CN1690210A - 棉花黄萎病和枯萎病的抗性表达载体 - Google Patents
棉花黄萎病和枯萎病的抗性表达载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1690210A CN1690210A CN 200410037688 CN200410037688A CN1690210A CN 1690210 A CN1690210 A CN 1690210A CN 200410037688 CN200410037688 CN 200410037688 CN 200410037688 A CN200410037688 A CN 200410037688A CN 1690210 A CN1690210 A CN 1690210A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cotton
- gene
- gafp
- expression vector
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 title claims abstract description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 title claims description 19
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 101710083587 Antifungal protein Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 241000305492 Gastrodia Species 0.000 claims 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 claims 1
- PUQSUZTXKPLAPR-UJPOAAIJSA-N Gastrodin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(CO)C=C1 PUQSUZTXKPLAPR-UJPOAAIJSA-N 0.000 abstract 3
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 abstract 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 abstract 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 abstract 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 abstract 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 abstract 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 abstract 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000879806 Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum Species 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940023569 palmate Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种棉花抗黄萎病与枯萎病的表达载体,该表达载体含有天麻凝集素,即天麻抗真菌蛋白(GAFP)的基因、启动子、终止子和筛选标记基因表达框,能在棉花中产生天麻抗真菌蛋白,导入该基因的转基因棉花具有抗黄萎病与枯萎病的特性。
Description
技术领域 本发明涉及生物技术领域中生物体转化技术。即将GAFP基因的表达载体通过花粉管通道法或者农杆菌介导法导入白棉或彩色棉花,通过目的基因GAFP的表达,赋予转基因棉花抗枯萎病和黄萎病的特性。
背景技术 枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)和黄萎病菌(Vecticilliumdahliae kleb)引起的棉花枯萎病和黄萎病是棉花生产中最主要的两种真菌病害,广泛分布在世界各主要产棉国,并有逐年加重的趋势。尤其是黄萎病,侵染后造成蕾铃大量脱落,导致减产达20%-60%,且纤维的品质下降。据不完全统计,我国棉花黄萎病的发病率在300万公顷以上,并且呈逐年加重的势头。目前,选育和种植抗病新品种仍是防治棉花枯萎病和黄萎病的主要措施,但由于棉花中本来就缺乏抗黄萎病的突变材料,通过常规育种的方法很难选育出高抗黄萎病的品种,迄今尚无有效的防治措施,因此,高抗品种的培育是迫在眉睫的任务。
随着分子生物学、植物病理学和基因工程技术的迅猛发展,运用基因工程手段提高植物的抗病性,为抗病育种开辟了一条全新的途径。天麻抗真菌蛋白GAFP是我国独立分离和鉴定的抗真菌蛋白,是由胡忠最早在1988年从传统中药天麻中提取到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白,也是天麻中的重要功能蛋白质。它对许多植物致病菌包括棉花枯萎病菌和黄萎病菌离体具有很强的抑制作用,在植物抗真菌基因工程上具有巨大的应用潜力。我们已经将它的基因转入新疆彩色棉品种中,获得了高抗黄萎病转基因彩色棉花植株,经过选育和扩繁,转基因彩色棉具有稳定的、较强的抗真菌病能力,证明了基因工程的方法是获得抗病品系的一条有效的途径。
附图说明 GAFP棉花组成型高效表达载体与GAFP棉花真菌诱导型高效表达载体的载体结构图。
发明内容 本发明的目的是:将构建的GAFP基因的表达载体转入不同的棉花优良品种,通过对转化后代的筛选,获得的转基因棉花具有了抗棉花枯萎病和黄萎病的特性,经过进一步的选育,可以育成抗真菌病的转基因棉花品系。
本发明主要包括以下七方面的技术:
一、GAFP棉花组成型高效表达载体的构建技术;
二、GAFP棉花真菌诱导型高效表达载体的构建技术;
三、GAFP表达载体花粉管通道法转化棉花的技术;
四、GAFP表达载体农杆菌介导法转化棉花的技术;
五、转化棉花后代的筛选技术(一)幼苗期卡那霉素或除草剂筛选;
六、转化棉花后代的筛选技术(二)病圃筛选;
七、转化棉花后代的筛选技术(三)分子检测;
具体实施方式
实施例1
GAFP棉花组成型高效表达载体的构建技术
棉花表达载体pBI35Sgafp-bar的构建过程为:用XbaI和SacI分别酶切pBI221和pUC-gafp,将切下的.gafp片段连接到切去1.9Kb GUS片段的pBI221载体上,得到中间载体pBI35Sgafp,然后从HindIII酶切位点处连上用同样酶切从pBI221-bar上切下的bar盒而成。含有35S启动子、nos终止子、gafp基因、氨苄青霉素抗性基因Ampr和除草剂抗性基因bar.
另外一个载体pBin35Sgafp来自pBI35Sgafp。用HindIII和SacI酶切pBI35Sgafp切下35S-gafp片段,用同样酶切pBI121,切去GUS片段连入35S-gafp片段而得到载体pBin35Sgafp,此载体与pBI35Sgafp-bar的差异在于两个抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr和NPTII筛选标记基因,而不是Ampr和bar。表达载体详细结构见说明书附图图1.。
实施例2
GAFP棉花真菌诱导型高效表达载体的构建技术
GAFP基因的真菌诱导型启动子Fi由本实验室克隆。
棉花表达载体pBIFigafp-bar的构建过程为:用XbaI和SacI分别酶切pBIFi-GUS和pUC-gafp,将切下的gafp片段连接到切去1.9Kb GUS片段的pBIFi载体上,得到中间载体pBIFigafp,然后从HindIII酶切位点处连上用同样酶切从pBI221-bar上切下的bar盒而成。含有Fi启动子、nos终止子、gafp基因、氨苄青霉素抗性基因Ampr和除草剂抗性基因bar.
另外一个载体pBinFigafp来自pBIFigafp。用HindIII和SacI酶切pBIFigafp切下Fi-gafp片段,用同样酶切pBI121,切去GUS片段连入Fi-gafp片段而得到载体pBinFigafp,此载体与pBIFigafp-bar的差异在于两个抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr和NPTII筛选标记基因,而不是Ampr和bar。表达载体详细结构见说明书附图图2.。
实施例3
GAFP表达载体花粉管通道法转化棉花的技术
在开花的次日,按照每朵花0.1~0.2μg(10μl)质粒的量,采用微注射法(用微量加样器直接将质粒注射入棉花的子房)和柱头滴加法(将质粒滴加到柱头上,让其自然吸收)。收获时,将转化植株的棉铃单独采收,单独轧花,得到种子以备后续的检测。
实施例4
GAFP表达载体农杆菌介导法转化棉花的技术
农杆菌感受态的制备
●接种农杆菌LBA 4404单菌落于50ml YEB培养基(含有30μg/ml链霉素)中,28℃振荡培养,转速为200~250rpm,至OD600为0.3~0.5左右,冰浴30分钟,5000rpm离心10分钟,收集菌体并用10ml 0.15M NaCl悬浮。
●4℃离心(同上),菌体悬浮于1ml 20mM CaCl2溶液中。
●取50μl菌液分装到1.5ml离心管中,液氮迅速冷冻,并保存于-70℃冰柜中。农杆菌的冻融转化法
●取0.5~1μg DNA加入到50μl的感受态菌液中,轻轻混合,冰浴30分钟,并在液氮中迅速冷冻1分钟。
●在37℃水浴融化后,加入1ml YEB培养液,28℃轻轻摇动2~4小时。
●5000rpm离心,倒去大部分上清液,剩200μl培养液悬浮。
●涂布在含有30μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB固体培养基上,28℃培养。长出的菌落用碱法提取质粒,进行酶切鉴定。
农杆菌介导的转化法
●挑取GAFP表达载体的农杆菌单菌落,接种于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中,28℃、280rpm过夜培养至OD600为0.7~0.8。5000rpm离心,用MS液体培养基重新悬浮,与棉花愈伤组织共侵染10分钟。
●将愈伤组织用无菌吸水纸吸干,放置于MS培养基上,暗培养2~3天后,用无菌水将外植体洗净,转到含有100μg/ml头孢霉素,75μg/ml卡那霉素的分化培养基中,在12小时光照,12小时黑暗的条件下,继续培养至分化出小芽。
●待芽长到1~2cm后,用无菌剪刀和镊子将分化的芽剪下,插到生根培养基中,继续培养4周左右,移栽到土壤中。
实施例5
转化棉花后代的筛选技术(一)幼苗期卡那霉素或除草剂筛选
在转化单株幼苗长出3~4片真叶时,对其进行了卡那霉素或除草剂Bastar叶片涂抹初筛实验。除草剂Bastar和卡那霉素的浓度分别为0.1%(W/V)和1.0%(W/V)。涂抹5天后进行观察,淘汰显症(叶片涂抹点变黄)单株后进行第二轮筛选,如此连续涂抹三次,选出三次不显症单株,进入下一步筛选。
实施例6
转化棉花后代的筛选技术(二)病圃筛选
分别于蕾期(6月中下旬)、花期(7月中旬)和铃期(8月中下旬)逐株进行三次病情调查,观察转化后代的抗病情况。采用成株期鉴定法,单株划分黄萎病的病情级别,发病程度采用5级(0、1、2、3、4)分级法调查,用发病程度值的大小作为衡量抗病程度的一个指标,筛选出抗病的单株。
0级:健株;1级:病株叶片有25%以下表现病状,叶片主脉间产生淡黄色或黄色不规则病斑;2级:病株叶片有25%~50%表现病状,病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色,叶片边缘略有卷枯;3级:病株叶片有50%~75%表现病状,病斑颜色大部分成黄褐色,叶片边缘卷枯,有少数叶片凋落;4级:全株叶片发病,多为褐色掌状枯斑,以致植株死亡。
感病对照按照下列公式计算病情指数:病情指数=【(∑各级病级×相应病级发病株数)/调查总株数×4】×100
经过病圃筛选,转基因棉花对黄萎病与枯萎病的抗性显著提高,有16个株系高抗黄萎病,5个兼抗枯萎病。
实施例7
转化棉花后代的筛选技术(三)分子检测
转化棉花后代的分子检测技术有PCR、Southern、和RT-PCR等。
采取入选棉花单株的新鲜幼嫩叶片,用CTAB法提取总DNA。
PCR检测 对转化棉花后代总DNA做模板,阳性对照为质粒pBI35Sgafp,阴性对照为非转基因的棉花总DNA,以gafp基因的上下游引物5’>ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT<3’;和5’>GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC CGC TGT<来扩增,反应的总体积为20μl,程序为:94℃ 3min,94℃ 40s,55℃ 30s,72℃ 40s,30个循环后,72℃延伸10min。反应结束后,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。如果能扩增出了特异的387bp gafp基因的条带,则该样品为候选的转基因植株。
Southern杂交 取不同样品的总DNA约10μg,用HindIII+SacI 37℃双酶切过夜,阴性对照为非转基因的棉花总DNA,阳性对照为未酶切和经同样酶切的质粒pBI35Sgafp。琼脂糖凝胶电泳检测后,将核酸电转移到尼龙膜上(BioRad公司Mini-3cells),操作方法按照BioRad公司使用说明。同样用α-32P-dCTP标记gafp基因为探针进行点杂交,标记方法、杂交系统和洗膜及压片的方法参考文献(Sambrook,1989)。杂交阳性的样品则为正确的转基因植株,表明gafp基因整合进了棉花基因组中。
RT-PCR检测 为了检测Southern阳性植株中gafp基因是否得到了表达,进一步进行RT-PCR检测。用CTAB法提取待测样品的总RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后,使用AccessRT-PCR试剂盒(Promega公司)进行一步法RT-PCR,操作的详细步骤参见试剂盒说明书。使用的gafp上、下游引物的序列为:上游引物:5’>ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT<3’;下游引物:5’>GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC C6C TGT<3’。转基因植株扩增出了特异的387bp gafp基因的条带,则该转基因样品中,gafp基因得到了正确的表达。
GAFP基因序列表(核苷酸序列和推导的成熟肽氨基酸序列)
Claims (5)
1.一种棉花抗黄萎病与枯萎病的表达载体,该表达载体含有天麻凝集素,即天麻抗真菌蛋白(GAFP)的基因、启动子、终止子和筛选标记基因表达框,能在棉花中产生天麻抗真菌蛋白,导入该基因的转基因棉花具有抗黄萎病与枯萎病的特性。
2.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于以GAFP为目的基因,该基因的表达赋予转基因棉花抗棉花黄萎病和枯萎病的特性。
3.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于用组成型、组织特异表达或真菌诱导型启动子启动GAFP的表达。
4.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于用NPTII和Bar基因作为筛选标记基因,转化株及其后代可分别用卡那霉素和除草剂Bastar来筛选。
5.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于通过花粉管通道法或者农杆菌介导法转入彩色棉或者白棉品种,并获得天麻抗真菌蛋白基因表达的转基因棉花。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410037688 CN1690210A (zh) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | 棉花黄萎病和枯萎病的抗性表达载体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410037688 CN1690210A (zh) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | 棉花黄萎病和枯萎病的抗性表达载体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1690210A true CN1690210A (zh) | 2005-11-02 |
Family
ID=35345967
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200410037688 Pending CN1690210A (zh) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | 棉花黄萎病和枯萎病的抗性表达载体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1690210A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101870977A (zh) * | 2010-04-12 | 2010-10-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体 |
CN101928338A (zh) * | 2010-09-03 | 2010-12-29 | 河北农业大学 | 棉花GbVe基因、其编码蛋白及在植物抗黄萎病中的应用 |
CN102965392A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-03-13 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 抗纹枯病转基因水稻的培育及专用载体 |
CN105238789A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-01-13 | 河北农业大学 | 海岛棉GbHyPRP1基因启动子及其应用 |
-
2004
- 2004-04-29 CN CN 200410037688 patent/CN1690210A/zh active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101870977A (zh) * | 2010-04-12 | 2010-10-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体 |
CN101870977B (zh) * | 2010-04-12 | 2012-04-18 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体 |
CN101928338A (zh) * | 2010-09-03 | 2010-12-29 | 河北农业大学 | 棉花GbVe基因、其编码蛋白及在植物抗黄萎病中的应用 |
CN101928338B (zh) * | 2010-09-03 | 2012-12-26 | 河北农业大学 | 棉花GbVe基因、其编码蛋白及在植物抗黄萎病中的应用 |
CN102965392A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-03-13 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 抗纹枯病转基因水稻的培育及专用载体 |
CN105238789A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-01-13 | 河北农业大学 | 海岛棉GbHyPRP1基因启动子及其应用 |
CN105238789B (zh) * | 2015-11-16 | 2017-12-29 | 河北农业大学 | 海岛棉GbHyPRP1基因启动子及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113249229B (zh) | 一种假瓶霉属内生真菌p-b313及其应用 | |
CN110894470B (zh) | 一种适合工厂化栽培的香菇菌种农香5号及其分子鉴定方法 | |
CN113528518B (zh) | 抑制核盘菌的miRNA及其应用 | |
CN1833488A (zh) | 一种柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法 | |
CN101186926B (zh) | 一种改进的农杆菌介导浸花法转化禾本科作物的方法 | |
CN113151553B (zh) | 与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记及应用 | |
CN106480163A (zh) | 一种联合苹果愈伤组织细胞培养和遗传转化鉴定苹果抗病基因的方法 | |
CN109879947A (zh) | 毛竹转录因子PheDof 2基因及应用 | |
CN110468229B (zh) | 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1 | |
CN107858372A (zh) | 一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法 | |
CN110205333B (zh) | 玉米矮化病诱导基因P3a及其遗传转化体系的构建方法和应用 | |
CN101870977B (zh) | 培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体 | |
CN110004155B (zh) | 控制植物趋避性抗蚜性状的抗病基因、蛋白质及其应用 | |
CN115261237B (zh) | 一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌株及其应用 | |
CN1690210A (zh) | 棉花黄萎病和枯萎病的抗性表达载体 | |
CN104372019B (zh) | 转CmWRKY48基因切花菊的培育、鉴定方法及应用 | |
CN114250233B (zh) | 拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用 | |
CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
CN115491380A (zh) | 植物脂氧合酶基因lox及其在植物广谱抗病性中的应用 | |
CN1957676A (zh) | 一种抗蔓枯病西瓜品种的选育方法 | |
CN110358862B (zh) | 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁的分子标记Hxjy-14 | |
CN106701783A (zh) | 水稻基因OsDF1及抗病调控功能的应用 | |
CN1126446C (zh) | 一种转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法 | |
CN110862930A (zh) | 一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法 | |
CN111748645B (zh) | 一种用于检测赤霉病抗性QTL QFhb.hbaas-5DL的分子标记及其使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Sun Yongru Document name: Correction notice |
|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |