CN101870977A - 培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体。本发明的培育抗黄萎病转基因植物的方法，是将SPGAFP1蛋白的编码基因导入目的植物得到黄萎病抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述SPGAFP1蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列2。所述SPGAFP1蛋白的编码基因的序列可为序列表中序列1。所述目的植物和所述转基因植物均可为双子叶植物，所述双子叶植物可为棉花，尤其优选为陆地棉″中棉所24″。实验证明：将含有SPGAFP1的表达载体导入棉花获得的转SPGAFP1棉花，可以高效地抵抗引发黄萎病的真菌，说明信号肽的存在明显增强了转基因植物的抗病性。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域中一种培育高抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体。
背景技术
病害一直是农业生产上不可忽视的重要问题。据估计，目前病害造成的损失一般为农作物产量的10％以上，一些病害，如水稻白叶枯病、小麦赤霉病和棉花黄萎病，是我国稻、麦和棉区的主要病害，发病后一般使作物减产10-30％，严重时减产50％甚至更多，同时还可导致农产品质量下降，给生产造成重大的损失。同时，目前农业生产上成片的单一种植，直接降低了植物在遗传上的多样性，增加了时空上的连续性，为病原物的侵染和传播提供了方便。长期以来，人们已经对植物抗病的机理及其在生产上的应用等方面做了大量的工作，积累了相当多的资料，但由于对植物抗病机制仍缺乏深入的认识，抗病育种一直是农业生产上的重大难题之一。
随着分子生物学、植物病理学和基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性，为抗病育种开辟了一条全新的途径。
天麻抗真菌蛋白(Gastrodia Antifungal Protein，以下简称GAFP)是从红天麻中独立分离和鉴定的抗真菌蛋白(胡忠，杨增明，王钧，1988，天麻球茎中一种抗真菌蛋白的分离和部分特性，云南植物研究，10：373-380；胡忠，黄清藻，刘小烛，1999，天麻抗真菌蛋白GAFP-I的一级结构和cDNA克隆，云南植物研究，21(2)：131-138；王义琴、李文彬、Lam Honming，张秀海，陈潜，郭顺星，孙勇如，2000，天麻抗真菌蛋白(GAFP)的N端序列测定及cDNA基因克隆，高技术通讯，10(1)：10-14)，它对许多植物致病菌包括小麦赤霉病菌、水稻纹枯病和黄萎病菌离体具有很强的抑制作用，在植物抗真菌基因工程中具有巨大的应用潜力(Sa Q-L(萨其拉)，Wang Y(王义琴)，Li W(李文彬)，Zhang L(张利明)，Sun Y(孙勇如)，Isolation of a genomic DNA for GastrodiaAntfungal Protein and analyses of its promoter in transgenic tobacco，Acta Bot Sin2003a，45(2)：229-233；Sa Q-L(萨其拉)，Wang Y(王义琴)，Li W(李文彬)，Zhang L(张利明)，Sun Y(孙勇如)，The promoter of an antifungal protein gene from Gastrodiaelata confers tissue-specific and fungus-inducible expression patterns and responds to bothsalicylic acid and jasmonic acid，Plant Cell Rep 2003b；22：79-84)。
因此，获得含有天麻抗真菌蛋白GAFP的转基因植物对植物抗真菌病基因工程育种具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育高抗黄萎病转基因植物的方法及其专用表达载体。
本发明提供的培育转基因植物的方法，是将含有信号肽(Signal Peptide，简称SP)的GAFP1蛋白(SPGAFP1)的编码基因SPGAFP1导入目的植物得到黄萎病抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述SPGAFP1蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列2。
所述SPGAFP1蛋白的编码基因的序列可为序列表中序列1。
序列表中的序列1由540个核苷酸构成，自5‘末端第1-84位为编码信号肽的基因，自5‘末端第85-537位为编码成熟肽的基因。
序列表中的序列2由179个氨基酸构成，自氨基末端第1-28位为信号肽，自氨基末端第29-178位为成熟肽。上述SPGAFP1蛋白为天麻抗真菌蛋白信号肽SP及成熟肽GAFP1。所述目的植物和所述转基因植物均可为双子叶植物，所述双子叶植物可为棉花，尤其优选为陆地棉“中棉所24”。
所述黄萎病可由下述致病菌引起：大丽花轮枝孢(Verticilliu dahliae Kleb.)。
所述SPGAFP1蛋白的编码基因通过下述表达载体导入所述目的植物中：该表达载体含有筛选标记基因、启动子和连接在所述启动子下游的SPGAFP1蛋白的编码基因。
所述启动子可为组成型、维管组织特异表达或真菌诱导型启动子，所述组成型启动子优选为35S启动子。
所述筛选标记基因可为NPTII，即为卡那霉素抗性基因NPTII；也可为除草剂Bastar抗性基因Bar。优选卡那霉素抗性基因NPTII。
所述载体为pCambia2300-35S-SPGAFP1，所述pCambia2300-35S-SPGAFP1为在pCambia2300的HindIII和SacI位点间插入35S-SPGAFP1得到的载体；所述35S-SPGAFP1是用HindIII和SacI酶切pBI35S-SPGAFP1得到的小片段，所述pBI35S-SPGAFP1是在pBI221的35S启动子下游的XbaI和SacI识别位点间插入SPGAFP1基因替换掉GUS基因得到重组载体。
所述表达载体可采用花粉管通道法、基因枪或农杆菌介导法导入目的植物。
上述表达载体、含有上述表达载体的重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
实验证明：将含有SPGAFP1的表达载体导入棉花获得的转SPGAFP1棉花，可以高效地抵抗黄萎病菌的侵染，与转成熟肽基因GAFP1棉花相比，转SPGAFP1棉花具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力，其病指数显著降低，说明转SPGAFP1棉花表达的天麻抗真菌蛋白能够在信号肽的引导下将成熟肽GAFP1准确定位于胞外，从而有效增强了转基因植物对真菌病源物侵染的抗性，进一步说明信号肽的存在明显增强了转基因植物的抗病性。
附图说明
图1为转SPGAFP1陆地棉株系的PCR鉴定结果。
图2为转SPGAFP1陆地棉株系的Southern杂交鉴定结果。
图3为转SPGAFP1陆地棉株系的RT-PCR电泳图。
图4为转SPGAFP1棉花在病圃中的抗病效果。
图5为转SPGAFP1陆地棉株系的剖杆实验结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1表达载体的构建
一、含有SPGAFP1的高效表达载体的构建
人工合成SPGAFP1基因，SPGAFP1的核苷酸序列为序列表中的序列1。将SPGAFP1连接到pUCm-T(购自上海生工生物工程有限公司)上，构建载体pUCm-SPGAFP1。
用XbaI和SacI分别酶切pUCm-SPGAFP1和pBI221(购自Clontech Laboratories，Inc.)，将酶切后的SPGAFP1片段连接到用同样的酶切去1.9Kb GUS片段的pBI221载体上，得到中间载体pBI35S-SPGAFP1。
用HindIII和SacI酶切中间载体pBI35S-SPGAFP1得到35S-SPGAFP1片段，再用同样的酶酶切pCambia2300(购自Cambia Laboratories公司)，将二者连接得到表达载体pCambia2300-35S-SPGAFP1。该表达载体的细菌和植物抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr+和NPTII筛选标记基因。
实施例2将含有SPGAFP1的高效表达载体导入棉花获得转SPGAFP1棉花
用农杆菌介导法获得转SPGAFP1棉花
1)将实施例1中获得的表达载体pCambia2300-35S-SPGAFP1转化到根癌农杆菌LBA4404(购自Invitrogen公司)中，构建含有SPGAFP1表达载体的根癌农杆菌LBA4404/pCambia2300-35S-SPGAFP1。
挑取LBA4404/pCambia2300-35S-SPGAFP1的农杆菌单菌落，接种于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28℃、280rpm过夜培养至OD600为0.7～0.8。然后5000rpm离心，弃上清，沉淀用MS液体培养基重新悬浮。最后将陆地棉“中棉所24”(于娅、刘传亮、马峙英、李付广、李凤莲、王玉芬、武芝霞、张朝军，陆地棉中棉所24胚性愈伤组织的诱导及植株再生，西北植物学报，2004，24(2)：306-310，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)的棉花愈伤组织在悬浮液中浸泡10分钟。
2)将愈伤组织用无菌吸水纸吸干，放置于MS培养基上，暗培养2～3天后，用无菌水将外植体洗净，转到含有100μg/ml头孢霉素，75μg/ml卡那霉素的分化培养基中，在12小时光照，12小时黑暗的条件下，继续培养至分化出小芽。
3)待芽长到1～2cm后，用无菌剪刀和镊子将分化的芽剪下，插到生根培养基中，继续培养4周左右，移栽到土壤中，得到210株棉花转化苗。
所述分化培养基的配方为：每1000mL水中含有下述物质KNO32g，NH4NO31g，MgSO41g，KH2PO45g，CaCl2·H2O1g，FeSO4·7H2O0.3g，MnSO4·4H2O0.055g，KI0.01g，CuSO40.00005g、CoCl20.00005g、HBO30.008g，吲哚乙酸IAA 0.003mg，激动素KT 0.05mg，葡萄糖25g，琼脂15g，pH6.5。
所述生根培养基的配方为：每1000mL水中含有下述物质KNO32g，NH4NO31g，MgSO41g，KH2PO45g，CaCl2·H2O1g，FeSO4·7H2O0.3g，MnSO4·4H2O 0.055g，KI0.01g，CuSO40.00005g、CoCl20.00005g、HBO30.008g，萘乙酸NAA 5mg，激动素KT 1mg，谷氨酰胺0.6g，葡萄糖25g，琼脂15g，pH值为6.5。
采用上述方法，克隆GAFP1基因并构建得到重组载体pCambia2300-35S-GAFP1，将该重组载体导入陆地棉″中棉所24″中获得含有该基因的T0代转GAFP1棉花。
实施例3转pCambia2300-35S-SPGAFP1棉花后代的筛选及黄萎病抗性检测
一、利用卡那霉素初步筛选转SPGAFP1棉花后代
在由实施例2中获得的棉花转化苗长出3～4片真叶时，利用卡那霉素涂抹叶片进行转SPGAFP1棉花的初筛实验，具体步骤如下：将浓度为1.0％的卡那霉素，涂抹在幼苗叶片表面，5天后进行观察，结果显示，部分转SPGAFP1棉花单株叶片的涂抹点变黄，这些叶片变黄的单株为显症单株。淘汰这些显症单株，将余下的单株再继续第二轮筛选、淘汰，如此连续涂抹三次，选出三次不显症36株T0代转SPGAFP1棉花单株。
二、利用分子检测技术筛选转SPGAFP1棉花后代
1、提取总DNA
采摘上述初筛选出的不显症T0代转SPGAFP1棉花单株的新鲜幼嫩叶片，用CTAB法提取总DNA。
2、分子检测
1)PCR检测
以步骤1获得的各单株叶片的总DNA为模板，以实施例1中获得的质粒pCambia2300-35S-SPGAFP1为阳性对照，以非转基因的棉花总DNA为阴性对照，以SGAFP1-F引物：5’-CAG CCA TGG CAG CAT CCG CAA GCA C-3’和GAFP1-R引物：5’-GCG TCG ACC TAT TCT CTT AGA CCG T-3’作为上下游引物进行PCR扩增。PCR反应的总体积为20μl，程序为：先94℃ 3min；然后94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 40s，30个循环后；72℃延伸10min。反应结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果如图1所示：泳道1为Marker，泳道12为阳性对照，泳道13为阴性对照，泳道2-11为不同的T0代转SPGAFP1棉花株系。从图1可以看出，与阳性对照相比，泳道2-7和9-11在537bp处均有特异条带，且条带的大小与阳性对照扩增的片段大小一致，说明这些泳道为T0代转SPGAFP1棉花。
2)Southern杂交
取步骤1获得的各单株叶片的总DNA约10μg，用HindIII+SacI在37℃双酶切过夜，阴性对照为非转基因的棉花总DNA；阳性对照为是经HindIII+SacI双酶切的质粒pCambia2300-35S-SPGAFP1琼脂糖凝胶电泳检测后，将核酸电转移到尼龙膜上(BioRad公司Mini-3cells)，操作方法按照BioRad公司使用说明。同样用α-32P-dCTP标记SPGAFP1基因为探针进行点杂交。经电泳检测，结果如图2所示，1为阴性对照，2-6为T0代转SPGAFP1棉花的不同株系，7为经HindIII+SacI双酶切的质粒pCambia2300-35S-SPGAFP1，从图2中看出，T0代转SPGAFP1棉花株的SPGAFP1基因整合进了棉花基因组中。
3)RT-PCR检测
为了检测Southem阳性植株中SPGAFP1基因是否得到了表达，进一步进行RT-PCR检测。用CTAB法提取上述Southern杂交检测的阳性植株的总RNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，使用Access RT-PCR试剂盒(购自Promega公司)进行一步法RT-PCR，操作的详细步骤参见试剂盒说明书。阳性对照分别为实施例2获得的pCambia2300-35S-GAFP1和pCambia2300-35S-SPGAFP1，RT-PCR中除阳性对照pCambia2300-35S-GAFP1的引物为GAFP1-F：5’-TTC CAT GGT TAG CGA TCG GTTGAA TTC G-3’和GAFP1-R：5’-GCG TCG ACC TAT TCT CTT AGA CCG T-3’外，其余均采用上游引物SPGAFP1-F为：5’-CAG CCA TGG CAG CAT CCG CAA GCA C-3’；下游引物GAFP1-R为：5’-GCG TCG ACC TAT TCT CTTAGA CCG T-3’。经电泳，结果如图3所示，M为Marker，NC为阴性对照，PC1为阳性对照pCambia2300-35S-GAFP1，PC2为阳性对照pCambia2300-35S-SPGAFP1，1-7为不同的T0代转SPGAFP1棉花株系。从图3中可以看出，与阳性对照PC2相比，泳道1-7在537bp处均有特异条带，且条带的大小与阳性对照扩增的片段大小一致，说明这些泳道为T0代转SPGAFP1棉花。表明该转基因样品中，SPGAFP1基因得到了正确的表达。
三、病圃筛选和剖杆实验进行转SPGAFP1棉花后代的黄萎病抗性检测
1、病圃筛选进行转SPGAFP1棉花后代的黄萎病抗性检测
1)培养棉花黄萎病的病原菌大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)(购自中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号3.3758)
棉花黄萎病菌大丽轮枝菌培养物采用棉籽或麦粒砂，先将棉籽或麦粒用水煮涨为止，沥干水分后，装入广口瓶，高压湿热灭菌2h；在超净台上将已培养好的黄萎病菌平板或斜面接入其中，随后置于25℃恒温箱培养(10～15)d。
2)病圃的建立
按每公顷(450～750)Kg的接种量，将培养好的棉花黄萎病的病原菌菌种均匀地施入田间，再翻耕(2～3)遍，使病菌与土壤混均匀。
3)标准对照
选取实施例3中经卡那霉素初筛、PCR、Southern检测和RT-PCR分子鉴定筛选出的稳定表达SPGAFP1的T0代转SPGAFP1棉花中的4株，培育得到4个纯合的T2代转SPGAFP1棉花株系。
将实施例2获得的含有GAFP1基因的T0代转GAFP1棉花培育得到4个纯合的T2代转GAFP1棉花株系。
以受体材料陆地棉“中棉所24”、感病对照冀棉11号(房卫平、许守明、孙玉堂、唐中杰、王家典，棉花抗黄萎病的RAPD标记，河南农业科学，2001，9：11-12，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)、实施例2获得的T2代转GAFP1棉花四个株系为对照，经过上述步骤二的三种分子检测均为阳性的T2代转SPGAFP1棉花的四个株系为鉴定植株，将对照植株和鉴定植株在人工病圃中随机分布，按棉花正常的播种时间和田间管理方式进行种植，保持田间的适当湿度，以利于黄萎病的发生。
4)发病检测
进行病圃筛选，对铃期(8月中下旬)的棉花逐株进行三次病情调查，观察T2代转SPGAFP1棉花后代的抗病情况。
采用成株期鉴定法，单株划分黄萎病的病情级别，发病程度采用5级(0、1、2、3、4)分级法调查，用发病程度值的大小作为衡量抗病程度的一个指标，筛选出抗病的单株。0级：健株；1级：病株叶片有25％以下表现病状，叶片主脉间产生淡黄色或黄色不规则病斑；2级：病株叶片有25％～50％表现病状，病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片有50％～75％表现病状，病斑颜色大部分成黄褐色，叶片边缘卷枯，有少数叶片凋落；4级：全株叶片发病，多为褐色掌状枯斑，以致植株死亡。
按照下列公式计算病情指数：病情指数＝【(∑各级病级×相应病级发病株数)/调查总株数×4】×100
经鉴定，该黄萎病是由大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)病原菌引起。
图4为T2代转SPGAFP1棉花在病圃中的抗病效果，1为陆地棉“中棉所24”、2为转SPGAFP1棉花，3为转GAFP1棉花，从图中可以看出转SPGAFP1棉花抗病效果良好，其具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力。
经过病圃筛选，结果如表1所示，其中HR代表高抗、R代表抗病、T代表耐病、S代表感病，受体材料为“中棉所24”(病圃编号Hn8336-10)、感病对照为“冀棉11号”(病圃编号Hn8336-9)，病圃Hn8336-1至Hn8336-4为T0代转GAFP1棉花，病圃Hn8336-5至Hn8336-8为T0代转SPGAFP1棉花，从表1中可以看出T0代转SPGAFP1棉花的感染率、病指数均明显高于T0代转GAFP1棉花，T0代转SPGAFP1棉花多为高抗，T0代转GAFP1棉花仅为抗病型，说明T0代转GAFP1棉花具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力，抗黄萎病效果显著。
表1转SPGAFP1/GAFP1陆地棉株系铃期的病圃鉴定结果
进行剖杆实验检测，结果如图5所示，1为“中棉所24”，2为转GAFP1的棉花，3为转SPGAFP1棉花，其中“中棉所24”棉花杆横截面中有较多的褐色黄萎病菌侵染斑点，转GAFP1棉花杆横截面就相比于对照好很多，但也见少量褐点，转SPGAFP1棉花的杆横截面最为干净，说明受黄萎病菌的侵染最少，这个实验也说明转SPGAFP1的转基因植株抗黄萎病的能力明显好于转GAFP1棉花。
从上述的抗病效果、病圃筛选和剖杆实验均可看出，与转GAFP1棉花相比，转SPGAFP1棉花具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力，其病指数显著降低，说明转SPGAFP1棉花中表达的天麻抗真菌蛋白能够在信号肽(SP)的引导下将成熟肽GAFP1准确定位于胞外，从而有效增强了转基因植物对真菌病源物侵染的抗性，进一步说明信号肽的存在明显增强了转基因植物的抗病性。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体
<130>CGGNARB102218
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>540
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atggcagcat ccgcaagcac tgcggtaatc ctgttctttg ccgtgacaac aatgatgagt 60
ttgtcagcca tcccggcctt cgctagcgat cggttgaatt cgggccacca acttgatacc 120
gggggctcac tagcacaagg cggctaccta ttcataatac aaaacgattg taatcttgtc 180
ttatatgata acaacagagc ggtctgggca tcaggaacca acggaaaggc ctctggctgt 240
gtgcttaaga tgcagaatga tggcaacctc gttatttata gcggtagcag ggcaatatgg 300
gcaagcaaca ccaatcgcca aaacggtaac tactatctga tccttcagag agatcgtaac 360
gtcgtcatat acgataattc taataatgcg atttgggcaa cccacaccaa cgttggaaat 420
gctgaaatca ctgccatccc acacagcaac ggcacagcgg cggcgtctgg cgcagcacag 480
aacaaggtca atgaattata catatccatg tactcacggt ctaagagaat agctggctag 540
<210>2
<211>179
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Ala Ala Ser Ala Ser Thr Ala Val Ile Leu Phe Phe Ala Val Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Ser Leu Ser Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ser Asp Arg Leu
20 25 30
Asn Ser Gly His Gln Leu Asp Thr Gly Gly Ser Leu Ala Gln Gly Gly
35 40 45
Tyr Leu Phe Ile Ile Gln Asn Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Asn
50 55 60
Asn Arg Ala Val Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Lys Ala Ser Gly Cys
65 70 75 80
Val Leu Lys Met Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Ser Gly Ser
85 90 95
Arg Ala Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asn Arg Gln Asn Gly Asn Tyr Tyr
100 105 110
Leu Ile Leu Gln Arg Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Asp Asn Ser Asn
115 120 125
Asn Ala Ile Trp Ala Thr His Thr Asn Val Gly Asn Ala Glu Ile Thr
130 135 140
Ala Ile Pro His Ser Asn Gly Thr Ala Ala Ala Ser Gly Ala Ala Gln
145 150 155 160
Asn Lys Val Asn Glu Leu Tyr Ile Ser Met Tyr Ser Arg Ser Lys Arg
165 170 175
Ile Ala Gly
Claims (10)
1.一种培育转基因植物的方法，是将SPGAFP1蛋白的编码基因导入目的植物得到黄萎病抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述SPGAFP1蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SPGAFP1蛋白的编码基因的序列为序列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的植物和所述转基因植物均为双子叶植物，所述双子叶植物为棉花，尤其优选为陆地棉“中棉所24”。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述黄萎病由下述致病菌引起：大丽花轮枝孢(Verticilliu dahliae Kleb.)。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：所述SPGAFP1蛋白的编码基因通过下述权利要求6-10中任一所述的表达载体导入所述目的植物中。
6.一种表达载体，含有筛选标记基因、启动子和连接在所述启动子下游的SPGAFP1蛋白的编码基因。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于：所述启动子为组成型、维管组织特异表达或真菌诱导型启动子，所述组成型启动子优选为35S启动子。
8.根据权利要求6或7所述的载体，其特征在于：所述筛选标记基因为NPTII。
9.根据权利要求6-8中任一所述载体，其特征在于：所述载体为pCambia2300-35S-SPGAFP1，所述pCambia2300-35S-SPGAFP1为在pCambia2300的HindIII和SacI位点间插入35S-SPGAFP1得到的载体；所述35S-SPGAFP1是用HindIII和SacI酶切pBI35S-SPGAFP1得到的小片段，所述pBI35S-SPGAFP1是在pBI221的35S启动子下游的XbaI和SacI识别位点间插入SPGAFP1基因替换掉GUS基因得到重组载体。
10.含有权利要求6-9中任一所述表达载体的重组菌或转基因细胞系。
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