JPH02500566A

JPH02500566A - バチルス・スリンギエンシスからのｄｎａ配列で形質転換された植物

Info

Publication number: JPH02500566A
Application number: JP63506676A
Authority: JP
Inventors: ヴァエック，マーク; ホフテ，ヘルマヌス; ボッテルマン，ヨハン
Original assignee: プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ
Priority date: 1987-08-17
Filing date: 1988-08-15
Publication date: 1990-03-01
Also published as: WO1989001515A3; EP0305275A3; WO1989001515A2; EP0305275A2; AU2257288A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２、ｂｔ１３遺伝子断片がゲノム内に挿入されており、その断片が位置７３７から出発し、位置２４９７において終了し、及び本質的に６６ｋＤａタンパク質から構成される鞘翅類（Ｃｏ１ｅｏｐｔｅｒａ）毒素をコード化する第２図に示されるようなりＮＡ配列を有する請求項２に記載の細胞。

３、ｂｔ１３遺伝子が３５Ｓブロモ−クー、ＴＲＩ’プロモーター、或いはＴＲ２”プロモーターである強い構成植物プロモーターの下流及びその制御下にある請求項１又は２に記載の細胞。

４、ｂｔ１３遺伝子がポリアデニル化及びオクトビンシンターゼ遺伝子或いはＴ −ＤＮＡ遺伝子７からの転写停止信号の上流にある請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。

５、ｂｔ１３遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子と同一の転写ユニット内にあり、且つそれと同一のプロモーターの制御下にある請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。

６、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｌ毒素をコードする遺伝子も又細胞のゲノム内に挿入されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。

７、請求項１〜６のいずれか一項に記載の形質転換細胞がある植物。

８、請求項７に記載の植物の種子。

９、請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換細胞を有する植物を与えることを特徴とする植物を鞘翅類（Ｃｏ１ｅｏｐｔｅｒａ）に対して耐性にする方法。

１０、位置７３７から出発し１位置２４９７において終了する第２図に示されたＤＮＡ配列を特徴とするＤＮＡ。

１１、請求項１０のＤＮＡ配列によりコード化された６６ｋＤａ結晶タンパク質。

１２、請求項１０のＤＮＡ配列により形質転換された微生物、特に大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉｃ。

明細書バチルス・スリンギエンシスからのＤＮＡ配列で形質転換された植物１豆Ω１１本発明は菌株バチルス・スリンギエンシス・テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）（英国特許出願８７．１９４１４号）及びバチルス・スリンギエンシスＳｌ（英国特許出願８７．３０２６１号）の両者のゲノムにおいて、独立に見出されたＤＮＡ配列（ｒｂｔ１３遺伝子」）に関する。このｂｔ１３遺伝子は、これらのＢ、ｔ、菌株により産生される結晶毒素（ｒＢｔ１３毒素」）における活性タンパク質と思われる６６ｋＤａ結晶タンパク質（ｒＢｔ１３タンパク質」）をコード化する。このＢｔ１３毒素は鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）　（甲虫）に対して毒性である。

本発明は特にそのゲノムがｂｔ１３遺伝子により植物のいくらか或いはすべての細胞がｂｔ１３タンパク質を産生じて植物を鞘翅類に対して耐性となるように形質転換されるトマト或いはジャガイモ植物などの植物に関する。

このｂｔ１３遺伝子はヌクレオチド配列において、ｌ）ヨーロッパ特許公開公報０，２１３．８１８号（１９８７年）に開示されており、８６ｋＤａタンパク質を含有する鞘翅類毒素をコード化するＢ、ｔ、遺伝子、及び２）ヨーロッパ特許公開公報０．１４９．１６２号（１９８５年）に開示されており、２０．４ｏ、６５及び７０ｋＤａのタンパク質を含有する鞘翅類毒素を産生ずるＢ、ｔ、菌株中に見出された遺伝子と同一であることが判明した。

１豆至里１本発明に従えば、植物細胞ゲノムがｂｔ１３遺伝子の全部、特にＢｔ１３クンバク質をコード化するｂｔ１３遺伝子の部分により形質転換される。得られた植物細胞を用いて植物細胞のあるもの或いは全てがＢｔ１３クンバク質を産生ずることによりその遺伝子を発現して植物を鞘翅類耐性にすることができる。

又、本発明に従えば、ｂｔ１３遺伝子の全部或いは一部により植物細胞遺伝子の形質転換方法が提供される。

更に本発明に従えば、ｂｔ１３遺伝子から得ることができ、正にＢｔｌ　３タンパク質をコード化するＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ配列により形質転換された植物細胞は、本質的にＢｔ１３タンパク質により構成される鞘翅類毒素を産生ずることができる。

一旦！」０Ｌ焚諷ｊ本発明に従えば、ｂｔ１３遺伝子は常法によりドイツ連邦共和国、ゲッチンゲンに在るドイツ微生物収集機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　Ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）（ｒＤｓＭＪ　）に寄託されているＢ、ｔ、菌株：１）１９８７年１０月２２日に受理番号’４２８８で寄託されたもの（英国特許出願８７．３０２６１号に記載のもの）、及び２）受理番号２８０３で寄託されたもの（ヨーロッパ特許公開公報０．１４９．１６２号に記載のもの）から単離することができる。この点に関し、ｂｔ１３遺伝子のＤＮＡ配列は、これらの寄託された菌株から産生され、鞘翅類に対して毒性であるアミノ酸配列から演鐸することができる。

ｂｔ１３遺伝子はまた単一植物細胞の核ゲノム中に常法により安定的に挿入することができ、そのように形質転換された植物細胞を用いて常法により形質転換植物を産生ずることができる。この点に関し、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｌ中にｂｔ１３遺伝子を含有するＴｉ−プラスミドを用いて、例えばヨーロッパ特許出願０．１１６．７１８号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ３４１０２９１３及びヨーロッパ特許出願８７／４００．５４４．０　（これらは、本発明において準用する）に記載された方法を使用して植物細胞を形質転換することができる。

好ましくは、ｂｔ１３遺伝子は植物細胞中の遺伝子の発現を指図するプロモーターの下流において且つその制御下に植物ゲノム内に挿入される。好ましいプロモーターとしては、強い構成外来性植物プロモーター例えば、３５Ｓ転写物を指図するカリフラワーモザイクウィルス（Ｏｄｅｌｌ、　Ｊ、　Ｔ、、　Ｎａｇｙ、　Ｊ、及びＣｈｕａ。

Ｎ、Ｍ、（１９８５年）　、　Ｎａｔｕｒｅ３１３，８１０〜８１２）［ｒ３５ＳプロモーターＪ］；ＣａＭＶ単離物Ｃａｂｂ−ＪＩからの３５Ｓプロモーター（Ｈｕｌｌ及びＨｏｗｅｌｌ　（１９８７年）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８６．４８２−４９３）［ｒ３５Ｓ３プロモーター」］；及びＴ−ＤＮＡの１′及び２′遺伝子の発現をそれぞれ駆動するＴＲＩ′プロモーター及びＴＲ２’プロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ等（１９８４年）　ＥＭＢＯＪ、３．２７２３−２７３０）［それぞれｒＴＲｌ”プロモーター」及びｒＴＲ２’プロモーター」］が挙げられる。或いは又、構成的なものではないが、しかし、植物の１種以上の組織或いは器官（例、葉及び／又は根）に対して特異的であり、Ｂｔ１３クンバク質がこれらの特異的組織或いは器官においてのみ発現されるプロモーターを用いることができる０例えば、ｂｔ１３遺伝子はその遺伝子をその植物自体の或いは米国特許出願８２１，５８２号明細書（１９８６年１月２２日出願、本発明において準用）に開示されるようなもう一つの植物のりブロース−１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターなどの光−誘発性プロモーターの制御下におくことにより植物（例、トマト或いはジャガイモ）の葉に選択的に発現することが可能である。又、その発現が誘発可能である（例、温度或いは化学的要因により）プロモーターを使用することもできる。

ｂｔ１３遺伝子は適当なポリアデニル化及び転写停止信号の上流の植物ゲノム、例えば、オクトビンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎ等、（１９８４年）　、ＥＭＢＯＪ。

３．８３５〜８４５）；或いはＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８５年）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　（ｒＮＡ　ＲＪ　）　ｌ　３．６９８１−６９９８）などに挿入することが更に好ましい。

ｂｔ１３遺伝子は更に選択可能なマーカー遺伝子と同一の転写ユニット内にあり、且つそれと同一のプロモーターの制御下におかれて、これらの二つの遺伝子が融合タンパク質として形質転換植物に発現されることが更に好ましい（米国特許８願８２１，５８２号、１９８６年１月２２日出願；　Ｖａｅｃｋ等（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ３２７．３３〜３７）、その発現を形質転換植物細胞の選択に用いることのできる任意の通常のマーカー遺伝子を利用することができる。適当な選択的マーカー遺伝子の具体例はカナマイシン耐性をコード化するｎｅｏ遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子である。（ヨーロッパ特許出願８７／４００．５４４．Ｏ：米国特許出願８２１．５８２号）。

ｂｔ１３遺伝子は、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｌに対する毒素をコード化するｂｔ２遺伝子（米国特許出願８２１．５８２号：　Ｈｏｆｔｅ等（１９８６年）　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｄｅｍ、１６１．２７３−２８０）などの遺伝子と共に植物遺伝子ゲノムに挿入されることが更に好ましい、それにより、鱗翅類及び鞘翅類の両者に耐性を有する形質転換植物を産生することができる。

以下の実施例は本発明を例示するものである。これらの実施例において、言及される図面は下記の通りである。

第１区は、実施例１及び２においてｂｔ１３遺伝子を含有するプラスミドｐＢｔ１３０及びｐＢｔ２３０’の２．９ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ！断片の制限地図を示す。

第２図は、ｂｔ１３遺伝子の開放読取り枠（ｒＯＲＦＪ）を含むヌクレオチド配列及びＢｔ１３タンパク質の推定アミノ酸配列を示す、ｂｔ１３遺伝子はヌクレオチド５６６からヌクレオチド２４９７までの第２図に示されるヌクレオチド配列を示す、コスミドクローンなスクリーニングするために用いられた合成りＮＡプローブも示され、ｂｔ１３遺伝子のＤＮＡとの不適合は下線を付せられている。Ｂｔ１３タンパク質の２２Ｎ−末端アミノ酸が示されている。疑問符（ｒ？Ｊ）はこのアミノ酸残基が明確に決定されなかったことを示し、二つの可能性のあるアミノ酸残基が示されている。ｂｔ１３遺伝子の枠内ＡＴＧ−コドンに二重下線が引かれている。第一の枠内上流停止コドンを枠で囲み、又推定Ｓｈｉｎｅ− Ｄａ１ｇａｒｎ。

配列は下線を付されている。

第３図はＢｔ１３タンパク質の予測されたアミノ酸配列を有するｂｔ１３遺伝子の３′末端配列を示す、その他の公知のＢ、ｔ、毒素における同種の配列を示す、矢印はＢｔ２毒素（米国特許出願８２１．５８２号：　Ｈｏｆｔｅ等（１９８６年））の最大非毒性断片（「断片１」）及び最少毒性断片（「断片２」）のＣ −末端を示す、この図面における番号は、第２図に示された配列の番号に対応するものではない。

第４図は、ｂｔ１３遺伝子の５゛末端（断片ｌ）及び３′末端（断片２）のプラスミドｐＭＡ５−８へのクローニングを概略図示するものである。

第５図は、ｂｔ１３遺伝子の５゛及び３′末端の突然変異誘発的を概略図示するものである。ヌクレオチド配列変化は枠に囲んである。ｂｔ１３のコドンは番号が付されている。

第６図は、Ａ）ベクターｐ　Ｂ　ｔ　’１３６を形成するｂｔ１３遺伝子の修飾３′末端のプラスミドｐｔＪｃ１９中へのクローニング及び挿入断片のｐＢｔ１３６における配置、及びＢ）ｐＢｔ１３６からのＥ。

コリ発現ペククーｐＢｔ１３４及びｐＢｔ１３５の造築を概略図示する。

第７図は、融合遺伝子のプラスミドｐＢｔ１３ｎｅ。

の造築及び融合遺伝子の接合における配列を概略図示する。

第８図はｂｔ−１３遺伝子の全部或いは一部を含む植物発現ベクター：Ａ）ｐＧｓＪ１４１及びｐＧＳＪ１４２：Ｂ）ｐＧｓＪ１４３及びｐＧＳＪ１４４：Ｃ）　ｐＧＳＪ１４７及びｐＧＳＪ　ｌ　４８　：及びＤ）ｐＴＶＥ３８の造築を概略図示する。

第９図は、ｂｔ１３遺伝子を含有する植物遺伝子ベクターｐＧｓＪ１４５及びｐＧｓＪ１４６の造築を概略図示する。

実施例において特に断りのない限り、組換えＤＮＡの作成及び操作方法は全てＭａｎｉａｔｉｓ等ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２年）において説明されている標準化された方法により行った。

実施例において用いられた次のプラスミド及びベクターを含有するＥ、コリはブタペスト条約の規定の下にＤＳＭに寄託されている。

１−ｂｔ　１３’のポリクローナル抗血清を５０ｍＭ　Ｎａｇ　ＣＯｓ　、　ｐＨ１０＋１０ｍＭジチオスレイトール（ｒＤＴＴＪ　）を含有する緩衝溶液内において可溶化された全バチルス・スリンギエンシス・テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）結晶毒素に対して、マウス内において栽培した。この結晶毒素は、　Ｍａｈｉｌｌｏｎ。

Ｊ、及びＤｅｌｃｏｕｒ、　Ｊ、（１９８４）　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　３　、６９−７３に従って精製した。この結晶毒素は５ＤＳ− ＰＡＧＥに示されるような一つの主５５ｋＤａタンパク質を含有した（　Ｌａｅｍｍｌｉ、　１１゜（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０−６８５）、結晶中におけるこの主６６ｋＤａタンパク質のＮ−末端配列を決定した。この目的のために、全結晶タンパク質をポリブレン被覆ガラス繊維上にプロットしくヨーロッパ特許出願８６／４０１９３３．６）及び６６ｋＤａタンパク質を抽出してアミノ酸配列決定を行った。第２図に示されるような最初の２２個のアミノ酸の配列は、Ｈｅｗｉｃｋ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ、　Ｍ、　Ｗ、。

Ｈｏｏｄ、　Ｌ、　Ｅ、及びＤｒｅｙｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、（１９８１）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５６．７９９０〜７９９７において記載されるように操作される気相配列決定器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、　ＵＳＡＩを用いる気相配列決定により決定した。精製可溶化結晶は、コロラドジャガイモ甲虫（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）に対して〈１１００ｎ／ｃｍ”のＬＤ５０を示した。

Ｂ、ｔ、テネブリオニスの部分５ａｕ３Ａ−消化全ＤＮＡのライブラリーを前者の独特のＥｃｏＲＩ部位におけるＢａｍＨＩ−リンカ−を用いてｐＬＡＦＲｌ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、　Ａ、　Ｍ、、　Ｌｏｎｇ、　Ｓ、　Ｒ，、Ｂｒｏｗｎ、　Ｓ、　Ｅ、。

Ｂｉｕｋｅｍａ、　Ｗ、　Ｊ、及びＡｎｓｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、　（１９８２）、Ｇｅｎｅｌ８．２８９−２９６）の誘導体であるコスミドベクターｐＬＡＦＢ　ｌ中に造築した。Ｂ、ｔ、テネブリオニスの結晶毒素に対して栽培されたポリクローナルマウス坑血清を用いて約２０ｏＯ個のクローンをコロニー免疫アッセイにおいてスクリーニングした。２１個の陽性クローンを更に全細胞抽出物のウェスタンブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，、５ｔａｈｅｌｉｎ、　Ｔ、及びＧｏｒｄｏｎ、　Ｊ、　（１９７９年）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、米国（ｒＰＮＡｓＪ　）７６．４３５０−４３５３）により分析した。これらのクローンの中には、可視化交叉反応タンパク質に基づき四種の異ったタイプが区別された。これらの四種のクローンを次表１に示す。

１：Ｂ、ｔ、テネラ１オニス　日　と六゛　口るクンバク　を　るＥ、コリクローンのタイプＢ、ｔ、テネブリオニス結晶毒素の１０個のアミノ酸配列（第２図）に基づき、Ｉｔｅｋａｒｕ等（１９８４）Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５３，３２３−３５６の方法を用いて２９ｂＰ縮退ＤＮＡプローブを合成した。四つのタイプのコスミドベクーンの代表例を低緊縮性反応条件下においてハイブリダイズした。

ｐＢＴＴ３２　（タイプ■）のみがプローブとの相同性を示した。ハイブリダイズ配列を１．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に局在化した。この断片の両側からのＤ　Ｎ　’Ａ配列決定（Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ（１９８０年）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５．４９９−５６０）はｂｔ２遺伝子（Ｈｏｆｔｅ等、（１９８６年））に対する何等かの相同性を示す開放読取り枠が２．９ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩｒ断片上に局在化され得ることを示した。この断片をｐ　Ｕ　Ｃ８（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１９８２）　Ｇｅｎｅｌ　９．２５９−２６８）中にサブクローニングしてプラスミドｐＢｔ１３０（第４図）を生じた。

ｐＢｔ１３０がウェスタンプロットに示されるようにポリクローナルマウス抗− Ｂ、ｔ、テネブリオニス結晶毒素血清と反応した７　１　ｋＤａタンパク質のＥ、コリにおける合成を指図した。この７１ｋＤａタンパク質はＥ、コリにおいてＢ、ｔ、テネブリオニスの主６６ｋＤａ結晶クンバク質と同一の大きさのタンパク質にプロセッシングされた。ｐＢｔ１３０はベクターのプロモーター（ｐＬａｃ）に関して反対配向のｂｔ１３遺伝子を含有した。従って、この遺伝子はそれ自身のプロモーターから転写された。この発現を高めるだめに、ｂｔ１３遺伝子をプラスミドｐＬＫ５９（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ、　Ｊ、及びＺａｂｅａｕ、　Ｍ、　（１９８７年）、ＤＮＡ６，５８３−５９１）中のラムグＰＬ−プロモーターノ後のＨｉ　ｎｄｌＴＩ断片としてクローニングし、それを次いで用いてラムダＰＬブロモークーの温度感応性レプレッサーを有するＥ、コリ菌株に一１２△ Ｈ１△ｔ　ｒ　ｐ　（Ｂｅｒｎａｒｄ等（１９７９年）、Ｇｅｎｅ５．５９−７６）を形質転換した。この造築は・形質転換Ｅ、コリに一１２△Ｈ１△ｔｒｐの４２℃における温度誘発時において高レベルのＢｔ１３タンパク質の発現を与えた。

例２−もｍ一つのｂｔ１３遺伝　ｒｂｔ１３’ｌ旦土ＬＬ二！ＩＤ　Ｓ　Ｍに受理番号４２８８で寄託したＢ、ｔ。

菌株の結晶毒素をＫｒｉｅｇ、　Ｖ、　Ａ、、　Ｈｕｇｅｒ、　Ａ、　Ｍ、。

Ｌａｎｇｅｎｂｒｕｃｈ、　Ｇ、　Ａ、及び５ｃｈｎｅｔｔｅｒ、　Ｗ、　（１９８３年）により、２．　Ａｎｇｅｗ、　Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ９６．５００〜５０８に記載された方法を用いて精製した。ポリクローナル抗血清をこのＢ、ｔ、菌株ＤＳＭ４２８８により産生される結晶毒素に対してウサギ中で産生せしめた（米国特許出回８２１，５８２号）、この抗血清を用いてこのＢ、ｔ、菌株により産生される結晶タンパク質をウェスタンブロッティングにより検出した。

６６ｋＤａ結晶タンパク質がこのＢ、ｔ、菌株ＤＳＭ４２８８により産生される結晶毒素の主成分であることがＳ　Ｄ　Ｓ　−ｐａ　ｇ　ｅ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｌｌ。

（１９７０年））により示された。この毒素の６６ｋＤａタンパク質のＮ−末端配列を次いで決定した。この目的のために、全結晶タンパク質をポリブレン−被覆ガラス繊維上でプロットしくヨーロッパ特許出願８６／４０１９３３．６）約６６ｋＤａ断片を抽出して気相配列決定（Ｈｅｗｉｃｋ等（１９８１年））によりアミノ酸の配列決定を行った。

この菌株の部分５ａｕ３Ａ−消化全ＤＮＡのライブラリーをＢａｍＨＩ部位を用いてｐ　Ｕ　Ｃ８（Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２年））中で造築した。実施例１のｂｔ１３遺伝子に由来する約１０００個の塩基対ＢａρＩ−ＸｂａＩ断片（第１図）を放射活性（ｓｉｐ）標識し、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。プラスミドＤＮＡを強ハイブリグイズ化クローンから抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｂｔ１３遺伝子から得られたプローブを用いてサザーンブロッティングにおいて分析した。プローブとハイブリダイズした２、９ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ＋断片を含有する数個のプラスミドを同定した。ＨｉｎｄＩＩ［断片の両側から配列決定したＤ　Ｎ　Ａ　（Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ　（１９８０年））は実施例１のｂｔ１３遺伝子に対して相同性を示すＯＲ’ＦがこのＨｉｎｄＩＩｌ断片に局在化されたことを示した。この断片をｐＵＣ８（Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８２年））中においてサブクローニングしてプラスミドｐＢｔ１３０′を生じた。

ｐＢｔ１３０’はウェスタンプロットにおいてＢ、ｔ、菌株ＤＳＭ４２８８の結晶毒素に対するポリクローナルウサギ抗血清と反応した７１ｋＤａタンパク質のＥ、コリ内における合成を指示した。この７１ｋＤａタンパク質はＥ、コリ内においてＢ、ｔ、菌株ＤＳＭ４２８８の主６６ｋＤａ結晶タンパク質と同一の大きさのタンパク質中にプロセッシングされた。ｐＢｔ１３０′はベクターのプロモーター（ｐＬａｃ）に関して反対配向にｂｔ１３”遺伝子を含有した。従って、この遺伝子はそれ自身のプロモーターから転写された。その発現を高めるために、ｂｔ１３’遺伝子をプラスミドｐＬＫ５９中のラムダＰＬ−プロモーター（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ（１９８７年））の後のＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローニングし、それを次いで用いてＥ、コリ菌株に一１２△Ｈ１△ｔ　ｒ　ｐ　（Ｂｅｒｎａｒｄ等（１９７９年））を形質転換した。この造築は形質転換Ｅ、コリに一１２△Ｈ１△ｔｒｐの４２℃における温度誘発時に高レベルのｂｔ１３′遺伝子の発現を与えた。

＋３−ｂｔ１３’　びｂｔ１３パ　の１１立且μ 実施例１のｂｔ１３遺伝子及び実施例２のｂｔ１３’遺伝子は、それらが異った領域において発見された二つの菌株から独立に単離されたという事実にも拘らず、同一であることが判明した０両ｂｔ１３遺伝子は予測された７１ｋＤａの分子量を有する６４４個のアミノ酸のポリペプチドをコード化する０両ｂｔ１３遺伝子におけるＡＴＧイニシエーターコドンは遺伝子のＤＮＡ配列において５６６の位置に局在化する（第２図）、この結論は次の想定に基づくものであった：Ａ）主６６ｋＤａ結晶タンパク質のＮ−末端配列は位置７３７から出発する。両ｂｔ１３遺伝子からの予測されたアミノ酸配列と一致する（第２図）、これは６６ｋＤａタンパク質がより長い７１　ｋＤａ前駆体のプロセッシングされた生成物であることを示す、６６及び７１　ｋＤａタンパク質は共に実施例１及び２においてｂｔ１３遺伝子を発現するＥ、コリクローンにおいても観察された。

Ｂ）ｂｐ７３７の上流の最初の枠内停止コドンは位置５２７にある。その間に３個の枠内ＡＴＧ−コドンがある。位置５６６におけるＡＴＧはイニシェークーコドンに対する候補者として極めてふされしいものである；１）それは明確な５ｈｉｎｅ及びＤａ１ｇａｒｎｏ配列により先行される唯一の枠内ＡＴＧである。（５ｈｉｎｅ、　Ｊ、及びＤａｌｇａｒｎｏ、　Ｌ、　（１９７４年）　ＰＮＡＳ７１．１３４２〜１３４６）。

２）この位置において開始する予測されたＮ−末端配列はｂｔ２遺伝子のＮ−末端に対して相同性を示す（Ｈｏｆｔｅ等１９８６年）；ｂｔ１３遺伝子：Ｍ−ＮＰＮＮｂｔ　２遺伝子：　ＭＤＮＮＰＮＣ）位置５６６において出発するＯＲＦは、位置２４９７において終了する。

Ｄ）両ｂｔ１３遺伝子によりコード化された６６ｋＤａタンパク質はＢ、ｔ、ベルソナー１フ１５菌株（Ｈｏｆｔｅ等（１９８６年））及びＢ、ｔ、イスラエレンシス４Ｑ−２７２菌株（米国特許出願０２１．４０５号、１９８７年３月４日出願；Ｃｈｕｎｇｊａｔｕｐｏｒｎｅｈａｉ等（１９８８年）　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７３．９−１６）によりそれぞれ産生されたＢｉ２及びＢｔ８結晶毒素と局所的な相同生を示す（第３図）、これらのｂｔ１３遺伝子の各々のＣ−末端配列も又その他のＢ、ｔ、毒素類（第３図）における公知の配列と強い相同性を示す、更に、欠失マツピングにより決定されたＢｔ２結晶毒性（Ｖａｅｃｋ等（１９８７年））の最少毒素断片のＣ−末端はこれらのｂｔ１３遺伝子の各々の結晶タンパク質のＣ−末端アミノ酸に先行するアミノ酸配列と一致する。Ｂｔ１３タンパク質はこのように天然の截頭アッセイ毒素と考えることができる。

これらの想定はＭ　ｃ　Ｐ　ｈ　ｅ　ｒ　ｓ　ｏ　ｎ等（１９８８年）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ６．６１−６６により確認された。

９施例４−Ｅコリにお（るＢｔ１３タンパク　の′澁Ｈｏｆｔｅ等（１９８６年）の方法を用いて、精製Ｂｔ１３タンパク質（６６ｋ　Ｄ　ａ）を７１　ｋＤａ前駆体と共に実施例１及び２の形質転換Ｅ、コリに一１２△Ｈ１△ｔｒｐの誘発培養液から製造した。

そのように製造されたＢｔ１３タンパク質はレプチノクルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）に対して１２　ｎｇ／　ｃｍ”のＬＤｓｏ値を示した。

命旌例５−ｂｔ１３遺伝　を　いる１　形　転　力立工Σ二豆１トランスジェニック植物においてｂｔ１３遺伝子の最適発現を得るために、実施例１及び２のｂｔ１３遺伝子の各々を用いて、異った強転写開始信号（プロモーター）を用いて第４図〜第９図に示されるようにしてキメラ造築物を作成した。

実施例１及び２のＥ、コリに一１２△Ｈ１△ｔｒｐ菌株におけるｂｔ１３遺伝子は遺伝子カセットとして容易に利用可能でなかったので、遺伝子を次のようにして修飾した。

’　ＢａｍＨＩ部位をｂｔ１３遺伝子のＡＴＧコドンに隣接して創出した。ｂｔ１３遺伝子の４番目のヌクレオチドを、５ｔａｎｓｓｅｎｓ、　Ｐ、、　ＭｃＫｅｏｗｎ、　Ｙ、、　Ｆｒ１ｅｄｒｉｃｋ。

Ｋ、及びＦｒ１ｔｚ、　Ｈ，Ｊ、　（１９８７年）ドイツ連邦共和国マルチンスリート、Ｍａｘ　Ｐｌａｎｃｋ生化学研究所にて１９８０年７月に「指図突然変異誘発及びタンパク質エンジニャリング（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　Ｊと題するＥＭＢＯコースにおいて公布された実験方法集において刊行されているｒ　ｐ　Ｍ　ａ　／　ｃファスミドベクターを用いるギヤラビング二本鎖ＤＮＡ法によるオリゴヌクレオチド−指図突然変異の構成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘＤＮＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐＭａ／ｃ　ｐｈａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ）　Ｊにおいて記載されている方法によって、部位指図突然誘発によりＡからＧへ変化させて遺伝子内に独特のＢａｍＨＩを得た。「コザック則（Ｋｏｚａｋ−ｒｕｌｅｓ）　Ｊ（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、（１９８６年）　Ｃｅ１１４４．２８３−２９２）によれば、この突然変異は又植物細胞における翻訳開始を最適化すべきである。しかしながら、この突然変異は又、Ａ　ｓ　ｎからＡｓｐまでのｂｔ１３遺伝子の２番目のアミノ酸も変化させる。この突然変異のＥｔ１３タンパク質の活性に及ぼす影響をＥ、コリにおける修飾タンパク質の発現後に毒性アッセイにおいて評価した。

ｂｔ１３遺伝子の第２＠目のコドンの変化を避けるために、別の造築を行った。

Ｈｉｎｆ１部位をＡＴＧ−イニシューターコドン（’ＡＴ　Ｇ　ＡＡＴ　ＣＣ’ 　）　の直接下流に与えて第２番目のコドンを植物ブロモ−クー断片内に存在するイニシェークーに直接融合させた。

更に、プロセッシングされた６６ｋＤａタンパク質をコード化する断片を有する造築物を作成した。Ｂｔ１３タンパク質は、Ｅ、コリ内及びＢ、ｔ、菌株内の６６ｋＤａ　Ｂｔ１３タンパク質中にプロセッシングされた（結晶形成時に）約７１ｋＤａの前駆体として合成されるものと思われる。その他のＢ、ｔ。

毒素類（Ｈｏｆｔｅ等（１９８８年８月）　、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ１−ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ／、印刷中）と異り、この６６ｋＤａ　Ｂｔ１３タンパク質は、既にＢ、スリンギエンシス・テネブリオニスの結晶中にプロセッシングされた形態で存在する。７１ｋＤａの前駆体タンパク質が鞘翅類の幼虫の中腸或いは植物細胞内で正確に活性化されるか否かは知られていないので、別のアプローチはこの６６ｋＤａタンパク質をコード化する遺伝子断片をそのまま形質転換植物において発現することであった。この目的のために、制限部位を前駆体タンパク質の位置５８におけるアミノ酸の推定プロセッシング部位において創出した（第２図）。

Ｆｏｋ１部位を６６ｋＤａタンパク質をコード化する遺伝子断片の第一コドンの９塩基対上流に５ｔａｎｓｓｅｎｓ等（１９８７年）の突然変異誘発法により導入した。これはｒｂｔ１３−５７Ｊと称される修飾ｂｔ１３遺伝子を与えた。Ｆｏｋｌの認識部位は、それに正しくプロセッシング部位において、制限断片を発生させたその切断部位から分離した。

ｂｔ１３遺伝子コード化領域の植物発現ベクター内の転写停止及びポリアデニル化信号への適当な融合を行うために、ｂｔ１３遺伝子中の非−コード化配列下流（３′末端）を除去した。この目的のために、ＴＡＡ停止コドンに重複するＥｃｏＲＩ部位を有するオリゴヌクレオチドを５ｔａｎｓｓｅｎｓ等（１９８７年）の突然変異誘発法によりｂｔ１３遺伝子中に導入した。

鞘翅類を殺す十分なりｔ１３タンパク質を産生ずるトランスジェニック植物を容易に選択することができるように、選択性マーカーをコード化する遺伝子を用いてハイブリッド遺伝子造築物を米国特許出願８２１．５８２号明細書及びＶａｅｃｋ等（１９８７年）に記載されるようにして作成した。そのようなハイブリッド造築物はそのマーカー遺伝子発現がｂｔ１３遺伝子発現も又形質転換体を鞘翅類耐性にするのに十分で大きいことを適当に予測することができるように十分に大きい形質転換体の選択を可能にする（　Ｈｏｆｔｅ等（１９８６年）　、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２２６．３６４−３７０）、この目的のために、ｂｔ１３−ｎｅｏハイブリッド遺伝子融合体を造築した。停止コドンの前にＨｐａ　Ｉ部位を発生させるために、全パラグラフからのＥｃｏＲＩ部位を有するオリゴヌクレオチドを用いた。この部位はｂｔ１３遺伝子及びｂｔ１３−５７遺伝子のコドン６４３を米国特許出願８２１．５８２号明細書に記載されるような活性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ酵素Ｈを活性化するｎｅｏ遺伝子断片（「ＮＰＴ■」）に融合させた。Ｃ−末端Ａｓｎは毒性に必須のものでないように思われた。得られた融合タンパク質をＨｏｆｔｅ等（１９８６年）により記載された方法によりｂｔ１３−ｎｅｏハイブリッド遺伝子融合で形質転換されたＥ、コリ内において産生し、以下のようにしてＢｔ１３及びＮＰＴＩＩ活性を試験した。

上記修飾のＢｔ１３タンパク質の活性に及ぼす影響を評価するために、修飾ｂｔ１３遺伝子なＥ、コリ内に退いて発現させ、それらの修飾ｂｔ１３タンパク質生成物をコロラドジャガイモ甲虫に対して試験した。この目的のために、ｂｔ１３遺伝子断片をフェーズ内においてファージラムダのＰ７プロモーターの制御下にファージラムダのｃｒｏ遺伝子のＡＴＧ−イニシェークーコドンに融合させた（　Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ（１９８７年））。

以下に説明するように、ｂｔ１３遺伝子の植物内の発現は上記の異ったｂｔ１３カセットを５′末端の３５Ｓ、ＴＲＩ　′或いはＴＲ２′プロモーターの制御下に置くことにより得られた。シンターゼ遺伝子（ｒｏｃｓＪ　）　（Ｇｉｅｌｅｎ等（１９８４年））或いはＴ−ＤＮＡ遺伝子（ｒ　ｇ　７　Ｊ　）　（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ（１９８５年））からのポリアデニル化及び転写停止信号も又遺伝子カセットの３′末端に与えられた。ハイブリッド遺伝子造築物思外は、カセットは更に形質転換体に対する選択マーカー、即ちそれ自身のＴＲＩ’ プロモーター或いはツバリンシンターゼ遺伝子（ｒＰｎｏｓＪ−米国特許出願８２１，５８２号明細書）からのプロモーター及びそれ自身のＯＣＳポリアデニル化及び転写停止信号を含有した。鱗翅類及びめにｂｔ２及びｂｔ１３遺伝子の両者を含有する造築物も又作成した。これらのキメラ造築物の各々をアグロバクテリウム・ラネファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　（Ｄｅｂｌａｅｒｅ等（１９８５年）、ＮＡＲ１３，４７７７−４７８８）から得られた武装解除されたＴｉプラスミドの植物形質転換ベクター内に挿入した。作成された植物発現造築物を下記表２にまとめて示す。

＜２　：ｂｔ１３”イー　６　する　１王　′告−イｂｔ１３遺伝子カセットの造築のために、制限部位−ＢａｍＨＩ、Ｆｏｋ　Ｉ、Ｈｐａ■及びＥｘｏＲＩ− をオリゴヌクレオチドによる部位−指図突然変異誘発を突然変異プライマーとして用いてｂｔ１３遺伝子コード化領域に創出した（　５ｔａｎｎｓｓｅｎｓ等（１９８７年）　）　、　５ｔａｎｓｓｅｎｓ等（１９８７年）により説明されたベクターを用いた。この点に関し、ｂｔ１３遺伝子の５′末端（断片１）及び３ ′末端（断片２）を含有するＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌ　Ｉ！ｌｊＴ片をｐＢｔｌ３０から単離し、ｐＭＡ５−８　（受理番号４５６７でＤＳＭに寄託）中にクローニングしてそれぞれｐ　Ｍ　Ａ　Ｂ　ｔ１３１及びｐＭＢｔ１３５を生成した（第４図）。

次いで、３個のオリゴヌクレオチド：　ｌ）２１−ｍｅｒ　：　５　′　−ＧＧＡＡＧ、へ　ＡＡＡＡＴ　ＧＧＡＴＣＣＡＡＣ−３’　：２）２５−ｍｅｒ：５ ’　−ＧＣＡ３゛：及び３）３４−ｍｅｒ　：　５　′−ＣＴＴＴＣＴＡＧＴ　ＧＡＡＴＴＣＡ　ＧＴＴＡＡ　ＣＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴＴＣを、Ｉｔｅｋａｒｕ等（１９８４年）により説明された方法を用いて合成した。　５ｔａｎｓｓｅｎｓ等（１９８７年）のギヤッピング化二本鎖方法を用いてオリゴヌクレオチド１）及び２）を用いて、それぞれＥａｍＨＩ及びＦｏｋ工部位なりｔ１３遺伝子のＮ−末端配列中に導入し、又、オリゴヌクレオチド３）を用いてこの遺伝子のＣ −末端にＨｐａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩを創出した。これにより、それぞれプラスミドｐＭｃＥｔ１３１、ｐＭｃＢｔ１３３及びｐＭｃＥｔ１３６が得られた（第５図）。

ｂｔ１３遺伝子の再造築を容易に行うために、ｐＭｃＢｔ１３６及びｐＥｔ１３０７５）らの断片をｐ　Ｕ　Ｃｌ　９　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１９８５年）　、　Ｇｅｎｅ３３．１０３−１１９）中にクローニングして第６Ａ区に示したようなｐＢｔｌ３６を得た。このようにして、遺伝子の直下流に独特のＢａｍＨＩ部位を導入し、ｂｔ１３遺伝子のＣ−末端を含有する断片をＮ−末端に上記突然変異を有する全ｂｔ１３遺伝子の再造築に使用することができた。

第６Ｂ図に示されるように、ｂｔ１３からのＮ−末端断片をｐＭｃＢｔ１３３からＦｏｋＩ−ＯｘａＮＩ断片として、及びｐＭｃＢｔ１３１からＢ　ａｍＨＩ　 −ＰｓｔＩ断片として回復した。これらのＮ−末端断片及びｐＢｔｌ・３６からの適当なＣ−末端断片を、それぞれバクテリオファージラムダＰ８プロモーター及びファージラムダのｃｒｏ遺伝子のリポソーム結合部位を有するＥ、コリ発現ベクターｐＪＢ６６及びｐＪＢ６３内にそれぞれ連結した（　Ｂｏｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ　（１９８７年））、これにより、それぞれｐＢｔｌ３４及びｐＢｔｌ３５が得られた。

ｐＢｔｌ３５中のｂｔ１３遺伝子の３′末端に存在するＨｐａＩ部位を利用してｂ　ｔ　１．３遺伝子を活性Ｃ−末端断片をコード化する截頭ｎｅｏ遺伝子（Ｒｅｉｓｓ。

Ｂ、、　Ｓｐｒｅｎｇｅｌ、　Ｒ，、ｌｌ’ｉｌｌ、　Ｈ，及び５ｃｈａｌｌｅｒ、　Ｈ。

（１９８４）　、　Ｇｅｎｅ３０．２１７−２２３）にフェーズ中に融合した。

このｎｅｏ遺伝子断片はｐ　Ｌ　Ｋ　Ｍ９１　（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ　（１９８６年））から得られて、第７図に示されたようなｐＢｔｌ３−ｎｅｏを得た。

制御可能な強Ｐ７プロモーターを有するプラスミドｐＢｔ１３４、ｐＢｔｌ３５及びｐＢｔｌ　３−ｎｅ。

を用いて、Ｅ、コリ菌株に一１２△Ｈ１△ｔｒｐを形質転換した。この形質転換Ｅ、コリを次いで温度誘発させて、Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ　（１９８７年）により記載されるような異った遺伝子生成物を発現させた。これらの遺伝子突然変異の遺伝子生成物に及ぼす影響を分析した。Ｂｔ１３−ＮＰＴＩＩ融合タンパク質は、上記の元のＢｔ１３タンパク質について見られたＬＤ５０活性に悪影響を及ぼすことなくＮＰＴＩＩ活性を示した。

キメラＥ、コリ発現造築物ｐＢｔ１３４、ｐＢｔｌ３５及びｐＢｔｌ３−ｎｅｏから、ｂｔ１３遺伝子を単離し、植物発現ベクター中に挿入した。ｐＢｔｌ３５からのＢａｍＨＩ断片のｐＧｓＨ１６０及びｐＧ　Ｓ　Ｊ　２８０　（Ｄｅｂｌａｅｒｅ等（１９８７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５３．２７７−２９２）のクローニングはそわぞれｐＧＳＪｌ　４１及びｐＧＳＪ１４２をもたらした（第８Ａ図）。これらのプラスミドは、それぞれ３５Ｓプロモーター（０ｄｅ１１等（１９８５年））及びＴＲ２′プロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８５年））の制御下にｂｔ１３遺伝子を有した。カナマイシン耐性遺伝子が形質転換のための選択マーカーとして存在した。同様に、ｐＢｔｌ３４からのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離し、同−ベクター中に連結させて、それぞれ３５Ｓ及びＴＲ２′プロモーターの制御下のｂｔ１３− ５７遺伝子を含有する造築物ｐＧｓＪ１４３及びｐＧＳＪ１４４を得た（第８Ｂ図）。又、ｂｔ１３−ｎｅｏパイブリッド遺伝子よりなるｐＥｔ１３０−ｎｅｏからのＢａｍＨＩ−Ｂｇｆｌｒｌ断片をｐＧｓＨ１５０及びｐ　Ｇ　Ｓ　Ｊ　２７０　（Ｄｅｂｌａｅｒｅ等（１９８７年））中にクローニングして、ＴＲ２′ 或いは３５Ｓプロモーターの制御下のｂｔ１３−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を有するｐＧｓＪ１４７及びｐＧＳＪ１４８を得た（第８Ｃ図）。後者のプラスミドにおいては、形質転換植物が融合クンバク質の発現に対して直接選択することができたので、選択マーカー遺伝子は存在しなかった。

同様な方法により（第８Ｄ図）、ｂｔ１３−ｎｅ。

ハイブリッド遺伝子を３５Ｓプロモーター（Ｈｕｌｌ及びＨｏｗｅｌｌ　（１９８７年））の制御下においた。この３５Ｓ３プロモーターをｐ　Ｕ　Ｃ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等（１９８５））中でクローニングして、Ｎｃｏ　Ｉ部位を３５８３転写物の第−ＡＴＧコドンに含有するｐＤＥ９を得た。このプロモーター断片の３′末端−Ｎｃｏ　Ｉ部位を部位指図突然変異誘発（５ｔＢｎｓｓｅｎｓ等（１９８７年））により第−ＡＴＧコドンに創出した。ｂｔ１３遺伝子断片及びｎｅｏ遺伝子の一部を含有するＮｃｏ　Ｉ断片をｐＢｔ１３−ｎｅｏから単離し、ｐＤＥ９のＮｃｏＩ部位にクローニングしてｐＶＥ３７を得た。ｐＶＥ３７から３５Ｓ３プロモーターｂｔ１３−ｎｅｏキメラ造築物を含有するＨ　ｉ　ｎｄＩＩＩ−Ｎａｒ　Ｉ断片を単離し、ＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＮａｒ　Ｉで消化されたｐＧｓＨ１５２中にクローニングした。これにより、３５Ｓ３プロモーターの制御下のｂｔ１３−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を含有し、それに続いてＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３′−未翻訳末端を有するｐＴＶＥ３８が得られた。このキメラ造築物をＴ−ＤＮＡ境界配間に配置した。

ｂｔ１３及びｂｔ２遺伝子を同時に植物中に発現するために、各遺伝子をそれ自身の構成プロモーターの制御下に置いた（第９図）。この点に関し、ＣρａＩ− ＳｎａＢ　Ｉ断片をｐＧＳＪ　１４１から単離して、ｐＧｓＨ１５２中に導入した（米国特許出願８２１．５８２号明細書；　Ｖａｅｃｋ等（１９８７年））。

これにより、ＴＲＩ′プロモーターの制御下のｂｔ１３遺伝子（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８５年））、及びＴＲ２”プロモーターの制御下のｂｔ −ｎｅｏ−８６０ハイブリツド遺伝子（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８５年））を有する。ｐＧＳＪ　１４５を得た。このｂｔ−ｎｅｏ−８６０遺伝子は米国特許出願８２１，５８２号明細書の実施例９に説明されてしするｂｔ２遺伝子とｎｅｏ遺伝子の融合体である。

ｐＧｓＪ１４２からＢａｎｌｌ−５ｎａＢ　Ｉ断片のｐＧｓＨ１６３（米国特許出願８２１，５８２号明細書；　Ｖａｅｃｋ等（１９８７年））中への挿入はｐＧＳＪ１４６を与えた。ｐＧｓＪ１４６は、ＴＲ２’プロモーターの制御下のｂｔ１３遺伝子、もう一つのＴＲ２”プロモーターの制御下のｂｔ８８４遺伝子、及びＴＲＩ′プロモーターの制御下の選択マーカーとしてのｎｅｏ遺伝子を含有した。ｂｔ８８４遺伝子は、米国特許出願８２１，５８２号明細書の実施例８に記載されるような截頭ｂｔ２遺伝子である。

正にＢｔ１３タンパク質をコード化するｂｔ１３−５７遺伝子のハイブリッド、及び植物内に発現することのできるｎｅｏ遺伝子（ｒｂｔ−５７−ｎｅｏ遺伝子」）を形成するために、ｐＴＶＥ３８を造築するための上記同一方法を用いて植物発現造築物ｐＴＶＥ３９も又作成された。

６−　バク、ジャガイモ　びトマト盲　の乏！転羞実施例５からの植物発現造築物をプラスミドｐＧＶ（１９８５年）　ＮＡＲ１３，４７７７以下）を有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌株Ｃ５５ＣＩＲｉｆ中にＥ、コリから移した。ｐＧＶ２２６０はＴ−ＤＮＡ領域の植物ゲノムへの転移に必要とされるｖｉｒｌｌ伝子機能を与える。

植物発現造築物の可動化をｐＲＫ２０１３（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ等（１９７９年）　ＰＮＡＳ７６．１６４８以下）を含有するＥ、コリＨＢ　１０１をヘルパー（ヨーロッパ特許公開公報０，１１６，７１８号）として用いて行った。得られた組換えアグロバクテリウム菌株を次いで用いてトマト植物（ソラニラム・ツベロサムＳｏｌａｎｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　ｃｖ、　Ｂｅｒｏｌｉｎａ、　Ｂｉｎｔｊｅ　ａｎｄＤｅｓｉｖｅｅ）をチュバーディスク感染（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ等（１９８７年）　ＥＭＢＤ　Ｊ、　６．２５１３−２５１８）　を用いて形質転換した。カルスを５０ｍｇ／Ａカナマイシン上に選択し、耐性カルスな発芽に用いた。伸長した芽を分離し、根付は培地に移した。根付いた芽を更に増殖させて植物を再生した。これらの植物の細胞（Ｄｅｌ　１ａｐｏｒｔａ等（１９８４年）　Ｐｌａｎｔ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒｌ、１９−２１）から調製された全ＤＮＡは標識化ｂｔ１３遺伝子断片とのハイブリダイゼーションによるキメラ遺伝子の存在を示した。

タバコ及びトマト植物も同様にしてアグロバクテリラム・ツメファシェンスで形質転換され、ヨーロッパ特許８願８７／４００１４１．５に記載される方法に従ってカナマイシン上に選択された。

７−ｂｔｌ３−ｎｅｏ　びｂｔｌ　３−５７−ｎｅｏハイブリッド゛　のン２転　ジャガイモ　びバク育　におしるｐＴＶＥ３８及びｐＴＶＥ３９に、に’）形質転換すした実施例６からのジャガイモ及びタバコ植物のカルスについて、３２ｐ−ＡＴＰを用いるｉｎ　５ｉｔｕホスホリル化アツセイ（Ｒｅ１ｓｓ等（１９８４年）　Ｇｅｎｅ３０．２１７− ２２３．米国特許出願８２１．５８２号明細＠）によりＮＰＴに活性を試験した。形質転換植物のカルス内に有意なＮＰＴｎ活性が検出された。予め、タバコ及びジャガイモ植物の形質転換カルスは５０ｍｇ／ρカナマイシンを含有する培地上で選択されていた。

これらの試験は、形質転換カルスが、それらが形質転換されたハイブリッド遺伝子を発現することを示した。そのような発現は正にＢｔ１３タンパク質をコード化する完全なりｔ１３遺伝子及びｂｔ−５７遺伝子の発現を含むものであった。

ｎｕ　ジャガイモ　びトマト畜　におＬるｂｔｌ３゛　びｂｔｌ３゛　の断　ののレブチノ　ルサ・デセムリ　アタ　コロラドジャガイモ　に　ぼ　≦ Ｌ、デセムリネアクの幼虫をプラスチック容器内でジャガイモの葉或いはトマトの葉で詞育した。２５日後に、幼虫を湿った砂を充填した容器に移した。幼虫は砂にもぐり、４４化する。−週間後に、成虫が現われる。それらを植物葉を有する飼育篭に入れる。葉の上に生れた卵を毎日採集する。４〜５日後に、卵がかえる。これらの甲虫の全生活サイクルは２５℃、７０％相対温度及び１８：６明対暗光期間に維持された制御環境食器棚中で行われる。

新生児幼虫の殺傷はＢｔ１３タンパク質の毒性を示す。各幼虫は別々に２％寒天培地上に保たれ、次のいずれかのものから切断された円盤（０，２８ｃｍ”　）が供給された：１）実施例１及び２の形質転換Ｅ、コリに一１２ΔＨ１△ｔｒｐからのｂｔ１３タンパク質の水溶液５ｇを適用された新鮮なトマト或いはジャガイモの葉；或いは２）実施例６の形質転換トマト或いはジャガイモ植物からの新鮮な葉。

葉の円盤が消化された後に、未形質転換トマト或いはジャガイモ植物からの新鮮な未処理葉片を次の５日間供給する。処理葉円盤及び形質転換植物からの葉円盤を消費する幼虫内に未形質転換植物からの未処理葉のみを消費する対照幼虫よりも５日の試験期間に亘って有意により多（の幼虫の死亡が認められる。

言うまでもな（、本発明はｂｔ１３遺伝子の用途に限定されるものではない。むしろ、本発明は又、純粋１）ｔ１３タンパク質をコード化する位置７３７から出発し位置２４９７に終了する。第２図のＤＮＡ配列並びにＢｔ１３タンパク質と同−或いは等価であるタンパク質をコード化するその他のＤＮＡ配列の使用も含むものである０本発明は更に植物細胞の形質転換に適したｂｔ１３遺伝子或いはその断片を含むあらゆるＤＮＡ組換え体に関するものである。

本発明は又、ｂｔ１３遺伝子を発現し、鞘翅類耐性出あるトランスジェニックジャガイモ及びトマト植物に限定されるものではない。それは又同様にして、形質転換することのできる任意の植物、例えば菜種アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、タマネギ、クローバ−、トウモロコシ、大豆、タバコ、アブラナ及びテンサイにも関する。

Ｃ丁！＾＾ｔｔ＾＾＾Ｃ＾丁＾Ａ丁＾ｔＣｔ丁ｔＣａ＾τ丁ＣＴ＾＾ＣＧζＣＣＣＴＣ＾＾＾＾Ｃ丁＾＾ｃＡＡζ丁＾Ｃ轟＾＾＾＾ＡＡＣ＾OＴＡ（Ｃ７了＾丁＾ＴＡＣ＾＾＾Ｔ＾丁ａｔ丁丁Ｃ＾ムＣ１６２°コ”ａｓｏ６０グ０６６ｇ。

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Ｆｉ９．　７ｐＧｓＪ１４２Ｆ１９．８ｐ。

ｐＶＥ３７　ｐＧｓＨ＋５２ＴＶＥ３Ｂｉｇ　８国際調査報告　ＰＣ？／！Ｐ　８８／。。７，２ｔ＋ｍ＋＋＃Ｉｍ−＾−−−− −・　ＰＣ？ｌＥＰ　Ｂａ１００７己２　＝国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも６６ｋＤａタンパク質をコード化し、且つ細胞のゲノム内に挿入されているｂｔ１３遺伝子或いはその断片により特徴付けられる形質転換植物細胞。
２．ｂｔ１３遺伝子断片がゲノム内に挿入されており、その断片が位置７３７から出発し、位置２４９７において終了し、及ひ本質的に６６ｋＤａタンパク質から構成される鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）毒素をコード化する第２図に示されるようなＤＮＡ配列を有する請求項２に記載の細胞。
３．ｂｔ１３遺伝子が３５Ｓプロモーター、ＴＲ１′プロモーター、或いはＴＲ２′プロモーターである強い構成植物プロモーターの下流及びその制御下にある請求項１又は２に記載の細胞。
４．ｂｔ１３遺伝子がポリアデニル化及びオクトピンシンターゼ遺伝子或いはＴ −ＤＮＡ遺伝子７からの転写停止信号の上流にある請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
５．ｂｔ１３遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子と同一の転写ユニット内にあり、且つそれと同一のプロモーターの制御下にある請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
６．鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）毒素をコードする遺伝子も又細胞のゲノム内に挿入されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
７．請求項１〜６のいずれか一項に記載の形質転換細胞がある植物。
８．請求項７に記載の植物の種子。
９．請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換細胞を有する植物を与えることを特徴とする植物を鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に対して耐性にする方法。
１０．位置７３７から出発し‘位置２４９７において終了する第２図に示されたＤＮＡ配列を特徴とするＤＮＡ。
１１．請求項１０のＤＮＡ配列によりコード化された６６ｋＤａ結晶タンパク質。
１２．請求項１０のＤＮＡ配列により形質転換された微生物、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。