CN116904495A - 白芷原生质体高效瞬时转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及白芷原生质体高效瞬时转化的方法，包括以下步骤：S1、将待转化的外源基因DNA溶液和原生质体溶液进行混合；其中，外源DNA质粒的高纯度为吸光度值OD260/OD280＝1.6‑2.0，高浓度为0.5‑1.5μg/μl，外源基因DNA的用量为7.5‑12.5μg，原生质体溶液的浓度范围为2×104‑2×106个/mL；S2、将浓度为45‑55％的PEG‑Ca2+溶液加入步骤S1得到的混合液中，于20‑26℃黑暗条件下转化25‑35min；S3、往孵育转化后的混合液中加入W5溶液以终止转化，离心后去除上清液，再加入W5溶液将管底的原生质体重悬，进一步在24‑32℃条件下黑暗孵育14‑16h即可。本发明的瞬时转化方法周期短、操作便捷、效率高，弥补了传统遗传转化方式的缺点。

Description

白芷原生质体高效瞬时转化的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及白芷原生质体高效瞬时转化的方法。
背景技术
瞬时表达作为一种快速、高效的检测蛋白质表达的方法，可引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合，并且随载体进入细胞后12h左右就可表达，基因产物在2～4d内即可被检测出。因此，因其具有可以表达多种外源基因，同时时间短，重复性好的特点，目前被广泛应用于分析基因功能领域中，如基因表达、亚细胞定位、蛋白活性及蛋白与蛋白的相互作用等。为缩短白芷培养时间，提高白芷遗传转化效率，探索白芷瞬时表达体系势在必行。
原生质体是植物细胞中除去细胞壁后有生命活性的部分。其常被作为研究植物生理学、细胞生物学、分子生物学等方向的理想材料，主要用于细胞融合、亚细胞定位、基因表达调控和新品种选育等领域。近年来许多文献报道利用植物原生质体作为试验材料并获得大量有效数据，相比于现存的其他瞬时表达体系，其具有试验周期短(一般转化2～3d即可检测)，检测面广泛(细胞水平、亚细胞水平和分子水平)，体内实验结果准确等优势，为研究蛋白亚细胞定位和基因表达的调控提供了一种方便而有效的实验系统。因此，原生质体瞬时表达系统在各种研究中已有广泛应用，但尚未见在白芷中应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种白芷原生质体高效瞬时转化的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：白芷原生质体高效瞬时转化的方法，包括以下步骤：
S1、将待转化的外源基因DNA溶液和原生质体溶液进行混合；其中，外源DNA质粒的高纯度为吸光度值OD260/OD280＝1.6-2.0，高浓度为0.5-1.5μg/μl，外源基因DNA的用量为7.5-12.5μg，原生质体溶液的浓度范围为2×104-2×106个/mL；
S2、将PEG-Ca2+溶液加入步骤S1得到的混合液中，并混合均匀，将浓度为45-55％的PEG-Ca2+溶液加入步骤S1得到的混合液中，于20-26℃黑暗条件下转化25-35min；
S3、往孵育转化后的混合液中加入W5溶液以终止转化，离心后去除上清液，再加入W5溶液将管底的原生质体重悬，置于在24-32℃条件下黑暗孵育14-16h。
进一步的，步骤S1中，所述原生质体的分离方法包括以下步骤：
A、白芷的培养：选取含有3片以上基生叶的白芷进行黑暗培养，黑暗培养的时间为20-60天，优选为25-55天，更优选为25-35天；
B、原生质体材料的选择：选取步骤S1处理后白芷的黄化叶片作为原生质体材料；所述黄化叶片是从白芷基生叶中新抽出长大的黄化叶；黄化叶片提取原生质体效果最好，即细胞完整度和细胞活力最高。
C、原生质体的分离：将黄化叶片进行酶解；酶解的时间为5h±30min，所述酶解使用的酶解液含有1.3-1.7％的纤维素酶、0.6-0.8％的离析酶和0.35-0.45mol/L的甘露醇，每克黄化叶片使用10-80mL酶解液。
进一步的，步骤S1中，所述外源基因DNA为AdNAC20基因，所述AdNAC20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述AdNAC20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，步骤S1中，所述混合均匀的方法为：使用剪尖移液枪枪头轻轻吸打，避免产生气泡，直至混匀。
进一步的，步骤S3中，加入W5溶液以终止转化时，W5溶液与孵育转化后的混合液体积比范围为1:1.5-2.5；再加入W5溶液将管底的原生质体重悬时，W5溶液与孵育转化后的混合液体积比范围为1:3.5-4.5。
进一步的，W5溶液的配方为：154mmol/L NaCl+125mmol/L CaCl2+5mmol/L KCl+5mmol/L葡萄糖+2mmol/L MES。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种细胞数量极多、细胞完整破碎少、杂质少的白芷原生质体的制备方法，基于得到原生质体进一步建立了适合白芷原生质体高效瞬时转化的方法，可实现高效率(65％以上)的白芷原生质体瞬时转化。本发明的瞬时转化方法实验周期短、操作便捷、转化效率高，弥补了传统遗传转化方式中实验周期长、操作繁琐、转化效率低的缺点。
本发明实现了白芷原生质体瞬时转化开展目的基因功能验证，证明了缺失AdNAC20基因具有提高白芷香豆素含量的效果，将会极大的促进白芷内源基因功能的研究进展及白芷遗传性状定向改良的进展。
附图说明
图1为不同因素处理下原生质体转化；(a)不同因素处理下原生质体转化效率柱形图；(b)第2组处理转化效果；
图2为原生质体中瞬时表达；(a～c)原生质体转化过表达OE-NAC20质粒；(d～f)对照原生质体未转化任何质粒；(g～i)原生质体转化基因敲除OV-NAC20质粒；(j)原生质体转化后NAC20基因相对表达量；(k)原生质体转化后总香豆素含量。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1白芷黄化叶片的培养
本发明使用“川芷2号”白芷品种作为供试材料，其原植物为杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan。
生长条件为：长出4片基生叶后，黑暗条件下培养生长一个月。(注：直接采用种子放在黑暗中生长、将组培苗转至黑暗环境下培养等方式均不能成功实现白芷黄化苗的产生)
实施例2白芷原生质体的分离
称取0.1g黄化叶片，利用切丝法分别切成0.5-1.0mm的细丝，将切丝后的细丝放入5mL酶解液充分混合，利用循环水泵真空干燥器抽真空30min，之后立即转移至黑暗条件下，进行原生质体的分离(纤维素酶采用日本Yakult Cellulase R-10，离析酶采用日本YakultMacerozyme R-10)。酶解后，用70μm细胞筛过滤除去较大组织碎块，滤液转至圆底离心管，100g、4℃、升降速为5离心2min收集原生质体，除去上清液。加2mL W5(154mmol/L NaCl+125mmol/L CaCl2+5mmol/L KCl+5mmol/L葡萄糖+2mmol/L MES)溶液清洗原生质体3次，离心弃上清，加入1mL MMG(0.4mol/L甘露醇，15mmol/L MgCl2，4mmol/L MES，pH 5.7)溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。
其中，纤维素酶浓度为1.3-1.7％，离析酶浓度为0.6-0.8％，甘露醇浓度为0.35-0.45mol/Lmol/L，酶解时间为4.5-5.5h，得到的原生质体细胞数量极多(85×106个/mL以上)，细胞完整破碎少(90％以上完整，具有活力)，杂质少，其他条件均无法同时实现上述三种效果。
实施例3白芷原生质体高效瞬时转化体系探索
本发明采用PEG-Ca2+诱导原生质体转化方法，探究了孵育温度、转化时间、质粒含量及PEG浓度对白芷原生质体瞬时转化效率的影响，以获得较高的白芷原生质体瞬时转化效率。
具体操作方法如下：
1、所用植物表达载体为pCAMBIA3301-35S-eGFP-kana。
构建方法为：将AdNAC20基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301-35S-eGFP-kana质粒上，构建成为NAC20-3301质粒；将AdNAC20基因构建到Cpf1/gRNA-GFP载体上，构建成为NAC20-cpf1质粒。
所述AdNAC20基因的核苷酸序列如下所示：
ATGGAGGAAAGTGATATCAAGGTGCAACATGACAATAGTGAATATGAGGCAGGCCTG
CAAATTGAAGAAAGTATCGACAGAATTGAAACTTCTCAAGTGCGTGTTGACGACATGA
AATTATTGCCCGGCTATCGGTTTCATCCATTTGATTATGAACTAGTAGTTCATTACTTGT
GGAACAAGGTGAACAAACAGCCTCTCCCTCACAATAAGATCGTGGAACTTAAACAGCT
TTACAAGTATCATCCAGAGGAAATTACAAAAACAGACCAGGGATTGGTAGAGAATGA
GTGGTACTTTTTCACAGAGACGGAGAATGTGCAACTGGTGATGGTTACTGGAAAGCCA
CTGAAGATGAAGAAACGGTGTATTATAAAGGTGTTGCCGTTGGACATAGGAAGGAATT
TGTGTGTTATCGAGGAAAAGCTTTTCCGCCAAAAGGAGACGAGACGAACTGGATCTTG
CATGAATTTACAGTCACTGCATGTCCAAGTACCTGTAATTGTCAAGAGGACACAAGAC
TAG
所述AdNAC20蛋白的氨基酸序列如下所示：
MEESDIKVQHDNSEYEAGLQIEESIDRIETSQVRVDDMKLLPGYRFHPFDYELVVHYLWNK
VNKQPLPHNKIVELKQLYKYHPEEITKTDQGLVENEWYFFTETENVQLVMVTGKPLKMKK
RCIIKVLPLDIGRNLCVIEEKLFRQKETRRTGSCMNLQSLHVQVPVIVKRTQD
2、白芷原生质体瞬时转化体系构建
在2mL离心管中加入10μL纯化后浓度为1μg/μL的NAC20-3301质粒，随后加入100μL浓度为2×105个/mL原生质体，轻轻混匀，再加入PEG-Ca2+溶液110μL，使用剪尖蓝色枪头轻轻吸打，直至混匀，避免产生气泡，23℃黑暗放置20min。再加入480μL W5溶液，轻轻混匀，终止转化。常温升速3，降速3，100×g离心2min，去上清。最后加入1mL W5溶液将管底的原生质体重悬，置于28℃培养箱中黑暗培养16h后，用荧光显微镜观察。
3、白芷原生质体的瞬时转化条件探索
(1)为探究孵育温度、转化时间、质粒含量及PEG浓度对白芷原生质体瞬时转化效率的影响，采用四因素三水平正交试验设计，并对影响白芷叶肉原生质体转化的孵育温度、转化时间、质粒含量及PEG浓度进行统计和极差分析。设计方案如表1～2。
表1白芷原生质体瞬时转化的正交试验因素水平
表2白芷原生质体瞬时转化的四因素三水平正交试验设计
其中，原生质体转化效率统计方法为：取少量原生质体重悬液，在倒置荧光显微镜下观察，记录发出荧光的原生质体和原生质体总数，统计3个有代表性的视野数量取平均值。原生质体转化率以一个视野中荧光原生质体数占该视野中原生质体总数百分数来表示。
原生质体转化率(％)＝(发荧光原生质体数/同视野下原生质体总数)×100
(2)不同转化条件对白芷叶肉原生质体转化效率的影响
不同转化条件对白芷叶肉原生质体转化效率的影响结果表明(见图1)，孵育温度因素下三水平得到的转化效率平均值范围在42.09％～55.28％，其中孵育温度为28℃时原生质体转化效率平均值最高为55.28％。转化时间因素下三水平得到的转化效率平均值范围在40.96％～56.75％，其中转化时间为25min时原生质体转化效率平均值最高，为56.75％。质粒含量因素下三水平得到的转化效率平均值范围在40.18％～57.43％，其中质粒含量为10μg时原生质体转化效率平均值最高，为57.43％。PEG浓度因素下三水平得到的转化效率平均值范围在27.46％～63.59％，其中PEG浓度为50％时原生质体转化效率平均值最高，为63.59％。
利用四因素三水平正交试验对影响白芷叶肉原生质体转化的孵育温度、转化时间、质粒含量及PEG浓度进行极差分析(表3)。结果表明，四个因素中按重要性排序分别为PEG浓度＞质粒含量＞转化时间＞孵育温度。其中PEG浓度的R值最大，说明设定的四个因素中PEG浓度对白芷叶肉原生质体转化的影响最大，为27.46；其次是质粒含量和转化时间，分别为17.25和15.78；孵育温度的R值最小，为13.19。说明PEG浓度是影响原生质体转化的最关键因素，孵育温度对白芷原生质体转化的影响不大。
综上，筛选出理想的原生质体转化最优条件为：转化温度28℃，质粒浓度10μg，转化时间25min，PEG浓度50％。
表3不同试验条件下获得的白芷叶肉细胞原生质体转化率极差分析
注:K1，K2和K3分别表示不同因素各水平下的转化效率；k1，k2和k3分别表示不同因素各水平下的原生质体转化效率平均值；R表示极差。
实施例4白芷原生质体瞬时转化体系的应用
按照前述记载的原生质体转化方法，将重组质粒pCAMBIA3301-AdNAC20、重组质粒Cpf1-AdNAC20和CRISPR敲除质粒转化至原生质体进行瞬时表达验证，分别对转化后基因表达量、香豆素含量进行测定，重复三次取平均值进行分析。
荧光定量检测以组成型18S为内参基因进行AdNAC20荧光定量鉴定，正向引物：AAGAGACGGAGAATGTGCAACT；反向引物：CAAGATCCAGTTCGTCTCGTCT。使用TaKaRa公司产品TBGreen Premix Ex TaqTM进行反应。不同组织样品设置三个生物学重复，每个样品实验设置三个技术，重复同时设置三个重复的内参基因对照。
根据《酒炖白芷中总香豆素及4种香豆素类成分的含量测定》方法，采用分光光度法对总香豆素含量进行测定，总香豆素含量计算公式为：
总香豆素(μg/mL)＝(校正后OD300-0.0215)/0.0214
总香豆素含量(％)＝总香豆素量*50/10000
结果表明，通过PEG-Ca2+介导法将质粒转化进白芷原生质体后，过表达重组质粒和基因敲除重组质粒均可正常表达(如图2a～i)，以未转化任何质粒的原生质体为对照即基因表达量为1，转化过表达质粒OE-NAC20的原生质体基因表达量为对照的1.56倍，转化基因敲除质粒OV-NAC20的原生质体基因表达量为对照的0.88倍(图2j)。未转质粒的对照原生质体平均总香豆素含量为23.84μg/mL，转化过表达质粒OE-NAC20的原生质体平均总香豆素含量为22.66μg/mL，转化基因敲除质粒OV-NAC20的原生质体平均总香豆素含量为24.95μg/mL(图2k)。与未转化任何质粒的原生质体相比，转化过表达质粒的原生质体总香豆素含量显著降低了4.95％，转化基因敲除质粒的原生质体总香豆素含量显著升高了4.66％。
上述结果说明，质粒载体能够在构建的原生质体瞬时转化体系中正常表达，且转化NAC20质粒会对香豆素含量产生显著影响，敲除白芷NAC20基因具有提高白芷香豆素含量的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.白芷原生质体高效瞬时转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将待转化的外源基因DNA溶液和原生质体溶液进行混合；其中，外源DNA质粒的高纯度为吸光度值OD260/OD280＝1.6-2.0，高浓度为0.5-1.5μg/μl，外源基因DNA的用量为7.5-12.5μg，原生质体溶液的浓度范围为2×104-2×106个/mL，外源基因DNA的质量和原生质体的个数比范围为1μg:2×104个-2×106个；
S2、将PEG-Ca2+溶液加入步骤S1得到的混合液中，并混合均匀，于20-26℃黑暗条件下转化25-35min；其中，PEG-Ca2+溶液的浓度为45-55％；
S3、往孵育转化后的混合液中加入W5溶液以终止转化，离心后去除上清液，再加入W5溶液将管底的原生质体重悬，置于24-32℃培养箱中黑暗孵育14-16h。
2.根据权利要求1所述的白芷原生质体高效瞬时转化的方法，其特征在于，步骤S1中，所述外源基因DNA为AdNAC20基因，所述AdNAC20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的白芷原生质体高效瞬时转化的方法，其特征在于，所述AdNAC20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的白芷原生质体高效瞬时转化的方法，其特征在于，步骤S1中，所述混合均匀的方法为：使用剪尖移液枪枪头轻轻吸打，避免产生气泡，直至混匀。
5.根据权利要求1所述的白芷原生质体高效瞬时转化的方法，其特征在于，步骤S3中，加入W5溶液以终止转化时，W5溶液与孵育转化后的混合液体积比范围为1:1.5-2.5；再加入W5溶液将管底的原生质体重悬时，W5溶液与孵育转化后的混合液体积比范围为1:3.5-4.5。
6.根据权利要求1所述的白芷原生质体高效瞬时转化的方法，其特征在于，W5溶液的配方为：154mmol/LNaCl+125mmol/LCaCl2+5mmol/LKCl+5mmol/L葡萄糖+2mmol/LMES。
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