CN1614022A - 对鳞翅目昆虫高毒力的Bt cry1Ah基因及其表达产物 - Google Patents

Abstract

本发明为“对鳞翅目昆虫高毒力的Bt crylAh基因”，属于生物防治技术领域。本发明涉及对鳞翅目害虫具有抗性的Bt crylAh基因及其一种部分序列和由该基因及其部分序列所编码的蛋白质及多肽序列。进一步，本发明还涉及这些基因及其部分序列和由它们所编码的蛋白质及多肽在鳞翅目害虫生物防治中的应用。

Description

对鳞翅目昆虫高毒力的Bt cry1Ah基因及其表达产物

本发明的技术领域：

本发明属于生物防治技术领域。进一步，本发明涉及对鳞翅目害虫具有高毒力的Btcry1Ah基因及其一种部分核苷酸序列和由该基因及其部分序列所编码的蛋白质及多肽。

本发明的研究背景：

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革蓝氏阳性产芽孢土壤细菌，广泛分布于土壤、虫尸、植物根围、粮仓尘埃等区域。众所周知，它在芽孢形成期能产生蛋白性质的晶体，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、食毛目、同翅目等昆虫，甚至线虫等动物均具有毒杀活性，而对人类、高等动物、植物等非靶标生物安全无害，已被广泛地应用于农业、林业、卫生害虫的防治。

1981年，Schnepf和Whiteley等克隆了第一个Bt杀虫蛋白基因cry1Aa，于1985年完成了核苷酸序列分析，该基因对鳞翅目害虫具有活性。随后，对鞘翅目、双翅目等害虫有活性的菌株和基因相继被发现和分离克隆(Krieg，A.et al，J.Appli.Entomology，1983，96：500-508；Ward，E.S.，andD J.Ellar.1986.J.Mol.Biol.191：1-11.Herrnstadt，C.et al，Gene，1987，57(1)：37-46；Payne，J.，K.E.Narva，and J.Fu.December 1996.U.S.Patent 5,589,382.)。随着生物技术的突飞猛进，Bt转基因工程菌和抗虫植物的商业化取得巨大成功，各国均加大投入，以期获得新的高毒力、新活性的Bt菌株和基因。截止到2004年10月底，全球共发现和公布了323种Bt杀虫蛋白基因(可参见 http：//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/list. html)。

1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它所使用的基因主要部分就是来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米、转cry3Aa基因的抗虫土豆等GMO相继问世，截止到2003年底，在美国抗虫棉种植面积占总棉花种植的73％，玉米占到40％(Clive James，International Service for the Acquisition ofAgri-Biotech Application，preview，No.30，2003)。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/1Ab基因的抗虫棉以来，累计种植已达9千万亩，仅2004年种植面积就高达3700万亩。在我国获准商业化的还有转基因抗虫杨树，它所使用的基因与抗虫棉几乎相同。与此同时，国内相关研究单位正在进行环境释放的抗虫转基因植物有水稻(cry1Ac/1Ab或者cry1Ab)、玉米(cry1Ac/Ab)。但无论是已商品化还是处于研究评价阶段的抗虫工程植物所用的基因都具有种类单一的缺点，因此如果大面积推广这些抗虫作物将存在害虫避难所减少、抗药性上升过快的风险。解决这一问题的有效方法是寻找新的高毒力基因或基因组合作为新的替代和补充。美国孟山都公司的第二代抗虫棉就采用了对棉铃虫高毒的cry2Ab基因进行组合(Bruce E.Tabashnik et al.，APPLIEDAND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Aug.2002，p.3790-3794；Nicholas，D.et al，Transgenic Plant and Insect Pests Biocontrol，John Wiley & Sons Press，USA，1997，1-18)。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫蛋白基因，将能丰富杀虫基因资源，为转基因工程菌和抗虫植物的研制提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并有望降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

本发明的内容：

本发明的目的：

针对目前世界上防治鳞翅目害虫所使用的Bt制剂以及转基因产品基因品种单一、害虫易于产生抗性、杀虫谱较窄和毒力较低等不足，本发明从国内Bt菌株中分离克隆了新的基因cry1Ah，该基因表达产物对多种鳞翅目害虫毒力显著强于目前已知的Cry蛋白。这种新的基因可以应用于转化微生物和植物，使之表现对相关害虫的高毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

本发明的技术方案：

1.出发菌株Bt BT8菌株中cry基因的鉴定

采用Kuo(Kuo and Chak，Appl.Environ.Micro.1996，62：80-86)和宋福平的PCR-RFLP鉴定体系对国内Bt分离株(宋福平、张杰、黄大昉等，《中国农业科学》，1998，第31卷，第3期，第13-18页)进行cry基因分析，发现该菌株中存在cry1Aa、cry1Ba cry2Aa、cry2Ab等已知基因，同时发现了一种尚不能定名的新基因cry1X。

2.BT8菌株中cry1Ah基因的克隆

采用快速克隆方法对该菌株中的新cry基因进行分离克隆。

按照Narva(Narva，K.E.et al，EP0462721 A2，1991，8)等的方法从Bt BT8菌株(该菌株来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可向公众提供)中提取质粒DNA，用Sau3AI酶部分消化质粒DNA，从凝胶中回收4-7kb DNA片段，纯化后与经BamHI消化、碱性磷酸酶处理的pUCP18载体进行连接(Schweizer HP，Gene，1991 Jan2；97(1)：109-21.)，转化大肠杆菌JM107(购自美国NEBiolab公司，32 Tozer Road Beverly，MA01915-5599，USA)后，用cry1基因通用引物K5un2/K3un2对能在抗生素Amp上正常生长的阳性转化子进行PCR扩增鉴定，筛选含有Bt cry基因的阳性转化子。引物分别为：

正向引物(Forward primer)：TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；

反向引物(Reverse primer)：CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC’

通过附图6所示的程序及条件对pHT59进行亚克隆。对筛选得到的重组质粒pHT59，进行DNA序列分析，结果表明该质粒含有cry1Ah基因全长DNA片段。该基因全序列如SEQ ID NO 1所示，共含有3549bp；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，该蛋白质共由1182个氨基酸组成，分子量为134kDa，等电点为pI 4.985。Btδ--内毒素基因国际命名委员会把该基因命名为cry1Ah1。

3.穿梭表达载体的构建

根据cry1Ah1全长基因3549bp的核苷酸序列设计一对引物，并在引物5’端加上限制性酶位点，用于基因与表达载体的连接，引物序列如下：

正向引物：5’C GGGATCC ATGAAAAACAGTATCAA 3’

                 BamHI

反向引物：5’ACGC GTCGAC CTATTCCTCCATAAGGAG 3’

                 SalI

3549bp的PCR产物经BamHI、SalI消化后克隆于含有Bt复制子的Bt-E.coli穿梭质粒pSXY422(7.3kb)。该质粒由pUC18改造而成，加入了Bt质粒的复制子、Bt cry基因营养期表达启动子Pcry3Aa和来自pET21b质粒的多克隆位点，成为穿梭表达载体(该质粒来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可向公众提供)。所获得的重组表达载体质粒命名为pSXY422-1Ah。采用Lereclus等转化方法(Lereclus，D.et al，FEMSMicrobiology Letters，1989，60：211-217)，利用pSXY422-1Ah转化Bt无晶体突变株HD73--(该菌株来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可向公众提供)。对能在红霉素抗性平板上生长出的阳性转化子进行多种分子检测，证明转化成功。将该转化子命名为工程菌Biot1Ah。该菌能在Bt无晶体突变株HD73-稳定遗传，稳定性大于90％。

4.工程菌的培养和观察

采用GT培养基(配方为：液体GT：每升中加入10ml 0.8％CaCl₂，10ml G-Tris盐(0.025％FeSO₄.7H₂O，0.05％CuSO₄.5H₂O，0.05％ZnSO₄.7H₂O，0.5％MnSO₄.H₂O，2.0％MgSO₄)，10ml20％(NH₄)₂SO₄，10ml 5％ K₂HPO₄，10ml 20％葡萄糖，50ml 1M Tris-HCl，pH7.5，1.5g酵母提取物，pH7.4；固体GT：在液体GT中加入1.3％琼脂)、1/2 LB培养基(配方为：液体LB：Tryptone 1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0；固体LB：在液体培养基中加1.3％琼脂)分别培养Biot1Ah工程菌，用电子扫描显微镜和光学显微镜观察结果。结果显示在Biot1Ah中存在双锥体形晶体，证明该基因正常表达。

5.cry1Ah1基因5’-端活性区确定和表达研究

根据其它cry1A基因活性区大于1.8kb的情况，设计引物B.2001bp部分基因引物：

正向引物：5’CG GGATCC ATGAAAAACAGTATCAA 3’

                BamHI

反向引物：5’ ACGC GTCGAC TGATCAATATGATAATCCG 3’

                SalI

把2001bp的PCR产物经BamHI、SalI消化后克隆于E.coli表达载体pET21(购自于美国Novagen Inc，601 Science Drive Madison，Wi 53711)，把所获得的重组表达载体质粒命名为pET1Ah-2。利用pET1Ah-2转化大肠杆菌BL21(DE3)(Dubendorff，J.W.and Studier，F.W.1991，J.Mol.Biol.219，45-59.)，经过IPTG诱导表达了75kD的多肽。

6.杀虫生物活性测定

利用的鳞翅目害虫包括：小菜蛾(Plutella xylostella)为二龄幼虫；棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、亚洲玉米螟(Ostrina furnacalis)、水稻二化螟(Chilo supperssalis)为一龄幼虫。上述测试昆虫为标准实验室饲养种群。

还有大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)：在自然种植的大豆田中诱捕成虫，室内产卵孵化的1～2幼虫。

以不同浓度的Bt毒蛋白为样品进行单独测试和组合测试，时间4-7天。实验数据按标准进行相关处理。

本发明的有益效果：

本发明分离克隆的Bt cry1Ah基因和其一种部分序列及其它们的基因表达产物能够对鳞翅目害虫产生强毒力，这种毒力强于目前国际上发现的同类自然菌株的基因。通过cry1Ah基因与cry1Ab、cry1Ba、cry2Ab等基因表达产物组合，可扩大对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

附图说明：

图1为BT8 cry1型基因的PCR扩增产物及RFLP。

其中M代表pUC DNA混合Marker(1116，883，692，501，489，404，331，242，190，147，111，110bps)，1为Kun3引物PCR扩增产物1.4kb，2为1/PstI and EcoRI酶切，3为4/PstI andXbaI酶切，4为Kun2引物扩增产物1.6kb。

图2为含有目的基因的重组质粒pHT59 PCR-RFLP鉴定。

其中M代表pUC DNA混合Marker，1为Kun2引物扩增产物/PstI+XbaI，2为Kun3引物扩增产物/PstI+EcoRI。

图3为pHT59单酶切分析。

其中1、2、3、4、5、6和M分别代表：pHT59/EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI和λDNA/Ecol30I marker(19.1，7.7，6.2，4.2，3.4，2.7，1.9，1.5，0.9，0.4kb)。

图4为pHT59质粒双酶切分析。

其中1、2、3、4、5、6、7和M分别代表pHT59/EcoRI and XbaI、pHT59/EcoRI and KpnI、pHT59/EcoRI and HindIII、pHT59/EcoRI and PstI、pHT59/EcoRI and SacI、pHT59/SacIand PstI、pHT59质粒和λDNA/EcoO130I marker。

图5亚克隆质粒pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22的酶切分析。

其中1、2代表pHT59-15/HindIII，3、4代表pHT59-32/HindIII，5、6代表pHT59-22/HindIII，M为λDNA/EcoO130I marker。

图6为cry1Ah基因/pHT59的亚克隆流程图。

图7为cry1Ah全长基因穿梭表达载体pSXY422-1Ah酶切分析。

其中1、2为cry1Ah全长基因PCR扩增产物，3为穿梭载体pSXY422/BamHI and SalI，4为pSXY422-1Ah/BamHI and SalI，M代表λDNA/EcoO130I marker。

图8为cry1Ah基因2.0kb片段PCR扩增检测。

其中1、2为E.coli表达载体pET21b/BamHI and SalI，3、4代表cry1Ah基因5’端2.0kb片段PCR扩增产物，M代表λDNA/EcoO130I marker。

图9为含有cry1Ah基因2.0kb片段重组质粒pET1Ah-2酶切分析。

其中1、M分别代表pET1Ah-2/BamHI and SalI和λDNA/EcoO130I marker。

图10为cry1Ah基因2.0kb片段在E.coli中表达产物SDS-PAGE检测。

其中1、2代表表达细胞形成的包含体蛋白组分，3为可溶性蛋白组分，4为阴性对照菌(BL21：pET21b)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。

图11为不同培养时间BT8中各种cry基因的表达。

其中12、18、24、30、36分别代表细菌培养时间(小时)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。

图12为不同培养时间工程菌Biot1Ah中cry1Ah基因的表达。

其中18、24、30、36、48分别代表细菌培养时间(小时)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。

图13为Cry1Ah蛋白晶体(工程菌Biot1Ah)的扫描电镜结果。

图14为cry1Ah全长基因与其它cry1类基因核苷酸序列同源进化树。

图15为cry1Ah 2.0kb基因与其它cry1类基因相同长度核苷酸序列同源进化树。

图16为Cry1Ah蛋白与其它Cry1类蛋白全长氨基酸序列同源进化树。

图17为Cry1Ah蛋白与其它Cry1类蛋白N-末端667个氨基酸序列同源进化比较。

本发明的具体实施方案：

以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

实施例1、BT8菌株的基因型鉴定

按照Narva(Narva，K.E.et al，EP0462721 A2，1991)的方法从Bt菌株BT8中提取质粒DNA。以B-8-G菌株质粒DNA为模板，用cry1的3’端引物(K5un2和K3un2)、5’端引物(K5un3和K3un3)进行PCR扩增，PCR循环参数分别为94℃1分钟，54℃1分钟，72℃3分钟，32个循环，72℃延伸10分钟。分别获得了cry1型基因3’端的1.6kb、5’端的1.4kb两种片段PCR产物，该DNA片段经过氯仿抽提纯化后进行限制性内切酶消化反应，37℃1-2小时，琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段的多态性(附图1)。分析结果(见表1)表明BT8菌株含有cry1Aa，cry1Ba，cry2Aa，cry2Ab和一个未知的新的cry1基因(cry2基因结果从略)。

表1 BT8菌株cry1型基因的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性

基因          PCR扩增产物(K5un3/K3un3)(bp)     EcoRI和PstI酶切片段(bp)

cry1Aa        1463                             726，493，244

cry1Ba        NP

cry1Ax        1460                             940，520

基因          PCR扩增产物(K5un2/K3un2)(bp)     XbaI和PstI酶切片段(bp)

cry1Aa        1635                             1117，518

cry1Ba        1686                             1015，655，16

cry1？        1630                             780   540  310

实施例2、BT8菌株新基因的克隆

经鉴定BT8菌株中含有一个未知的新的cry1基因，采用以下方法进行分离克隆。BT8质粒经Sau3AI部分酶切，回收4-7kb片段，与BamHI酶切的载体pUCP19连接转化JM107，经PCR扩增和RFLP分析(附图2)获得含有BT8菌株新cry1型基因的阳性转化子ETG59，把重组质粒命名为pHT59。

依据已有的cry1类基因的酶切图谱分析，选择EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI等分别对pTG59进行单一酶切分析(附图3)，结果表明pHT59上克隆的外源片段为6.9kb。经过EcoRI和XbaI、EcoRI和KpnI、EcoRI和HindIII、EcoRI和PstI、EcoRI和SacI、SacI和PstI双酶切分析(附图4)，构建了该基因大片段的物理图谱。根据多种酶切分析结果选择HindIII酶切片段进行亚克隆，pHT59经HindIII完全消化为6.7kb(2.2kb和pUCP19 4.5kb)、3.2kb、1.5kb三个片段，分别将3.2kb、1.5kb与HindIII酶切的pBlueScriptSK⁺连接，6.7kb片段自连，转化大肠杆菌，经质粒酶切分析筛选获得了三个亚克隆，所含重组质粒命名为pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22(附图5)。附图6为此亚克隆流程图。

对三个亚克隆进行序列测定，再与其它cry1基因进行同源序列比较，表明该基因为全长新基因。该基因编码区3549bps(SEQ ID NO 1)，编码1182个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO2)，分子量为134kDa，等电点为pH4.985。该基因由Btδ内毒素基因国际命名委员会命名为cry1Ah1。

实施例3、cru1Ah全长基因穿梭载体的构建

为了便于克隆和表达，根据cry1Ah1基因编码区全长核苷酸序列，设计了一对分别含有BamHI和SalI酶切位点的特异性引物。PCR扩增条件为94℃1分钟，54℃1分钟，72℃3分钟，32个循环，72℃延伸10分钟，采用高保真性能的pfu聚合酶进行扩增。获得了3.5kbcry1Ah全长片段，如附图7中A的第1、2样品所示。经BamHI和SalI双酶切完全反应后，进行电泳，从凝胶中回收该片段，与经同样的酶切处理的Bt-E.coli穿梭表达载体pSXY422进行连接反应，12℃12小时；取连接产物2μL转化E.coli受体菌JM110，以Amp抗性平板筛选阳性重组质粒。将所获得的阳性重组质粒分别接种于液体LB试管中，37℃230rpm培养12小时，以常用的碱解法提取质粒，分别进行BamHI和SalI的单、双酶切反应，通过凝胶电泳鉴别得到含有cry1Ah基因全长片段3.5kb的重组表达克隆pSXY422-1Ah，附图7中B为双酶切检测结果，其中3号为pSXY422空载体，4号为pSXY422-1Ah。

实施例4、Bt工程菌Biot1Ah的构建

将来自JM110的重组表达克隆pSXY422-1Ah用电激方法转化E.coli甲基化突变株SCS110，电激条件为：2500V，400Ω，25μF，100μL感受态细胞，1μL质粒DNA。37℃温浴1小时，100rpm；从SCS110中提取去甲基化的pSXY422-1Ah质粒。

制备Bt无晶体突变株HD-73-感受态，用电激转化方法将去甲基化的pSXY422-1Ah质粒导入其中。电激条件：2200V，1000Ω，25μF，100μL感受态细胞，1μL质粒DNA。30℃温浴2小时，100rpm；以25μg/mL Ery(红霉素)平板筛选阳性转化子。经过提取质粒、酶切分析、PCR扩增等分子检测，获得了含有pSXY422-1Ah表达质粒的Bt阳性转化子，将该转化子命名为工程菌Biot1A。

实施例5、Bt工程菌Biot1Ah的培养、观察和检测

活化工程菌Biot1Ah(30℃，12小时)；1％接种于1LGT培养基中，加入红霉素，终浓度为25μg/mL，30℃，230rpm，振荡培养20～48小时；在培养期间，每隔6小时取1mL培养液，进行蛋白表达的时空研究；同时培养出发菌株BT8，作为参照。取少量培养物进行光学显微镜检测，观察细胞裂解、芽孢的释放和晶体的形成。待40％的营养体细胞裂解时，停止培养，离心收集菌体，加入100mL 1M NaCl/10mM Tris·Cl(pH7.5)溶液洗涤2次，无菌水洗涤3次，以除去发酵次生代谢物和盐分，4℃，6,000rpm，离心10分钟(这些培养物可以-20℃保存备用)。取上述胞晶混合物进行扫描电镜的观察和记录。结果(附图13)显示，cry1Ah基因在Bt无晶体突变株HD-73-中能正常表达，形成cry1基因所特有的双锥体型晶体。

取上述胞晶混合物20mg，悬浮于100μL水中，加入25μL0.5N NaOH，25℃作用5分钟；加入65μL 3×样品缓冲液，100℃煮沸5分钟，离心去除沉淀；分别进行SDS-PAGE电泳检测，结果如附图11和12所示。图11表明：在出发菌株BT8中，130kD左右的蛋白自18小时能够被检测到，至36小时均能稳定存在和积累，晶体数量相应较多。而在工程菌Biot1Ah中，自24小时以后可以检测到134kDa的Cry1Ah蛋白(图12)，并随着培养时间延长而不断积累，能形成相当数量的稳定的双锥体状晶体(图13)，与天然菌株相同。连续继代和稀释涂板测定，结果表明工程菌遗传稳定性在98％以上。

实施例6、cry1Ah基因活性区2.0kb片段克隆、表达与检测

克隆：根据cryAh1基因从5’-段其始密码子ATG至2001bp处核苷酸序列，设计了一对分别含有BamHI和SalI酶切位点的特异性引物。PCR扩增条件为94℃1分钟，54℃ 1分钟，72℃2分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，反应用酶为pfu聚合酶。扩增获得2.0kbcry1Ah活性区片段(见附图8中第3、4样品)，经BamHI和SalI双酶切完全反应后，进行电泳，从凝胶中回收该片段，与经同样的酶切处理的E.coli表达载体pET21b进行连接反应，18℃4小时，取连接产物2μL转化E.coli受体菌BL21，以Amp抗性平板筛选阳性重组质粒。将所获得的阳性重组质粒接种于LB试管中37℃ 230rpm培养12小时，提取质粒，分别进行BamHI和SalI的单、双酶切反应，得到含有cry1Ah基因2.0kb片段的阳性克隆pET1Ah2，附图9为双酶切检测结果。

诱导表达：活化阳性克隆BL21(pET1Ah2)(37℃，12小时)；1％接种于1L LB培养基中，37℃，230rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，(约2小时)；加入诱导物IPTG，终浓度为0.7mM，150rpm，20℃低温诱导18小时；离心收集菌体，加入50mL 10mM Tris·Cl(pH8.0)悬浮；超声波破碎细胞壁(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5sec)，处理10分钟，反应控制在0℃；4℃，12,000rpm，离心10分钟；收集上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳检测。

SDS-PAGE电泳：对上述蛋白样品的处理：取100μL上清液，或包涵体沉淀悬浮于100μL 10mM Tris·Cl缓冲液中，分别加入50μL 3x样品缓冲液(25μL上样缓冲液+75μLβ-巯基乙醇)，100℃煮沸5分钟，离心除去沉淀；将样品依次加入浓缩胶中，4℃下电泳；完成染色、脱色和凝胶扫描和数据记录分析。在Cry1Ah活性区2.0kb表达产物为75kD，与预测结果一致。cry1Ah基因2001kb的部分核苷酸序列如SEQ ID NO 3，其编码的多肽即Cry1Ah的一半共667个氨基酸的序列如SEQ ID NO 4所示。

实施例7、Cry1Ah对几种害虫毒力测定

1.小菜蛾：采用甘蓝叶片称重后浸叶法，取100g新鲜叶片，Cry1Ah全长蛋白按不同样品稀释浓度浸叶10秒，取出后室温自然凉干，置于广口瓶中，每瓶接2龄幼虫20头，25℃，每日光∶暗为12∶12小时，设Cry1Ac等不同的Bt Cry蛋白作为对照，96小时调查结果。

2.棉铃虫、亚洲玉米螟、水稻二化螟生测采用一龄幼虫，将Cry1Ah全长蛋白样品按预试验结果设计适宜的浓度梯度，按10g人工饲料/mL蛋白样品比例均匀混合，分装于指形管、24孔板等器皿中25～26℃培养，96、120、168小时分别调查，计算LC₅₀。

3.大豆食心虫：将在田间捕到的三千头成虫(雌雄比接近1∶1)放入事先罩好网的大豆田(已接荚)内饲养，让其自然产卵，待孵化后1～2幼虫即用于生测。

以不同浓度的Bt Cry1Ah全长蛋白为样品进行测试。将青豆在稀释好的待测样品浸湿10秒钟，晾干，放入剥开的豆荚中，然后把该豆荚谢谢生测瓶中，每瓶接虫20头，每个处理重复3次，25℃培养24、48、96小时调查大豆食心虫死亡数。计算死亡率、校正死亡率。

Cry1Ah全长蛋白生物活性测定结果详见表2-表5。

表2 Cry1Ah蛋白对小菜蛾(Plutella.Xylostella)二龄幼虫杀虫活性

         浓度                                       正          LC₅₀

样品               试虫数       虫数       ％

         ug/ml                                      ％          ug/ml

CK                 60           2          3.33

         12.8      60           59         98.33    98.27

         6.4       60           55         91.67    91.38

                                                                1.39

         3.2       60           46         76.67    75.87

Cry1Ah                                                        (1.15-1.67)

         1.6       60           29         48.33    46.55

         0.8       60           18         30       27.59

         0.4       60           11         18.33    15.52

表3 Cry1Ah蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)一龄幼虫杀虫活性

         浓度               虫                  正             LC₅₀

样品               试虫

         ug/ml              数          ％      ％             ug/ml

CK                 48       0           0.00

         45        48       33          68.75   68.75

         12.8      48       28          58.33   58.33

                                                               6.06

         6.4       48       23          47.92   47.92

Cry1Ah                                                         (3.99-11.94)

         2.56      48       19          39.58   39.58

         1.6       48       14          29.17   29.17

         0.8       48       11          22.92   22.92

表4 Cry1Ah蛋白对二化螟(Chilo supperssalis)一龄幼虫杀虫活性

                                               正

         浓度                                                   LC₅₀

样品               试虫      虫数

         g/g                         ％                         g/g

                                               ％

CK                 50        2       4.00

         20        50        48      96.00     95.83

         10        50        42      84.00     83.33

                                                                0.904

         5         50        38      76.00     75.00

Cry1Ah                                                         (0.142-1.922)

         2         50        36      72.00     70.83

         1         50        31      62.00     60.42

         0.5       50        15      30.00     27.08

表5 Cry1Ah蛋白对玉米螟(Ostrina furnacalis)一龄幼虫杀虫活性

         浓度                        虫数      正               LC₅₀

样品               浓度      试虫

         ug/g                        ％        ％               ug/g

CK                 144       9       6.25                       0.05012

Cry1Ah   18        144       144     100.00    100.00           (0.024-0.096)

         5         144       143     99.31     99.26

         1         144       139     96.53     96.30

               0.1          144       93        64.58    62.22

               0.01         144       45        31.25    26.67

               0.005        144       10        6.94     0.74

根据上述各表结果可知，Cry1Ah对小菜蛾、棉铃虫、亚洲玉米螟、水稻二化螟均具有显著的杀虫活性，对四种测试害虫的LC₅₀数值分别低于几种已知的高毒力Bt杀虫蛋白。目前国际上所发现的对这四种害虫毒力最高的Bt Cry蛋白分别为：

小菜蛾，Cry1Ac(LC50＝1.85μg/ml)；棉铃虫，Cry1Ac(LC50＝12.26μg/ml；

亚洲玉米螟，Cry1Ac(LC50＝0.134μg/g)；水稻二化螟Cry1Ab(LC50＝1.81μg/g)。

由此可知本发明的Cry1Ah的毒力均强于这几种已知的杀虫蛋白。

以上结果均为Cry1Ah全长蛋白134kDa组分杀虫活性。

对于Cry1Ah活性区的研究表明，自起始密码子ATG至200lbp(如SEQ ID NO 3所示)共667个氨基酸的多肽片段(75kDa)(如SEQ ID NO 4所示)同样具有高毒力，是活性必需区段，对大豆食心虫、小菜蛾、棉铃虫和二化螟的毒杀作用与全长的Cry1Ah蛋白相当。此片段完全能用于抗虫转基因植物的构建。

实施例8、cry1Ah全长基因和2.0kb片段与其它Bt cry1基因同源性比较

同源比较的结果分别如下表6、7、8、9所示：

      表6 cry1Ah全长基因与其它Bt cry1A基因同源性比较

1Aa11Ag11Ab11Af11Ae11Ad11Ac11Ah

cry1Aa1100

cry1Ag188100

cry1Ab18288100

cry1Af1677279100

cry1Ae181879075100

cry1Ad17884837289100

cry1Ac1827878637770100

cry1Ah71616751645984100

表7 cry1Ah基因2kb片段与其它Bt cry1A基因同源性比较

1Ah 2kb1Ac 2kb1Ab 2kb1Af 2kb1Aa 2kb1Ag 2kb1Ad 2kb1Ae 2kb

1Ah2kb100

1Ac2kb84100

1Ab2kb7288100

1Af2kb718698100

1Aa2kb66809290100

1Ag2kb6478898895100

1Ad2kb677787869288100

1Ae2kb73849594898789100

         表8 Cry1Ah全长蛋白与其它Bt Cry1A蛋白同源性比较

Cry1Aa1Cry1Ag1Cry1Ad1Cry1Ab1Cry1Af1Cry1Ae1Cry1Ac1Cry1Ah

Cry1Aa1100

Cry1Ag194100

Cry1Ad19287100

Cry1Ab1908686100

Cry1Af167646375100

Cry1Ae19086899370100

Cry1Ac1848180866386100

Cry1Ah72697279567686100

表9 Cry1Ah 75kDa多肽与其它Bt Cry1A多肽同源性比较

1Aa2k1Ag2k1Ad2k1Ab2k1Ac2k1Ah2k1Ae2k1Af2k

1Aa2k100

1Ag2k93100

1Ad2k9287100

1Ab2k908685100

1Ac2k76737284100

1Ah2k5957616782100

1Ae2k888486958267100

1Af2k888486958267100100

同源比较结果表明，cry1Ah全长基因和2kb片段与cry1Ac全长基因核苷酸同源性最高，达到84％(表6，7)；Cry1Ah蛋白与Cry1Ac蛋白氨基酸同源性为86％(见表8)；而Cry1Ah74kDa多肽与Cry1Ac蛋白氨基酸同源性则为82％(见表9)，与其它Cry1A蛋白的同源性均低于此值，例如与Cry1Ab同源性为67％，与Cry1Aa同源性为59％。

附图14-图17分别为cry1Ah全长基因与其它cry1类基因核苷酸序列、cry1Ah 2.0kb基因与其它cry1类基因相同长度核苷酸序列、Cry1Ah蛋白与其它Cry1类蛋白全长氨基酸序列、Cry1Ah蛋白与其它Cry1类蛋白N-末端667个氨基酸序列的同源进化树。无论是从核苷酸序列还是从氨基酸序列的分析比对，也无论是全长还是半长，cry1Ah(Cry1Ah)与cry1Ac(Cry1Ac)、cry1Ab(Cry1Ab)、cry1Ae(Cry1Ae)、cry1Ad(Cry1Ad)和cry1Af(Cry1Af)的遗传距离较近；但是在生物活性上却相差较大。

因此可得知，若选用cry1Ah半长基因(2001kb，SEQ ID NO 3)作为转基因抗虫植物的研制材料，能够更为有效地克服目前基因同源性高、种类单一的问题，同时可望获得抗虫性能更好的工程植物。

附：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列

SEQ ID NO 1(cry1Ah基因的核苷酸序列)

atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat     60

tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc    120

gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct    180

ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga    240

ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa    300

gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa    360

ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa    420

gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact    480

tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca    540

gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg    600

caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg    660

attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg    720

ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact    780

gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca    840

gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt    900

tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata    960

cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat   1020

caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga   1080

accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat   1140

agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa   1200

ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct   1260

gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac   1320

gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc   1380

tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct   1440

gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac   1500

tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga   1560

ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc   1620

ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac   1680

ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg   1740

tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca   1800

tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata   1860

gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga   1920

gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat   1980

gtaacggatt atcatattga tcaagtgtcc aatttagtta cgtgtttatc ggatgaattt   2040

tgtctggatg aaaagcgaga attgtccgag aaagtcaaac atgcgaagcg actcagtgat   2100

gaacgcaatt tactccaaga ttcaaatttc aaagacatta ataggcaacc agaacgtggg   2160

tggggcggaa gtacagggat taccatccaa ggagtggatg acgtatttaa agaaaattac   2220

gtcacactat caggtacctt tgatgagtgc tatccaacat atttgtatca aaaaatcgat   2280

gaatcaaaat taaaagcctt tacccgttat caattaagag ggtacatcga agatagtcaa   2340

gatttagaag tttatttgat ccgttacaat gcaaaacacg aaacgttaaa cgtgccaggt   2400

acgggttcct tatggccact tgcagttaaa agtccaattg gaaggtgcgg tgaaccgaat    2460

cgatgtgcac atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgtaggatg tacagactta    2520

aatgaggatt taggcgtatg ggtgatattc aagattaaga cacaagatgg ccatgcgaaa    2580

ataggaaatc tagaatttct cgaagagaag cttttattag gagaagcatt agcacgtgtg    2640

aagaaagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgcgaaaaat tggaatggga aacaaatatt    2700

gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttattcg tagattctca atataataga    2760

ttacaaacgg atacgaacat tgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatcgaatc    2820

cgagaagcgt atttgccaga gttatctgtg attccgggtg tcaatgcggc tattttcgaa    2880

gaattagaag gtcttatttt caccgcattc tccctatatg atgcgagaaa tgtcattaaa    2940

aacggagatt tcaattatgg tttatcatgc tggaatgtga aagggcatgt agatgtagaa    3000

gaacaaaaca accaccgttc cgtccttgtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcccaa    3060

gaagttcgtg tctgtccagg tcgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga    3120

tatggagagg gctgcgtaac gatccatgag atcgaagaca atacagacga actgaaattc    3180

agcaactgtg tagaagagga agtatatcca aacaacacgg taacgtgtaa tgattatact    3240

gcgactcaag aagaatatga gggtacgtac acttctcgta atcgaggata tgacggagcc    3300

tatgaaagca attcttctgt accagctgat tatgcatcag cctatgaaga aaaagcgtat    3360

acagatggac gaagagacaa tccttgtgaa tctaacagag gatataggga ttacacacca    3420

ctaccagctg gctatgtgac aaaagaatta gagtacttcc cagaaaccga taaggtatgg    3480

attgagatcg gagaaacgga aggaacattc attgtggata gcgtggaatt actccttatg    3540

gaggaatag                                                            3549

SEQ ID NO 2(cry1Ah基因编码的蛋白质序列)：

MKNSIKLSEL WYFNERKWRY FMEIVNNQNQ CVPYNCLNNP EIEILEGGRI SVGNTPIDIS     60

LSLTQFLLSE FVPGAGFVLG LIDLIWGFVG PSQWDAFLAQ VEQLINQRIA EAVRNTAIQE    120

LEGMARVYRT YATAFAEWEK APDDPELREA LRTQFTATET YISGRISVLK IQTFEVQLLS    180

VFAQAANLHL SLLRDVVFFG QRWGFSTTTV NNYYNDLTEG ISTYTDYAVR WYNTGLERVW    240

GPDSRDWVRY NQFRRELTLT VLDIVALFPN YDSRRYPIRT VSQLTREIYT NPVLENFDGS    300

FRGSAQGIER SIRSPHLMDI LNSITIYTDA HRGYYYWSGH QIMASPVGFS GPEFTFPLYG    360

TMGNAAPQQR IVAQLGQGVY RTLSSTFYRR PFNIGINNQQ LSVLDGTEFA YGTSSNLPSA    420

VYRKSGTVDS LDEIPPQNNN VPPRQGFSHR LSHVSMFRSG SSSSVSIIRA PMFSWIHRSA    480

EFNNIIASDS ITQIPAVKGN FLFNGSVISG PGFTGGDLVR LNSSGNNIQN RGYIEVPIHF    540

PSTSTRYRVR VRYASVTPIH LNVNWGNSSI FSNTVPATAT SLDNLQSSDF GYFESANAFT    600

SSLGNIVGVR NFSGTAGVII DRFEFIPVTA TLEAEYNLER AQKAVNALFT STNQLGLKTN    660

VTDYHIDQVS NLVTCLSDEF CLDEKRELSE KVKHAKRLSD ERNLLQDSNF KDINRQPERG    720

WGGSTGITIQ GVDDVFKENY VTLSGTFDEC YPTYLYQKID ESKLKAFTRY QLRGYIEDSQ    780

DLEVYLIRYN AKHETLNVPG TGSLWPLAVK SPIGRCGEPN RCAHHSHHFS LDIDVGCTDL    840

NEDLGVWVIF KIKTQDGHAK IGNLEFLEEK LLLGEALARV KKAEKKWRDK REKLEWETNI    900

VYKEAKESVD ALFVDSQYNR LQTDTNIAMI HAADKRVHRI REAYLPELSV IPGVNAAIFE    960

ELEGLIFTAF SLYDARNVIK NGDFNYGLSC WNVKGHVDVE EQNNHRSVLV IPEWEAEVSQ    1020

EVRVCPGRGY ILRVTAYKEG YGEGCVTIHE IEDNTDELKF SNCVEEEVYP NNTVTCNDYT    1080

ATQEEYEGTY TSRNRGYDGA YESNSSVPAD YASAYEEKAY TDGRRDNPCE SNRGYRDYTP    1140

LPAGYVTKEL EYFPETDKVW IEIGETEGTF IVDSVELLLM EE                       1182

SEQ ID NO 3(cry1Ah2k基因核苷酸序列)

atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat     60

tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc    120

gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct    180

ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga    240

ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa    300

gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa    360

ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa    420

gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact    480

tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca    540

gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg    600

caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg    660

attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg    720

ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact    780

gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca    840

gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt    900

tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata    960

cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat   1020

caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga   1080

accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat   1140

agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa   1200

ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct   1260

gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac   1320

gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc   1380

tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct   1440

gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac   1500

tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga   1560

ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc   1620

ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac   1680

ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg   1740

tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca   1800

tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata   1860

gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga   1920

gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat   1980

gtaacggatt atcatattga t                                             2001

SEQ ID NO4(crylAh2kb基因编码的蛋白的氨基酸序列)

MKNSIKLSEL WYFNERKWRY FMEIVNNQNQ CVPYNCLNNP EIEILEGGRI SVGNTPIDIS     60

LSLTQFLLSE FVPGAGFVLG LIDLIWGFVG PSQWDAFLAQ VEQLINQRIA EAVRNTAIQE    120

LEGMARVYRT YATAFAEWEK APDDPELREA LRTQFTATET YISGRISVLK IQTFEVQLLS    180

VFAQAANLHL SLLRDVVFFG QRWGFSTTTV NNYYNDLTEG ISTYTDYAVR WYNTGLERVW    240

GPDSRDWVRY NQFRRELTLT VLDIVALFPN YDSRRYPIRT VSQLTREIYT NPVLENFDGS    300

FRGSAQGIER SIRSPHLMDI LNSITIYTDA HRGYYYWSGH QIMASPVGFS GPEFTFPLYG    360

TMGNAAPQQR IVAQLGQGVY RTLSSTFYRR PFNIGINNQQ LSVLDGTEFA YGTSSNLPSA    420

VYRKSGTVDS LDEIPPQNNN VPPRQGFSHR LSHVSMFRSG SSSSVSIIRA PMFSWIHRSA    480

EFNNIIASDS ITQIPAVKGN FLFNGSVISG PGFTGGDLVR LNSSGNNIQN RGYIEVPIHF    540

PSTSTRYRVR VRYASVTPIH LNVNWGNSSI FSNTVPATAT SLDNLQSSDF GYFESANAFT    600

SSLGNIVGVR NFSGTAGVII DRFEFIPVTA TLEAEYNLER AQKAVNALFT STNQLGLKTN    660

VTDYHID                                                              667

Claims (8)

1.一种对昆虫具有毒性的Bt crylAh基因，其特征是该基因具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。

2.一种对昆虫具有毒性的蛋白质，其特征是该蛋白质是由权利要求1的基因所编码，且具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求1的Bt crylAh基因的部分序列，其特征是该部分序列具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。

4.一种对昆虫具有毒性的多肽，其特征是该多肽是由权利要求3的部分序列所编码，且具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。

5.一种转化微生物或植物的方法，其特征是该方法应用权利要求1的crylAh基因。

6.权利要求5的方法在转化微生物或植物使之表现出对昆虫的毒性并克服或延缓昆虫抗药性产生中的应用。

7.一种转化微生物或植物的方法，其特征是该方法应用权利要求3的crylAh基因的部分序列。

8.权利要求7的方法在转化微生物或植物使之表现出对昆虫的毒性并克服或延缓昆虫抗药性产生中的应用。

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