CN103266132A - 苏云金芽胞杆菌cry1Ah/cry1Ie双价基因表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苏云金芽胞杆菌cry1Ah/cry1Ie双价基因表达载体及其应用，属于生物技术领域。以pCIABIA3301为载体骨架，在其多克隆位点上插入有m2-cry1Ah和m2-cry1Ie基因，得到表达载体pMAhIeb。利用农杆菌介导法将所构建的表达载体转化玉米自交系品种，获得了高抗转双价基因玉米转化事件。通过对这两个转化事件的Cry1Ah蛋白的表达和遗传稳定性进行研究，表明Cry1Ah蛋白在T1～T2代的玉米植株中都能正常稳定的表达，而且表达量非常高，并且植株在田间对玉米螟的抗性也是稳定遗传的。获得的抗虫转基因玉米材料具有很好的应用价值，可以作为候选材料进行下一步Bt抗虫玉米的育种工作。

Description

苏云金芽胞杆菌cry1Ah/cry1Ie双价基因表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌cry1Ah/cry1Ie双价基因表达载体及其在转基因植物中的应用。

背景技术

玉米（Zea mays L.）是重要的粮食作物、工业原料和饲料原料，对国民经济的发展起着十分重要的作用。我国玉米生产近年不断发展，2012年种植面积已达5.1亿亩，总产量达2.08亿吨，超过水稻成为我国第一大粮食作物。但是，玉米生产也受到诸多因素的制约，近年玉米螟、粘虫等鳞翅目害虫严重发生危害已成为影响玉米增产的一个重要因素。特别是玉米螟在我国北方地区连年发生，平均导致玉米减产5%左右，严重时可达30%以上。害虫不仅对玉米产生直接危害，还会引发多种植物病原真菌生长造成真菌毒素的间接危害，现已成为储存粮食污染的主要来源。目前，防治害虫的主要手段是使用化学农药，不仅提高了防治成本、加剧了害虫产生抗药性，还对环境和人体健康造成了极大危害。

实践证明，利用基因工程手段培育抗虫转基因作物已成为农业害虫防治的有效途径。Bt cry1Ah基因是中国农业科学院植物保护研究所从国内苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株BT8中分离克隆的一个新型杀虫蛋白基因（专利号：200410009918）。Bt cry1Ah基因与cry1Ac基因的氨基酸序列相似性最高，为82%。Cry1Ah蛋白对鳞翅目害虫具有高毒力，对棉铃虫、水稻二化螟的杀虫活性强于Cry1Ac蛋白；对亚洲玉米螟的杀虫活性强于Cry1Ac、Cry1Ab蛋白。Bt cry1Ie基因是中国农业科学院植物保护研究所从Bt菌株Btc007中分离克隆的另一个具有自主知识产权的杀虫蛋白基因（专利号：ZL01124163.2）。cry1Ie基因与cry1A类基因相似性很低，只有30%，并且它们之间无交互抗性。其编码的蛋白对抗性和敏感玉米螟都有一定的毒力。将cry1Ah和cry1Ie基因同时构建到一个表达载体中，能够有效地克服基因种类单一、同源性高以及昆虫对Bt产生抗性等一系列问题，同时也有望筛选到抗虫性能更高的转基因作物。

国内己有将cry1Ah和cry1Ie基因组合转入到禾本科植物中的应用，如文献“转Bt基因抗虫玉米田间试验与遗传达稳定性分析”（东北农业大学，2010年）采用花粉管通道法转cry1Ah基因抗虫玉米高代自交系(及其后代)和采用基因枪法获得的转Bt cry1Ah和cry1Ie双价基因抗虫玉米植株,通过田间及室内玉米螟抗性鉴定,利用PCR、RT-PCR、Southern blot、Western blot、ELISA等各种分子检测手段对外源基因的遗传稳定性和遗传规律等进行了研究分析；文献“转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究”（中国农业科技导报，2012年第14卷第4期）构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。但对于双价基因转化均采用基因枪法，其转化效率不够高，蛋白在植物中的表达量均不高，有必要对其进一步的改造，以适用大规模生产育种的需要。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一个双价基因的表达载体，采用农杆菌介导法将该表达载体导入禾本科植物中，其转化效率高，且蛋白表达量有大幅的提高。

一种表达载体，其特征在于：以pCAMBIA3300为载体骨架，在其多克隆位点上插入有m2-cry1Ah和m2-cry1Ie基因，所述m2-cry1Ah基因序列如SEQ ID NO1所示，所述m2-cry1Ie基因序列如SEQ ID NO2所示。

所述表达载体，命名为pMAhIeb，其结构如图3中所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO3。

所述表达载体在转基因植物中的应用。

所述应用为将上述表达载体转入转化禾本科植物，使其表达到对鳞翅目害虫的抗性。

所述禾本科植物为玉米，所述鳞翅目害虫为玉米螟。

所述转化采用农杆菌介导法，其中外植体为玉米的未成熟幼胚。

所述外植体为授粉10-13天的玉米雌穗中的幼胚，长1.5-2.0mm。

所述农杆菌介导法采用如下步骤：

（1）选取授粉10-13天的玉米雌穗，选用剥离长1.5-2.0mm幼胚；

（2）用接种环从19℃生长三天的YEP平板上挑取一满环含表达载体的农杆菌LBA4404，悬浮在侵染培养液中，室温，75rpm，2-4小时，至OD₅₅₀=0.3-0.5，侵染幼胚；

（3）侵染完的幼胚转移到共培养基上，20℃暗中培养三天；

（4）三天后将幼胚转移到恢复培养基中，28℃暗中培养7天；

（5）恢复培养后将幼胚转移到筛选培养基中，每两周转换一次，从中选择生长迅速的II型愈伤组织；

（6）选择出来的愈伤组织见光分化，培养2～3周，之后将再生出的苗移入生根培养基中，当苗高3～5cm，根长2～3cm时，洗去培养基，转移到装有消毒蛭石的小培养钵中培养7-15d，然后移栽温室或大田；

（7）对再生植株进行分子检测确定转基因植株。

所述侵染培养液为：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7/L g脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2；附加终浓度为100μM的乙酰丁香酮；

所述共培养培养基为：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH5.8；附加终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的AS，300mg/L的半胱氨酸；

所述恢复培养基为：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/L MES，4g/L植物凝胶，pH5.8；附加终浓度为0.85mg/L的硝酸银和200mg/L的羧苄青霉素；

所述筛选培养基为：在恢复培养基加入终浓度为5mg/L的筛选剂草丁膦；

所述生根培养基为：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶，pH5.8。

所述步骤6的培养条件为温度为26-28℃，光暗培养条件为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～4000lx。

所述玉米品种为玉米自交Z31。

本发明根据植物密码子偏好性对cry1Ah和cry1Ie基因进行了密码子优化改造，其序列见SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，并构建了双价高效植物表达载体，利用农杆菌介导法转化玉米自交系品种，获得两个高抗转双价基因玉米转化事件pMAhIeb60和pMAhIeb186。通过对这两个转化事件的Cry1Ah蛋白的表达和遗传稳定性进行研究，结果表明Cry1Ah蛋白在T1～T2代的玉米植株中都能正常稳定的表达，而且表达量非常高，并且植株在田间对玉米螟的抗性也是稳定遗传的。获得的抗虫转基因玉米材料具有很好的应用价值，可以作为候选材料进行下一步Bt抗虫玉米的育种工作。

附图说明

图1植物表达载体pMAhIeb结构示意图

图2植物表达载体pMAhb的构建图谱

图3植物表达载体pMAhIeb的构建图谱

图4植物表达载体pMAhb的酶切验证，其中M:λDNA/Hind III+EcoR I;1:pMAhb/Hind III+EcoR I;2:pMAhb/Hind III+BamH I+EcoR I

图5植物表达载体pMAhIeb的酶切验证，其中M:λDNA/Hind III+EcoR I;1:pMAhIeb/EcoR I;2:pMAhIeb/BamH I

图6玉米抗性愈伤的筛选及转化植株的再生流程，

其中a：幼胚的准备；b：幼胚的共培养；c：幼胚的恢复培养；d：愈伤组织的筛选；e、f、g：玉米再生苗的获得；h：转入小花盆中的玉米苗；i:转入温室大地中的玉米苗；j：成熟的玉米穗

图7T0代转pMAhIeb玉米再生植株的PCR检测，其中a：1～～10分别为转pMAhIeb再生植株中m2-cry1Ah基因的PCR检测；b：1～10分别为转pMAhIeb植株中的m2-cry1Ie基因的PCR检测；P：阳性对照；N：非转基因植株

图8部分T0代转基因植株的Cry1Ah蛋白表达量，

图9部分T1代转基因植株的PCR检测，其中a：1～12为pMAhIeb植株中m2-cry1Ah基因的PCR检测；b：1～11为pMAhIeb植株中的m2-cry1Ie基因的PCR检测；M:DNA marker;P:阳性对照;N:非转基因植株

图10T1代转基因植株生物活性检测，其中a：抗虫事件；b：未转化植株

图11T2代转基因植株接虫2周后虫测情况，其中a：抗虫事件；b：非转基因植株

图12T2代部分转基因抗虫植株的RT-PCR检测，其中M：DNA marker;P：阳性对照;a：pMAhIeb植株中m2-cry1Ah基因的RT-PCR检测，1、3、5、7、9、11、13以cDNA为模板，2、4、6、8、10、12、14以RNA为模板，15和16分别以非转基因植株的cDNA和RNA为模板；b：pMAhIeb植株中m2-cry1Ie基因的RT-PCR检测，1、3、5、7以cDNA为模板，2、4、6、8以RNA为模板，9和10分别以非转基因植株的cDNA和RNA为模板

图13T2代转基因植株Cry1Ah蛋白的Western blot检测，其中M:蛋白预染Marker；P:纯化Cry1Ah蛋白；1～14为转基因植株；N：非转基因植株

图14T2代转基因玉米植株的Cry1Ah蛋白表达量，其中1：pMAhIeb60转化事件；2：pMAhIeb186转化事件

图15抗虫玉米事件T2代植株不同组织部位Cry1Ah蛋白表达量，其中1：苞叶；2：叶片；3：花丝

图16抗虫事件T2代植株的金标免疫试纸条检测结果，其中1和2：抗虫事件pMAhIeb60；3和4：抗虫事件pMAhIeb186；5：非转基因植株

图17抗虫事件T2代植株在实验室条件下的生物活性检测，其中a：抗虫事件pMAhIeb60；b：抗虫事件pMAhIeb186；c：非转基因植株；d：喂食非转基因植株后的玉米螟

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

下面所用到的生物材料，本申请人的实验室中均有保藏，可以对公众发放。

1、导入的基因：

目的基因：本研究对cry1Ah和cry1Ie基因分别进行了二次密码子优化，改造后的cry1Ah基因（m2-cry1Ah）与原始cry1Ah基因进行比对：GC含量由37%提高到55%。优化后的cry1Ie基因(m2-cry1Ie)的GC含量提高到55%。改造后的核苷酸序列及推导的氨基酸序列见序列表。表1为二次改造的cry1Ah和cry1Ie基因的GC含量和密码子使用频率

表1改造的cry1Ah和cry1Ie基因的GC含量和密码子使用频率

2、重组载体pMAhIeb的构建：

以pCAMBIA3300为载体骨架，插入序列包括玉米ubiqutin启动子（大小为2036bp）和增强子Ω和kozak序列（全长67bp）；二次改造的m2-cry1Ah基因，PolyA、3’nos序列和ubiqutin启动子、二次改造的m2-cry1Ie基因组成。载体结构示意图见图1所示。其中RB：右边界；Ubi：ubiquitin启动子；m2-cry1Ah：二次改造cry1Ah基因；m2-cry1Ie：二次改造cry1Ie基因；nos：nos终止子；35S：35S启动子；bar：草胺膦乙酰转移酶基因；polyA：polyA终止子；LB：左边界。

构建过程如下：

用Hind III和EcoR I分别双酶切pUmAh中间载体和pCAMBIA3300载体，回收二次改造的cry1Ah基因表达盒片段和pCAMBIA3300载体片段，连接得到植物表达载体pMAhb（图2）。用Hind III单酶切pMAhb载体，用Hind III和EcoR I双酶切pUmIe中间载体，分别回收pMAhb载体片段和二次改造的cry1Ie基因表达盒片段，klenow补平后连接得到植物表达载体pMAhIeb（图3）。所构建的植物表达载体经过酶切验证构建正确（图4、图5）。

3、农杆菌介导法导入玉米，其操作程序如下：

（1）选取授粉10-13天的玉米雌穗，从中剥离大小适中的幼胚（1.5-2.0mm）；

（2）用接种环从19℃生长三天的YEP平板上挑取一满环农杆菌LBA4404（含表达载体），悬浮在侵染培养液中，室温，75rpm，2-4小时，至OD₅₅₀=0.3-0.5，侵染剥离的幼胚；

（3）侵染完的幼胚转移到共培养基上，20℃暗中培养三天；

（4）三天后将幼胚转移到恢复培养基中，28℃暗中培养7天；

（5）恢复培养后将幼胚转移到筛选培养基中，每两周转换一次，从中选择生长迅速的II型愈伤组织（白色至浅黄色、结构疏松、易碎、呈颗粒状、易产生胚状体的愈伤组织）；

（6）选择出来的愈伤组织见光分化，培养2～3周，之后将再生出的苗移入生根培养基中，当苗高3～5cm，根长2～3cm时，洗去培养基，转移到装有消毒蛭石的小培养钵中培养7-15d，然后移栽温室或大田；

（7）对再生植株进行分子检测确定转基因植株。其流程图如图6所示。

相关培养基如下所示：

侵染培养液：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7/L g脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖（pH5.2），过滤灭菌，于4℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮（AS），终浓度为100μM；

共培养培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶（pH5.8）；高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的AS，300mg/L的半胱氨酸；

恢复培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/L MES，4g/L植物凝胶（pH5.8）；高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银和200mg/L的羧苄青霉素；筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂5mg/L草丁膦；

生根培养基：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶(pH5.8)，高压灭菌。

4、抗虫转化事件pMAhIeb60和pMAhIeb186的获得：

根据植物密码子偏好性对Bt cry1Ah和cry1Ie基因进行了密码子优化改造，构建高效植物表达载体pMAhIeb，以玉米自交系Z31幼胚为转化受体材料，进行大规模农杆菌转化，一共转化5890个玉米未成熟幼胚，获得2150块抗性愈伤，共得到T0代玉米转化植株358株。通过分子检测和生物活性检测，从263个PCR阳性植株中筛选出两个双价高抗虫的玉米转化事件pMAhIeb60和pMAhIeb186；通过对这两个抗虫事件的T1～T2代植株的Cry1Ah蛋白的表达和遗传稳定性的研究，结果表明Cry1Ah蛋白在T1～T2代的玉米植株中都能正常稳定的表达，进一步对这两个双基因抗虫玉米事件的T2代植株的苞叶、叶片和花丝进行了Cry1Ah蛋白表达量的分析，结果表明Cry1Ah蛋白在叶片中的高表达可以有效防治玉米螟初期危害，而在苞叶和花丝中的高表达可以有效防治玉米螟后期危害，并且植株在田间对玉米螟的抗性也是稳定遗传的。这两个转化事件抗虫性状突出，表现为1级，具有很好的应用前景，有望推向产业化。具体内容详见如下。

4-1T0代玉米再生植株的检测

(1)T0代玉米再生植株的PCR检测

将获得的358株玉米植株全部进行PCR检测，提取玉米叶片基因组，用引物F2/R2（F2:5'-ATACCGCCATCCAAGAGC-3'，R2：5'-CGTGAAGGCATTCGCAGA-3'）扩增pMAhIeb植株中的m2-cry1Ah基因，用引物F9/R9（F9:5'-AGGTGCCGCTTCTGCCAATCTAC-3'，R2：5'-ATGTCGCCGAATGTGCCAGTGTT-3'）扩增pMAhIeb植株中的m2-cry1Ie基因。检测结果见图7。共计263株为PCR阳性植株，PCR阳性率为73%，转化率约为5%。而未转化的玉米植株则没有相应大小的产物。

(2)T0代PCR阳性植株的ELISA检测

将获得的部分转基因PCR阳性植株进行蛋白的提取，然后进行ELISA检测，分析每个转基因植株每鲜克重叶片表达Cry1Ah蛋白量。将ELISA结果进行统计（表2），其中有2株玉米转化植株表达Cry1Ah蛋白量约为3-3.5μg/g鲜重左右（见图8）。

表2T0代玉米再生植株的Cry1Ah蛋白表达量（μg/g鲜重）

(3)T0代PCR阳性植株的生物活性检测

为了保证大部分植株结实，所以只选取Cry1Ah蛋白量小于300ng的玉米再生植株进行生物活性检测。待小苗移栽至温室大地一个月左右（5叶期），将玉米螟初孵幼虫接于玉米心叶内，接虫14天后，将咬食严重的玉米植株去除，最终共计228株PCR阳性玉米植株结实，并收获种子。4-2T1代转基因植株的检测及抗性转基因事件的初步确定

将收获的228个事件的玉米种子全部进行廊坊播种并进行跟踪检测，每个事件播种一行，每行播种15棵左右。对T1代转化植株进行了PCR、ELISA和生物活性检测。

(1)T1代转基因植株的PCR检测

因T1代植株群体较大，并且每个事件都存在分离现象，所有我们从每个事件中随机选取8株苗进行取样，混合成一份样品再提取基因组DNA并进行PCR检测，检测结果与T0代完全一致，228个事件全部为PCR阳性事件（见图9）。

(2)T1代转基因植株的ELISA检测

每个转基因玉米事件随机选取4株进行ELISA检测，检测结果显示每个事件的Cry1Ah蛋白量与T0代Cry1Ah蛋白量基本一致（数据未列出），将Cry1Ah蛋白量小于200ng的事件剔除后进行后续的检测。

(3)T1代转基因植株的生物活性检测

当植株生长到6～8叶期时，将40～60头初孵玉米螟幼虫接于心叶中，以非转基因植株作为阴性对照，调查食叶级别于接虫两周后。检测结果显示，Cry1Ah蛋白表达量大于500ng的转化事件表现为抗虫；300ng～500ng的事件部分表现抗虫，部分表现感虫；Cry1Ah蛋白表达量小于300ng的所有事件全部表现为感虫而全部剔除（见图10）；因此选择蛋白表达量大于300ng并表现出一定抗虫性的17个事件进行下一代播种及跟踪检测。

4‐3T2抗性转基因事件的跟踪分析

将收获的T1代17个玉米事件种子在海南进行T2代播种并进行跟踪检测。

(1)生物活性检测

当植株生长到6～8叶期时，将40～60头初孵玉米螟幼虫接于心叶中，以非转基因植株作为阴性对照，调查食叶级别于接虫两周后。将虫测结果进行统计，表3列出播种的事件数以及不同抗虫级别的事件数。虫测结果显示，转化事件pMAhIeb60和pMAhIeb186对玉米螟的抗性达到1级，表现为高抗性（见图11）

表3T2代转基因植株对亚洲玉米螟的抗性统计

(2)RT-PCR检测

将抗性级别5级以上的植株全部剔除，对1～4.9级的14个抗虫事件RNA水平的转录情况进行检测。对每个事件的抗性植株选取一株进行叶片总RNA的提取，同时提取非转基因植株叶片的总RNA作为阴性对照，将RNA反转录生成cDNA，以cDNA为模板，用引物，F2/R2和F9/R9分别对抗虫事件中的m2-cry1Ah和m2-cry1Ie转录本进行检测（见图12）。RT-PCR检测结果表明，以cDNA为模板的所有转基因植株都扩增出与阳性对照同等大小的目的条带，而未转化植株无相应条带，说明m2-cry1Ah和m2-cry1Ie基因在RNA水平上均正确转录。以植株总RNA为模板没有扩增出相应大小的条带，说明提取的RNA没有基因组DNA的污染。

(3)Western blot检测

为了检测Cry1Ah蛋白是否正确表达，利用Western blot检测方法对14个抗虫事件的Cry1Ah蛋白进行分析。取15μg蛋白进行杂交。一抗为Cry1Ah抗血清，按照1:1000的比例稀释，二抗采用碱性磷酸酯酶标记的IgG抗体（Sigma，1:10000）。Western blot结果显示所有抗虫事件都杂交出了与正对照等大的65kDa的目的条带，证明了cry1Ah基因在玉米中稳定遗传并能够进行正确翻译。而未转化植株无杂交条带（见图13）。

(4)ELISA检测

对1～4.9级的14个抗虫事件进行ELISA检测，首先对Cry1Ah蛋白表达量进行分析。每个转基因玉米事件随机选取4株进行ELISA检测，结果显示所有事件每鲜克重叶片表达Cry1Ah蛋白量均在500ng以上（图14），并且每个事件的蛋白量与T0、T1代ELISA结果基本一致，说明Cry1Ah蛋白在玉米内能够稳定遗传和表达。结合生物活性检测结果可以看出，抗虫级别表现为1级的两个事件Cry1Ah蛋白表达量最高，在3000～3500ng之间，而2～2.9级的1个事件Cry1Ah蛋白表达量在1000～1500ng之间，3～3.9级的9个事件Cry1Ah蛋白表达量在700～1000ng之间，4～4.9级的2个事件Cry1Ah蛋白表达量在500～700ng之间，ELISA检测和生物活性检测结果充分说明了Cry1Ah蛋白在玉米植株中的表达量与植株抗虫性表现基本一致。

分别对pMAhIeb60和pMAhIeb186这两个玉米转化事件植株的苞叶、叶片和花丝的Cry1Ah蛋白表达量进行检测，每个事件取三株PCR阳性植株进行取样。检测结果显示，事件pMAhIeb60植株各部位的Cry1Ah蛋白表达量都比较高，由高到低的表达部位分别是苞叶、叶片和花丝，每鲜克重表达Cry1Ah蛋白量分别是4.5μg、3.5μg和2.5μg；事件pMAhIeb186植株苞叶、叶片中表达Cry1Ah蛋白量较高，都为3.5μg，而花丝中表达量为0.8μg（见图15）。分别对不同转化方法、不同转化事件的Cry1Ah蛋白表达量进行了比较，结果表明，通过农杆菌介导法获得的二次改造的转基因事件其Cry1Ah蛋白表达量要显著高于其它转化事件，而且抗虫性也明显提高，表现为一级高抗（见表4）。

表4不同转化方法、转化事件Cry1Ah蛋白表达量比较

(5)金标免疫试纸条检测

利用Bt Cry1Ac金标免疫试纸条对14个抗虫事件的Cry1Ah蛋白进行检测，每个事件选取3～5株抗性植株，用塑料棒将叶片研碎后加入300μl试剂盒所带的提取buffer再研磨30s，然后将金标免疫试纸条放入提取buffer中进行检测。检测结果显示只有事件pMAhIeb60和pMAhIeb186玉米植株表现为阳性结果，其余12个事件和未转化植株都表现为阴性结果（见图16）。分析原因可能是因为我们所用的试纸条为Cry1Ac金标免疫试纸条，虽然Cry1Ac与Cry1Ah蛋白同源性高达82%，但免疫杂交效率还未达到100%，Cry1Ah蛋白的表达量还未达到可被检测的量因而表现为阴性结果。

(6)抗虫玉米事件T2代植株室内生物活性检测

对两个高抗虫事件pMAhIeb60和pMAhIeb186玉米植株进行室内生物活性检测。检测结果显示，事件pMAhIeb60接虫三天后玉米螟幼虫全部致死，事件pMAhIeb186接虫三天后玉米螟幼虫有六头存活，但体积很小，六天后全部致死(见图17)。

Claims (10)

1.一种表达载体，其特征在于：以pCIABIA3301为载体骨架，在其多克隆位点上插入有m2-cry1Ah和m2-cry1Ie基因，所述m2-cry1Ah基因序列如SEQ ID NO1所示，所述m2-cry1Ie基因序列如SEQ ID NO2所示。

2.根据权利要求1所述表达载体，命名为pMAhIeb，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

3.权利要求1或2所述的表达载体在转基因植物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，为将权利要求1或2所述的表达载体转入转化禾本科植物，使其表达到对鳞翅目害虫的抗性。

5.根据权利要求4所述的应用，所述禾本科植物为玉米，所述鳞翅目害虫为玉米螟。

6.根据权利要求5所述的应用，所述转化采用农杆菌介导法，其中外植体为玉米的未成熟幼胚。

7.根据权利要求6所述的应用，所述外植体为授粉10-13天的玉米雌穗中的幼胚，长1.5-2.0mm。

8.根据权利要求7所述的应用，所述农杆菌介导法采用如下步骤：

（1）选取授粉10-13天的玉米雌穗，选用剥离长1.5-2.0mm幼胚；

（2）用接种环从19℃生长三天的YEP平板上挑取一满环含表达载体的农杆菌LBA4404，悬浮在侵染培养液中，室温，75rpm，2-4小时，至OD₅₅₀=0.3-0.5，侵染幼胚；

（3）侵染完的幼胚转移到共培养基上，20℃暗中培养三天；

（4）三天后将幼胚转移到恢复培养基中，28℃暗中培养7天；

（5）恢复培养后将幼胚转移到筛选培养基中，每两周转换一次，从中选择生长迅速的II型愈伤组织；

（6）选择出来的愈伤组织见光分化，培养2～3周，之后将再生出的苗移入生根培养基中，当苗高3～5cm，根长2～3cm时，洗去培养基，转移到装有消毒蛭石的小培养钵中培养7-15d，然后移栽温室或大田；

（7）对再生植株进行分子检测确定转基因植株；

所述侵染培养液为：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7/Lg脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2；附加终浓度为100μM的乙酰丁香酮；

所述共培养培养基为：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH5.8；附加终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的AS，300mg/L的半胱氨酸；

所述恢复培养基为：N6盐和N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/LMES，4g/L植物凝胶，pH5.8；附加终浓度为0.85mg/L的硝酸银和200mg/L的羧苄青霉素；

所述筛选培养基为：在恢复培养基加入终浓度为5mg/L的筛选剂草丁膦；

所述生根培养基为：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶，pH5.8。

9.根据权利要求8所述的应用，所述步骤6的培养条件为温度为26-28℃，光暗培养条件为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～4000lx。

10.根据权利要求5所述的应用，所述玉米品种为玉米自交Z31。

Images