CN1037538A

CN1037538A - 新型化合物

Info

Publication number: CN1037538A
Application number: CN89101863A
Authority: CN
Inventors: 辛迪·卢·杰利斯; 詹姆斯·罗伯特·鲁希; 丹利尔·帕克·韦特
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1988-02-25
Filing date: 1989-02-24
Publication date: 1989-11-29
Also published as: IL89391A0; IL89391A; DE3905865A1; DK84589D0; PL277925A1; FR2627778B1; GB8904016D0; ZA891463B; NL8900481A; DK84589A; IE890589L; AU616945B2; AU3029789A; BE1001877A4; BR8900881A; PT89812A; HUT50507A; GB2216127B; HU209148B; MY104405A

Abstract

突变的苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白，表现出野生型δ-内毒素具有的杀虫活性特征。表明在每个单突变点上，可用编码其他任何天然氨基酸的密码进行置换以产生活性内毒素蛋白。还描述了编码这种内毒素的DNA顺序及生产具杀虫活性的突变内毒素的重组技术。

Description

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种能产生孢子的细菌，它在无性生长阶段的末期产生一种蛋白晶体δ-内毒素。此内毒素由某些昆虫吞食后产生毒性效应，包括停止进食、胃肠功能失常、脱水并最终导致死亡。δ-内毒素通常是由一质粒来源产生的一种无活性的前体或前毒素，分子量为130，000-140，000道尔顿（Calabrese，Canad，J.Microbiol.26∶1006，1980）。此分子在昆虫肠道内，通常由于肠道蛋白酶的水解作用而被切除掉C-端的大约一半，可能还切掉N-端的若干氨基酸，而这正是产生分子量为65，000-70，000道尔顿的活性毒素所必须的（Tyrell等，J.Bacteriol.145∶1052，1981）。

已经鉴定了苏云金芽孢杆菌的大量亚种。虽然其中的大部分对于鳞翅目昆虫具有更大的特异性或增强的毒性，但也有一部分表现出对于其他类昆虫的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌以色列亚种（B.t.israelensis）具有针对双翅目幼虫（蚊子和墨蚊）的毒性，最近还证明，另外两个亚种具有针对鞘翅目幼虫的毒性（Hofte等，Nuc.Acid.Res.15（17）：7183，1987）。

虽然已做了大量工作以生产活性毒素及其结构基团，但对于苏云金芽孢杆菌δ-内毒素顺序中的活性或毒性部分抵抗点突变的能力，以及这种突变对于毒素分子活性的影响，人们了解得似乎比较少。

本发明的目的之一是在苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的活性部分提供新的突变种。

本发明的进一步的目的是产生这样的突变：它们能有效地使截断的和完整长度的δ-内毒素两种形式都产生类似苏云金芽孢杆菌内毒素的活性。

本发明的另一目的是提供能增强苏云金芽孢杆菌δ-内毒素杀虫活性的突变。

根据本发明，我们使成百上千的DNA链随机产生了单个和多个点突变，这些DNA链编码典型的具有鳞翅目杀虫活性的苏云金芽孢子杆菌内毒素活性部分的一大段，然后通过重组技术分离并产生了若干突变的苏云金芽孢杆菌内毒素，它们表现出野生型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素所具有的针对鳞翅目的杀虫活性特征。而且还表明，在这些被发现的突变点处，能够置换编码任何其他天然氨基酸的密码以产生活性内毒素蛋白。还发现一些随机突变产生更强的杀虫活性。这种活性可以根据后面所述的方法加以证明，例如美洲菸夜蛾（Heliothisvirescens）检测法或粉蚊夜蛾（Trichoplusia ni）检测法，在许多情况下，这种增强非常显著，其活性比母体内毒素结构至少高出两倍或更多倍。还分别对多突变（每条突变的DNA链通常2或3个氨基酸）单独及以不同组合进行了评价，以鉴别出那些更有效的突变及其组合。除了一个例子以外，还发现本发明的突变都存在于在大量野生型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素中高度保守的氨基酸顺序内，因此表明是本发明提供的突变作用具有广泛的适用性，它能用于大量在这种保守区域内提供了具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌内毒素的内毒素结构。

更具体地说，参考表A的氨基酸顺序及其编号（见后面，始于1位的甲硫氨酸（MET），它也是表A所示的具有代表性的鳞翅目活性内毒素的正常N-端），发现苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白如果在其活性部分含有与表A所示的116个氨基酸残基顺序（90-205位，包括两头，也就是m-1至m-116位氨基酸）相同或基本同源的氨基酸残基顺序，则它们虽然具有如天然苏云金芽孢杆菌内毒素那样的针对鳞翅目昆虫的杀虫活性，但它们可在指出的或等同的同源位置具有下述一个或多个氨基酸残基（括号内的m位号码是针对所述的116氨基酸残基顺序而言）：a）在94位（所述116氨基酸顺序的m-5位），由遗传密码编码的除Asn外的任何天然氨基酸;b）在95位（所述116氨基酸顺序的m-6位），除了Gln外的任何这种天然氨基酸;c）在101位（所述116氨基酸顺序的m-12位），除Glu外的任何这种天然氨基酸;d）在105位（所述116氨基酸顺序的m-16位），除Asn外的任何这种天然氨基酸;e）在116位（所述116残基顺序的m-27位），除Glu外的任何这种天然氨基酸;f）在119位（所述116残基顺序的m-30位），除Ala外的任何这种天然氨基酸;g）在122位（所述116残基顺序的m-33位），除Thr外的任何这种天然氨基酸;h┰?23位（所述116残基顺序的m-34位），除Asn外的任何这种天然氨基酸;i）在125位（所述116残基顺序的m-36位），除Ala外的任何这种天然氨基酸;j）在130位（所述116残基顺序的m-41位），除Met外的任何这种天然氨基酸;k）在184位（所述116残基顺序的m-95位），除Phe外的任何这种天然氨基酸;l）在187位（所述116残基顺序的m-98位），除Ala外的任何这种天然氨基酸;m）在188位（所述116残基顺序的m-99位），除Thr外的任何这种天然氨基酸;n）在194位（所述116残基顺序的m-105位），除Asn外的任何这种天然氨基酸;以及o）在201位（所述116残基顺序的m-112位），除Gly外的任何这种天然氨基酸。

此外，同样参考表A所示的氨基酸残基顺序的号码，本发明还包括将第4位的氨基酸Asn变成由遗传密码编码的任何其他的天然氨基酸。

对于在所述的116残基顺序中本发明提供的氨基酸残基来说，根据本发明，优选在所指出的位置具有下述一个或多个氨基酸的顺序（同样参考表A所示的完整的成熟顺序，还参考这种116残基顺序）：a）94位是Lys（116残基顺序的5位）;b）95位是Lys（116残基顺序的6位）;c）101位是Lys（116残基顺序的12位）;d）105位是Tyr（116残基顺序的16位）;e）116位是Lys或Arg，更优选Arg（所述116残基顺序的27位）;f）119位是Thr（所述116残基顺序的30位）;g）122位是Ile（所述116残基顺序的33位）;h）123位是Tyr（所述116残基顺序的34位）;i）125位是Val（所述116残基顺序的36位）;j）130位是Ile（所述116残基顺序的41位）;k）184位是Ile（所述116残基顺序的95位）;l）187位是Thr（所述116残基顺序的98位）;m）188位是Ser（所述116残基顺序的99位）;n）194位是Lys（所述116残基顺序的105位）;以及o）201位是Asp（所述116残基顺序的112位）。

如果要改变第4位氨基酸Asn，优选将它变成Tyr。

表A靠近本说明书的末尾，它给出了与苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的天然生产有关的核苷酸顺序及因此推测出的氨基酸顺序。除了一个例外以外，此核苷酸顺序是得自苏云金芽孢杆菌武汉亚种（B.t.wuhanensis）中产生δ-内毒素的质粒。具体地说，完整的结构基因（实际编码内毒素本身）是来自苏云金芽孢杆菌武汉亚种，一个例外是在结构基因开始处的甲硫氨酸（Met）之前的顺序是来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种（B.t.kurstaki）HD-1中的产生内毒素的基因（HD-1的所谓5.3kb Hind Ⅲ类质粒），此上游顺序含有来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1中产生内毒素质粒的天然的核糖体结合位上（RBS）。苏云金芽孢杆菌武汉亚种中含有核糖体结合位点的上游顺序与表A所示库斯塔亚种的差别很小，本文后面指出了这种差异。但应当记住，从内毒素顺序起始处直至其完整的活性部分以及至少直至表A指出的Kpn Ⅰ位点处（所述Kpn Ⅰ位点在前毒素部分中），苏云金芽孢杆菌武汉亚种和库斯塔亚种HD-1的结构基因的核苷酸顺序及氨基酸顺序都是一致的。因此，昆虫吞食并切割后产生的活性毒素部分对于苏云金芽孢杆菌武汉亚种和库斯塔亚种HD-1的内毒素来说都是相同的。在表A中，由结构基因的表达而产生的内毒素蛋白的氨基酸，在氨基酸下面的括号中用1至1181的正数编号。1-Met上游非转译区的氨基酸用反向或朝上游方向的负数编号（终止信号作为一个氨基酸位置计数）。结构基因的核苷酸在横线上方计数（不用括号），数目中的最后一位数位于所指核苷酸的上方。包括核糖体结合位点在内的非转译区核苷酸从起始ATG密码（编码1-Met）起用负数反向编号。在编号的顺序之内，在其一部分的上方另外用m-1至m-116对氨基酸编号，用n-1至n-348对编码这些氨基酸的核苷酸编号，用它们更具体地指出一个高度保守的区域，本发明提供的大多数突变都位于其中。与表A中的核苷酸顺序相关的某些限制性位点用线条在限制性位点所涉及的核苷酸上方标出，并用脚注形式指明具体的位点。表A所示的内毒素中由本领域公认的毒素部分所涉及的氨基酸顺序始于第一位氨基酸（Met），延伸至第610位氨基酸（Thr）。从表A所示的完整DNA顺序的本质出发，并为了更易于理解下面的说明，应当指出，自表A的第一行非转译部分的DNA和氨基酸顺序起直至大约第724-725位氨基酸处的Kpn Ⅰ位点止，及其中的部分，能够并也被本文称为是来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1（5.3kb的Hind Ⅲ类质粒）。

图1是本发明不同阶段使用的普通型工作质粒prAK和prAK-3的图谱，它包括编码截断的苏云金芽孢杆菌内毒素的DNA，此DNA来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1，并具有针对鳞翅目的杀虫活性。

图2是质粒pB8rⅡ的图谱，它包括编码截断的苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白的DNA，其长度比prAK所编码的略长一些，也是来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1，并也具有针对鳞翅目的杀虫活性。

图3a和3b是两条具有代表性的双链DNA，它们可以合成制备，用来进行所谓的密码旋转实验，还可用来在苏云金芽孢杆菌内毒素DNA编码顺序中方便地导入所需要的突变。

图4是质粒pBT210的图谱，它包括编码苏云金芽孢杆菌武汉亚种的完整长度的天然内毒素的DNA，此内毒素活性部分的氨基酸顺序与prAK和pB8rⅡ编码的苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1的内毒素一致。

图5是质粒prAK-9的简化图谱及其一部分的扩大，所述的prAK-9与质粒prAK-3在其它方面非常相似，母体质粒中的所述部分及其亚部分能方便地用来进行密码旋转实验，并能如本发明提供的那样导入突变作用。

在大肠杆菌JM103中的质粒prAK于1988年2月19日保藏于农业研究培养物收集中心（NRRL，Peoria，Illinois），保藏号为NRRL B-18329。

在大肠杆菌JM103中的质粒pB8rⅡ于1988年2月19日保藏于农业研究培养物收集中心（NRRL，Peoria，Illinois），保藏号为NRRL B-18331。

在大肠杆菌JM103中的质粒pBT210于1988年2月19日保藏于农业研究培养物收集中心（NRRL，Peoria，Illinois），保藏号为NRRL B-18330。

正如已基本指出的那样，本发明的点突变可应用于苏云金芽孢杆菌亚种和亚型产生的内毒素蛋白顺序，这些顺序如果含有上面所示的116个氨基酸的保守顺序，或含有与其高度同源或基本上是等同的顺序，则这些顺序具有针对鳞翅目幼虫的杀虫活性，包括天然的完整长度型或基本上是完整长度的内毒素蛋白顺序，通过去除所有或部分前毒素下游片段或其无活性的部分而截短的顺序，甚至包括那些可由正常的C-端上游反向至内毒素活性部分截短的顺序。已经清楚地知道，苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种和武汉亚种的内毒素都具有相同的116氨基酸的保守区，而其它亚种则已经或能够期望也具有相同的116氨基酸顺序或与其大部分同源的等同物。例如，苏云金芽孢杆菌猝倒亚种（B.t.sotto）、库斯塔亚种HD-73（菌株）和蜡螟亚种（B.t.Galleriae）已知能产生具有相同的116氨基酸顺序的内毒素，尽管如此，其中有些在内毒素毒性部分的剩余部分和前毒素部分两方面仍至少有一定程度的区别，某些时候甚至差别显著。另外一些，例如苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1Dipel（一种商业化亚株），在所述116氨基酸顺序中有一个氨基酸被改变（m-59是由TTG编码的Leu），在其它顺序中还有其它的改变/缺失/增加。这种和其他的具有单个或多个变化但与所述116氨基酸顺序至少有大约70%的氨基酸同源度的顺序，可具有一个或多个本发明做出的氨基酸突变，使之突变的氨基酸与所述116氨基酸的未突变顺序中的相应氨基酸一致，这种突变在下述条件下尤其有利：即待改变的氨基酸两侧有2个，更好是4个其它的氨基酸与116氨基酸顺序中的相应氨基酸一致。本发明的突变作用还可在同源系列的相应氨基酸中进行，这些系列基本上都含有缺失或增加，使得顺序本身比所述116氨基酸顺序更长或更短。在这种情况下，用作参考的116氨基酸顺序的编号仍可保留，因为存在于顺序中的待改变的缺失可像它们实际存在一样计数，而顺序中有待改变的增加只需不计数便可。因此，在这种同源顺序中，可以说氨基酸位置的分配是独立于缺失或增加的。

将用本发明的突变作用置换的同源氨基酸顺序优选这种顺序：此顺序是由这样一种DNA编码的，此DNA在严格的杂交条件下，将与表A中始于n-1位直至n-348位DNA的有义或反义链（或双链）之一杂交，前提是待突变的同源顺序的氨基酸对应于116氨基酸的参考顺序，并如参考顺序中的对应氨基酸一样由相同的密码编码。制备这种标记的杂交探针的方法是本领域内众所周知的。严格的杂交条件即使杂交作用于60℃在2.5X柠檬酸盐缓冲液（SSC）中进行，然后于37℃用低浓度的缓冲液洗涤，它将不会影响所发生的杂交作用。

最好是，突变作用在这样的氨基酸顺序中进行，它与116氨基酸参考顺序的差别不多于1、2或3个氨基酸，最优选的是与参考顺序相同的顺序。

在本领域内已经清楚地知道，116氨基酸的参考顺序可能形成一种具有大量修饰的或不同的内毒素蛋白顺序，它具有针对鳞翅目幼虫的杀虫活性，此参考顺序之外的其它修饰将一定会被揭示出来，成为本领域的知识。因此，邻接所需的突变部分（它类似于116氨基酸的参考部分）的顺序可能有相当程度的差别，它们只需足以提供具有杀虫活性的内毒素蛋白就行。例如检测其对于美洲菸夜蛾的杀虫活性。因此，突变部分上游的氨基酸顺序可以缩短或伸长，或它自己也相对于表A所示的顺序发生突变，但通常以甲硫氨酸作为起始，并最优选与表A所示的顺序高度同源（70%）或完全一致，但很显然，这种顺序也可以选择性地含有本发明在4位提供的优选突变。与此相似，所需的突变顺序的下游部分可以广泛不同，可以相对于表A所示的剩余部分（直至其在昆虫肠道中的切割点）缩短或伸长，当然也可以进一步延伸或不延伸，以形成一种前毒素或无活性的部分，它在昆虫肠道中切除后将提供一种具有杀虫活性的毒素蛋白。

将含有本发明提供的突变内毒素编码顺序的DNA置于合适的调控顺序的控制下，并掺入质粒中形成表达载体，将此载体转化或转染至细胞中生产内毒素。通过这种重组技术生产内毒素与（例如）用这种技术生产药物不同，很少或不涉及为纯化内毒素而设计的进一步处理。可将产生它的细胞溶解，但过去商业化生产苏云金芽孢杆菌内毒素的特点一直是简单地应用成品生产中的培养物或发酵体系的所有内容物，使用前通常只是通过常规方法进行干燥，例如本领域公知的低温喷雾干燥法。根据产品的不同，可根据公知技术加入各种物质以提高产品稳定性，同样根据公知技术，如果发酵体系中存在的蛋白物质数量不够，则可使之分别与（例如）大豆粉或脱脂大豆粉混合以提高其稳定性。

虽然利用生物技术可在大量转化或转染的细胞体系中生产内毒素，但一般优选转化或转染革兰氏阴性或阳性的细菌细胞。一种优选的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌，在生物技术领域，关于此细菌已得到了相当多的经验，并已知和能够得到大量的质粒和表达载体转移系统，它们都适用于大肠杆菌并能在其中行使功能。英光假单胞菌代表了另一类型的革兰氏阴性细菌，在其中已掺入过携带内毒素顺序的质粒。正如本文所指明的，产生内毒素的基因可以含有调控顺序，具体说例如核糖体结合位点顺序，它们被掺入基本上是异源的细菌细胞（如大肠杆菌）中后仍具有其在苏云金芽孢杆菌中的原点。由于芽孢杆菌型细菌提供的环境与本发明的突变内毒素更为相近，因此，用含有编码本发明突变内毒素的DNA的表达载体转化或转染芽孢杆菌型细菌是尤其落在本发明范围之内的，并是本发明所期望的。特别感兴趣的是这种芽孢杆菌细胞的例子有苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）和枯草芽孢杆菌。最近，发现了一个得到极大改进的转化芽孢杆菌细胞（尤其是苏云金芽孢杆菌细胞）的方法，参见待批的8729726号英国专利申请。适于此转化方法的细胞类型包括cry^-型，例如已知的苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种cryB细胞（此细胞无质粒），以及野生型芽孢杆菌细胞如天然的携有产生内毒素质粒的苏云金芽孢杆菌细胞。适于掺入芽孢杆菌细胞（例如苏云金芽孢杆菌细胞）的质粒已知有（例如）质粒pBC16.1（Kreft等，Molec，Gen.Genet.162∶59，1978）及其母体质粒，它们可以直接或通过常规的重组技术修饰后用来携带本发明突变内毒素的编码顺序。正如本领域内众所周知的那样，芽孢杆菌的特点是只在孢子形成期产生需要量的内毒素，因此使其生长到此阶段以获得最多的可用作杀虫剂的产物。因此，本发明提供的携有突变内毒素DNA的质粒或表达载体，可掺入不含产生内毒素质粒的或已经含有一个或多个这种质粒的芽孢杆菌细胞中，虽然本发明的突变内毒素的特点是具有针对鳞翅目的活性，但也可能具有针对其他类昆虫的内毒素活性，因为在突变之前的母体内毒素中就可能存在这些活性，或由于其他的顺序改变而产生这些活性，在所有情况下，用本发明的鳞翅目毒性内毒素产生质粒转化芽孢杆菌细胞（如果这种细胞携带的内毒素质粒对鳞翅目基本上无效）都在本发明的范围内，从而在孢子形成期产生提供广谱杀虫活性的结合内毒素。例如，携带突变内毒素编码顺序的质粒可用来转化苏云金芽孢杆菌以色列亚种或B.t.tenebrionis，它们基本上都不具针对鳞翅目的活性。

虽然已经参考截断的和完整长度的天然型内毒素蛋白说明了本发明，但如上述应用突变内毒素直接作为杀虫剂时，一般还是优选采用或生产更完整长度的顺序，它们至少在达到内毒素蛋白折迭能力的机会方面与天然型相同或相似，或具有改善的完整长度的折迭效应。

本发明的突变的DNA顺序还能插入植物基团组中。在这种情况下，优选使用截断型的突变顺序，但更完整长度的顺序也可适用。可利用任何合适的方法将内毒素顺序掺入宿主植物基因组，例如通过根癌农杆菌的Ti质粒、电穿孔、电转化、显微注射、病毒转染或利用化学试剂诱导或提高游离DNA的吸收等等。这些方法及其在植物转化中的应用对于本领域专业人员是众所周知的。编码突变内毒素的DNA顺序最好与合适的调控顺序连接，例如，能在植物中发挥功能的操纵基因和3′调控顺序，将此整体掺入表达型载体中。这种植物细胞的转化作用，及随后的细胞发育至完整植株的再生，使得突变内毒素的DNA顺序成为植物基因组的稳定和永久部分，因此，它通过有丝分裂和减数分裂从一代传至下一代，在表达后产生具有昆虫毒性的蛋白，赋予植物以可遗传的昆虫抗性。

在我们的工作中使用两种非常相似的载体（prAK和prAK-3），作为苏云金芽孢杆菌δ-内毒素顺序的来源以进行突变，并提供苏云金芽孢杆菌内毒素突变体生产和评价的载体。质粒prAK和prAK-3示于图1中。图中出示了prAK的有关细节，并指出了prAK-3中存在的与它相比较的次要差别。质粒PrAK和prAK-3基本上是完全适于大肠杆菌的表达载体，每种都包括一个氨苄青霉素抗性基团、一个复制原点和操纵基团顺序，包括一个大肠杆菌启动子。正如图1中的粗黑线和黑框所标明，载体prAK包括一个野生型苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1菌株的DNA顺序，此顺序与启动子位于正确定向的解读框中。粗黑线代表已缩短的成熟顺序，它编码截断的天然苏云金芽孢杆菌δ-内毒素，从表A中的第1位氨基酸（Met）延伸至第610位（Thr），以及进一步延伸至前毒素部分，直至末端的第723位氨基酸（Leu）。在所述粗黑线的下游末端，即图1中用空心粗框所示的一小部分，代表54碱基的短DNA顺序，它紧跟在编码723-Leu的三联体之后，它本身的后面也紧接着一个终止信号。所有这一段57碱基的延伸顺序（包括终止信号）具有其在众所周知的质粒pBR322中的原点，它被用来构建prAK。因此，表达载体prAK在大肠杆菌中基本上编码并产生一种截短的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素融合蛋白，总共有741个氨基酸，由天然的前毒素部分的610个氨基酸和具有pBR322中原点的18个氨基酸组成。这种截短的苏云金芽孢杆菌内毒素融合蛋白具有很强的杀虫活性，并用来评价本发明所产生的突变体。此活性与完全截距的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素蛋白（只有活化毒素的610个氨基酸，表A中的第1-610氨基酸）基本上无法辨别。

在图1中，代表编码截短的苏云金芽孢杆菌内毒素融合蛋白大部分顺序的粗黑线，其上游末端与一粗黑框相连，它代表的顺序中包括一个苏云金芽孢杆菌核糖体结合位点（RBS）。含有RBS的这一部分（也示于表A中，第1和2行）的起始处上游大约47核苷酸处有一个Bam HI位点（图1中由箭头标出）。它是在质粒中的这一部分与大肠杆菌启动子相连之前插入的。启动子和RBS以正确的解读定向与内毒素的编码顺序相连。因此，粗黑线和黑框共同代表具有苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1中原点的DNA。

图1中所示的各种其它限制位点与DNA片段的去除和再插入的常规战略有关，而这是突变实验需要的。这些其它的限制位点有Nsi Ⅰ位点（在内毒素编码顺序起始处后面大约只有26核苷酸处），两个Xba Ⅰ位点（参见下面，但与prAK-3有关）、Sst Ⅰ位点和Hind Ⅲ位点。

正如上述，prAK-3与prAK仅在一个次要方面有差别。此差别是，表A中292-297位核苷酸处的Xba Ⅰ位点（TCTAGA），通过常规技术被变为TCG CGA，从而变成了一个Nru Ⅰ位点。此变化没有导致所编码的氨基酸顺序变化。在后面实例1的步骤a）中给出了prAK-3的制备方法。prAK-3在制备其他质粒prAK-7和prAK-9中还是第一中间体。

通过常规方法，例如Craick所述的方法（Biotechniques Jan/Feb 1985，12-19页：“用于位点专一性诱变的寡核苷酸”），从prAK和prAK-3的不同长度的单链DNA片段（有义及反义链）中突变产生DNA片段，为方便起见，此处将它们称为M-1和M-2，M-1是指prAK中两个Xba Ⅰ位点之间的375碱基对片段，M-2是指prAK-3中Bam HI和Xba Ⅰ位点之间的片段（如图1所示）。

本发明中两个Xba Ⅰ位点之间的突变可很容易地使用本文公开的质粒prAK-7、prAK-8或prAK-9得到，以及使用合成的双链寡核苷酸得到，此寡核苷酸的构建和使用与本文中实例2所述方法类似。

在突变以后，通过常规方法使突变的单链片段变为双链。对于M-1突变体来说，使用prAK作为突变载体，得到的双链突变质粒转化至大肠杆菌JM103中，在含有50μg/ml氨苄青霉素的YT琼脂上进行平板培养，保温过夜后得到大量集落，在它们相同的prAK质粒中具有大量的不同突变。

对于M-2突变体来说，用限制性核酸内切酶Bam HI和Xba Ⅰ分别从突变载体中切下Bam HI和Xba Ⅰ位点之间的突变的双链区域，然后与用同样这两种酶消化过的prAK-3载体连接。得到的含有M-2突变区的prAK-3质粒转化至大肠杆菌JM103中，在含有50μg/ml氨苄青霉素的YT琼脂上进行平板培养，保温过夜后也得到大量具有多种不同突变的集落。

为了证实诱变的内毒素顺序的活性，根据后面实例A所述的美洲菸夜蛾检测法（TBW）或粉蚊夜蛾检测法进行测试，所述内毒素是（例如）通过大肠杆菌JM103或大肠杆菌SG4044（公众可从农业研究培养物收集中心（NRRL）得到，Peoria，Illinois，保藏号为B-15969）所含的DNA表达的。表现出比常规的非突变内毒素更强活性的突变DNA在相关区域测定其顺序，以确定DNA中的突变和蛋白质顺序。通过这种方法，评价了6，000个以上的不同集落，其质粒中含有M-1或M-2诱变片段，结果发现，在每一个突变实验中，一般都发生了1-3个氨基酸的改变。

下面的表B出示了作为突变实验的结果而直接回收到的增强突变体，并给出了每个突变发生处的氨基酸位置（参考表A的位置编号），每个突变体中的每个突变密码，以及由于密码改变导致的所指出位置的氨基酸变化。

表B中用负数表示的氨基酸位置是指Bam HI位点和内毒素顺序起始处1位Met之间的变化，这种变化因此不影响由突变顺序编码的内毒素顺序。

下面表B中的突变体都通过TBW检测法的所有三期进行了评价，结果示于下面的表B-1中。这些不同的突变体也通过粉蚊夜蛾检测法进行了评价，其结果示于下面的表B-2中。

表B

突变片段突变体氨基酸内毒素中的改变

位置核苷酸氨基酸

M-1 p26-3 119 GCA to ACA Ala to Thr

130 ATG to ATA Met to Ile

201 GGC to GAC Gly to Asp

M-1 p48al4 101 GAA to AAA Glu to Lys

116 GAG to AAG Glu to Lys

217 CGT to CAT Arg to His

M-1 p48c5 116 GAG to AAG Glu to Lys

187 GCG to ACG Ala to Thr

M-1 p36a65 122 ACT to ATT Thr to Ile

125 GCA to GTA Ala to Val

M-2 p95a76 123 AAT to TAT Asn to Tyr

M-2 p95a86 188 ACT to TCT Thr to Ser

M-2 p98cl 188 ACT to TCT Thr to Ser

M-2 p99c62 204 ACA to ACT Thr to Thr

105 AAT to TAT Asn to Tyr

4 AAT to TAT Asn to Tyr

M-2 p107c22 194 AAT to AAA Asn to Lys

94 AAC to AAA Asn to Lys

M-2 p107c25 184 TTT to ATT Phe to Ile

-11 TTG to TAG -

M-2 p114a30 95 CAA to AAA Gln to Lys

-15 TAT to TAA -

在下面的表B-1中，毒性栏中的低分数表明更大的活性（见实例A对毒性分数的解释），对照是指未用任何质粒转化的等量的大肠杆菌JM103细胞和大肠杆菌SG4044细胞。可以看出，所有突变体都比兄柿rAK的等量细胞产生的截短的天然内毒素具有显著更强的活性。

表B-1

参考表B的突变体毒性分数

平均毒性

p26-3 2.75

p48a14 2.25

p48c5 2.63

p36a65 1.50

p95a76 2.50

p95a86 1.30

p98c1 1.33

p99c62 1.83

p107c22 1.42

p114a30 2.00

对照（JM103细胞） 4.68

prAK 3.35

对照（SG4044细胞） 4.12

表B-2

参考表B的突变体相对毒性

p26-3 217

p36A65 887

p95a76 291

p107c22 357

p114a30 239

对照（SAN415） 59

pBT301 100

在上面的表B-2中，以pBT301为标准定义相对毒性为100（根据LD₅₀，更详细的解释见实例A），因此，相对毒性值高于此则表明突变增强了毒性水平。

在为了促进本发明的其他工作中，对表B所示的某些涉及多突变的突变DNA进行分析，以确定这种多突变片段中的单个和成对突变的效应。通过下述战略对这种单突变或成对突变进行亚克隆：分离多突变片段靶，在片段之内且位于两个突变密码之间的限制位点上切断此片段。这两半或小片段然后通过凝胶分离，每种都与未突变的互补半混合，或与通过类似切割prAK的相同片段而得到的小片段混合。然后，被切割后以分离更大的互补片段的prAK载体与两种混合的互补半混合，使所有三种DNA片段连接在一起形成修饰的prAK质粒，它含有存在于来自多突变克隆的片段半的点突变或多突变。更具体地说，通过构建战略使限制性核酸内切酶Xho Ⅱ的位点位于某些多突变片段之内，从而使得能够分离出这样的片段：其中的突变点比完整突变片段中的总突变数要少。显而易见，核酸内切酶Xho Ⅱ可用于初突变体中去掉或减少一个或两个突变的效应。其毒性或杀虫活性的评价结果示于下面表E中，可以见到：1）毒性栏的低分数表明更强的活性（见实例A的分数说明）;2）对照是指未用任何质粒转化的等量的JM103细胞和SG4044细胞，可以见到，在两种大肠杆菌细胞中评价的大多数突变体（如果不是所有的话）及表中参照两种对照给出的突变体结果应当看作是两种细胞表达的突变体的结果平均值。

利用制备表C中的克隆相似的方法，制备第二轮杂交的突变体克隆，通过三个片段的结合制备了一个系列混合的结合突变质粒，此三个片段即用Nsi Ⅰ和Sst Ⅰ消化prAK得到的大片段（大约4Kb），来自表B中一个克隆的330bp Nsi Ⅰ/Xho Ⅱ片段和来自表B中不同克隆的1100bp的Xho Ⅱ/Sst Ⅰ片段。由此第二轮得到的杂交的突变克隆示于下面的表D中，可以看到，由此第二轮产生的两个质粒与母体prAK质粒相比含有四个氨基酸变化。

表D

新形成载体片段及 NsiⅠ/XhoⅡ XhoⅡ/SstⅠ

的prAK 来源片段来源片段来源突变氨基酸位置

命名

prAK-J prAK Nsi/Sst p48a14 p26-3 Glu to Lys@101

Glu to Lys@116

Met to Ile@130

Gly to Asp@201

prAK-K 〃 p48a14 p48c5 Glu to Lys@101

Glu to Lys@116

Ala to Thr@187

prAK-L 〃 p48c5 p26-3 Glu to Lys@116

Met to Ile@130

Gly to Asp@201

prAK-M 〃 p26-3 p48a14 Ala to Thr@119

Arg to His@217

prAK-N 〃 p26-3 p48c5 Ala to Thr@119

Ala to Thr@187

prAK-O 〃 p48c5 p48a14 Glu to Lys@116

Arg to His@217

prAK-P 〃 p26-3 p36a65 Ala to Thr@119

Thr to Ile@122

Ala to Val@125

许多表B中的多突变片段，以得到具有单一点突变的片段和其它具有双突变的片段。因此，首先用限制性核酸内切酶Nsi Ⅰ和Sst Ⅰ处理多突变质粒，通过凝胶分离所得到的1430碱基对的片段。然后，用限制性核酸内切酶Xho Ⅱ处理每个这种1430bp片段，对每种多突变体通过凝胶分离所得到的330bp（Nsi Ⅰ/Xho Ⅱ）和1100bp（Xho Ⅱ/Sst Ⅰ）片段。然后通过类似方法得到330和1100bp的非突变的对应片段，以及prAK中更大的约为4Kb的Nsi Ⅰ/Sst Ⅰ片段。更具体地说，使少量的大片段与突变的330bp片段和非突变的prAK1100bp片段混合，连接混合物便得到一系列prAK的杂交的突变质粒。通过类似的方式，一定量的这种较大的prAK片段与未突变的300bp prAK片段和突变的1100bp片段混合，连接这些DNA以形成另一系列杂交的突变质粒。下面的表C概括了由上述战略得到的杂交的突变质粒或克隆，表中给出了所结合的三个片段及与质粒prAK比较所得到质粒中的突变。

表C

新形成的 NsiⅠ/XhoⅡ XhoⅡ/SstⅠ

prAK命名载体片段及来源片段来源片断来源突变氨基酸的位置

A prAK NsiⅠ/SstⅠ p48a14 prAK Glu to Lys@101

4Kb Glu to Lys@116

B 〃 p26-3 prAK Ala to Thr@119

C 〃 p48c5 prAK Glu to Lys@116

D 〃 prAK p48a14 Arg to His@217

E 〃 prAK p26-3 Met to Ile@130

Gly to Asp@201

F 〃 prAK p48c5 Ala to Thr@187

表D（续）

新形成的载体片段 Nsi Ⅰ/Xho Ⅱ Xho Ⅱ/

prAK- 及来源片段来源 Sst Ⅰ 突变氨基酸位置

命名片段来源

prAK-Q 〃 p48c5 p36a65 Glu to Lys@116

Thr to Ile@122

Ala to Val@125

prAK-R 〃 p48a14 p36a65 Glu to Lys@101

Glu to Lys@116

Thr to Ile@122

Ala to Val@125

prAK-S 〃 p26-3 p95a86 Ala to Thr@119

Thr to Ser@188

prAK-T 〃 p48c5 p95a86 Glu to Lys@116

Thr to Ser@188

prAK-U 〃 p48a14 p95a86 Glu to Lys@101

Glu to Lys@116

Thr to Ser@188

prAK-53 〃 p99c62 p107c25 Asn to Tyr@105

Phe to Ile@184

prAK-68 〃 p99c62 p26-3 Asn to Tyr@105

Met to Ile@130

Gly to Asp@201

prAK-70 〃 p26-3 p107c25 Ala to Thr@119

Phe to Ile@184

prAK-39 〃 p99c62 p98c1 Asn to Tyr@105

Thr to Ser@188

根据实例A的美洲菸夜蛾检测法评价表C和D中的各种杂交突变体，评价包括与表B中的突变克隆进行比较，尤其是观察从表B的原

表E

本发明进一步包括表明这样一种能力，即用一般的氨基酸在最初的DNA随机突变产生氨基酸变化的氨基酸位置处进行置换，从而提供大量新型的具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌内毒素鞍住Ｍü降摹懊苈胄笔笛榭杀冉先菀椎刂な嫡庵帜芰Γ诖耸笛橹校股婕白畛跬槐涞难《苈氡湮渌烊话被岬拿苈搿Ｕ庑┬碌耐槐涮灞泶锏哪诙舅氐鞍拙哂姓攵悦乐掭我苟甑纳背婊钚浴Ｎ烁行У亟姓庀钛芯浚票噶艘幌盗衟rAK型的独特质粒，它们基本上始于prAK并止于质粒prAK-7，其它的中间质粒如实例1所述按制备顺序依次是prAK-3、prAK-4、prAK-5和prAK-6。图2所示的质粒pB8r Ⅱ在所有方面都与质粒prAK相同，只是它含有的DNA编码的截断内毒素比prAK编码的稍长，另一不同点是，在其与截断内毒素结构基因DNA下游末端的连接区中，对母体质粒作出了一些无关紧要的修饰，图2中所示的所述结构基因中，Kpn Ⅰ位点在天然基因中，而在prAK中，此位点被去掉，prAK的结构基因终止于大约所述位点的以前的位置。所设计的质粒prAK-7能表达与质粒prAK相同的内毒素氨基酸顺序，但其DNA顺序已进行修饰，它不仅含有prAK-3的Nru Ⅰ位点，还含有Hind Ⅲ、Mst Ⅱ和BssH Ⅱ位点，此外，最好去掉prAK中最初的Hind Ⅲ位点。正如实例1更具体指出的那样，由prAK依次制备prAK-7以及每步中的位点加入和消除可概括如下：

prAK-→prAK-3（加入Nru Ⅰ）

prAK-3-→prAK-4（加入Hind Ⅲ）

prAK-4-→prAK-5（加入Mst Ⅱ）

prAK-5-→prAK-6（加入BssH Ⅱ）

prAK-6-→prAK-7（消除原来的Hind Ⅲ）

上面指出的位点以大约40碱基对的间隔引入，这样便可有效地使用DNA自动合成仪合成DNA双链小片段，它们的两端终止于代表限制位点残基的互补残基的核苷酸，而这些正是prAK-7用两种相关的限制性核酸内切酶切割时所需要的。因此，这种片段能够方便地通过标准的切割和连接方法（见后面的实例p）置换入prAK-7中，以提供一种能够表达与prAK相同的内毒素蛋白的质粒，不同之处在于，与prAK-7中的相应片段比较，由置换入prAK-7中的合成片段编码的氨基酸发生了变化，参见实例2所述。

图3A和3B是根据上述密码旋转战略制备的两个双链DNA小片段，将它们置换入prAK-7中的Hind Ⅲ/Mst Ⅱ片段中。图3A所示的双链片段是这样设计的：根据遗传密码选择合适的ⅩⅩⅩ密码，使其在prAK质粒表达的截断的苏云金芽孢杆菌内毒素116位氨基酸处能产生任一种氨基酸。与此相似，图3B所示的双链片段是这样设计的：在此片段中选择合适的ⅩⅩⅩ密码，使其在prAK质粒表达的截断的苏云金芽孢杆菌内毒素119位氨基酸处能产生任一种氨基酸。显而易见，置换入prAK-7的Spe Ⅰ/Nru Ⅰ片段（长约115bp的片段，也可由DNA自动合成仪制备）中、Nru Ⅰ/Hind Ⅲ片段中和Mst Ⅱ/BssH Ⅱ片段中所要求的其它双链片段都可通过类似的标准方法制备，它们被设计成在这些片段的所有突变点处编码所有的氨基酸。因此，在prAK-7中Nru Ⅰ和BssH Ⅱ位点间的每个点突变处要进行的19个天然氨基酸改变或突变中，剩下的18个可方便地利用质粒prAK-7来完成。

为了覆盖116个氨基酸编码顺序之内的所有点突变以方便地进行有关密码子的旋转，可以使用质粒prAK-7制备质粒prAK-8，后者又可用来最后制备prAK-9，正如实例1所述。在图5中，最终积累于prAK-9中的所有有关的限制位点都扩大显示于prAK-9的切下片段中。图5所示的Spe Ⅰ位点也是已存在于prAK、prAK-3等中的单一位点。还可以想见，质粒prAK-7、prAK-8和prAK-9可用来在任一对限制位点之间导入多突变，和/或在两个或更多这种片段中产生至少有一个变化的DNA顺序，从而能构建大量涉及本发明的最初点突变的多突变结合体，以产生大量新的具杀虫活性的苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白。

还可以想见，质粒例如prAK-7、prAK-8和prAK-9等完全有能力改变这些质粒中的任一限制位点对片段中的一个或更多密码。如果需要在一个或两个但少于三个的这种片段内进行改变，则可使用如prAK-4或prAK-5这样的质粒，如果它们覆盖了需进行改变的片段的话，但最好是先去掉prAK中原来的Hind Ⅲ位点，如果这种质粒不适用，则将会认识到，可通过常规方法制备含有任一个或更多这种片段的prAK型质粒，即在生产prAK-9的过程中，改变或限制用以修饰prAK的限制位点对的选择。因此，本发明还提供了大量新质粒，它们可用于生产本发明的突变体和结合突变体，它们含有任一个或多个最终产生于prAK-9中的限制位点对。

还将会认识到，在进行修饰以使其含有一个或多个本发明的突变之前或之后，可通过限制位点的切割将含有任一个或多个这种限制位点对的DNA从prAK型质粒上切下，所述的限制位点在所需进行突变的区域之外，并相应地存在于另一种苏云金芽孢杆菌内毒素质粒中，然后将切下的DNA片段插入（通过标准方法连接）这种其它的苏云金芽孢杆菌内毒素质粒中（已预先进行类似的切割），从而使这种其它的质粒方便地进行修饰，或达到将本发明的突变直接插入其中的目的。

为了达到将本发明的突变掺入完整长度的内毒素编码顺序中的目的，使用一种掺入有苏云金芽孢杆菌武汉亚种δ-内毒素的结构基因DNA的质粒，这一方面是为方便计，一方面是它在当时易于得到。这种质粒称为pBT210，它示于图4中。正如图4中的粗黑线所指明，质粒pBT210掺入有苏云金芽孢杆菌武汉亚种完整长度内毒素的结构基因，与图1相比较，与结构基因一起，它还掺入有一个含有苏云金芽孢杆菌核糖体结合位点的顺序，它得自于苏云金芽孢杆菌武汉亚种，在图4中用黑框标明，质粒pBT210能完全胜任作为大肠杆菌的表达载体，如图4所示，它含有与prAK质粒相同的大肠杆菌启动子系统，一个大肠杆菌复制原点（未出示）及一个氯霉素抗性基因。图4中的箭头表明苏云金芽孢杆菌武汉亚种基因在大肠杆菌启动子调控下的解读方向，及氯霉素抗性基因的解读方向。根据我们所知的顺序资料，完整的操纵子（结构基因，来自苏云金芽孢杆菌的核糖体结合顺序和大肠杆菌启动子/操纵基因顺序）非常相似，只与质粒prAK中的操纵子稍有不同。尤其是，编码苏云金芽孢杆菌内毒素活性部分的610个氨基酸（表A）的DNA，以及延伸入前毒素区中至少直至图4的pBT210中所示的Kpn Ⅰ位点处的DNA与质粒prAK中的相应DNA顺序相同。在pBT210的苏云金芽孢杆菌结构基因中，从Kpn Ⅰ位点的下游DNA区直至此结构基因的末端，与制备prAK时截断的苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1基因的相应片段相比存在有未知的但是不显著的差别。通过限制性核酸内切酶图谱标明了这些差别。质粒pBT210编码表A所示的完整长度的内毒素，并且在活性区是完全同源的（至少从产生的氨基酸直至prAK和pB8r Ⅱ克隆中苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1δ-内毒素的Kpn Ⅰ位点），在前毒素的剩余部分中也是基本上同源的。最后，pBT210中的核糖体结合位点与prAK中的相同，而且，在pBT210和prAK中，包括核糖体结合位点（RBS）在内并从起始Met之前反向向上游延伸至与启动子区结合的Bam HI位点处的所有DNA都是一致的，不同的只是在pBT210中，紧接在Bam HI位点之后有两个核苷酸变化（CC代替了prAK中的GT），而在prAK中紧接在这两个核苷酸之后的三个核苷酸（TTT）在pBT210中缺失，这些差别仅仅是不同的连接战略产生的，即通过Bam HI位点连接苏云金芽孢杆菌的RBS片段和大肠杆菌的启动子片段时产生的。质粒pBT210可用来生产具有本发明任一个或多个氨基酸变化的完整长度的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素突变蛋白。图4所示的pBT210的Nsi Ⅰ位点、两个Xba Ⅰ位点、Sst Ⅰ位点和下游出现的第一个Hind Ⅲ位点对应于图1所示的prAK的相同位点（如上所述，两种质粒中此区域内的DNA都是相同的）。

实例A

1、粉蚊夜蛾检测法

用二龄期幼虫进行测试。整个试验期间，所有昆虫都置于人工气候室中，并给以标准的温度、湿度等条件，饲喂标准的人工饲料。测试物质作为食物的一部分喂给昆虫，每种浓度的测试物质喂给20只一组的昆虫。处理后监测昆虫7天，然后计算昆虫的LD₅₀。LD₅₀可定义为诱导50%主体死亡所需的物质剂量。最终结果以相对毒性给出：

相对毒性＝ (标准的LD₅₀)/(实验的LD₅₀) ×100

利用上述技术能够提供LD₅₀的绝对值，结果的解释是很简单的，所有高于标准的相对毒性值表明其活性高于标准。例如，某种物质的相对毒性是400，与标准值100相比较，其活性高于标准4倍。

上述试验中的标准是质粒pBT301，其相对毒性为100，此质粒含有完整长度的野生型δ-内毒素顺序，与pBT210的相同，只是含有两个大肠杆菌启动子，每个都与pBT201中所含的相同。

用于上述试验的对照是：

a）CAG629-一种大肠杆菌菌株，不含产生δ-内毒素的质粒，本身也不具备杀虫活性（由C.A.Gross所赠，威斯康星大学细菌学系）。

b）SAN415-一种市售可得的苏云金芽孢杆菌杀虫剂，其注册商标名称是JAVELIN。

2、美洲菸夜蛾（TBW）检测法

所采用的TBW检测法与Dulmage等人所述基本相同（J.Invertebr.Path.18∶240-245，1971），试验用3份重复样品在1盎司的透明塑料制的蛋奶酥盖中进行，每杯中放入一个二龄期TBW幼虫（4-5天龄，平均重1.6g）。如Dulmage等人所述（USDA Techincal Bulletin 1528：1～5，1976），使样品与15ml食物混合（包括营养粉，维生素粉，琼脂及其它成分）。将食物平均分至3个杯中，使其冷却半小时。每杯中加入一个TBW（使用00号驼毛刷），将盖子安全地扣上。然后，将这些样品置于27℃，相对湿度为50%的保温箱中4～5天。下表给出了用以评定的TBW毒性检测的按大小分组的号码，以及与之相对应的重量范围。

组大小重量范围（mg）平均重量（mg）

1.0 1.3-1.9 1.6

1.5 2.7-3.1 2.8

2.0 5.5-6.3 5.8

2.5 11.7-12.3 12.0

3.0 17.3-22.2 19.6

3.5 30.8-34.2 32.8

4.0 50.1-52.4 51.1

4.5 76.6-94.3 84.8

5.0 119.9-114.7 113.5

6.0 119.8-134.3 ＞140.0

上面的“组大小”直接等同于本文给出的毒性分数。因此，在每次试验后测定幼虫重量，并按照其重量所落入的重量范围确定它所对应的组，给出与组相等的毒性分数。但下文可见到有例外，既如果所有幼虫死亡，则给定其组大小和毒性分数为0。本文报告的结果是所有重复的毒性分数的平均值，而所有结果一般都是以至少30个重复为基础。

杯子保持打开状态，直至确定不同大小的TBW的范围。使这些TBW称重，直至确定一个TBW落入每种重量范围中。然后，用相应的组大小号码对含有给定重量范围的样品杯作标记。然后，将这些杯子以上升的次序搁在实验台上。然后，剩余的样品通过与称过的样品TBW进行大小的目测比较而评分，并在分数单上记下该组的号码。死亡幼虫记为“+”，所给分数为0。死亡幼虫如果呈浅粉色，或似乎已经液化，则其死因可能与δ-内毒素无关。这些幼虫记为“＊”，并且不计算在结果中。

1ml prAK培养锓种梁斜曜佳返娜霰校峁股な艿阶枰郑涠拘苑质械确段АＲ虼耍思觳夥捎糜诖颖任赐槐淠柑宥拘愿突蛳嗟鹊目寺≈蟹直娉龆拘栽銮康目寺　８萃度爰觳夥ㄖ械膒rAK培养物数量，此检测法还会产生剂量反应。因此，样品中加入的含有prAK的细菌的量更多，则所观察到的对于TBW的毒性程度更强。prAK的剂量反应曲线可用于评价克隆比未突变母体毒性增强的程度。下表说明了含有prAK的细菌的剂量反应：

prAK静止期培养物毒性分数

的加入量

5ml 1.5 1.5 2.0

2 2 2.5 2.5

1 3 3 3.5

0.5 3 3.5 4

0.25 3.5 4 4

在上述评价的基础上，用1ml培养物对所有培养物依次（对所得到的组大小而言）进行检测，从而给出一个很宽的范围，以确定那些相对于作为标准的prAK（及其它未突变质粒）来说活性更强或更弱的克隆。

TBW检测法中所用的营养粉是以下述重量比例混合的：大豆粉1103.4g;小麦胚429.4g;Wesson Salt Mix 292.4g;蔗糖164.2g;甲基对苯甲酸（Methyl parabenzoate）24.6g;山梨酸14.8g。

TBW检测法中所用的维生素粉是以下述重量比例混合的：calcium peutothenate 12.0g;烟酰胺6.0g;核黄素3.0g;叶酸3.0g;盐酸硫胺素1.5g;盐酸吡哆醇1.5g;生物素0.12g;维生素B₁₂6.0g。

TBW检测法的下述三种筛选应用（初级、二级和系列稀释）被用于不同的评价阶段，并在本说明书中被提及。

初级检测法：来自两个不同克隆18小时培养物的1ml等分试样在50ml锥形离心管中与TBW食物混合，平均分入3个杯中（每杯一个TBW）。对这些样品进行评价时，用通过同样方式制备的野生型prAK或pBT210转化的细胞和未转化的细胞作为对照。

二级检测法：在初级检测中表现出对于TBW有增强毒性的样品通过二级检测法筛选。选择的突变体克隆由文库平板接种于YT/Amp培养基上（每种培养物一个集落）。与合适的对照一起，评价10个1ml的样品。表现出对于TBW有增强毒性的克隆称为“可探测的增强突变体”，并对其进行第3次评价。第3次重复其“增强”表型的克隆被称作“增强突变体”，并通过系列稀释检测法进行评价，以更精确地测定其相对于母体野生型来说活性提高了多少。

系列稀释检测法：相对于未突变的构建体确实表现出“增强”表型的突变体进行系列稀释后通过TBW检测法筛选，稀释以冷冻干燥的细菌细胞干重为基础进行，这些细菌培养了18小时，其中含有来自prAK或pBT210克隆的突变型或野生型毒素（冷冻干燥前使细胞离心沉淀）。下述每种稀释度的样品作三个重复（最终体积为15ml）;167μg/ml、67μg/ml、33μg/ml。对来自这些实变体的蛋白进行SDS-PAGE和Western（免疫印迹）分析，一般是每泳道75μg干重。系列稀释的结果基本上证实了前面检测的结果，但此处并未报道这些结果，或将它们平均于此处报道生物学结果的表中。

实例P 一般程序

在下面的编号实例中或本说明书的其他需要的地方，除非本说明书另有说明，使用了下述一般的或标准的实验程序。

实例P-1 细菌和噬菌体株的维持和生长

大肠杆菌SG4044和JM103菌株是所有质粒构建体的宿主。大肠杆菌JM103株和噬菌体M18和MP19得自New England Biolabs。这些细菌株培养在YT培养基中（5g/l的酵母膏，10g/l细菌胰蛋白胨，5g/l NaCl）。对于含有prAK或此质粒的衍生物的细胞，在培养基中补充有50mg/l氨苄青霉素，对于含有pBT210或此质粒衍生物的细胞补充有20mg/ml氯霉素。

实例P-2 噬菌体DNA的增殖和分离

利用以前所述的方法（Messing，J.Methods Enzymol 101∶20～78，1983），制备M13衍生的重组噬菌体储备物和分离噬菌体DNA。

实例P-3 合成寡核苷酸的制备

利用Applied Biosystems（Foster City，CA）380A型DNA合成仪，通过自动合成制备合成寡核苷酸。

循环结束后的纯化步骤如下进行。通过加入等量的氢氧化铵并于55℃保温过夜而使合成的寡核苷酸去封闭。通过连续多轮的快速真空离心和再悬浮于蒸馏水中去掉氢氧化铵，然后，通过脲聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）进一步纯化寡核苷酸。为了目测观察凝胶上的带，将凝胶置于双层层析平板上（上面覆盖有Saran^R带），用短波紫外光照射寡核苷酸。用保险刀片从凝胶上切下含有寡核苷酸的部分，然后，在0.5M乙酸铵，1mM EDTA，pH8.0中于37℃搅拌过夜，从凝胶上洗脱寡核苷酸。过夜洗脱之后，以6000RPM在JA20转子中离心凝胶片段，含有洗脱的寡核苷酸的上清液转移至新鲜试管中。利用乙醇沉淀浓缩寡核苷酸，通过测定O.D.260的光吸收进行定量。在加有2单位T4多核苷酸激酶和0.05mMATP的40μl反应液中，使200微微摩尔的寡核苷酸活化。

实例P-4 大肠杆菌细胞的DNA转化

A）根据常用方法（Cohen，S.N.，Chang，A.C.P.和Hsu，L.Proc.Natl.Acad.Sci.USSA 69：2110～2114，1972），制备能胜任DNA转化的大肠杆菌JM103或SG4044。为了进行定点寡核苷酸诱变实验，在0.2ml感受态细胞中加入杂交的双螺旋重组噬菌体（M13）DNA（60ng），并保持在0℃15分钟。细胞然后于42℃保持2分钟，30μl此混合物加至3ml含有0.7%细菌琼脂的YT培养基（保持在42℃以防止固化）和0.2ml JM103或SG4044的新鲜过夜培养物中。混合物立即铺在YT琼脂平板上（YT肉汤加1.5%细菌琼脂），平板（倒置）于37℃保温过夜。

B）来自诱变实验或涉及prAK或pBT210载体的其它任何连接体的质粒DNA（100ng）加至0.2ml感受态细胞中（JM103或SG4044），于0℃保持30分钟。然后使细胞于42℃保持2分钟，然后回到冰浴中。2μl～200μl的量铺在YT琼脂上，其中对于以prAK为基础的克隆含有50μg/ml氨苄青霉素，对于以pBT210为基础的克隆含有20μg/ml氯霉素，于37℃保温过夜。

实例P-5 限制性酶消化

所有的限制性酶都购自Bethesda Research Labs（Gaithersburg，MD）或New England Biolabs。保温根据厂家推荐的条件进行。

实例P-6 DNA片段的连接

A）DNA连接反应液（20μl）含有60mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，50μM ATP，20nM DNA终端和20单位T4 DNA连接酶（New England Biolabs）。保温于14℃进行4小时。

B）进行三片段连接时，反应体积为20μl，各种片段以1∶1∶1摩尔比例存在，各自的浓度都为0.04微微摩尔。如果只连接粘性末端（例如Xho Ⅱ内部位点），则保温于16℃下进行4小时，连接平头末端（例如FnuD2位点）则保温过夜。New England Biolabs（NEB）T4连接酶的酶的使用浓度为每微升反应体积10单位（NEB定义）。

实例P-7 DNA顺序测定

根据Heidecker等的链终止法（Heidecker，G.，Messing，J.，Gronenborn，B.Gene 10∶68～73，1980），测定δ-内毒素基因及其衍生物的DNA顺序。

实例1 载体prAK-3、prAK-4、prAK-5、prAK-6和prAK-7的制备

步骤a）prAK-3的制备

1μg质粒pB8rⅡ（示于图2中，见上述）及来自公知的M13噬菌体克隆载体MP18和MP19的复制型DNA，在100mM氯化钠缓冲液中，于37℃下用限制性核酸内切酶Bam HI（8单位）和Kpn Ⅰ（10单位）同时消化60分钟，缓冲液中还含有6mM Tris-HCl pH 7.9，6mM MgCl₂，100μg/ml牛血清清蛋白。使所有混合物通过1%制备型琼脂糖凝胶以根据大小进行分离，从而从得到的DNA混合物中纯化出需要的片段。通过溴化乙铵染色和长波紫外光照射目测观察电泳带。切下含有所需DNA的凝胶片段，DNA在透析管中通过电泳洗脱。来自pB8rⅡ的Bam HI/Kpn Ⅰ片段连接入mp18和mp19的Bam HI/Kpn Ⅰ切割及凝胶纯化的载体中，连接反应在20μl总量的反应液中于14℃保温4小时，反应液中含有60mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，50mM ATP，20nM DNA终端。产生的DNA如实例P-4所述转化至感受态大肠杆菌JM103细胞中，不同之处在于YT平板中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷（X gal），二者都得自Sigma Chemical Company。在这些条件下，重组噬菌体（含有切自pB8rⅡ的DNA插段）将产生透明空斑，而M18和M19产生蓝色空斑，将透明空斑加至2ml在YT肉汤中的大肠杆菌JM103细胞中，于37℃保温过夜，然后根据J.Messing所述的方法（Methods Enzymol.101∶20-78，1983），从噬菌体中制备单链DNA。通过琼脂糖凝胶电泳，根据其比之mp18或mp19较慢的泳动速度，鉴别出含有来自pB8r Ⅱ的大的但是单链的DNA插段的需要克隆。通过双脱氧链终止法测定含有内毒素DNA的克隆的部分顺序，证实存在有内毒素DNA，并表明mp18获得了其反义链，而mp19获得了其有义链，对二者进行回收。一个26碱基的反义寡核苷酸具有下列顺序

5′GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG3′根据Maniatis等人所述（Molecular Cloning（1982）：A Laboratory Manual;冷泉港实验室，纽约冷泉港），用DNA自动合成仪通过固相合成法制备此顺序，用T4多聚核苷酸激酶和ATP使其活化。总量为60μl的混合物中含有0.4μg含有内毒素有义链的重组噬菌体mp19，20mM Tris-HCl pH7.5，7mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，50mM氯化钠和10ng26碱基的反义寡核苷酸，使此混合物于68℃加热15分钟，然后于37℃10分钟，然后置于0℃。产生的混合物中含有与诱变的寡核苷酸退火的mp19重组DNA，对其进行如下处理，即加入dATP、dCTP、dTTP和dGTP各0.2mM，1mM ATP4单位DNA聚合酶ⅠKlenow片段（得自New England Biolabs），0.5μg大肠杆菌单链结合蛋白（得自Pharmacia，Piscataway，NJ）和20单位T4 DNA连接酶（NewEngland Biolabs）。产生的混合物于14℃保温4小时，使其进行聚合和连接，得到的环状杂合双链DNA转化至大肠杆菌JM103中，并如实例P-4所述进行平板培养。然后选择出20个单独的空斑，如Maniatis等人所述（同上）从噬菌体中分离单链DNA。每种来自此20个空斑的噬菌体DNA加入20μl总量的反应液中，其中含有50mM Tris-HCl pH8.0，50mM KCl，10mM MgCl₂，10ng上述的26碱基反义寡核苷酸和0.2μg不同的环状单链噬菌体DNA分子，每种都于68℃加热15分钟，然后置于37℃10分钟。在每种产生的混合物中加入限制性核酸内切酶Nru Ⅰ（8单位），于37℃持续保温1小时。混合物通过0.8%琼脂糖凝胶进行电泳。大约10%的样品含有如线状DNA泳动的DNA，使得能够鉴别出含有所需Nru Ⅰ位点的阳性克隆，将阳性克隆转化至大肠杆菌JM103中以确保纯化。在阳性克隆中Bam HI和Xba Ⅰ位点之间的DNA，通过用这些位点的核酸内切酶同时切割而从克隆上切下（如上面对Nru Ⅰ寡核苷酸所述，在与M13测序寡聚物退火并聚合产生双链之后）并与大片段（大约5004bp，缺失了prAK中Bam HI和第二Xba Ⅰ位点之间的大约749bp片段）连接（实例P-6A），此大片段是通过用同样两种限制性酶同时对prAK进行完全消化之后经凝胶纯化得到的，从而通过所有这些常规方式形成质粒prAK-3。

步骤b）prAK-4的制备

基本上根据与上述步骤a）相似的所有步骤，使步骤a）得到的单链噬菌体DNA与25碱基合成的反义寡核苷酸退火，其顺序如下：

5′CCACTCTCTAAAGCTTTCTGCGTAA3′它是设计用来将Hind Ⅲ位点导入表A的核苷酸顺序中327-351位核苷酸之间的。通过用核酸酶Hind Ⅲ的切割评价鉴别具有所需Nru Ⅰ和Hind Ⅲ两个位点的阳性克隆，其频率约为6.6%，用它如下述制备的prAK-4：根据步骤a）的方式，使具有新位点的Bam HI/Xba I片段与来自prAK的5004bp大片段相连接。

步骤C）prAK-5的制备

基本上根据与步骤a）相似的所有步骤，使上述步骤b）得到的单链噬菌体DNA与26碱基合成的反义寡核苷酸退火，其顺序如下：

5′GCATCTCTTCCCTTAGGGCTGGATTA3′

它是设计用来将Mst Ⅱ位点导入表A的核苷酸顺序中366-391位核苷酸之间的。通过限制性酶Mst Ⅱ的切割评价鉴别具有所需Nru Ⅰ、Hind Ⅲ和Mst Ⅱ的所有三个位点的阳性克隆，其频率约为9.1%，用它来制备prAK-5。

步骤d）prAK-6的制备

基本上根据与上述步骤a）相似的所有步骤，使来自上述步骤c）的阳性双链噬菌体克隆体转化成单链噬菌体DNA，并与具有如下顺序的26碱基合成的反义寡核苷酸退火：

5′GCGGTTGTAAGCGCGCTGTTCATGTC3′

它是设计用来将BssH Ⅱ位点导入表A的核苷酸顺序中406-431位核苷酸之间的。通过限制酶BssH Ⅱ的切割评价鉴别具有所有四个位点（prAK-7中最终需要的）的阳性克隆，其频率约为12.5%，用它们来制备prAK-6。

步骤e） prAK-7的制备

基本上根据与上述步骤a）相似的所有步骤，使上述步骤d）得到的单链噬菌体DNA与具有如下顺序的26碱基的合成反义寡核苷酸退火：

5′TACAGTCCTAAATCTTCCGGACTGTA3′

它是设计用来去除表A的核苷酸顺序中1682-1707位核苷酸之间的Hind Ⅲ位点的。通过限制性核酸内切酶筛选复制型（双链的）重组噬菌体DNA，以大约2.8%的频率鉴别出代表prAK-7所需完整顺序的阳性克隆，并且在核苷酸1682和1707之间缺失Hind Ⅲ位点。由突变体中分离出双链DNA，用其制备prAK-7。

为了完成具有合适的单一和间开的限制性位点的质粒（prAK-9）的制备，以用于在两个Xba Ⅰ位点之间的其它突变位点处进行密码旋转实验，可类似地将prAK系列质粒的制备持续到下述步骤，以制备出质粒prAK-8，以及从中制备出prAK-9，正如下面的步骤f）和g）所述。

步骤f）prAK-8的制备

基本上根据与上述步骤a）相似的所有步骤，使上述步骤e）得到的单链噬菌体DNA与具有如下顺序的27碱基的合成反义寡聚物退火：

5′TCCCCACCTTTGGCCAAACACTGAAAC3′

它是设计用来将Bal Ⅰ位点导入表A核苷酸顺序中大约534位核苷酸处的。根据上述步骤a）的方法鉴别出具有所需的Nru Ⅰ、Hind Ⅲ、Mst Ⅱ、BssH Ⅱ和Bal Ⅰ所有五个位点的阳性克隆（prAK-8），它并且缺失制备prAK-7时去掉的Hind Ⅲ位点。

步骤g）prAK-9的制备

基本上根据与上述步骤a）相似的方法，使上述步骤f）得到的单链噬菌体DNA与具有如下顺序的30碱基合成的反义寡聚物退火：

5′GTTGCCAATAAGACGCGTTAAATCATTATA3′

它是设计用来将Mlu Ⅰ限制位点导入表A核苷酸顺序中588-595位核苷酸之间的。根据上述步骤a）的方法鉴别出具有所需的Nru Ⅰ、Hind Ⅲ、Mst Ⅱ、BssH Ⅱ、Bal Ⅰ和Mlu Ⅰ所有6个限制位点的阳性克隆，它并且缺失制备prAK-7时去掉的Hind Ⅲ位点，它被命名为质粒prAK-9。

这一点将是显然的，适于在prAK-9的Bal Ⅰ和Mlu Ⅰ位点之间进行置换的盒式DNA，可适当地使其在突变氨基酸位184、187、188和194处引入所有可能的密码和氨基酸改变。

以类似的方法，适于在Mlu Ⅰ和第二Xba Ⅰ位点之间进行置换的盒式DNA，可适当地使其在突变氨基酸位201和204处引入所有可能的密码和氨基酸改变。

图5是一个示意图，它表明了在prAK的两个原始Xba Ⅰ位点之间可导入的单一限制性位点（prAK-9中的第一个这种Xba Ⅰ位点现在是Nru Ⅰ位点）。

上面实例2各步中所示的反义寡核苷酸的下标横线表明引入的变化。

实例2 密码旋转实验

A）根据实例P-3所述，用DNA合成仪制备具有图3A和3B所示两链中之一的顺序的单链寡核苷酸，合成仪能在图3A所示每条链的每个X处自动地随机插入所有的A、T、C、G核苷酸。通过这种方法，由仪器的每次操作制备出总量大约为200μg（纯化后）的这种单链DNA（代表一族寡核苷酸），每条链除了X位以外都是相同的。每种链各取10微微摩尔，以及每种密码旋转的有义及反义链全部混合，通过于68℃加热10分钟，然后于37℃10分钟。冷却至室温及置于冰上而退火。产生的符合图3A所示DNA的双链寡聚物被确定在XXX位置（116位氨基酸）含有遗传密码所允许的包括终止信号的各种结合，以及编码20种天然氨基酸及终止信号中每一种的多个但不同号码的密码。然后，1微微摩尔的这些双链寡聚物或DNA盒用T4多核苷酸激酶（New England Biolabs）活化，然后全部与大片段（以低于10倍的摩尔浓度存在）混合，此大片段是用限制性核酸内切酶Hind Ⅲ和Mst Ⅱ在100mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl₂，10mM 2-巯基乙醇和100μg/ml BSA中同时切割质粒prAK-7后通过凝胶分离得到的，得到的混合物根据实例P-6（A）进行连接。然后，在实例P-4（B）的条件下，用得到的连接混合物的等分试样（5μl）转化大肠杆菌JM103。得到的一些（200）转化细胞单个进行TBW和粉蚊夜蛾检测法（事先并不知道在任一具体的克隆中XXX处是何种密码），发现所产生的活性水平基本上表明，所有各种不同的突变体都导致了具杀虫活性的蛋白产物，其活性至少大约相当于截短内毒素对照的活性，还表明了明显的增强突变体（5X对照）。在此之前，还选择来自转化作用的随机细胞，如实例P-1进行涂布和集落培养，以分离质粒DNA以进行DNA顺序分析，此分析通过将Bam HI/Xba I片段克隆入用同样的酶切割的测序载体mp18和mp19中进行。然后，测定11个这种116位突变的区域的DNA及鉴定出的增强突变体的顺序，以确定在此116位所编码的氨基酸。发现两个增强突变体中之一是原初的增强突变体（116-Lys，但由AAA编码）。另一增强突变体发现是由CGT编码的116-Arg。发现另一个克隆是天然的116-Glu（但由GAA编码）。另外七个轻型突变体是116-Ile（ATT）、116-Cys（TGC）、116-Leu（CTC）、116-Asp（GAT）、116-Asn（AAC）、116-Ile（ATT）和116-Gly（GGA），除了新的116-Ile（ATT）有两个克隆之外，其它所有都是单一的。最终的克隆编码116-终止（TGA）。

B）利用图3B所示的DNA为119位氨基酸重复此实例2部分A）中的方法。对所产生的大量克隆进行随机评价再次通过TBW和粉蚊夜蛾检测法产生了活性水平，基本上表明产生的所有突变克隆都具有活性。（无活性分子的百分比大致等于由于仪器在XXX位置处随机输入核苷酸而可期望的终止密码UAA、UAG和UGA的频率）。七个随机选择的单个克隆中每一种都表明具有大约至少相当于prAK产生的截短的天然顺序内毒素的活性水平，但根据我们的主观标准没有一个是增强突变体。对七个克隆直鸾兴承虿舛ū砻鳎嵌际遣煌捞氐模缦滤荆?19-Leu（CTA）、119-Tyr（TAC）、119-Asp（GAT）、119-His（CAT）、119-Pro（CCA）、119-Ile（ATT）和119-Ser（TCT）。

实例3 突变的完整长度的苏云金芽孢杆菌内毒素

质粒pBT210（1μg）用限制性核酸内切酶Bam HI（8单位）和Sst Ⅰ（8单位）同时切割，切割在100mM氯化钠缓冲液中进行60分钟，其中还含有6mM Tris-HCl pH7.9，6mM MgCl₂，100μg/ml牛血清清蛋白。大约7180bp的大片段凝胶纯化后用作载体。然后，1μg质粒prAK-26-3（含有如下突变：119位Ala→Thr，130位Met→Ile，201位Gly→Asp）也用限制性核酸内切酶Bam HI（8单位）和Sst Ⅰ（8单位）同时切割，切割在含有6mM Tris-HCl pH7.9，6mM MgCl₂和100μg/ml牛血清清蛋白的100mM氯化钠缓冲液中进行。大约1428bp的小片段中含有突变及苏云金芽孢杆菌RBS部分，凝胶纯化此片段，大约0.06微微摩尔的这种片段与0.02微微摩尔的上面得到的7180bp载体片段混合以进行连接，并一同加进20μl的连接基质，其中含有60mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，50mM ATP和20单位T4DNA连接酶，得到的混合物于14℃保温4小时。产生的质粒称为pBt26-3，通过将5μl所述的连接混合物加至0.2ml感受态大肠杆菌JM103中使其转化，首先将其于0℃下保持30分钟，然后给予42℃2分钟的脉冲，然后返回至冰上。然后，立即从产生的混合物中取不同量（2μl，20μl，180μl）铺在YT琼脂平板上（YT培养基加上1.5%细菌琼脂，还含有20μg/ml氯霉素），使平板倒置于37℃保温过夜。只有具氯霉素抗性的转化细胞能在这些平板上生长。氯霉素抗性集落培养在液体培养基中于37℃过夜，分离质粒DNA用EcoRI试剂进行限制性消化，测定DNA顺序以实际确定是否存在有点突变。然后，含有质粒pBT26-3的成功转化体通过TBW和粉蚊夜蛾检测法进行评价。

继续按照类似实例3上面部分的方法，制备下述另外的完整长度的突变内毒素，并通过TBW和粉蚊夜蛾检测法进行评价。下面的表F给出了这样制备的能产生其他完整长度突变内毒素的质粒/细胞系统，并对所有都给出了用TBW检测法进行评价的大致结果，及上述实例3的产物在这种检测法中得到的大致结果，以及在大肠杆菌JM103中产生的苏云金芽孢杆菌武汉亚种天然内毒素和未转化的JM103对照细胞的大致结果。

表F

表F（续）

实例4 更完整长度的突变的苏云金芽孢杆菌内毒素

用限制性核酸内切酶Bam HI（8单位）和Sst Ⅰ（8单位）同时消化质粒pBT210（1μg），用凝胶分离所产生7180bp的大片段。在另一系列分开的实验中，质粒prAK、prAK-E、p26-3、p36a65和p95a86各取1μg也用限制性核酸内切酶Bam HI（8单位）和Sst Ⅰ（8单位）同时消化，每个都产生含有一部分截断的内毒素编码顺序的1428bp片段，用凝胶进行分离。然后，这些1428bp片段各取一定量分别用限制性核酸内切酶Fnu D2（4单位）消化，消化在6mM NaCl 6mM Tris-HCl pH7.4，6mM MgCl₂，6mM 2-巯基乙醇，100μg/ml牛血清清蛋白中进行。限制性核酸内切酶Fnu D2（也称为Acc 2）对各种不同的1428bp BaM HI/Sst I片段只切割一次，将其切成640bp Bam HI/Fnu D2片段和788bp Fnu D2/Sst Ⅰ片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化每个实验中的不同片段。

因此，得到一系列不同的640bp Bam HI/Fnu D2片段和一系列不同的788bp Fnu D2/Sst Ⅰ片段。从这两个系列的每一种中选择一个片段，并与得自pBT210的7180bp大片段连接（实例P-6B），便得到许多新的质粒，它们携有不同的完整长度的突变的苏云金芽孢杆菌内毒素基因。这样得到的新质粒记载于下面的表G中，然后根据实例P-4（A）的方法用它们转化大肠杆菌JM103，通过实例A中的TBW检测法评价这些细胞产生的苏云金芽孢杆菌内毒素，下面的表G报告了所述检测法得到的大致结果。表F和表G中所述的含有质粒的各种转化细胞还用粉蚊夜蛾检测法进行了评价，其结果示于下面的表H中。

表G

新突变的 Bam HI/ Fnu D2/ 实际涉及 TBW

样品号完整长度 Fnu D2 Sst Ⅰ 检测法

质粒的名称片段来源片段来源的突变分数

4-A 66 p36a65 p26-3 122-Ile 3

125-Val

201-Asp

4-B 67 p26-3 p95a86 119-Thr 1

130-Ile

188-Ser

4-C 74 p36a65 p95a86 122-Ile 3

125-Val

188-Ser

4-D 106 p26-3 prAK 119-Thr 1

130-Ile

4-E 107 prAK p26-3 201-Asp 2.5

4-F 108 prAK-E prAK 130-Ile 3

表H

质粒名称表来源相对毒性

pBTA F 391

pBTC F 299

pBT66 F 169

pBT107c25 F 254

pBTP F 340

pBTS F 255

pBT67 G 304

pBT106 G 367

标准 pBT301 100

对照 SAN415 59

对照 CAG629 0

实例5

用编码突变内毒素的DNA顺序转化的细胞培养在发酵罐中，所用条件是进行这种培养已知的标准条件。发酵罐中的所有内容物，在细胞生长结束和马上就收集之前，使其温度提高至大约70～80℃。此温度维持10分钟后冷却，这便足以使重组的微生物失活，而不影响内毒素蛋白的生物活性。然后，使发酵罐的内容物在压力下蒸发，浓缩至原体积的三分之一，使得到的浓缩物在大约2000psi的加压下进行喷雾干燥，使用加热的对流空气，其输入温度为140～160℃，输出温度为20-50℃。得到的粉末与载体（例如脱脂大豆）混合以形成可湿型浓缩物。混合的合适比例将根据最终产品的需要强度而定，但可以是（例如）60∶40（重量份数，粉末∶载体）。以孢子或内毒素蛋白计，得到的浓缩物中优选含有0.4-10%的活性成份，更优选0.8～8%。如本领域众所周知的那样，可湿型粉末适于用水稀释后进行喷雾使用。

表A

注：（a）是Bam HI位点

（b）是Spt Ⅰ位点

（c）是Xba Ⅰ位点

注：（d）是Xba Ⅰ位点

注：（e）是Kpn Ⅰ位点

本发明更优选的突变包括116位（Lys或Arg）、119位（Thr）、130位（Ile）和188位（Ser）的突变，以及包括其中一个或多个的结合，例如pBT26-3、pBT-106、pBT-68、pBT-C、pBT-67和pBT-70中存在的突变（其中某些存在于表G中）。还有一种优选突变是p36a65中的单个和结合的突变，尤其对于截短的内毒素来说。

本发明在第4位氨基酸处发现并允许的突变是有用的，因为它位于已被假设也构成内毒素的毒素原或前毒素部分的25氨基酸（1～25位，包括两头，表A中）片段内，并在肠道内受到蛋白酶切割而形成活性内毒素或活性更强的内毒素。因此，在4位允许的突变被表明相关于含有所述25氨基酸或与其基本同源（至少70%）的内毒素顺序，更具体地说，相关于由DNA内这种区域编码的那些内毒素，此DNA在4位突变前和在严格条件下能与具有表A中自1位核苷酸至75位（包括75）核苷酸的核苷酸顺序的DNA杂交，与缺失和加入无关，并具有相应氨基酸的等同编码顺序，正如前面论及116氨基酸的保守区时所述那样。

前面的表B中报告的并已在本文中别处进行评价的由我们的工作揭示出的在217位氨基酸处的突变表明，所有天然编码的氨基酸可能在活性内毒素中存在于此位置，所述活性内毒素具有与示于表A中的由116氨基酸参考顺序末端至217位（包括217）氨基酸相关的顺序。因此，在这种顺序或其等同顺序中217位是除Arg外的任一种天然编码的氨基酸时，这种情况也被包括在本发明的范围内。但由于所指出的217位的突变效果稍差一些，因此主要兴趣还是在于用本文公开的其它突变进行结合，并表明在此位天然存在有Arg的内毒素中217位能够改变。

Claims

1、一种生产具有昆虫毒性的内毒素蛋白的方法。该方法包括用一含有DNA顺序的表达载体转化或转染细胞，此DNA顺序包括编码与表A中m-1位至m-116位的116氨基酸顺序基本同源的氨基酸顺序的部分，所述的应用于这种同源顺序的位置号码不受任何缺失或增加的影响，其中，所述DNA进行了这样的修饰：在所指出的氨基酸参考位置处编码了下列任一个或多个氨基酸：

a)m-5 位，除Asn 外的任何天然氨基酸；

b)m-6 位，除Gln 外的任何天然氨基酸；

c)m-12 位，除Glu 外的任何天然氨基酸；

d)m-16 位，除Asn 外的任何天然氨基酸；

e)m-27 位，除Glu 外的任何天然氨基酸；

f)m-30 位，除Ala 外的任何天然氨基酸；

g)m-33 位，除Thr 外的任何天然氨基酸；

h)m-34 位，除Asn 外的任何天然氨基酸；

i)m-36 位，除Ala 外的任何天然氨基酸；

j)m-41 位，除Met 外的任何天然氨基酸；

k)m-95 位，除Phe 外的任何天然氨基酸；

l)m-98 位，除Ala 外的任何天然氨基酸；

m)m-99 位，除Thr 外的任何天然氨基酸；

n)m-105 位，除Asn 外的任何天然氨基酸；

o)m-112 位，除Gly 外的任何天然氨基酸；

所述DNA顺序在导致DNA表达的调控之下，培养所产生的细胞以生产所述内毒素。

2、根据权利要求1的方法，其中，由表达载体中的一部分DNA顺序编码的氨基酸顺序与表A中m-1位至m-116位的116氨基酸顺序之间的同源度至少是70%。

3、根据权利要求1或2的方法，其中，表达载体中的DNA已进行了这样的修饰：在所指出的氨基酸参考位置处编码了下列任一个或多个氨基酸：

a）在m-5位是Lys

b）在m-6位是Lys

c）在m-12位是Lys

d）在m-16位是Tyr

e）在m-27位是Lys或Arg

f）在m-30位是Thr

g）在m-33位是Ile

h）在m-34位是Tyr

i）在m-36位是Val

j）在m-41位是Ile

k）在m-95位是Ile

l）在m-98位是Thr

m）在m-99位是Ser

n）在m-105位是Lys

o）在m-112位是Asp。

4、根据权利要求3的方法，其中的DNA经修饰后在氨基酸参考位置m-27和m-30处的一处或两处上掺入有改变。

5、根据权利要求4的方法，其中，不具有权利要求1、3或4所述的任一种修饰的DNA部分，能在严格的杂交条件下与348核苷酸寡聚物杂交，所述寡聚物具有表A中n-1位至n-348位核苷酸的核苷酸顺序。

6、根据权利要求5的方法，其中的DNA在进行权利要求1、3或4所述的任一种修饰之前，编码表A中m-1位至m-116位的116氨基酸顺序。

7、根据权利要求6的方法，其中编码内毒素的DNA含有编码表A中1位氨基酸直至205位氨基酸的氨基酸顺序的DNA。

8、一种生产具有昆虫毒性的内毒素蛋白的方法，该方法包括用一含有DNA顺序的表述载体转化或转染细胞，此DNA顺序包括编码与表A中1位氨基酸直至205位氨基酸的205氨基酸顺序基本上同源的氨基酸顺序的部分，其中，第4位氨基酸是除Asn外的任何氨基酸。

9、根据权利要求8的方法，其中的4位氨基酸是Tyr。

10、根据权利要求1至9中任一项的方法，其中被转化或转染的细胞是细菌细胞。

11、根据权利要求10的方法，其中被转化或转染的细胞是苏云金芽孢杆菌细胞。

12、根据权利要求1至9中任一项的方法，其中被转化或转染的细胞是植物细胞。

13、一种杀虫组合物，其中包含一种权利要求1定义的杀虫有效量的蛋白，并结合有一种农业上可接受的载体。