DE3686452T2

DE3686452T2 - Aktiviertes bacillus thuringiensis-delta-endotoxin, hergestellt von einem manipulierten hybrid-gen.

Info

Publication number: DE3686452T2
Application number: DE8686304385T
Authority: DE
Inventors: Algis Anilionis; Donald A Colbert; Daniel P Witt
Original assignee: Repligen Corp
Current assignee: Repligen Corp
Priority date: 1985-06-14
Filing date: 1986-06-09
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2006-06-10
Also published as: EP0206613A3; EP0206613B1; DE3686452D1; EP0206613A2; JPS61291600A; US5110905A

Description

Bacillus thuringiensis, ein sporenbildendes Bakterium, von dem es mehr als 200 natürlich vorkommende Varianten gibt, produziert einen rhombischen Kristall während der Sporulation. Dieser Kristall ist bei Aufnahme für eine große Vielzahl von Schmetterlingslarven toxisch. Viele dieser empfindlichen Larven sind ökonomisch wichtige Getreideschädlinge. Der toxische Faktor in dem Kristall leitet sich ab von einem Proteinprotoxin mit einem Molekulargewicht von 130000, das als δ-Endotoxin bezeichnet wurde; das Protoxin ist nicht selbst toxisch, sondern erfordert eine proteolytische Aufarbeitung, was ein aktives Toxin (aktiviertes δ-Endotoxin) liefert, und diese Aufarbeitung geschieht normalerweise im Insektendarm.
Bacillus thuringiensis (B.t.) Toxin lieferte eine Basis für kommerzielle Formulierungen von Insektiziden in den letzten 10 Jahren. Der aktive Inhaltsstoff bei diesen Produkten ist ein getrocknetes Präparat sporulierter B.t.-Zellen. In diesem getrockneten Pulver ist der rhombische Kristall und die lebensfähige Spore enthalten, die sich regenerieren kann, was zu vegetativen B.t.-Zellen führt.
Die kommerziellen Präparate von B.t. haben in Bereichen von Gemüseanbau bis Forstwirtschaft Anwendung gefunden. Einschränkungen bei der Verwendung dieser Produkte schließen jedoch ein:
1. Instabilität des Toxingens in dem Mikroorganismus führt zu Schwierigkeiten bei der Qualitätskontrolle.
2. Probleme bei der Anwendung treten auf, da das Toxin in Teilchenform statt in löslicher Form ist.
3. Die Wirkgeschwindigkeit ist langsamer als die von chemischen Pestiziden, wahrscheinlich wegen der erforderlichen Aktivierungsstufe des Protoxins zum Toxin.
4. Die Manifestation der Toxizität erfordert die Aufnahme des toxischen Kristalls durch ein empfängliches Insekt.
5. Kommerzielle Präparate enthalten lebensfähige Sporen.
Trotz dieser Beschränkungen hat die Verwendung von B.t.-- Präparaten zugenommen, insbesondere in solchen Bereichen wie der Bekämpfung von Ungeziefer im Wald. Gründe dafür schließen ein:
1. Das Toxin ist sehr spezifisch für Insektenungeziefer und ist inaktiv gegenüber anderen Lebensformen einschließlich nützlicher Insekten.
2. Der aktive Faktor ist ein Proteinmolekül und als eine Konsequenz leicht bioabbaubar und bietet wenig Risiko bei einer Langzeitanwendung für das Ökosystem.
1981 wurde ein Gen, das das Protoxin kodiert, von einem kommerziellen Stamm von B.t. kloniert und in E. coli exprimiert von Schnepf und Mitarbeitern (H. E. Schnepf und H.R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897). Ein US-Patent wurde für diese Konstruktion erteilt (US-Patent Nr. 4 448 885). Das rekombinante Plasmid kodiert das gesamte Protoxinmolekül und das Gen ist unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors. EP-A-0 093 062 offenbart ein rekombinantes Protoxingen aus einem wahrscheinlich anderen Stamm (B. thuringiensis 1715).
In keinem von diesen Patenten ist die Sequenz des Gens oder des Proteinprodukts offenbart. Es ist offensichtlich, daß die Toxingene in beiden Fällen von undefinierten Sequenzen von DNA begrenzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Plasmids, das präaktiviertes B.t. δ-Endotoxin kodiert. Es ist keine Aufarbeitung des Genprodukts erforderlich für die Aktivität. Dieses Plasmid enthält ein konstruiertes Gen, das aus einem Fragment des B.t. δ-Endotoxingens besteht, das ein 0000d Protein kodiert, das identisch oder nahezu identisch ist mit dem aktivierten δ-Endotoxin, das durch Proteolyse aus dem Protoxinmolekül erzeugt wird. Somit ist das aktivierte Toxin ein direktes Produkt der Proteinsynthese und erfordert keine zusätzliche Prozessierung. Die Vorteile dieser genetischen Konstruktion sind folgende:
1. Das Gen ist stabiler als sein Gegenstück in B.t. und kann stabiler sein als das relativ undefinierte Fragment der DNA, die gemäß US-A-4 448 885 oder EP-A-0 093 062 kloniert wurde. Die Instabilität des natürlich vorkommenden Gens kann auftreten, da es innerhalb einer transposonartigen Struktur liegt (D. Lereclus, J. Ribier, A. Klier, G. Menou und M.M. Lecadet [1984] EMBO Journal 3:2561-2567). Invertierte Wiederholungssequenzen, die für ein Transposon charakteristisch sind, wurden aus dem Plasmid der vorliegenden Erfindung eliminiert.
2. Das aktivierte δ-Endotoxin, das direkt aus dem Hybridgen produziert wurde, ist im wesentlichen ein chemisches Produkt. Die Formulierung, in der es zur Kontrolle von Ungeziefer angewendet wird, enthält keine lebensfähigen Mikroorganismen oder Sporen. Dies bietet einen wesentlichen Vorteil gegenüber den derzeit verwendeten im Handel befindlichen Präparaten, die zu einem Austragen lebensfähiger Sporen in die Umgebung führen.
3. Das durch das Hybridgen erzeugte aktivierte δ-Endotoxin ist unlöslich, wird aber leicht in wäßrigen Lösungen in lösliche Form überführt. Dies kann Vorteile beim Auftragen bieten. Unlösliche Toxinkristalle, die sich von B.t. ableiten, können Probleme liefern bezüglich der Aufbringung und der Deckung. Diese Probleme werden mit einem löslichen Präparat überwunden.
4. Die theoretische Expressionsrate wird mindestens zweifach gegenüber den Konstruktionen von US-A-4 448 885 oder EP-A-0 093 062 erhöht, da das rekombinante Genprodukt des Hybridgens nur halb so groß ist wie das gesamte Protoxin. Die Vorteile können größer sein, da die C-terminale Hälfte des Moleküls, die bei der Konstruktion eliminiert wurde, zu einer Beschränkung des Wachstums/der Expression bei E. coli führen kann.
5. Die spezifische Aktivität des von dem Hybridgen produzierten aktivierten Moleküls ist tatsächlich doppelt so groß wie die von dem Protoxin, da die Hälfte des Moleküls, die nicht zur Toxizität beiträgt, eliminiert wurde. Somit ist die Aktivität des Materials, bezogen auf Gewicht, etwa doppelt so groß wie die von Protoxin, das mit dem rekombinanten Plasmid entweder von US-A-4 448 885 oder EP-A-0 093 062 produziert wurde.
6. Das von dem Hybridgen produzierte Protein ist ein präaktiviertes Toxin und erfordert keine weitere Verarbeitung oder Veränderung für die volle Aktivität. Im Gegensatz dazu sind sowohl die aus natürlichen Quellen stammenden δ-Endotoxine als auch die von rekombinanten Plasmiden von US-A-4 448 885 oder EP-A-0 093 062 exprimierten Endotoxine inaktive Moleküle und erfordern eine proteolytische Prozessierung für die Aktivität (M.M. Lecadet und R. Dedonder [1967] J. Invert. Pathol. 9:322). Obwohl die Prozessierung dieser Protoxine im Insektendarm geschehen kann, kann diese Präaktivierung eine Verbesserung der Tötungsgeschwindigkeit liefern, eine wichtige Überlegung bei der kommerziellen Nutzung von B.t.-Toxin.
Die Nukleotidsequenz des konstruierten Gens der vorliegenden Erfindung ist in Tafel A dargestellt. In Tafel A ist auch die abgeleitete Aminosäuresequenz des aktivierten B.t. δ-Endotoxins gezeigt.
Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des wesentlichen B.t. δ-Endotoxinfragments, das zwischen den Codons 566 und 608 liegt, sind in Tafel B gezeigt. Die Codons, die zwischen divergenten Genen konserviert sind, sind umrandet. Codons, bei denen Substitutionen zugelassen sind, wobei die Insektizideigenschaft des exprimierten Proteins erhalten bleibt, sind Asn&sub5;&sub7;&sub6;, Ser&sub5;&sub7;&sub8;, Asn&sub5;&sub7;&sub9;, Gly&sub5;&sub8;&sub0;, Ser&sub5;&sub8;&sub1;, Val&sub5;&sub8;&sub3;, Leu&sub5;&sub8;&sub6;, Ser&sub5;&sub8;&sub9;, His&sub5;&sub8;&sub9;, Val&sub5;&sub9;&sub0;, Asn&sub5;&sub9;&sub2; und Ala&sub6;&sub0;&sub7;. Somit kann eine Substitution mit irgendeiner Aminosäure, d. h. Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin oder Valin, an mindestens 12 Positionen der Sequenz erfolgen, wobei immer noch die Insektizidaktivität des δ-Endotoxins erhalten bleibt.
In den beigefügten Zeichnungen ist Fig. 1 ein Konstruktionsschema, das die Herstellung der Plasmide pK7-3 und pK8-1 aus den Plasmiden pBR322 und pK15 zeigt. Stufe (1) stellt den Bam/Pst-- Verdau dar; (2) stellt die Gelreinigung der Fragmente A und B von pBR322 und der Fragmente A' und B' von pK15 dar; und (3) stellt die Ligierung von Fragmenten A + A' und B + B' dar.
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pK8-1, wobei der umrahmte Bereich die in pBR322 insertierte DNA zeigt, auf einer Skala von 0 bis 11 Kb (Kilobasen).
Um die Ausführungsformen der Erfindung zu erhalten, wurde ein δ-Endotoxingen kloniert aus einem 72 Md Plasmid von Bacillus thuringiensis var. kurstaki (B.t.k.). Das Klonieren ist in den Beispielen beschrieben. Das entstehende rekombinante Plasmid, pK15, exprimierte bei Transformation in E. coli, ein Protein, das mit Antiseren reagierte, die gegen B.t.k. Endotoxin gerichtet waren, und war toxisch für die Larven des Tabakknospenwurms (TBW).
Das Subklonieren des Gens wurde erreicht, indem pK15 zuerst mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und PstI verdaut wurde (doppelter Verdau, um zwei Fragmente zu erzeugen). Die Rekombination dieser Fragmente mit auf gleiche Weise verdautem pBR322 lieferte zwei Plasmide. Bei einem dieser Plasmide, pK8-1, erwies sich, daß es das vollständige δ-Endotoxingen, das in pK15 vorhanden war, enthielt.
Dieses Insert wurde mit der Technik von Maxam und Gilbert (A.M. Maxam und W. Gilbert, (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. 74:560) sequenziert. Ein offener Leserahmen wurde festgestellt und die Aminosäuresequenz des aktivierten δ-Endotoxins wurde aus dem Subklon pK8-1 bestimmt.
Die aminoterminale Analyse des aktivierten toxischen Proteins aus B.t. kurstaki Kristallen wurde durchgeführt und die Sequenz erwies sich als:
Gly Glu X Ile Glu Thr,
was dem Hexapeptid der Codons 26 bis 31 des B.t.k. Gens entspricht:
Gly Glu Arg Ile Glu Thr³¹.
Dies ließ eine genaue Lokalisierung des Aminoterminus des prozessierten und aktivierten δ-Endotoxins in dem Protoxinmolekül zu.
Das Carboxyende des aktivierten Toxinmoleküls wurde durch Verdau mit Carboxypeptidase Y bestimmt und die Sequenz des Hauptprodukts war Val-Thr&sup6;¹&sup0;. Eine Betrachtung des Molekulargewichts des Proteins und der vorhergesagten Aminosäuresequenz führte zu der Zuordnung von Val-Thr&sup6;¹&sup0; als wahrscheinlichem C-Terminus der Hauptmolekülart. Die in Tafel A offenbarte Sequenz schließt zwei Aminosäureaustausche zu Lys-His an den Positionen 609 und 610 des natürlich vorkommenden Moleküls ein. Die Hauptmolekülart, die in dem mit Bromelain aktivierten Endotoxin vorhanden ist, wird daher vorhergesagt mit einer Länge von 585 Aminosäuren und hat ein berechnetes Molekulargewicht von 65406 Dalton. Der N-Terminus liegt bei Codon 26 und der C-Terminus der Hauptmolekülart des aktivierten Moleküls bei Codon 610.
Ein Plasmid, bezeichnet als pΔ649, wurde konstruiert, bei dem Sequenzen in der 3'-Hälfte des Strukturgens, die die nicht-toxischen und möglicherweise hemmenden Regionen kodieren; deletiert wurden, während die Region, die das prozessierte Protein, das oben beschrieben wurde, kodiert, erhalten blieb. Um diese Konstruktion herzustellen, wurde eine KpnI-Stelle bei Codon 722/723 in dem B.t. kurstaki δ-Endotoxingen verwendet. Diese einzige Restriktionsendonukleasestelle liegt 81 Codons stromabwärts (d. h. innerhalb der Protoxinsequenz) von dem Codon, das das Hauptende des proteaseaktivierten Toxins markiert. Das Stammplasmid wird an der KpnI-Stelle geöffnet und mit Bal31, einer doppelsträngigen Exonuklease verdaut. Die Religierung nach einem variablen Zeitraum führt zu einer Reihe von Plasmiden, die δ-Endotoxingene enthalten mit Trunkierungen am 3'-Ende. Das kürzeste Mitglied dieser Reihe, das die vollständige Toxizität gegenüber den Larven des Tabakknospenwurms zeigte, wurde als pΔ649 bezeichnet. Dieser Klon exprimierte ein Protein mit einem Molekulargewicht von 66000 d, das mit Antiseren, die gegen das B.t. kurstaki δ-Endotoxin gerichtet waren, reagierte. Die Nukleotidsequenzierung dieser Konstruktion ergab, daß das δ-Endotoxin am Codon 608 endet. An zwei falsche Aminosäuren, Lysin und Histidin schließt sich ein Stopcodon an. Ein abrupter und dramatischer Abfall der Toxizität wurde bei anderen Konstruktionen gefunden, die stromaufwärts von Codon 608 endeten. Der niedrige Grad an Toxizität, der sich bei diesen trunkierten Genprodukten zeigt, wurde bei erheblich kürzeren Proteinen aufrechterhalten.
Diese Untersuchungen ließen die Identifizierung einer Sequenz am Carboxyende des aktivierten B.t. δ-Endotoxinmoleküls zu, die wesentlich für die biologische Aktivität des Toxins ist. Diese Sequenz ist nicht länger als 45 Aminosäuren und ist in Tafel B gezeigt. Aminosäuresubstitutionen sind zugelassen zumindest bei 12 Codons. Diese sind auch in Tafel B gezeigt. Diese Sequenz ist nicht selbst toxisch, ist aber eine wesentliche Komponente des aktiven δ-Endotoxins und definiert das äußerste Carboxyende des funktionellen Moleküls. Proteine, die diese Sequenz verloren haben oder in diesem Bereich enden, zeigen eine merklich erniedrigte Aktivität gegenüber Schmetterlingslarven.
Das wesentliche funktionelle δ-Endotoxin liegt zwischen Codon 26 und Codon 608 des Protoxingens. Eine Sequenz am Carboxyende des Moleküls, die zwischen den Codons 566 und 608 (Tafel B) liegt, ist wesentlich für die biologische Aktivität des Moleküls. Die Toxizität ist sehr viel weniger empfindlich gegenüber einer Veränderung bei den Aminosäuren, die am N-Terminus liegen.
Es folgen Beispiele, die Verfahren zur Durchführung der Erfindung zeigen, einschließlich der besten Ausführungsform. Diese Beispiele sollen nicht als Beschränkung angesehen werden. Alle Prozentangaben sind bezogen auf Gewicht und alle Mischungsanteile bei Lösungsmitteln sind bezogen auf Volumen, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1 - Konstruktion des rekombinanten Plasmids pK15

Die Herstellung von Plasmid-DNA aus B.t. kurstaki-Zellen (NRRL B-15974) wurde begonnen, indem Zellen in L-Broth (1 l) bis A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,6 gezüchtet wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5 KUpm, 10 Minuten, 4ºC) pelletisiert, in kaltem TES-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA) resuspendiert und repelletiert. Die Lyse wurde durchgeführt, indem die Zellen in 4 ml Lysozympuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 nM NaCl, 25% Saccharose) resuspendiert wurden und anschließend 0,2 ml 10 mg/ml Lysozymlösung zugegeben wurde und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurde. Dann wurden 16 ml SDS-Puffer (1,25% SDS, 60 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0) und 5 ml 5M NaCl zugegeben und die Zellen wurden auf Eis 3 Stunden stehengelassen. Anschließend an das Pelletisieren der Zellbruchstücke durch Zentrifugation (15 KUpm, 30 Minuten, 4ºC) wurden 5 ml 50% PEG6000 zugegeben, mäßig gemischt und 1 bis 3 Stunden auf Eis stehengelassen. Der entstehende Niederschlag wurde durch Zentrifugation (10 KUpm, 10 Minuten, 4ºC) pelletisiert, in 2 ml TES-Puffer wieder aufgelöst und mit Pankreasribonuklease (200 ug/ml, 65ºC, 30 Minuten) behandelt. Ethidiumbromid wurde dann zugegeben (0,1 ml aus 10 mg/ml Vorratslösung) und das Volumen wurde auf 4 ml mit TE-Puffer (10 mM Tris-Hcl pH 8,0, 1 mM EDTA) eingestellt. CsCl wurde dann zugegeben (7,3 g/8 ml) und die Plasmid-DNA durch Zentrifugation (48 bis 72 Stunden, 42 KUpm, in Beckman Ti50 Rotor) aufgetrennt. Die Lokalisierung, Ernte und Behandlung der entstehenden Plasmid-DNA wurde durchgeführt unter Anwendung von Standardverfahren. Routineausbeuten an Plasmid-DNA waren etwa 200 ug pro Liter Zellen.
B.t.k. Plasmid-DNA wurde isoliert, wie oben beschrieben, und teilweise verdaut mit Sau3A Restriktionsendonuklease (100 ug/ml DNA, 17 u/ml Sau3A, 2,5 Minuten, 37ºC). Die entstehenden B.t.k. DNA-Fragmente (5 ug) wurden mit T4-Ligase ligiert. Das 130000 Dalton B.t.k. δ-Endotoxin sollte von einem DNA-Fragment mit einer Länge von 3,5 bis 4,0 Kilobasen (Kb) kodiert werden. Um eine größere Chance zu haben, das gesamte Protoxingen einschließlich Promotor, Ribosomenbindungsstelle und Terminationssignal zu klonieren, wurde ein Anreicherungsschema durchgeführt, um rekombinante Plasmide mit insertierter B.t.k. DNA, die größer war als die vorhergesagte Genlänge, zu erhalten.
Die von Schnepf und Whiteley (H. E. Schnepf und H.R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897) angegebenen Restriktionsendonukleasedaten zeigten, daß SalI das B.t.k. δ-Endotoxingen oder die direkt benachbarten flankierenden Sequenzen nicht schnitt. Unter Verwendung dieser Information wurden die ligierten rekombinanten B.t.k. Plasmide durch SalI Verdarn linearisiert und durch präparative Elektrophorese auf Agarosegel fraktioniert. Rekombinante Plasmid-DNA mit mehr als 10 Kb Länge (wahrscheinlich insertierte DNA größer als 6 Kb) wurde aus dem Gel extrahiert, mit T4-Ligase zirkularisiert und verwendet, um E. coli MS371 Zellen zu transformieren. Von den ersten 53 Ampr/Tets rekombinanten Kolonien wurden 24 für ein Minilysatpräparat und eine Restriktionsenzymanalyse entnommen. Die Größe der insertierten B.t.k. DNA lag im Bereich von 3,9 bis 14,7 Kb Länge mit einer durchschnittlichen Insertionslänge von 6,7 Kb. Die Zellextrakte von einem rekombinanten Plasmid, das als pK15 bezeichnet wurde, zeigten eine positive Reaktion mit Antiseren, die gegen B.t.k. 130000 Protoxin hergestellt worden waren und waren toxisch für Larven von Heliothis virescens bei einem Test auf Insektentoxizität. Da keine wesentliche Reaktion mit den Antiseren oder Toxizität gegenüber Larven bei Zellextrakten aus E. coli, die entweder pBR322 oder rekombinante Plasmide, die andere B.t.k. Plasmid-DNA insertiert enthielten, beobachtet wurde, wurde geschlossen, daß die insertierte B.t.k.-DNA von pK15 mindestens einen Teil des δ-Endotoxingens enthält.
Die isolierte DNA wurde dann mit Sau3A Restriktionsendonuklease (100 ug/ml DNA, 17 u/ml Sau3A, 2,5 Minuten, 37ºC) verdaut. Die entstehenden B.t.k. DNA-Fragmente (5 ug) wurden mit BamHZ verdauter pBR322 Plasmid-DNA (1,25 ug) vermischt und mit T4-Ligase ligiert. Das 130000 B.t.k. δ-Endotoxin sollte von einem DNA- Fragment mit einer Länge von 3,5 bis 4> 0 Kilobasen (Kb) kodiert werden. Um eine größere Chance zu haben, das gesamte Protoxingen, einschließlich Promotor, Ribosomenbindungsstelle und Terminationssignal, zu klonieren, wurde ein Anreicherungsschema durchgeführt, um rekombinante Plasmide zu erhalten mit insertierter B.t.k. DNA, die größer als die vorhergesagte Genlänge ist.
Die ligierten rekombinanten B.t.k. Plasmide wurden durch SalI Verdau linearisiert und durch präparative Standardelektrophorese auf Agarosegel fraktioniert. Rekombinante Plasmid-DNA mit einer Länge von mehr als 10 Kb (wahrscheinlich insertierte DNA größer als 6 Kb) wurde aus dem Gel extrahiert, mit T4-Ligase zirkularisiert und verwendet, um E. coli MS371 Zellen zu transformieren. Von den ersten 53 Ampr/Tets rekombinanten Kolonien wurden 24 für die Herstellung eines Minilysatpräparats und für eine Restriktionsenzymanalyse entnommen. Die Größe der insertierten B.t.k. DNA lag im Bereich zwischen 3,9 und 14,7 Kb Länge mit einer durchschnittlichen Länge der Insertion von 6,7 Kb. Die Zellextrakte aus einem rekombinanten Plasmid, das als pK15 bezeichnet wurde, zeigten eine positive Reaktion mit Antiseren, die gegen B.t.k. 130000 Protoxin erzeugt worden waren und waren toxisch gegenüber Larven von Heliothis virescens in einem Test auf Insektentoxizität. Da keine wesentliche Reaktion mit den Antiseren oder Toxizität gegenüber Larven mit Zellextrakten von E. coli, die entweder pBR322 oder rekombinante Plasmide, die andere B.t.k. Plasmid-DNA insertiert enthielten, beobachtet wurde, wurde geschlossen, daß die insertierte B.t.k. DNA von pK15 mindestens einen Teil des δ-Endotoxingens enthält.

Beispiel 2 - Herstellung der rekombinanten Plasmide pK7-3 und pK8-1

Das Plasmid pK15, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und PstI verdaut. Dieser Doppelverdau lieferte zwei Fragmente. Die Fragmente wurden durch Standardgelelektrophorese isoliert. Das Plasmid pBR322 wurde ebenso verdaut, was zwei Fragmente lieferte, die auf die gleiche Weise isoliert wurden.
Die zwei Fragmente aus Plasmid pK15 wurden dann mit den zwei Fragmenten, die durch Verdau von pBR322 erhalten wurden, ligiert. Die Ligierung wurde unter Standardbedingungen unter Verwendung von T4-Ligase durchgeführt. Das Ergebnis dieser Ligierung waren zwei Plasmide, die mit pK7-3 und pK8-1 bezeichnet wurden. Siehe Fig. 1 der Zeichnung. Es wurde gefunden, daß Plasmid pK8-1 das vollständige δ-Endotoxingen, das in Plasmid pK15 vorhanden war, enthielt.

Beispiel 3 - Herstellung der B.t.k. δ-Endotoxinmutante 649 des rekombinanten Plasmids pΔ649

Die Mutante 649 kann hergestellt werden, indem die einzige KpnI-Stelle in dem B.t.k. Gen geöffnet wird und von beiden Seiten mit, Bal3l verdaut wird. Der Verdau mit dieser Exonuklease wird beendet, nachdem 50 Nukleotide stromabwärts von der KpnI-Stelle entfernt worden sind. Die notwendige Inkubationszeit für diese Reaktion variiert je nach Bal31-Präparat und muß durch Agarosegelelektrophorese von religierten und mit HindIII verdauten Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen werden, überwacht werden. Das HindIII-Fragment pK8-1 hat 1050 bp, während das von pΔ649 285 bp hat.
Die Sequenzierung mit der Technik von Maxam und Gilbert (A.M. Maxam und W. Gilbert [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. 74:560) zeigte, daß pΔ649 mit Glu608 der δ-Endotoxinsequenz endete und mit einem nicht dazugehörigen Dipeptid, Lys-His, fusioniert war. Diese zwei Aminosäuren entstehen als Ergebnis einer Verschiebung des Leserahmens und einer falschen Ablesung und es schließt sich bei der Konstruktion ein Terminationskodon an. Das Genprodukt mit der vollständigen Länge ist somit 610 Aminosäuren lang, von denen 608 Aminosäuren sich von den δ-Endotoxinsequenzen ableiten. Das Genprodukt ist vollständig aktiv bei einem Bioassay unter Verwendung der Larven des Tabakknospenwurms. Genprodukte, die von kürzeren Konstrukten exprimiert werden, haben eine merklich verminderte Aktivität.
Die Plasmide pK8-1 und pΔ649 wurden in E. coli Wirtszellen mit Standardverfahren transformiert. Subkulturen dieser Plasmid enthaltenden Wirtszellen wurden in der Mikroorganismensammlung des Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt. Diese und andere Kulturen erhielten die folgenden Hinterlegungsnummern:
E. coli MS371 (pK8-1), NRRL B-15967 (hinterlegt am 24.04.85)
E. coli SG4044 (pΔ649), NRRL B-15968 (hinterlegt am 24.04.85)
E. coli SG4044, NRRL B-15969 (hinterlegt am 24.04.85)
E. coli MS371, NRRL B-15129 (hinterlegt am 18.08.82)
B.t.k. HD1R, NRRL B-15974 (hinterlegt am 06.06.85).
Plasmid pBR322 ist ein wohlbekanntes und erhältliches Plasmid. Es ist im Wirt E. coli ATCC 37017 enthalten. Gereinigte pBR322-DNA kann erhalten werden, wie bei F. Bolivar, R.L. Rodriquez, P.J. Greene, M.C. Betlach, H.L. Heyneker, H.W. Boyer, J.H. Crosa und S. Falkow (1977) Gene 2:95-113, und J.G. Sutcliffe (1978) Nucleic Acids Res. 5:2721-2728, beschrieben.

Beispiel 4 - Herstellung des rekombinanten Plasmids pKΔH

Das Plasmid pKΔH kann hergestellt werden durch Verdau von Plasmid pK8-1 mit der Endonuklease HindIII und Religierung mit Standardverfahren. Dies führt zur Deletion eines 1750 bp Fragments, das sich zwischen der rechten HindIII-Stelle, die in der Karte von Plasmid pK8-1 gezeigt ist, und der einzigen HindIII-Stelle von Plasmid pBR322 erstreckt. Das von diesem Konstrukt kodierte Genprodukt endet an oder etwa an Codon 565 und hat ein Molekulargewicht von 2000. Die Aktivität dieses Genproduktes in einem biologischen Test unter Verwendung der Larven des Tabakknospenwurms ist sehr niedrig verglichen mit pΔ649. Dieses Plasmid kann mit einem Fragment, das von dem in Beispiel 5 beschriebenen Konstrukt abgeleitet ist, rekombiniert werden, um ein Gen zu erzeugen, das ein vollständig aktives Proteintoxin kodiert.

Beispiel 5 - Herstellung des rekombinanten Plasmids pDW1

Das Plasmid pDW1, das die Hauptdomäne der Toxizität enthält, kann hergestellt werden durch Verdau des Plasmids pΔ649 mit HindIII und Isolierung über Standardgelelektrophorese eines 285 bp Fragments. Dieses Fragment kann in die einzige HindIII-Stelle der Mehrfachklonierungsstelle irgendeines pUC-Plasmids, zum Beispiel pUC8 (geliefert von Pharmacia, Piscataway, NJ), kloniert werden, was Plasmid pDW1 ergibt. Dieser Vektor kann dann verwendet werden, um größere Mengen dieses 285 bp HindIII-Fragmentes zu produzieren. Das Ausschneiden dieses Fragments aus pDW1 und das Klonieren in die HindIII-Stelle von pK H führt zur Rekonstruktion eines Gens, das ein aktives δ-Endotoxin in einem der beiden Transformanten kodiert. Die Selektion erfolgt durch Standardscreening mit Antikörper oder aufgrund der Toxizität.
Wie es auf diesem Gebiet wohlbekannt ist, wird die Aminosäuresequenz eines Proteins bestimmt durch die Nukleotidsequenz der DNA. Wegen der Redundanz des genetischen Codes, d. h. da mehr als ein kodierendes Nukleotidtriplett (Codon) für die meisten der Aminosäuren, die verwendet werden, um Proteine herzustellen, verwendet werden kann, können verschiedene Nukleotidsequenzen eine bestimmte Aminosäure kodieren. Somit kann der genetische Code wie folgt dargestellt werden:
Phenylalanin (Phe) TTK Histidin (His) CAK
Leucin (Leu) XTY Glutamin (Gln) CAJ
Isoleucin (Ile) ATM Asparagin (Asn) AAK
Methionin (Met) ATG Lysin (Lys) AAJ
Valin (Val) GTL Asparaginsäure (Asp) GAK
Serin (Ser) QRS Glutaminsäure (Glu) GAJ
Prolin (Pro) CCL Cystein (Cys) TGK
Threonin (Thr) ACL Tryptophan (Try) TGG
Alanin (Ala) GCL Arginin (Arg) WGZ
Tyrosin (Tyr) TAK Glycin (Gly) GGL
Terminationssignal TAJ
Terminationssignal TGA
Schlüssel: Jedes Deoxynukleotidtriplett mit 3 Buchstaben entspricht einem Trinukleotid von mRNA mit dem 5'-Ende auf der linken Seite und dem 3'-Ende auf der rechten Seite. Alle hier angegebenen DNA-Sequenzen sind solche aus dem Strang, dessen Sequenz der mRNA-Sequenz entspricht, wobei Thymin Uracil ersetzt. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Deoxynukleotidsequenz bilden.
A = Adenin
G = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin
X = T oder C, wenn Y A oder G ist
X = C, wenn Y C oder T ist
Y = A, G, C oder T, wenn X C ist
Y = A oder G, wenn X T ist
W = C oder A, wenn Z A oder G ist
W = C, wenn Z C oder T ist
Z = A, G, C oder T, wenn W C ist
Z = A oder G, wenn W A ist
QR = TC, wenn S A, G, C oder T ist
J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G
M = A, C oder T.
Die obigen Angaben zeigen, daß die neue Aminosäuresequenz eines Proteins hergestellt werden kann durch äquivalente Nukleotidsequenzen, die dieselbe Aminosäuresequenz des Proteins kodieren. Somit schließt die vorliegende Erfindung äquivalente Nukleotidsequenzen ein, die das B.t.k. δ-Endotoxin der vorliegenden Erfindung kodieren. Außerdem wurde gezeigt, daß Proteine der identifizierten Struktur und Funktion konstruiert werden können, indem die Aminosäuresequenz verändert wird, wenn diese Veränderung die Sekundär- oder Tertiärstruktur des Proteins nicht verändert (E.T. Kaiser und F.J. K zdy [1984] Science 223:249-255).
Die hier beschriebenen Untersuchungen geschahen alle im Einklang mit den physikalischen und biologischen Anforderungen, wie sie in den NIH-Richtlinien aufgeführt sind. Tafel A Tafel A (Seite 2) Tafel A (Seite 3) Tafel A (Seite 4) Tafel A (Seite 5) Tafel B

Claims

1. δ-Endotoxinprotein von B. thuringiensis kurstaki oder einem Analogen davon, das bezüglich der Funktion äquivalent ist, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus insgesamt 608 bis 610 Aminosäuren besteht, mit folgender Sequenz: a) die Aminosäuren, die sich von Aminosäureposition Nr. 1 bis Aminosäureposition Nr. 565 erstrecken, sind aufeinanderfolgend

b) die Aminosäuren, die sich von der Aninosäureposition Nr. 566 bis Aminosäureposition 608 erstrecken, entsprechen der Sequenz:

worin X irgendeine Aminosäure sein kann, die von einem genetischen Code kodiert wird,

c) eine Aminosäure an Aminosäureposition Nr. 609 ist entweder Val oder Lys; und

d) eine Aminosäure an Aminosäureposition Nr. 610 ist Thr oder His.

2. Protein nach Anspruch 1 mit insgesamt 610 Aminosäuren, wobei die endständigen Aminosäuren an den Aminosäurepositionen Nummer 609 und 610 Lys bzw. His sind.

3. Protein nach Anspruch 1 mit insgesamt 610 Aminosäuren, wobei die endständigen Aminosäuren an den Aminosäurepositionen Nummer 609 und 610 Val bzw. Thr sind.

4. Protein nach Anspruch 2, wobei die Aminosäuresequenz, die sich von Aminosäureposition Nr. 566 bis Aminosäureposition 608 erstreckt, die folgende ist:

5. Protein nach Anspruch 3, worin die Aminosäuresequenz, die sich von Aminosäureposition Nummer 566 bis Aminosäureposition 608 erstreckt, folgende ist:

6. Protein nach Anspruch 5 mit insgesamt 610 Aminosäuren, wobei die endständigen Aminosäuren an Aminosäureposition Nummer 609 und 610 Lys bzw. His sind.

7. Protein nach Anspruch 5 mit insgesamt 610 Aminosäuren, wobei die endständigen Aminosäuren an Aminosäureposition Nummer 609 und 610 Val bzw. Thr sind.

8. Rekombinanter DNA Transfervektor umfassend DNA mit einer Nukleotidsequenz, die Basen enthält, deren translatierte Region das δ-Endotoxinprotein von Anspruch 1 kodiert, wobei die Aminosäuren an Position Nummer 566 bis 608 durch die Nukleotidsequenz

oder eine äquivalente Sequenz davon kodiert werden, wobei NNN irgendein Codon ist, das die gewünschte Aminosäure kodiert.

9. Rekombinanter DNA Transfervektor gemäß Anspruch 8 umfassend DNA mit der folgenden Nukleotidsequenz oder einer äquivalenten Nukleotidsequenz, die Basen enthält, deren translatierte Region dieselbe Aminosäuresequenz kodiert:

10. Prokaryontischer Mikroorganismus, in den der DNA Transfervektor nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 transferiert wurde und repliziert werden kann.

11. Mikroorganismus nach Anspruch 10, der ein E. coli K-12 Derivat ist.

12. Plasmid pK8-1 (NRRL B-15967) oder Plasmid pΔ649 (NRRL B-15968).

13. Mikroorganismus transformiert mit dem Transfervektor von Anspruch 8 oder Anspruch 9.

14. E. coli MS371 (pK8-1) (NRRL B-15967) oder E. coli SG4044 (pΔ649) (NRRL B-15968).

15. Verfahren zur Herstellung eines δ-Endotoxinproteinprodukts mit der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz, umfassend, daß man einen prokaryontischen Mikroorganismus, der einen rekombinanten DNA-Transfervektor enthält, der DNA mit einer bestimmten Nukleotidsequenz oder einer äquivalenten Nukleotidsequenz umfaßt, die Basen enthält, deren translatierte Region dieselbe Aminosäuresequenz kodiert, wobei die bestimmte Sequenz die in Anspruch 9 definierte ist, der die Sequenz

vorangeht.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der prokaryontische Mikroorganismus ein E. coli K-12 Derivat ist und der rekombinante DNA-Transfervektor das Plasmid pK8-1 (NRRL B-15967) oder das Plasmid pΔ649 (NRRL B-15968) ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das E. coli K-12 Derivat E. coli MS371 oder E. coli SG4044 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 15, worin der rekombinante DNA-Transfervektor der in Anspruch 9 beanspruchte Vektor ist.