatg gatatggtac tatactacgg agttttttct 180

tcacaaaata acctgttatt ttgacctcca accaaacacg aattatacca aaaattgggt 240

tatttcatct atagtacaac tctattataa acatgcagta aattatccta cacatatacc 300

aaaattcaag tgtaataatc ctaatacaca gacttaaaaa acaaactatt tcctttttaa 360

gaaaaggaaa accatttttt taacggaagg aaaacaaatt cgggtcaagg cggaagccag 420

cgcgccaccc cacgtcagca aatacggagg cgcggggttg acggcgtcac ccggtcctaa 480

cggcgaccaa caaaccagcc agaagaaatt acagtaaaaa aaaagtaaat tgcactttga 540

tccacctttt attacctaag tctcaatttg gatcaccctt aaacctatct tttcaatttg 600

ggccgggttg tggtttggac taccatgaac aacttttcgt catgtctaac ttccctttca 660

gcaaacatat gaaccatata tagaggagat cggccgtata ctagagctga tgtgtttaag 720

gtcgttgatt gcacgagaaa aaaaaatcca aatcgcaaca atagcaaatt tatctggttc 780

aaagtgaaaa gatatgttta aaggtagtcc aaagtaaaac ttatagataa taaaatgtgg 840

tccaaagcgt aattcactca aaaaaaatca acgagacgtg taccaaacgg agacaaacgg 900

catcttctcg aaatttccca accgctcgct cgcccgcctc gtcttcccgg aaaccgcggt 960

ggtttcagcg tggcggattc tccaagcaga cggagacgtc acggcacggg actcctccca 1020

ccacccaacc gccataaata ccagccccct catctcctct cctcgcatca gctccacccc 1080

cgaaaaattt ctccccaatc tcgcgaggct ctcgtcgtcg aatcgaatcc tctcgcgtcc 1140

tcaaggtacg ctgcttctcc tctcctcgct tcgtttcgat tcgatttcgg acgggtgagg 1200

ttgttttgtt gctagatccg attggtggtt agggttgtcg atgtgattat cgtgagatgt 1260

ttaggggttg tagatctgat ggttgtgatt tgggcacggt tggttcgata ggtggaatcg 1320

tggttaggtt ttgggattgg atgttggttc tgatgattgg ggggaatttt tacggttaga 1380

tgaattgttg gatgattcga ttggggaaat cggtgtagat ctgttgggga attgtggaac 1440

tagtcatgcc tgagtgattg gtgcgatttg tagcgtgttc catcttgtag gccttgttgc 1500

gagcatgttc agatctactg ttccgctctt gattgagtta ttggtgccat gggttggtgc 1560

aaacacaggc tttaatatgt tatatctgtt ttgtgtttga tgtagatctg tagggtagtt 1620

cttcttagac atggttcaat tatgtagctt gtgcgtttcg atttgatttc atatgttcac 1680

agattagata atgatgaact cttttaatta attgtcaatg gtaaatagga agtcttgtcg 1740

ctatatctgt cataatgatc tcatgttact atctgccagt aatttatgct aagaactata 1800

ttagaatatc atgttacaat ctgtagtaat atcatgttac aatctgtagt tcatctatat 1860

aatctattgt ggtaatttct ttttactatc tgtgtgaaga ttattgccac tagttcattc 1920

tacttatttc tgaagttcag gatacgtgtg ctgttactac ctatctgaat acatgtgtga 1980

tgtgcctgtt actatctttt tgaatacatg tatgttctgt tggaatatgt ttgctgtttg 2040

atccgttgtt gtgtccttaa tcttgtgcta gttcttaccc tatctgtttg gtgattattt 2100

cttgcagatg cagatctttg tgaagacatt gaccggcaag actatcaccc tcgaggtgga 2160

gtcctctgac accatcgata atgtcaaggc taagatccaa gataaggagg gcatcccccc 2220

ggaccagcag cgtctcatct tcgctggcaa gcagctggag gatggcagga cccttgctga 2280

ctacaacatc cagaaggagt cgacccttca ccttgtcctc cgcctccgtg gtggcatgca 2340

gatctttgtc aagactctga ccggcaagac tatcaccctt gaggtggagt cttctgacac 2400

catcgacaac gtcaaggcca agatccagga caaagagggc atccccccag accagcagcg 2460

tctcatcttc gccggcaagc agctggagga tggcaggacc cttgctgact acaacatcca 2520

gaaggagtcc accctccacc ttgtcctccg cctccgtggt ggcatgcaga tctttgtcaa 2580

gacactgacc ggcaagacca tcaccctcga ggtggaatct tctgacacca tcgacaacgt 2640

caaggccaag atccaggaca aggagggcat tcccccggac cagcagcgtc tcatctttgc 2700

cggcaagcag cttgaggacg gcaggaccct tgctgactac aacatccaga aggagtcaac 2760

gcttcacctt gtcctccgtc tcaggggagg catgcaaatc ttcgtgaaga ctctgaccgg 2820

caagaccatc accctcgagg tggagtcttc tgataccatc gacaatgtca aggccaagat 2880

ccaggacaag gagggcattc ccccggacca gcagcgcctc atctttgctg gcaagcagct 2940

ggaggatggc aggacccttg ctgactacaa catccagaag gagtccaccc tccaccttgt 3000

gctccgcctt cgtggtggta tgcagatctt tgtcaagacc ctcacaggca agaccatcac 3060

cctggaggtt gagagctcgg acaccatcga caacgtcaag gccaagatcc aggacaagga 3120

gggcatcccc ccagaccagc agcgtctcat cttcgccggc aagcagctcg aggatggccg 3180

caccctcgcc gactacaaca tccagaagga gtctaccctc cacctggtgc ttcgtctccg 3240

tggtggtatg cagatcttcg tgaagacctt gactgggaag accatcactt tggaggttga 3300

gagctccgac accattgata atgtgaaggc caagatccag gacaaggagg ggattccccc 3360

agaccagcag cgtctgatct tcgctggcaa gcagctggag gatggacgca ccctcgccga 3420

ctacaacatc cagaaggagt ccaccctcca cctggtgctc cgcctccgtg gtggtcagta 3480

a 3481

<210> 6

<211> 3166

<212> DNA

<213> 水稻HPPD基因(GenBank number LOC4328425 )

<400> 6

aaatggtatt gtttagaagt ttagaaaacg ttctgccgga cggaatggtt ccatccctta 60

aaaaaggacg ctgtttcaaa ttcgaaaaaa agaagagcca tcacgataac cagacggtta 120

ctgacgattt tgccgaaggt gattatcgat ggtcagtcaa caaagtataa accctgctta 180

gcggtaataa acacttgatg ttttacgtaa aatcttttga aacttagacg gccaacgact 240

atcaaaatat ttacatcgaa atcatgaaaa aatgttgtgt tcatttgtct ttgcaaataa 300

tttcaaggcc tcataaactt attttaatac aaaataatgg ctaacgtcac actaaatcaa 360

aatccaatat caaatgcttt taaggaagca gtagagatat cttcaattga gattttgact 420

gtttgagaca gctcattcta ccgcttttca tatgtctatc gagaccgagg taatatatgt 480

ggcacaaaac gttttagaga agtgatgtga aaaacactac catccatcca tttgcaataa 540

gaaaatcctc cattactact ctccccgatt cttaatagat aacactatca atttttaaaa 600

atatatattt atcattcatc taattaagga atataattat cttttatttt tttaacttgg 660

tttatcatta aaaacacttt taaatatgac ttatattttc ttatgtttac acatgttttt 720

aaaataaaac aaatgattga acatataatc acctagtaaa aacaagagct ttactccaag 780

ttaccacaaa atttgtttcc ccttccctct aaaaatcaga acagtcacca acttttctca 840

aaaaaaaaaa aagtaacaaa ctcatcagct tcacaaattc accagcagcc aaggcaacca 900

gcaccagagg acaaatcccg tccgcaacca ctagacttag cgtccacgtg gcgccatctc 960

ctccctttat ttaacccccc accaccaact cctcccccca cgccgccact gtcatccact 1020

cccccacacc ccacgacgcg ccacgccacg ccgcgccgcg ccgcgccatg cctcccactc 1080

ccacccccac cgccaccacc ggcgccgtct cggccgctgc ggcggcgggg gagaacgcgg 1140

ggttccgcct cgtcgggcac cgccgcttcg tccgcgccaa cccgcggagc gaccggttcc 1200

aggcgctcgc gttccaccac gtcgagctct ggtgcgccga cgccgcgtcc gccgcgggcc 1260

ggttcgcctt cgccctgggc gcgccgctcg ccgccaggtc cgacctctcc acggggaact 1320

ccgcgcacgc ctccctcctc ctccgctccg cctccgtcgc gttcctcttc accgccccct 1380

acggcggcga ccacggcgtc ggcgcggacg cggccaccac cgcctccatc ccttccttct 1440

ccccaggcgc cgcgcggagg ttcgccgcgg accacggcct cgcggtgcac gccgtggcgc 1500

tgcgcgtcgc cgacgcggcc gacgccttcc gcgccagcgt cgcggccggt gcgcgcccgg 1560

cgttccagcc cgccgacctc ggcggtggct tcggcctcgc ggaggtggag ctctacggcg 1620

acgtcgtgct ccgcttcgtc agccacccgg acggcgccga cgcgcccttc ctcccgggtt 1680

tcgagggcgt cagcaacccg ggcgccgtgg actacggcct ccgccggttc gaccacgtcg 1740

tcggcaacgt gccggagctc gctccggtag ccgcgtacat ctccgggttc accgggttcc 1800

acgagttcgc cgagttcacc gccgaggacg tgggcaccgc cgagagcggc ctcaactcgg 1860

tggtgctcgc caacaacgcg gagaccgtgc tgctgccgct caacgagccg gtgcacggca 1920

ccaagcggcg gagccagata cagacgtacc tggaccacca cggcggcccg ggggtgcagc 1980

acatcgcgct ggccagcgac gacgtgctcg ggacgctgag ggagatgcgg gcgcgctccg 2040

ccatgggcgg cttcgagttc ttggcgccgc cgccgcccaa ctactacgac ggcgtgcggc 2100

ggcgcgccgg ggacgtgctc tcggaggagc agatcaacga gtgccaggag ctcggggtgc 2160

tcgtggacag ggatgaccag ggggtgttgc tccagatctt caccaagcca gtaggagaca 2220

ggtaaaatcc tcacctcttt catgatgaaa atggcttatg aattcagatt tgcagttatt 2280

tgttggcaca tagcatcgat taggcgcaga aaggtgtcaa gcattatgaa attaatccag 2340

aatgcttgaa taatacagta taatatatga tagtgagctc tgtgatactc catggatact 2400

ctttatgtgt ctccatgaat ccatgatgcg cctttctgaa gattgtgaca ctagaaaggg 2460

aataaagctg aatgtgcata ggaaaaaaat gaaaagccaa tgtgtgtctg tttatgcctt 2520

cttgcaagca tatcccagtt cctttttgcc ggcatgttgt aatgcagata gccagccaca 2580

tatagctact taattagtga gtactccctc tcacaatgta agtcattcta gtattttcca 2640

cattcatatt gatgctaatc tatctagatt cattagcatc aatatgaata tgggaaatac 2700

tagaatgact tacattgtga aacggaggaa gtattactta ctacatctaa ggtccatgga 2760

ttcctttttt tacaaaagaa agaaagaatc ttatggcaac tccatcagca taaaccagca 2820

atgctgctgg gaacaactta aactttaggt tcaggaggtt gtaattgtct ttaagcttaa 2880

tagtctgatt cagtcagtat tctaatttct gctgcatctt tgctattgtt atttcctctc 2940

tgtgactcca aatctaactg gatcagctat ttcactcagg ccaacctttt tcttggagat 3000

gatacaaagg attgggtgca tggagaagga tgagagtggg caggagtacc agaagggcgg 3060

ctgcggcggg tttgggaagg gcaacttctc ggagctgttc aagtccattg aggagtatga 3120

gaaatccctt gaagccaagc aagcccctac agttcaagga tcctag 3166

<210> 7

<211> 4311

<212> DNA

<213> 水稻PPO基因(GenBank number LOC4327918 )

<400> 7

caaaaaaaat tattcaaaag gaagcaggca gggcagcaca ttgtgaggga atcaggcggc 60

ggcgcacagt tctctccctt ggcaccctcc tttccctcat atgcaatgga ctcaaaaggg 120

cggctgcagc gtatgccggt ggattaggtt tcgagggtgg atccagtgag agcaaaggtg 180

gtggggtgac ccaaggacgc tgcttcgctc aagtccacat gtgcttcgcc tcaaggccag 240

gatgccgccg ccctactcga gactaggtag ctgacttgag actaggccgt tgtcgcgcgt 300

cggggccgcc cagccgctgc tccaccttgg gtcacgctgt cactctatct caaggctggg 360

ccatcgccac tatgcttgaa gccgcactac cgtcccacct caaggccggc accctgtcac 420

tccacctcga ggctacctag acgttatttt gttccgctgc tacgccttag agacacccca 480

ctgccgctct accttgggct atgccgtcgc tctttctcca aggcgcgctg ctacaactcc 540

gccctgagtc tccatgtgcc tgtgtggaga aaggagaggg aagaaagaaa gaaaggagaa 600

agaagtggga ggaatcacta acatgtgagc tctgtatatt gatttggtca gttggattag 660

gtcaacgagc catccaagag aaaacaaccc ttaaaatcat tgagaaaatc atttttaact 720

gttttaatag ttaagagatg aagatatatt tttttttata gaaagagatg aagatatccg 780

atatccaata tgataggaat cagaaaacgt atatttttga gggagtcaat gcggacttat 840

tcccaccaga aactgcagca tattggacgc agtggttcct tccgcggtag ctgcgcccgc 900

gcccacggga atgcgattcc cagcccattc cacccccttc ccattccggt gggccattcc 960

gaatccaacc aaccaaccaa ccatcgaacc cgcacccgca tcgtatccac tcctctccag 1020

tctccccgcc gctccgcatc ccgcagccgc tcgtcagcga cggacatggc cgccgccgcc 1080

gcagccatgg ccaccgccac ctccgccacg gcagcgccgc cgctccgcat tcgcgacgcc 1140

gcgaggagga cccgccgacg cggccacgtt cgctgcgccg tcgccagcgg cgcggccgag 1200

gcgcccgcgg cgcccggggc gcgggtgtcg gcggactgcg tcgtggtggg cggcggcatc 1260

agcgggctct gcaccgcgca ggcgctggcc acaaagcacg gcgtcggcga cgtgctcgtc 1320

acggaggccc gcgcccgccc cggcggcaac atcaccaccg ccgagcgcgc cggcgagggc 1380

tacctctggg aggaggggcc caacagcttc cagccttccg accccgtcct caccatggcc 1440

gtacgtcttc ttgctcccct tctcttctga ttctctcgcg gcggagacga catgaatggg 1500

aatggtggtg catggattgg ggcgcgcagg tggacagcgg gctcaaggac gatctcgtgt 1560

tcggggaccc caacgcgccg cggttcgtgc tgtgggaggg gaagctaagg ccggtgccgt 1620

ccaagcccgg cgacctgccg ttcttcgacc tcatgagcat ccccggcaag ctcagggccg 1680

gccttggcgc gctcggcgtt cgagcgccac ctccagtttg tgtgctctcc ccgctgtgca 1740

ttcttgattc acttgtgaaa ttcgattgtg ctgagcgttt ccggcgaagg tttcaggggc 1800

gtgaggagtc ggtggaggac ttcgtgcggc gcaacctcgg cgcggaggtc tttgagcgcc 1860

tcattgagcc tttctgctca ggtgtttatt gtagtgtgca attgctgttt tgtttttgat 1920

gattcagata agaatacggt gatttcggtg cttaggtgtg tatgctggtg atccttcaaa 1980

gctcagtatg aaggctgcat ttgggaaggt gtggaggctg gaggatactg gaggtagcat 2040

tattggtgga accatcaaaa caatccagga gagggggaaa aaccccaaac cgccgaggga 2100

tccgtgagtg agaaattgcc ttctttgttg gattaattgt ccattgtgtt acactgatat 2160

gccttcacca tttttagccg ccttccaacg ccaaaggggc agacagttgc atctttcagg 2220

aagggtctga ctatgctccc ggatgctatt acatctaggt ttgttatcat tgtctttgta 2280

atttacctag ttcttcaact atggatatta ggtgctgtag attgttcaga tagatgcaca 2340

ttgtacaaca atctaggtag attgattgct atggcttgtt gaattaactg tttcacttgc 2400

atcattgcct cagcacatat gaagcatatg gatagattct tcaatcattt atccctcaat 2460

aacacaattt tgacaccagt gcttctcctt tttttcatcc tgcttcatct ggctatccac 2520

aatataatta agcatacaaa agaggcactc tttgatggac aattcatagt gttgtgggtt 2580

aatattcatt tgcattcttt gagggacaat tcgttacacc ctaacatgaa ctagtaatga 2640

ttggggtgct taaccatttg ttctgcattt cctccatttt caggttgggt agcaaagtca 2700

aactttcatg gaagttgaca agcattacaa agtcagacaa caaaggatat gcattagtgt 2760

atgaaacacc agaaggggtg gtctcggtgc aagctaaaac tgttgtcatg accatcccat 2820

catatgttgc tagtgatatc ttgcggccac tttcagtaag ttatatatat ttaattaact 2880

ttctgttccc aaaatacact gcagcacttc attgcttcct gaggtcctcg attcattttt 2940

cggtagacag gaagtagtat tcatttgcac tttttaaggg attaattcaa catatccact 3000

ggaaatatac atatcctaca catcctgtca acatacttgc taaacagcat tttgtttgag 3060

ttgactggca tctcagcagc caattactat ctttagggga caagccacat tcttaataaa 3120

tcctgtcgga aatcactttt tgatttttat agattagtgt tgtcatagaa tttggcttgg 3180

tgatctactt ggtaaggtta actgattcac aagtcggaca atttcttcac caatctagca 3240

gtatgtttaa gtgtgttggt acttaattct aaatgtcctg cgcatggtaa catatcatat 3300

gcaaaaattc ctcagtaacc gaaatttata ctgtaagttt taactgtctt tacactgtta 3360

attttagaca tacttcttcc ttgcttgttc attgaacttg tttccccctt ccacagagtg 3420

atgcagcaga tgctctgtca atattctatt atccaccagt tgctgctgta actgtttcat 3480

atccaaaaga agcaattaga aaagaatgct taattgacgg agagctccag ggtttcggcc 3540

agctgcatcc gcgtagtcag ggagttgaga ctttaggtac ttataggaat tcaaccttat 3600

tattcttcta acatataaat gaactaatct ttcttgtcta gtttgcattt attgtggatt 3660

aagtttggtt atattgttct tacaagtttg tggtattatt ttgtatagga acaatatata 3720

gctcatcact ctttccaaat cgtgctccag ctggaagggt gttacttctg aactacatag 3780

gaggttctac aaatacaggg attgtttcca aggtatcgct gtcaagttgt ttattttgcg 3840

actatatgat tacagtatcc tgtttttcaa ctccagctgc tgttagactg tcataataaa 3900

tctgctacta catgtttgca cactatttga ctgcatttaa aaactcagat agcctatatt 3960

tttagttgcc tgctactggg tgtatttcta atgatcccat catgtttgca gactgaaagt 4020

gagctggtag aagcagttga ccgtgacctc aggaagatgc tgataaatcc taaagcagtg 4080

gaccctttgg tccttggcgt ccgggtatgg ccacaagcca taccacagtt cctcattggc 4140

catcttgatc atcttgaggc tgcaaaatct gccctgggca aaggtggtta tgatggattg 4200

ttcctcggag ggaactatgt tgcaggagtt gccctgggcc gatgcgttga aggtgcatat 4260

gagagtgcct cacaaatatc tgactacttg accaagtacg cctacaagtg a 4311

<210> 8

<211> 2463

<212> DNA

<213> 水稻CP12基因(GenBank number LOC4325791)

<400> 8

tttaaatcgt atttctactt ggactctcct ttccttttct aattttggat tttttttttg 60

aattttgatt aatctcgtat tgggttctta tatggaaact tctttcaata ttgcttattt 120

tcaattccga atttcagcta tttttaaatc gtatttctac ttggactctc cttttctttt 180

tttctttttc ttcgattaat gtgggaattt ctagccccca cagcgaacgt ggtgactatt 240

ttcaaagctg ttttaataat ataatagatt ttattttagg gcctgttcag attgtagcca 300

aaataaacct tatcaaaatt tgacaatacc aaaattttgt caagttgaca atattgccaa 360

aattttggca ggatttctta cgtatttatc aaatttggca acaaactaaa catagatatt 420

tttttggcaa ctttaccaaa aaagttgtat gattgaaaat gacatcaatc tgaacagccc 480

cttagaactt agaactacaa tctgaacagc cccttagaac ttagaactac agtggaatcc 540

atcttggcat atgtacttgg cagggaattt tttttacatt tttattatta aaaaattaca 600

aaattttttt tcgaaaattt acaaatctag acgcctaaca tcctttagga gggcgttttt 660

ttaaatcgcc cttctaaagg gcgttaaggg acctaaatgc aaaattttta tttgtattcg 720

aaccctttcc accagtttta attgcttaaa agctaataat gcttatttga cactccaaat 780

aattttaaat gaaaaggtaa taaactacaa agttgtagat ctcatcgaga tctatatctt 840

ttttataaag tttatctcca tccaatgtcg tttgaaatgt agttctgaga atttttttaa 900

ataggtttta gattttgtaa cgaatatttg gacatctaaa cgatcttaaa tgaaagttgt 960

taattacaaa cttgtagatc ttctccagct ctacaatttt gatataaact ttaatttcat 1020

atggctttat atgatatagt tttaaattgt aaaatcatag aggtagcaag ctatgatgga 1080

aaatttgtat ttaggtccct aacgccctct ggaagggtga tttgaaaaaa gccctctagg 1140

aggacgtgag gcacgactag atttgtaaat tttcggaatg aaaaattatt tttaaatatt 1200

ttaatcaaaa aatgtaaaaa taaaaaaaat tctcggcagg gtggcagcat gggcctaagg 1260

cccagtcaac tgtgggccta taagcgacta atccggctgt aactgggcct tgcaagaggc 1320

ttgtcttgtt ggtccgaact caggaagtcc aggttgcggg gacaacttca aggccatctg 1380

gtttccactt ctcttaccac ctcaattccg ctcttgatcc gagctagctt agtcccaatc 1440

taaaaacttt acaaagaaag aaccatacgc acctattggg caaaatgaaa aataatttgc 1500

tactcaccaa ataatttgag cacctctgca cctgtacact aaataactct gttccaccaa 1560

aatagttgag atatctagga cgtttcattt tgtccgttct tcaccaaact tttccatagt 1620

atctcagata ttttcgagac cgaaagtgat ctttctggcc ttagaccgag ttcacttccc 1680

tacaagccat tctttgctgg cacaacacga acctctacat caatttcgta tccaacctga 1740

acttctgcat acatgtacac acccacagtc atctgctcat gttttcacgg tcaaattaaa 1800

actgcttctc tcaccttaga ttcacccaag ggaaaagaaa aagatctcct ttgccaagtc 1860

cccatttcgc atgaaatatc tcaaaataca gcccacgtgg cacacgacga ttggctgagg 1920

aggcgataag aaacgagtgc acgtcgtcga atcctctctc cccttctccc ccaccccacg 1980

gagctatata tatataaacc ccatctcttc aatccgtgca acgaacgcct cgtcgcaaca 2040

gctacaaacg cccacatcac acgcagaaat ccgcatcaac agccagccat ggcgtccacg 2100

ctgaccaacg tcggcctgtc taccccggcg gcggcggcgt cgtccctcgt taggccggtc 2160

gccggagctg gacgcgtggt gtttccccgt gttggccgcg gcgggttcgc ggcggtgagg 2220

gcgagcgggc cggcgacgcc gccggacatc tcggacaaga tgtcggagag catcgacaag 2280

gcgaaggagg cgtgcgcgga ggacacggcg agcggcgagt gcgcggcggc gtgggacgag 2340

gtggaggagc tgagcgcggc ggcgagccac gcgcgcgaca agctcaagga gacctccgac 2400

ccgctcgagg cctactgcaa ggacaacccg gagaccgacg agtgccgcac ctacgacaac 2460

tga 2463

<210> 9

<211> 744

<212> DNA

<213> pQY002066载体转化原生质体检测加倍测序结果(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcaagtcca taggcgaggc gaccggcccg cggcggacgc ggcgtcggcg caccagagct 60

cgacgtggtg gaacgcgagc gcctggaacc ggtcgctccg cgggttggcg cggacgaagc 120

ggcggtgccc gacgaggcgg aaccccgcgt tctcccccgc cgccgcagcg gccgagacgg 180

cgccggtggt ggcggtgggg gtgggagtgg gaggcatggc gcggcgcggc gcggcgtggc 240

gtggcgcgtc gtggggtgtg ggggagtgga tgacagtggc ggcgtggggg gaggagttgg 300

tggtgggggg ttaaataaag ggaggagatg gcgccacgtg gacgctaagt ctagtggttg 360

cggacgggat ttgtcctctg gtgctggttg ccttggcaga tagggtaaga actagcacaa 420

gattaaggac acaacaacgg atcaaacagc aaacatattc caacagaaca tacatgtatt 480

caaaaagata gtaacaggca catcacacat gtattcagat aggtagtaac agcacacgta 540

tcctgaactt cataaataag tagaatgaac tagtggcaat aacttttcac acagaacatc 600

tcccttgttt tcaaatatgt agtaacagca cacgtatcct gtacttcaaa acttagtaga 660

atgaactagt ggcagtaatc tttcacacag aaagaatgaa ctagtggcaa taatctttca 720

cacagaatgt tggttgatgg atag 744

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<211> 603

<212> DNA

<213> pQY002068载体转化原生质体检测加倍测序结果(Artificial Sequence)

<400> 10

caacgtgcct taggcgaggc gaccggcccg cggcggacgc ggcgtcggcg caccagagct 60

cgacgtggtg gaacgcgagc gcctggaacc ggtcgctccg cgggttggcg cggacgaagc 120

ggcggtgccc gacgaggcgg aaccccgcgt tctcccccgc cgccgcagcg gccgagacgg 180

cgccggtggt ggcggtgggg gtgggagtgg gaggcatggc gcggcgcggc gcggcgtggc 240

gtggcgcgtc gtggggtgtg ggggagtgga tgacagtggc ggcgtggggg gaggagttgg 300

tggtgggggg ttaaataaag ggaggagatg gcgccacgtg gacgctaagt ctagtggttg 360

cggacgggat ttgtcctctg gtgctggttg ccttggagat agggtaagaa ctagcacaag 420

attaaggaca caacaacgga tcaaacagca aacatattcc aacagaacat acatgtattc 480

aaaaagatag taacaggcac atcacacatg tattcagata ggtagtaaca gcacacgtat 540

cctgaacttc agaaataagt agaatgaact agtggcaata acttttcccc ccaaaaacct 600

gtc 603

<210> 11

<211> 477

<212> DNA

<213> pQY002062载体转化原生质体检测倒置测序结果(Artificial Sequence)

<400> 11

gggcggattt cgacggaggg gcggagagga ggaggatcct gttggagagc gacttggacc 60

ctggcagctg aaccgccccg gagatctccc tgatgggctg gagcacgatc tcctccgcct 120

tcgccgccgg cgctgccacc gacgacgacg acgcggacgc caccaccacc gcctcccgcc 180

gcccccgcgc ccgcacccgc acccgcatcc ccccgcgcgc cgcggcgggc agccgcagct 240

gcttccgcga cgagaacgcc gccgacgccg ccacggcctg gtccagggac accgccgccg 300

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ttggggggac tcgtagccaa taaaaaggag ggggctatgg tgtggccgtt tggacat 477

<210> 12

<211> 670

<212> DNA

<213> pQY002062载体转化原生质体检测删除测序结果(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttcgttgg aggggcggag aggaggagga tcctgttgga gagcgacttg gaccctggca 60

gctgaaccgc cccggagatc tccctgatgg gctggagcac gatctcctcc gccttcgccg 120

ccggcgctgc caccgacgac gacgacgcgg acgccaccac caccgcctcc cgccgccccc 180

gcgcccgcac ccgcacccgc atccccccgc gcgccgcggc gggcagccgc agctgcttcc 240

gcgacgagaa cgccgccgac gccgccacgg cctggtccag ggacaccgcc gccgcagccg 300

cggcgttgga cgccatggtc gccgccattg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 360

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtc catggccgcg cactccgtcg ccgccgcgca 420

cgccaccatc gccgcgcgcg cgggtgccgc cgcgccagcg cccgcgccgc cggagcgcct 480

cgggttccgc ctcagcgcgc tcgccggccg cggcctccgc tccccgctcc cgcctcgccg 540

cggcgcgcca tcggcgtccg cgtcgcgccg ccgccacaac aaccgcgtgc gcgcggcggc 600

ggtcgagacg ctcgaggggc aggcggcgac gggggcgctg ctcgagaagt cggaaacccc 660

cgaatccaaa 670

<210> 13

<211> 777

<212> DNA

<213> pQY002093载体转化原生质体检测倒置测序结果(Artificial Sequence)

<400> 13

gaacgatgcg agccccacgc tcgaccgccg ccgcgcgcac gcggttgttg tggcggcggc 60

gcgacgcgga cgccgatggc gcgccgcggc gaggcgggag cggggagcgg aggccgcggc 120

cggcgagcgc gctgaggcgg aacccgaggc gctccggcgg cgcgggcgct ggcgcggcgg 180

cacccgcgcg cgcggcgatg gtggcgtgcg cggcggcgac ggagtgcgcg gccatggcga 240

gaggagtgga tggtcacctg actaccggtc ccctcaaact ggtttaattt cccctggcaa 300

aatccacctc cggacctaca atttaagctc cccttttttt ttttaaaaaa aaaaaaaaag 360

agggtaaacc aactaaccta gcttggacct tttttaatgg agtaagggat ttaaaacaaa 420

aacaaaaaaa aaatccaaac tggtaaaaaa acaaacaaac catttaaata aaaattttcc 480

ccaaagggaa attcctggcg aaaaaaatct atgcccctct gggtctatct tggtattttt 540

tccccggggc tccgtttcat ccttcatttt ggcgaataca aaaaaaaccg tttgaatttt 600

ttttggttga aagaatggca atttactggc caggatcatg tactctgcat ctaagaattg 660

attttttgac cccaaatttc aacttagcct ccatcgcagt agtgcgcaca cacaggctga 720

aggtgactct tagacccaat gtcactatct cagcaatatg cagagagaat gacccaa 777

<210> 14

<211> 635

<212> DNA

<213> pQY002093载体转化原生质体检测删除测序结果(Artificial Sequence)

<400> 14

agaacgatgc gcagcctcgg cgtctcgacc gccgccgcgc gcacgcggtt gttgtggcgg 60

cggcgcgacg cggacgccga tggcgcgccg cggcgaggcg ggagcgggga gcggaggccg 120

cggccggcga gcgcgctgag gcggaacccg aggcgctccg gcggcgcggg cgctggcgcg 180

gcggcacccg cgcgcgcggc gatggtggcg tgcgcggcgg cgacggagtg cgcggccatg 240

gcgagaggag tgtggtgggt accctttcaa acccccaaaa gagtgggtcg ggtctctctt 300

tcggctctcg gcgggggctg cttcccacaa agaccgccat cagacgtgag tgaactgcaa 360

gtctgcaact accactccag gtgctctccc cttaaattac tttactacta cctttattct 420

aggggccggt tcagataatt gccaaaatca ctcgcaccat tttttaataa tattaggatg 480

aaatatatat gtcgcgccaa atttttctac tgttactgaa atttggacac aaactacaca 540

ccaccgtata tttatctttt ttaccaaata ggggtatggt ttaaaatgac tttaatctaa 600

ataggccctg aaatataaaa gcgccccacc cctca 635

<210> 15

<211> 652

<212> DNA

<213> pQY002095载体转化原生质体检测倒置测序结果(Artificial Sequence)

<400> 15

tttgagtaga ctcgccggcg cgctcggcgg tggtgatgtt gccgccgggg cgggcgcggg 60

cctccgtgac gagcacgtcg ccgacgccgt gctttgtggc cagcgcctgc gcggtgcaga 120

gcccgctgat gccgccgccc accacgacgc agtccgccga cacccgcgcc ccgggcgccg 180

cgggcgcctc ggccgcgccg ctggcgacgg cgcagcgaac gtggccgcgt cggcgggtcc 240

tcctcgcggc gtcgcgaatg cggagcggcg gcgctgccgt ggcggaggtg gcggtggcca 300

tggctgcggc ggcggcggcc atgtccgtcg ctgacatgcg gatttctgcg tgtgatgtgg 360

gcgtttgtag ctgttgcgac gaggcgttcg ttgcacggat tgaagagatg gggtttatat 420

atatatagct ccgtggggtg ggggagaagg ggagagagga ttcgacgacg tgcactcgtt 480

tcttatcgcc tcctcagcca atcgtcgtgt gccacgtggg ctgtattttg agatatttca 540

tgcgaaatgg ggacttggca aaggagatct ttttcttttc ccttgggtga atctaaggtg 600

agagaagcag ttttaatttg accgtgaaaa catgagccaa aaggaaaaaa gg 652

<210> 16

<211> 506

<212> DNA

<213> pQY002095载体转化原生质体检测删除测序结果(Artificial Sequence)

<400> 16

acgcgtggtt cttccggtag ctgcgcccgc gcccacggga atgcgattcc cagcccattc 60

cacccccttc ccattccggt gggccattcc gaatccaacc aaccaaccaa ccatcgaacc 120

cgcacccgca tcgtatccac tcctctccag tctccccgcc gctccgcatc ccgcagccgc 180

tcgatgcgga tttctgcgtg tgatgtgggc gtttgtagct gttgcgacga ggcgttcgtt 240

gcacggattg aagagatggg gtttatatat atatagctcc gtggggtggg ggagaagggg 300

agagaggatt cgacgacgtg cactcgtttc ttatcgcctc ctcagccaat cgtcgtgtgc 360

cacgtgggct gtattttgag atatttcatg cgaaatgggg acttggcaaa ggagatcttt 420

ttcttttccc ttgggtgaat ctaaggtgag agaagcagtt ttaatttgac cgtgaaaaca 480

tagcccagaa tgacaaaata accttt 506

<210> 17

<211> 614

<212> DNA

<213> pQY002098载体转化原生质体检测倒置测序结果(Artificial Sequence)

<400> 17

gcatcgtccg gccgtcggcg gtggtgatgt tgccgccggg gcgggcgcgg gcctccgtga 60

cgagcacgtc gccgacgccg tgctttgtgg ccagcgcctg cgcggtgcag agcccgctga 120

tgccgccgcc caccacgacg cagtccgccg acacccgcgc cccgggcgcc gcgggcgcct 180

cggccgcgcc gctggcgacg gcgcagcgaa cgtggccgcg tcggcgggtc ctcctcgcgg 240

cgtcgcgaat gcggagcggc ggcgctgccg tggcggaggt ggcggtggcc atggctgcgg 300

cggcggcggc catgttgtgg gcgtttgtag ctgttgcgac gaggcgttcg ttgcacggat 360

tgaagagatg gggtttatat atatatagct ccgtggggtg ggggagaagg ggaaagagga 420

ttcgacgacg tgcactcgtt tcttatcgcc tcctcagcca atcgtcgtgt gccacgtggg 480

ctgtattttg agatatttca tgcgaaatgg ggacttggca aaggagatct ttttcttttc 540

ccttgggtga atctaaggtg agagaagcag ttttaatttg accgtgaaaa catgagccca 600

aattgacaaa tccc 614

<210> 18

<211> 574

<212> DNA

<213> QY2091-13检测HPPD加倍测序结果(Artificial Sequence)

<400> 18

ggatacgtgt gctgttacta cctatctgaa tacatgtgtg atgtgcctgt tactatcttt 60

ttgaatacat gtatgttctg ttggaatatg tttgctgttt gatccgttgt tgtgtcctta 120

atcttgtgct agttcttacc ctatctgcca aggcaaccag caccagagga caaatcccgt 180

ccgcaaccac tagacttagc gtccacgtgg cgccatctcc tccctttatt taacccccca 240

ccaccaactc ctccccccac gccgccactg tcatccactc ccccacaccc cacgacgcgc 300

cacgccacgc cgcgccgcgc cgcgccatgc ctcccactcc cacccccacc gccaccaccg 360

gcgccgtctc ggccgctgcg gcggcggggg agaacgcggg gttccgcctc gtcgggcacc 420

gccgcttcgt ccgcgccaac ccgcggagcg accggttcca ggcgctcgcg ttccaccacg 480

tcgagctctg gtgcgccgac gccgcgtccg ccgcgggccg gttcgccttc gccctgggcg 540

cgccgctcgc cgccaggtcc gacctctcca cggg 574

<210> 19

<211> 551

<212> DNA

<213> QY2091-20检测HPPD加倍测序结果(Artificial Sequence)

<400> 19

aggatacgtg tgctgttact acctatctga atacatgtgt gatgtgcctg ttactatctt 60

tttgaataca tgtatgttct gttggaatat gtttgctgtt tgatccgttg ttgtgtcctt 120

aatcttgtcc aaggcaacca gcaccagagg acaaatcccg tccgcaacca ctagacttag 180

cgtccacgtg gcgccatctc ctccctttat ttaacccccc accaccaact cctcccccca 240

cgccgccact gtcatccact cccccacacc ccacgacgcg ccacgccacg ccgcgccgcg 300

ccgcgccatg cctcccactc ccacccccac cgccaccacc ggcgccgtct cggccgctgc 360

ggcggcgggg gagaacgcgg ggttccgcct cgtcgggcac cgccgcttcg tccgcgccaa 420

cccgcggagc gaccggttcc aggcgctcgc gttccaccac gtcgagctct ggtgcgccga 480

cgccgcgtcc gccgcgggcc ggttcgcctt cgccctgggc gcgccgctcg ccgccaggtc 540

cgacctctcc a 551

<210> 20

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<212> DNA

<213> QY2234-20检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 20

tctctctccc ttctccccca ccccacggag ctatatatat ataaacccca tctcttcaat 60

ccgtgcaacg aacgcctcgt cgcaacagct acaaacgccc acaagcaacg aaggaaatgg 120

gcggccgccg ccgaaccctg ggccccggcc cctcc 155

<210> 21

<211> 447

<212> DNA

<213> QY2234-205检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 21

cccttctccc ccaccccacg gagctatata tatataaacc ccatctcttc aatccgtgca 60

acgaacgcct cgtcgcaaca gctacaaacg gacatggccg ccgccgccgc agccatggcc 120

accgccacct ccgccacggc agcgccgccg ctccgcattc gcgacgccgc gaggaggacc 180

cgccgacgcg gccacgttcg ctgcgccgtc gccagcggcg cggccgaggc gcccgcggcg 240

cccggggcgc gggtgtcggc ggactgcgtc gtggtgggcg gcggcatcgg cgggctctgc 300

accgcgcagg cgctggccac aaagcacggc gtcggcgacg tgctcgtcac ggaggcccgc 360

ccccgccccg gcggcaacat caccaccgcc gagcgcgccg gcgagggcta cctctgggag 420

gaggggccca acagcttcca gccttcc 447

<210> 22

<211> 463

<212> DNA

<213> QY2234-207检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 22

cccttctccc ccaccccacg gagctatata tatataaacc ccatctcttc aatccgtgca 60

acgaacgcct cgtcgcaaca gctacaaacg cccacagtca gcgacggaca tggccgccgc 120

cgccgcagcc atggccaccg ccacctccgc cacggcagcg ccgccgctcc gcattcgcga 180

cgccgcgagg aggacccgcc gacgcggcca cgttcgctgc gccgtcgcca gcggcgcggc 240

cgaggcgccc gcggcgcccg gggcgcgggt gtcggcggac tgcgtcgtgg tgggcggcgg 300

catcagcggg ctctgcaccg cgcaggcgct ggccacaaag cacggcgtcg gcgacgtgct 360

cgtcacggag gcccgcgccc gccccggcgg caacatcacc accgccgagc gcgccggcga 420

gggctacctc tgggaggagg ggcccaacag cttccagcct tcc 463

<210> 23

<211> 388

<212> DNA

<213> QY2234-580检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 23

cccttctccc ccaccccacg gagctatata tatataaacc ccatctcttc aatccgtgca 60

acgaacgcct cgtcgcaaca ggtacatggc cgccgccgcc gcagccatgg ccaccgccac 120

ctccgccacg gcagcgccgc cgctccgcat tcgcgacgcc gcgaggagga cccgccgacg 180

cggccacgtt cgctgcgccg tcgccagcgg cgcggccgag gcgcccgcgg cgcccggggc 240

gcgggtgtcg gcggactgcg tcgtggtggg cggcggcatc agcgggctct gcaccgcgca 300

ggcgctggcc acaaagcacg gcgtcggcga cgtgctcgtc acggaggccc gcgcccgccc 360

cggcggcaac atcaccaccg ccgagcgc 388

<210> 24

<211> 417

<212> DNA

<213> QY2234-H5-159检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 24

cccttctccc ccaccccacg gagctatata tatataaacc ccatctcttc aatccgtgca 60

acgaacgcct cgtcgcaaca gctacaaacg gacatggccg ccgccgccgc agccatggcc 120

accgccacct ccgccacggc agcgccgccg ctccgcattc gcgacgccgc gaggaggacc 180

cgccgacgcg gccacgttcg ctgcgccgtc gccagcggcg cggccgaggc gcccgcggcg 240

cccggggcgc gggtgtcggc ggactgcgtc gtggtgggcg gcggcatcag cgggctctgc 300

accgcgcagg cgctggccac aaagcacggc gtcggcgacg tgctcgtcac ggaggcccgc 360

gcccgccccg gcggcaacat caccaccgcc gagcgcgccg gcgagggcta cctctgg 417

<210> 25

<211> 430

<212> DNA

<213> QY2234-H5-232检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 25

ccttctcccc caccccacgg agctatatat atataaaccc catctcttca atccgtgcaa 60

cgaacgcctc gtcgcaacag ctacaaacgc ccgtcagcga cggacatggc cgccgccgcc 120

gcagccatgg ccaccgccac ctccgccacg gcagcgccgc cgctccgcat tcgcgacgcc 180

gcgaggagga cccgccgacg cggccacgtt cgctgcgccg tcgccagcgg cgcggccgag 240

gcgcccgcgg cgcccggggc gcgggtgtcg gcggactgcg tcgtggtggg cggcggcatc 300

agcgggctct gcaccgcgca ggcgctggcc acaaagcacg gcgtcggcga cgtgctcgtc 360

acggaggccc gcgcccgccc cggcggcaac atcaccaccg ccgagcgcgc cggcgagggc 420

tacctctggg 430

<210> 26

<211> 424

<212> DNA

<213> QY2234-H5-263检测PPO1倒位测序结果(Artificial Sequence)

<400> 26

ataaacccca tctcttcaat ccgtgcaacg aacgcctcgt cgcaacagct acaaacgccc 60

acagtcagcg acggacatgg ccgccgccgc cgcagccatg gccaccgcca cctccgccac 120

ggcagcgccg ccgctccgca ttcgcgacgc cgcgaggagg acccgccgac gcggccacgt 180

tcgctgcgcc gtcgccagcg gcgcggccga ggcgcccgcg gcgcccgggg cgcgggtgtc 240

ggcggactgc gtcgtggtgg gcggcggcat cagcgggctc tgcaccgcgc aggcgctggc 300

cacaaagcac ggcgtcggcg acgtgctcgt cacggaggcc cgcgcccgcc ccggcggcaa 360

catcaccacc gccgagcgcg ccggcgaggg ctacctctgg gaggaggggc ccaacagctt 420

ccag 424

Claims (72)

1.一种在生物体内创制新基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同的特定位置”可以位于同一条染色体上，也可以位于不同染色体上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同的特定位置”可以在至少两个不同基因上的特定位置，也可以在同一基因上的至少两个不同的特定位置。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同基因”的转录方向可以相同，也可以不同。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述的“DNA断裂”是通过将具有靶向特性的核酸酶递送到生物体细胞内与基因组DNA特定位置接触实现的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的“具有靶向特性的核酸酶”为Meganuclease、Zinc finger nuclease、TALEN或CRISPR/Cas系统。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述“具有靶向特性的核酸酶”以DNA形式存在。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述“具有靶向特性的核酸酶”以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。

9.根据权利要求5-8任意一项所述的方法，其特征在于，将具有靶向特性的核酸酶递送到细胞内的方法选自1)PEG介导的细胞转染的方法；2)脂质体介导的细胞转染的方法；3)电击转化的方法；4)显微注射；5)基因枪轰击；或6)农杆菌介导的转化方法。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，所述“基因元件”包括基因的启动子、5’非编码区、编码区或非编码RNA区、3’非编码区和终止子。

11.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区或非编码RNA区的组合。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合中一个为生物内源强启动子，另外一个为HPPD、EPSPS、PPO或GH1基因编码区。

13.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5’非编码区和另一基因的编码区或非编码RNA区的组合。

14.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异。

15.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达组织特异性的差异。

16.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达发育时期特异性的差异。

17.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为同一基因内相邻基因元件的组合。

18.根据权利要求1-17任意一项所述的方法，其特征在于，所述“蛋白结构域”是指对应于蛋白质特定功能结构域的DNA片段；优选地，包括核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、磷酸化位点、甲基化位点、跨膜结构域、DNA结合结构域、转录激活结构域、受体激活结构域或酶催化中心。

19.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域的组合。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述“不同亚细胞定位”包括核定位、胞质定位、细胞膜定位、叶绿体定位、线粒体定位或内质网膜定位。

21.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为两种不同生物学功能的蛋白结构域的组合。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述“不同生物学功能”包括识别特异DNA或RNA保守序列、激活基因表达、结合蛋白配体、结合小分子信号、离子结合或特异的酶促反应。

23.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为同一基因内相邻蛋白结构域的组合。

24.根据权利要求1-10和18任意一项所述的方法，其特征在于，所述基因元件和蛋白结构域的组合为同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5’非编码区、3’非编码区或终止子的组合。

25.根据权利要求1-24任意一项所述的方法，其特征在于，所述的生物体是动物、植物或真菌。

26.一种采用权利要求1-25任意一项所述方法获得的新基因。

27.根据权利要求26所述的新基因，其特征在于，所述的新基因与原基因相比，或具有不同启动子并因此具有了不同时空或不同强度或不同发育时期的表达特性，或具有了新的氨基酸序列；优选地，所述的“新的氨基酸序列”，即可以是两个以上基因编码区的整体融合，也可以是编码区的部分融合或同一基因部分蛋白编码区的加倍。

28.根据权利要求26或27所述的新基因，其特征在于，所述新基因为高表达生物内源HPPD、EPSPS、PPO或GH1基因。

29.一种包含权利要求26-28任意一项所述基因的DNA。

30.一种利用包含权利要求26-28任意一项所述基因编码的蛋白或其生物活性片段。

31.一种重组表达载体，其包含权利要求26-28任意一项所述的基因，以及与之可操作地连接的启动子。

32.一种包含权利要求26-28任意一项所述基因的表达盒。

33.一种宿主细胞，其中包含有权利要求32所述的表达盒；优选地，所述宿主细胞是植物细胞、动物细胞或真菌细胞。

34.采用权利要求33所述宿主细胞再生成的生物。

35.一种如权利要求26-28任意一项所述的基因在赋予或提高生物体抗性/耐受性性状或生长优势性状上的应用。

36.一种组合物，其包含：

(a)两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区或非编码RNA区；

(b)两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5’非编码区和另一基因的编码区或非编码RNA区；

(c)同一基因内相邻基因元件；

(d)两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域；

(e)两种不同生物学功能的蛋白结构域；

(f)同一基因内相邻蛋白结构域；或者，

(g)同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5’非编码区、3’非编码区或终止子。

37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异。

38.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达组织特异性的差异。

39.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达发育时期特异性的差异。

40.根据权利要求36-39任意一项所述的方法，其特征在于，所述“不同亚细胞定位”包括核定位、胞质定位、细胞膜定位、叶绿体定位、线粒体定位或内质网膜定位。

41.根据权利要求36-40任意一项所述的方法，其特征在于，所述“不同生物学功能”包括识别特异DNA或RNA保守序列、激活基因表达、结合蛋白配体、结合小分子信号、离子结合或特异的酶促反应。

42.根据权利要求36-41任意一项所述的组合物，其在体内融合。

43.一种不依赖于外源DNA供体片段，在生物体中提高目标内源基因表达水平的编辑方法，包括以下步骤：

分别在所述目标内源基因与可选的内源高表达基因的启动子和编码区之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生目标内源基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达内源基因。

44.根据权利要求43所述的编辑方法，其特征在于，所述目标内源基因与可选的内源高表达基因位于同一染色体上。

45.根据权利要求43所述的编辑方法，其特征在于，所述目标内源基因与可选的内源高表达基因位于不同染色体上。

46.一种在植物中敲高内源HPPD基因表达的编辑方法，其特征在于，将HPPD基因编码区与植物内源强启动子体内融合，形成新的高表达植物内源HPPD基因。

47.根据权利要求46所述的编辑方法，其特征在于，具体包括以下步骤：分别在HPPD基因与可选的内源高表达基因的启动子和编码区之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过细胞内修复途径互相连接，产生HPPD基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达HPPD基因。

48.根据权利要求46或47所述的编辑方法，其特征在于，所述植物为水稻，优选地，强启动子为ubiquitin2基因的启动子。

49.一种采用权利要求46-48任意一项所述编辑方法获得的高表达植物内源HPPD基因。

50.一种高表达水稻内源HPPD基因，其具有选自下述的序列：

(1)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的核酸序列或其部分序列或其互补序列；

(2)与(1)限定的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％以上同一性；或

(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列。

51.一种在植物中敲高内源EPSPS基因表达的编辑方法，其特征在于，将EPSPS基因编码区与植物内源强启动子体内融合，形成新的高表达植物内源EPSPS基因。

52.根据权利要求51所述的编辑方法，其特征在于，具体包括以下步骤：分别在EPSPS基因与可选的内源高表达基因的启动子和编码区之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过细胞内修复途径互相连接，产生EPSPS基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达EPSPS基因。

53.根据权利要求51或52所述的编辑方法，其特征在于，所述植物为水稻，优选地，强启动子为TKT基因的启动子。

54.一种采用权利要51-53任意一项所述编辑方法获得的高表达植物内源EPSPS基因。

55.一种高表达水稻内源EPSPS基因，其具有选自下述的序列：

(1)如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的核酸序列或其部分序列或其互补序列；

(2)与(1)限定的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％以上同一性；或

(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列。

56.一种在植物中敲高内源PPO基因表达的编辑方法，其特征在于，将PPO基因编码区与植物内源强启动子体内融合，形成新的高表达植物内源PPO基因。

57.根据权利要求56所述的编辑方法，其特征在于，具体包括以下步骤：分别在PPO基因与可选的内源高表达基因的启动子和编码区之间选择特定位置同时产生DNA断裂，所述DNA断裂通过细胞内修复途径互相连接，产生PPO基因编码区与可选的内源强启动子的体内融合，形成新的高表达PPO基因。

58.根据权利要求56或57所述的编辑方法，其特征在于，所述植物为水稻或拟南芥，优选地，在水稻中，强启动子为CP12基因的启动子；在拟南芥中，强启动子为ubiquitin10基因的启动子。

59.一种采用权利要求56-58任意一项所述编辑方法获得的高表达植物内源PPO基因。

60.一种高表达水稻内源PPO基因，其具有选自下述的序列：

(1)如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的核酸序列或其部分序列或其互补序列；

(2)与(1)限定的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％以上同一性；或

(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列。

61.一种包含权利要求49、50、54、55、59或60所述基因的DNA。

62.一种利用包含权利要求49、50、54、55、59或60所述基因编码的蛋白或其生物活性片段。

63.一种重组表达载体，其包含权利要求49、50、54、55、59或60所述的基因，以及与之可操作地连接的启动子。

64.一种包含权利要求49、50、54、55、59或60所述基因的表达盒。

65.一种宿主植物细胞，其中包含有权利要求64所述的表达盒。

66.采用权利要求65所述宿主植物细胞再生成的植物。

67.一种生产对于除草剂的抗性或耐受性提高的植物的方法，其中包括将权利要求65所述的宿主植物细胞再生成植物及其衍生后代。

68.根据权利要求67所述的方法，其特征在于，所述对于除草剂的抗性或耐受性提高的植物是将宿主植物细胞再生成的植物与野生型杂交通过遗传分离去除外源转基因成分的非转基因株系。

69.一种抗除草剂水稻，其包含权利要求50所述高表达水稻内源HPPD基因、权利要求55所述高表达水稻内源EPSPS基因和权利要求60所述高表达水稻内源PPO基因中的一种或两种以上组合。

70.根据权利要求69所述的水稻，其是非转基因的。

71.如权利要求49、50、54、55、59或60所述基因在提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的相应抑制性除草剂抗性或耐受性上的应用。

72.一种控制植物栽培场所的杂草的方法，其中所述植物包括权利要求66所述的植物、通过权利要求67或68的方法制备的植物或者权利要求69或70所述的水稻，所述方法包括对所述栽培场所施用控制杂草有效量的一种或多种HPPD、EPSPS或PPO抑制性除草剂。

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