JPH06339385A - オクトピンｔ−ｄｎａのプロモーターを用いて植物の転写を促進する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子工学と植物農業の分野に関し、特に、
植物における転写の促進の方法およびそれにより遺伝的
に修飾された植物組織および植物を提供する。 【構成】 本発明の植物細胞を遺伝的に修飾する方法
は、プロモーター，外来構造遺伝子およびポリアデニル
化部位を含むように細胞の形質転換により植物細胞を遺
伝的に修飾する方法であって，該プロモーター，該構造
遺伝子および該ポリアデニル化部位は互いに，該構造遺
伝子が該プロモーターと該ポリアデニル化部位との支配
下で植物細胞内で発現しうるような位置と方向にあり，
該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位のうちの少
なくとも一方がＯＲＦ１，４，５，９，10, 18, 19, 2
1, 24, 25および26から成る群から選択された oＴ−Ｄ
ＮＡ遺伝子とハイブリダイズし得るいづれかのＴＩＰ遺
伝子から得られることにより行われる。本発明の方法に
より遺伝的に修飾された植物組織および植物が得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，遺伝子工学と植物農業
の分野に関し，特に，植物における転写の促進の方法を
提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】以下は，本発明に関する従来技術情報を
明らかにする刊行物である。これらの刊行物は，ここで
述べられる事項と実施例１においてより徹底的に議論さ
れる。ピー．ダース等（1983）イーエムビーオージェ
イ．2 : 419-426 ，エイ．デピッカー等（1982）ジェ
イ．エムオーエル．エイピーピーエル．ジーイーエヌイ
ーティー．1 : 561-573 ，エイチ．デグリーブ等（198
2）ジェイ．エムオーエル．エイピーピーエル．ジーイ
ーエヌイーティー． 1 : 499-511，およびエフ．ハイデ
カンプ等（1983）エヌユーシーエル．アシッズ アール
イーエス．11 : 6211-6223（P.Dhaese et al．（198
3）EMBOJ. 2 : 419-426, A.Depicker et al．（198
2）J.Mol.Appl.Genet. 1 : 561-573, H. DeGreve et
al．（1982) J.Mol.Appl.Genet. 1 : 499-511, and F.
Heidekamp et al．（1983）Nucl.Acids Res.11 : 6211
-6223 ）はそれぞれ，“転写物７”の配列（本研究のＯ
ＲＦ３として同定されている），nos ，ocs ，（ここで
はＯＲＦ11）と，tmr ，（本研究のＯＲＦ８）について
報告している。ＴーＤＮＡ遺伝子のＲＮＡあるいはタン
パクの産物を明らかにしている刊行物は表７に列挙して
ある（ＴＩＰプラスミド上の遺伝子を参照）。エヌ．ム
ライ等（1983）サイエンス 222 : 476-482 ，およびテ
ィー．シー．ホール等，ユーエス アプリケーション
エスイーアール．エヌオー．485,614 （N.Murai et a
l．（1983) Science 222 : 476-482, およびT.C.Hall
et al., US appli-cation ser.no. 485,614）は，植物
の構造遺伝子を発現させる，ocs（ＯＲＦ11）プロモー
ターの使用法を明らかにしている。エム．ダブリュー．
ビーバン等（1983）ネイチャー 304 : 184-187 ，アー
ル．ティー．フレイリー等（1983）ピーアールオーシ
ー．エヌエイティーエル．エイシーエイディー．エスシ
ーアイ．ユーエスエイ 80 : 4803-4807 ，およびエ
ル．ヘレッラ−エストレッラ等（1983）ネイチャー 30
3 : 209-213 （M.W.Bevan et al．（1983) Nature 304
:184-187, R.T.Fraley et al．（1983) Proc. Nat
l.Acad. Sci.USA 80 : 4803-4807，および L. Herrera-
Estrella et al．（1983) Nature 303 :209-213,は，
細菌の構造遺伝子を発現させる，nosプロモーターの使
用法を明らかにしている(ＴＩＰプラスミドの取り扱い
方法を参照)。

【０００３】シャトルベクター ジー．ビー．ラブクンとエフ．エム．オースベル（198
1）ネイチャー 298 :85-88 ，（G.B.RuvkunとF.M.Ausu
bel (1981) Nature 298: 85-88,が開発したシャトルベ
クターは，外来遺伝物質を巨大プラスミド，ウイルスお
よびゲノムの中の選択位置へ挿入する方法を，与える。
巨大プラスミドあるいはゲノムを扱う際に遭遇する２つ
の問題がある。第一に，巨大プラスミドは各制限酵素に
対して多くの部位を持つことがある。独特の部位特異的
開裂反応は再現できず，多部位開裂反応とそれに続く連
結は，その順序と方向を変えたくない多数の断片の奪い
合いのため，非常な困難をもたらす。第二に，巨大ＤＮ
Ａプラスミドでの形質転換効率が非常に低い。シャトル
ベクターは，外来遺伝物質のしばしば，インビトロでの
より小さいプラスミドへの挿入を促進し，それから通
常，インビボの技術によってより巨大なプラスミドへ転
移させることによって，これらの困難を克服することが
できる。

【０００４】シャトルベクターは究極受容細菌へ導入さ
れる能力を保持するＤＮＡ分子，通常プラスミドからな
る。また，シャトルベクターは，外来遺伝物質が挿入さ
れることのできる受容ゲノムの１コピーの断片と，受容
ゲノム断片へ挿入される選択可能な特徴をコードしてい
るＤＮＡ小片も含む。選択可能な特徴(“マーカー”)は
トランスポソン突然変異生成によって，あるいは制限酵
素とリガーゼによって都合よく挿入される。

【０００５】当該シャトルベクターは究極受容細胞，典
型的にリゾビアッシー科の細菌（アグロバクテリウム属
を含む）へ，以下の方法で導入することができる。３親
交雑法（RuvkinとAusubel,前出），２親交雑法での自律
起動可能なベクターの直接転送，アグロバクテリウム細
胞による外部ＤＮＡの直接取込み（M.Holsters etal．
(1978) Molec.Gen.Genet. 163 : 181-187の条件を使用
する“形質転換”），他の細菌細胞とのアグロバクテリ
ウムのスフェロプラスト融合によるもの，リポソームに
入ったＤＮＡの取り込み，あるいはインビトロでパッケ
ージすることのできるウイルスを基本としたシャトルベ
クターの感染によるものがある。リゾビアッシー科に属
するものの中で見つけられた巨大プラスミドを操作する
当業者によく知られている技術である３親交雑法はプラ
スミドの移動と接合伝達に対する遺伝子を保持する，移
動可能なプラスミドを含む株をシャトルベクターを含む
株と交雑することを含む。シャトルベクターをそのプラ
スミド遺伝子によって移動させることができるなら，シ
ャトルベクターは，たとえばアグロバクテリウム株のTi
あるいはRiプラスミドのような巨大ゲノムを含んでいる
受容細胞へ転移される。

【０００６】シャトルベクターを受容細胞へ導入した
後，起こり得る事象は，マーカーのどちらかの側に一回
組み換えを伴った二重交叉を含む。この事象は，挿入を
欠いた相同性のある小片を交換している受容ゲノムへの
マーカーを含んだＤＮＡ小片の転移に帰着するであろ
う。元のシャトルベクターを失った細胞を選択するに
は，シャトルベクターは究極受容細胞では複製できない
か，あるいは受容細胞にあらかじめ存在する独立に選択
可能なプラスミドと不和合性でなければならない。この
ことを解釈する一般的なひとつの方法は，シャトルベク
ターと不和合性で，異なる薬剤耐性マーカーを持った他
のプラスミドを第三の親株に供給することである。した
がって，両方の薬剤耐性で選択すると，唯一の生残細胞
はシャトルベクター上のマーカーが受容ゲノムと組み換
えたものである。もしシャトルベクターが特別なマーカ
ーを持っていたら，それから当該シャトルベクターと受
容プラスミド間の一重交叉事象を生じ，その結果無傷の
シャトルベクターが受容プラスミドに組み込まれる同時
組み込みとなった，プラスミドを含む細胞を選択し，排
除することができる。もし外来遺伝物質が選択マーカー
に挿入されるか，あるいは近接したならば，それも同じ
二重組み換えの結果として受容プラスミドへ組み込まれ
るであろう。マーカー内あるいは近接部分以外の地点で
相同性のある断片へ挿入されると，外来遺伝物質も一緒
に保持されるかもしれないが，外来遺伝物質とマーカー
を隔てる距離が大きくなるにつれて，外来遺伝物質とマ
ーカー間で起こる組み換え事象が起こりやすくなるらし
く，外来物質の転移を妨げる。もしシャトルベクターが
表現型的に優性特徴（例えば，新しく発現可能な殺虫構
造遺伝子，しかし不活性化された癌遺伝子的なＴ−ＤＮ
Ａ遺伝子ではない）を導入するために使用されるなら，
二重相同組み換えを当てにする必要はない。同時組み込
みプラスミドに帰着する単一交叉事象の結果として生ず
る細胞は，植物細胞へ望まれる特徴を転移できる（エ
イ．キャプラン等(1983)サイエンス222 : 815-821(A. C
aplan et al.(1983) Science 222 : 815-821)）。Ｔ−
ＤＮＡの中断されない単一配列を保持している様々なシ
ャトルベクターも使用しても良い。しかし，それで生じ
たＴ−ＤＮＡは，今や隣接した遺伝子重複を含むので，
アグロバクテリウム，あるいは植物細胞のどちらかにあ
る２つの相同配列間に起こる単一相同組み換え事象によ
って，シャトルベクターに起こり得るまれな欠失に気を
配らなければならない。

【０００７】シャトルベクターはアグロバクテリウムプ
ラスミドの操作に有効であることを証明した。ディー．
ジェイ．ガーフィンクル等（1981）セル 27 :143-153
，エイ．ジェイ．エム．マッツケおよびケイ．−ディ
ー チルトン（1981）ジェイ．エムオーエルイーシー．
エイピーピーエル．ジーイーエヌイーティー．1 : 39-4
9,およびジェイ．リーマンズ等（1981）ジェイ．エムオ
ーエルイーシー．エイピーピーエル．ジーイーエヌイー
ティー．1:149-164，（D.J.Garfinkel et al.(1981)Cel
l 27 : 143-153,A.J.M.Matzke α K.-D Chilton (198
1) J.Molec.Appl.Genet. 1 : 39-49,およびJ.Leemans e
t al．(1981) J.Molec.Appl.Genet. 1:149-164,）を参
照。彼らはシャトルベクターを“仲介ベクター”あるい
は“ｉＶ”という言葉で言及している。

【０００８】巨大ＤＮＡ分子への挿入変換に対するシャ
トルベクター系の最近明らかにされた変種は“自殺ベク
ター”である。この系では，エイ．ピューラー等ユーエ
スアプリケーション エスイーアール．エヌオー．510,
370 およびアール．サイモン等（1983）ビーアイオーテ
ィーイーシーエイチ．1 : 784-791,（A.Puhler etal.,
US application ser.no.510,370 and R.Simon et a
l．(1983) Biotech.1: 784-791, ）によって述べられた
ように，シャトルベクターは受容細胞内で維持されるこ
とができない。この特徴は３親交雑の間に一般に行われ
るように当シャトルベクターを排除するために受容細胞
へ不和合性プラスミドを導入する必要性を削除する。あ
る既存のＤＮＡへ組み込まれないすべてのベクターは複
製されないことによって効率良く“自殺する”。従来の
型のシャトルベクターでなされ得るように，相同性のあ
る２つの領域間にない抗生物質耐性遺伝子に対するスク
リーニングによって，二重と単一相同性を区別すること
ができるかもしれない。pBR322 を基本とした自殺ベク
ターを，TiプラスミドへＤＮＡ配列を転移するために使
用することは，イー．バンホーテ等（1983）イーエムビ
ーオージェイ．2:411-417,およびエル．コメイ等（198
2）ピーエルエイエヌティー．エムオーエルイーシー．
ビーアイオーエル．1 : 291-300,およびエイ．キャプラ
ン等（E.Van Haute et al．（1983) EMBO J. 2 : 411-
417, and L.Comai et al．（1982) Plant.Molec.Bio
l. 1 : 291-300,および A.Caplan et al.,前出によっ
て報告されている。シー．エイチ．ショウ等（1983）ジ
ーイーエヌイー 28 : 315- 330,（C.H.Shaw et al．
（1983) Gene 28 : 315-330,は単一相同組み換えの選択
方法に続く二重相同組み換えの選択により選択可能なマ
ーカーを導入することもなく，Tiプラスミドへ外来遺伝
物質を導入するために自殺ベクターを使用することを報
告している。

【０００９】相同組み換えの方法によるＴ−ＤＮＡへ新
しいＤＮＡ配列の導入に対するシャトルベクターの使用
に代わるものに細菌性トランスポソンがある。ＴＩＰプ
ラスミド上のアグロバクテリウム−遺伝子という項で述
べているように，トランスポソンはＴＩＰプラスミドの
Ｔ−ＤＮＡ上へ飛び込むことができる（例えば，D.J.Ga
rfinkel et al．(1981) Cell 27 : 143-153 を参照）。
もしトランスポソンが新しい配列の挿入によってインビ
トロで修飾できるなら，その新しいＤＮＡはトランスポ
ソンによってＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡへ転移する
ことができる。次いでＴＩＰは，それが安定に組み込ま
れるなら，新しいＤＮＡ／トランスポソン／Ｔ−ＤＮＡ
の組み合せを植物細胞へ転移できる。

【００１０】アグロバクテリウムの総覧 アグロバクテリウム・チューメファシエンスとアグロバ
クテリウム・リゾゲネスは，グラム陰性菌のリゾビアッ
シー科に含まれるアグロバクテリウム属の種である。こ
れらの種は，それぞれ，植物のクラウンゴール疾患と毛
根症の原因菌である。クラウンゴールは脱分化した組織
のゴールの成長によって性格づけされている。毛根症は
感染組織での不適当な根の誘導を特徴とする奇形腫であ
る。どちらの疾患でも，不適当に成長する植物組織は通
常，感染している細菌によって異化作用を受け，植物に
よって正常には生産されない，オピンとして知られてい
る，一種あるいはそれ以上のアミノ酸誘導体を生産す
る。知られているオピンはオクトピン，ノパリン，アグ
ロピンという３種の型に分類されている。不適当に増殖
する組織の細胞は培地上で増殖でき，そして適当な条件
下では，ある形質転換された表現型を保持する完全な植
物体へ再生することができる。

【００１１】アグロバクテリウムの病毒性株は，アグロ
バクテリウム・チューメファシエンスのTi（腫瘍誘導）
プラスミドとアグロバクテリウム・リゾゲネスのRi（根
誘導）プラスミドとして知られている，巨大プラスミド
を保持している。これらのプラスミドの株の除去は病原
性の喪失に帰着する。Tiプラスミドは，腫瘍の中で宿主
植物のゲノムへ組み込まれることがわかっている，Ｔ−
ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる領域を含む。このＴ−
ＤＮＡはいくつかの転写物をコードしている。突然変異
の研究は，これらのいくつかが腫瘍増殖の誘導に関与す
る，ことを示した。tml，tmr，およびtmsの遺伝子での
突然変異はそれぞれ，巨大腫瘍（intabacco)，根を発生
する性質，シュート誘導の傾向に帰着する。Ｔ−ＤＮＡ
も少なくとも一種のオピン合成の遺伝子をコードしてい
て，Tiプラスミドは，それらが合成するオピンによっ
て，しばしば分類される。各Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は，Ｔ−
ＤＮＡプロモーターの制御下にある。Ｔ−ＤＮＡプロモ
ーターは構造上，真核生物のプロモーターに似ており，
形質転換された植物細胞中のみで機能するらしい。Tiプ
ラスミドは，Ｔ−ＤＮＡ領域以外の遺伝子も持ってい
る。これらの遺伝子はオピン異化作用，癌化，アグロシ
ン感受性，複製および細菌細胞への自律転移，を含む機
能を含む。Riプラスミドは，Tiプラスミドに類似した様
式で構成されている。植物細胞の形質転換に対応する遺
伝子とＤＮＡ配列の組を，ここでは今後，ひとまとめに
して形質転換誘導原理（ＴＩＰ）と呼ぶことにする。し
たがって，ＴＩＰの名称は，それに限定されないが，Ti
とRiプラスミドの双方を含む。ＴＩＰの組み込まれた小
片をここでは，Tiプラスミドから由来しようと，Riプラ
スミドからであろうとにかかわらず，“Ｔ−ＤＮＡ”
（転移ＤＮＡ）と名付ける。オクトピン型Ｔ−ＤＮＡと
Tiプラスミドは，ここでは時々，それぞれ oＴ−ＤＮＡ
とoTiプラスミドとして呼ぶ。

【００１２】エム．−ディー．チルトン（ジュン 198
3）エスシーアイ．エイエムイーアール．248(6):50-59
（M.-D.Chilton (June 1983) Sci.Amer. 248(6):50-59
）は，最近ベクターとしてのTiプラスミドの使用につ
いて紹介した論文を発表した。アグロバクテリウム原因
による病症の最近一般の総説にディ．ジェイ．マーロ
（1982），エイディブイ．プラント ピーエイティエイ
チオーエル．1 : 139-178 エル．ダブリュー．レイムお
よびエム．ピー．ゴードン（1982），サイエンス 218
: 854-859,およびエム．ダブリュー．ビーバンおよび
エム．−ディー．チルトン（1982），エイエヌエヌ．ア
ールイーブイ．ジーイーエヌイーティー．16 :357-384
: ジー．カールおよびジェイ．シェル（1982）モレキ
ュラー バイオロジー オブ プラント チューマー
ズ，ケイ．エイ．バートンおよびエム．−ディー．チル
トン（1983）エムイーティーエイチ．イーエヌズイーエ
ムオーエル．101:527-539,およびエイ．キャプラン等
（1983）サイエンス 222 : 815-821,（D.J.Merlo (198
2), Adv.Plant Pathol. 1 : 139-178,L.W.Ream α M.
P.Gordon (1982), Science 218: 854-859,および M. W.
Bevan α M.-D.Chilton(1982), Ann. Rev.Genet．16 :
357-384; G.Kahl α J.Schell (1982) Molecular Bi
ology of Plant Tumors, K.A.Barton α M.-D.Chilton
(1983) Meth.Enzymol. 101 : 527-539,および A.Capla
n et al．(1983) Science 222 : 815-821.）がある。

【００１３】植物組織の感染 植物細胞は，当業者に知られる多くの方法でアグロバク
テリウムによって形質転換できる。その方法は，アグロ
バクテリウムと供して培地で植物細胞を培養，植物の直
接感染，アグロバクテリウムのスフェロプラストと植物
のプロトプラストの融合，植物細胞プロトプラストによ
る遊離Ｔ−ＤＮＡの取込みによる直接形質転換，生細菌
による部分的に再生させた細胞壁を持つプロトプラスト
の形質転換，Ｔ−ＤＮＡを含んだリポソームによるプロ
トプラストの形質転換，Ｔ−ＤＮＡを運ぶウイルスの使
用，顕微注射，およびその他同様なものを含むか，限定
されない。どの方法も遺伝子が有糸分裂と減数分裂を通
して安定に伝達される限り充分である。

【００１４】植物組織のアグロバクテリウムによる感染
は当業者によく知られた単純な技術である。（例えば，
ディー．エヌ．ブッチャー等（1980）イン ティッシュ
カルチャー メソッズ フォー プラント パソロジ
スツ，イーディーエス．：ディー．エス．イングラムお
よびジェイ．ピー．ヘルゲソン，ピーピー．203-208
（D.N.Butcher et al．（1980) in Tissue Culture Me
thods for Plant Pathologists, eds. : D.S. Ingram
α J.P.Helgeson, pp.203-208）を参照）。典型的に，
植物はある種の方法によって傷つけられる；即ち，刃物
で切る，針で穴をあける，あるいは研摩剤でこする，こ
とが含まれる。次いで，その傷に腫瘍誘発細菌を含む溶
液を接種する。無傷な植物の感染に代わるものは，ジャ
ガイモの塊茎の薄切り（ディー．ケイ．アナンドおよび
ジー．ティー．ヘバーライン(1977)エイエムイーアー
ル．ジェイ．ビーオーティー．64:153-158（D.K.Anand
α G.T.Heberlein (1977) Amer.J.Bot.64 : 153-158)
）またはタバコの茎の小片（ケイ．エイ．バートン，
等（1983）セル 32 : 1033-1043（K.A.Barton, et a
l．(1983)Cell 32 : 1033-1043)のような組織片の接種
である。誘発後，腫瘍を植物ホルモン不含培地で組織培
養に生じさせることができる。ホルモンに依存しない増
殖は形質転換された植物組織の典型であり，培養のその
ような組織の普通の条件の増殖と非常に対照的である
（エイ．シー．ブローン（1956）キャンサー アールイ
ーエス．16 :53-56 （A.C.Braun (1956) Cancer Res. 1
6 : 53-56)）。

【００１５】アグロバクテリウムは，また分離した細
胞，培養で増殖させた細胞（エル．マートン等（1779）
ネイチャー 277 : 129-131 （L.Marton et al．(197
9) Nature 277 :129-131 ）），およびタバコ葉肉プロ
トプラストに感染することができる。後者の技術では，
新しい細胞壁の部分的な再生をさせた後，アグロバクテ
リウム細胞をしばらく培養に加え，次いで抗生物質を添
加して殺す。Tiプラスミドを保有しているアグロバクテ
リウム・チューメファシエンス細胞にさらされた細胞の
みが，ホルモンのない培地にまかれた場合，カルスを形
成することができた。たいていのカルスがオピン同化に
必要な酵素活性を含むことがわかった。他の研究者（ア
ール．ビー．ホーシュおよびアール．ティー．フレイリ
ー（18 ジャニュアリィ 1983）フィフティーンスマイ
アミ ウインター シンポジウム（R.B.Horsch α R.T.
Fraley (18 January 1983) 15th Miami Winter Symposi
um)）はホルモン独立増殖を示すカルスの速い増殖（10
％以上）を導き，これらカルスの95％がオピンを生成し
ている共同培養による形質転換を報告した。エム．アー
ル．ディビー等（1980）イン イングラムおよびヘルゲ
ソン，（M.R.Davey etal．(1980) in Ingram α Helges
on,）前出，pp. 209-219 は，プロトプラストから再生
した比較的古い細胞の感染を述べている。

【００１６】植物プロトプラストはＴＩＰプラスミドの
直接取込みによって形質転換することができる。エム．
アール．ディビー等（1980) プラント エスシーアイ．
エルイーティーティー．18 : 307-313，およびエム．ア
ール．ディビー等（1980）インイングラムおよびヘルゲ
ソン，（M.R.Davey et al．（1980) Plant Sci. Lett.
18 : 307-313, and M.R.Davey et al．（1980) in In
gram α Helgeson, ）前出はペチュニア（ツクバネアサ
ガオ）プロトプラストを，オピン合成と，培養でホルモ
ン独立増殖の表現型へと，ポリ−Ｌ−α−オルニチンの
存在下でTiプラスミドで形質転換できた。後にポリエチ
レングリコールがTiプラスミドの取込みを刺激したこ
と，およびＴ−ＤＮＡ配列がゲノムへ組み込まれたこ
と，が示された（ジェイ．ドラッパー等（1982）プラン
トおよびセルピーエイチワイエスアイオーエル．23 :
451-458 ，エム．アール．ディビー イーティーエイエ
ル．（1982）イン プラント ティッシュカルチャー19
82，イーディー；エイ．フジワラ，ピーピー．515-516
（J.Draper et al．（1982）Plant and CellPhysiol.
23:451-458, M.R.Davey et al．(1982) in Plant Tis
sue Culture 1982，ed:A.Fujiwara, pp.515-516)。エ
フ．エイ．クレンズ等（1982）ネイチャー 296:72-74
（F.A.Krens et al．(1982) Nature 296 : 72-74）
は，カルシウム刺激後のポリエチレングリコールの使用
により，同様の結果を報告したが，彼らのデータは組み
込まれたＴ−ＤＮＡが隣接Tiプラスミド配列を含むこと
を示唆する。

【００１７】ＤＮＡを取り込ませる他の方法にリポソー
ムの使用がある。ＤＮＡを含んだリポソームの調製は，
パパハドジュポロス イン ユーエス パテンツ4,078,
052および4,235,871（Papahadjopoulos in US Patents
4,078,052 and 4,235,871）によって述べられている。
リポソームを介してTiーＤＮＡを導入した調製物が報告
された（ティー．ナガタ等（1982）イン フジワラ，前
出，ピーピー．509-510,およびティー．ナガタ（1981）
エムオーエル．ジーイーエヌ．ジーイーエヌイーティ
ー．184 : 161-165 （T.Nagata et al．(1982) inFuj
iwara, 前出，pp.509-510，and T.Nagata (1981) Mol.G
en.Genet. 184 : 161-165) ）。類似した系に細胞壁を
取り除いた後の，植物細胞と細菌細胞の融合がある。こ
の技術の実施例は，エス．ハセザワ等（1981）エムオー
エル．ジーイーエヌ．ジーイーエヌイーティー．182 :
206-210,（S.Hasezawa et al．（1981) Mol.Gen.Genet.
182:206-210，）によって報告された，アグロバクテリ
ウムスフェロプラストによるビンカ（ツルニチニチソ
ウ）プロトプラストの形質転換である。植物プロトプラ
ストは細胞壁が一部除かれたアグロバクテリウム細胞を
取り込むことができる（エス．ハセザワ等（1982）イン
フジワラ，前出 ピーピー．517-518 （S.Hasezawa
et al，（1982) in Fujiwara,前出 pp. 517-518) ）。

【００１８】Ｔ−ＤＮＡは一方のみが形質転換された２
つのプロトプラストの融合から再生した組織に形質転換
され得る（ジー．ジェイ．ウレンズ等（1980）ティーエ
イチイーオーアール．エイピーピーエル．ジーイーエヌ
イーティー．56 : 203-208（G.J.Wullems et al．（19
80）Theor.Appl.Genet. 56：203-208)植物の再生の項で
詳述されるようにＴ−ＤＮＡは，減数分裂を通して伝わ
り，単純なメンデルの法則に従い子孫に伝達される。

【００１９】植物の再生 正常な形態を示す分化した植物組織が，クラウンゴール
腫瘍から得られた。エイ．シー．ブローンおよびエイ
チ．エヌ．ウッド（1976）ピーアールオーシー．エヌエ
イティーエル．エイシーエイディー．エスシーアイ．ユ
ーエスエイ 73:496-500,（A.C.Braun α H.N.Wood (19
76) Proc.Natl. Acad.Sci. USA 73 : 496-500,）は，
タバコ奇形腫を正常な植物に移植し，花をつけることの
できる正常な葉茎の出現を得た。この葉茎は，オピン生
成能と，培地にまかれた場合に植物ホルモンに依存せず
増殖する能力を保有した。スクリーニングされた植物で
は，これらの腫瘍性表現型が子孫に伝達されることは観
察されなかったので，明らかに減数分裂中に失われてい
た（アール．タージョン等（1976）ピーアールオーシ
ー．エヌエイティーエル．エイシーエイディー．エスシ
ーアイ．ユーエスエイ73 :3562-3564（R.Turgeon et a
l．(1976) Proc.Natl.Acad. Sci. USA 73 :3562-356
4)）。自然に腫瘍特性を喪失した，あるいは奇形腫の種
から由来した植物は，当初，すべてのそれらのＴ−ＤＮ
Ａを喪失したことが示された（エフ．−エム．ヤング等
（1980）イン ビトロ 16：87-92 ，エフ．ヤング等
（1980）エムオーエルイーシー．ジーイーエヌ．ジーイ
ーエヌイーティー．177 : 707-714 ，エム．レマーズ等
（1980）ジェイ．エムオーエル．ビーアイオーエル．14
4 : 353-376 （F.-M.Yang et al．(1980) InVitro 16
: 87-92, F.Yang et al．（1980) Molec.Gen.Genet.
177 : 707-714, M.Lemmers et al．(1980) J.Mol.B
iol. 144 : 353-376)）。しかし，ホルモン処理（１mg
／リットルカイネチン）後復帰変異になった植物を用いた後
の研究は，減数分裂を経た植物は，形質転換された表現
型に対応するＴ−ＤＮＡ遺伝子を失っているが，Ｔ−Ｄ
ＮＡの両端に相同性のある配列を保有できたことを示し
た（エフ．ヤングおよびアール．ビー．シンプソン（19
81）ピーアールオーシー．エヌエイティーエル．エイシ
ーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエイ 78 : 415
1-4155（F.Yang α R.B. Simpson (1981) Proc. Natl.
Acad.Sci. USA 78 : 4151-4155)。ジー．ジェイ．ウレ
ンズ等（1981）セル 24 : 719-724，（G.J.Wullems et
al．（1981) Cell 24 : 719-724,）は，さらに，その
植物は雄性不稔であるが，オピン同化作用に関与する遺
伝子が減数分裂を経ることができ，そして表面上変わら
ないＴ−ＤＮＡがメンデル法則に従って遺伝することが
できることを示した（ジー．ウレンズ等（1982）イン
フジワラ，（G.Wullems et al．（1982) in Fujiwar
a, ）前出）。エル．オットン等（1981）エムオーエル
イーシージーイーエヌ．ジーイーエヌイーティー．183
: 209-213（L.Otten et al．（1981) Molec Gen.Gene
t. 183 : 209-213）は，シュートを生じる腫瘍を創造す
るために，tms （シュート誘発）座でのTn7 トランスポ
ソン形成Tiプラスミド突然変異体を用いた。これらのシ
ュートが植物へ再生されると，自家受精する花を形成す
ることがわかった。その結果生じる種子はＴ−ＤＮＡを
含み，オピンを生成する植物へと生育した。さらに行っ
た実験では，エイチ．デグリーブ等（1982）ネイチャー
300:752-755 （H.DeGreve et al．（1982) Nature 3
00 : 752-755）は，オクトピン合成が単一優性メンデル
法則的遺伝子として遺伝できることを見つけた。しか
し，Ｔ−ＤＮＡはカルスから再生している間に，ocs以
外の機能の広範な欠失を受けた。tmr（根−誘発）突然
変異体での同様の実験は，Ｔ−ＤＮＡの全長が子孫へ減
数分裂を通して伝達されることができ，その子孫では，
様々なレベルであるが，ノパリンが発現されることがで
きたことと，同時に形質転換された酵母アルコールデヒ
ドロゲナーゼＩ遺伝子は発現しなかったことを示した
（ケイ．エイ．バートン等（1983）セル32 : 1033-1043
（K.A.Barton et al．（1983) Cell 32 : 1033-104
3)）。他の実験は，ノパリンＴ−ＤＮＡが再生の間に維
持されること，および雄性不稔花がメンデル法則に従っ
てＴ−ＤＮＡを伝えることを示した（ジェイ．メムリン
ク等（1983）エムオーエル．ジーイーエヌ．ジーイーエ
ヌイーティー．190 : 516-522（J.Memelink et al．
（1983) Mol.Gen.Genet. 190 : 516-522) ）。今では，
Ｔ−ＤＮＡを欠いた再生組織は，たぶん腫瘍に“混在し
ていた”非形質転換細胞からの子孫らしい（ジー．オー
ムズ等（1982）セル 30 : 589-597 （G.Ooms et a
l．(1982) Cell 30 : 589-597)）。エイ．エヌ．ビンス
（1983）プランタ158:272-279,（A.N.Binns (1983) Pla
nta 158 ：272-279,）による最近の研究は，腫瘍性遺伝
子，この場合ではtmr，は再生の間“止める”ことがで
き，再生組織を培養基に置くことによって再び“つけ
る”ことができることを示唆する。

【００２０】アグロバクテリウム・リゾゲネスの形質転
換の結果生じた根は比較的簡単に栽培植物へ直接に再生
することが証明された（エム．−ディー．チルトン等(1
982)ネイチャー 295 : 432-434 （M.-D.Chilton et a
l．(1982) Nature 295 : 432-434））。

【００２１】ＴＩＰプラスミド上の遺伝子 多くの遺伝子が，ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内で同
定された。約半ダースのオクトピンプラスミドＴ−ＤＮ
Ａの転写物が，マッピングされ（エス．ビー．ゲルビン
等（1982）ピーアールオーシー．エヌエイティーエル．
エイシーエイディ．エスシーアイ．ユーエスエイ 79 :
76-80，エル．ウィルミッツァー等（1982）イーエムビ
ーオージェイ．1 : 139-146 （S.B.Gelvin et al．
（1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 76-80, L.
Willmitzer et al．（1982) EMBOJ. 1 : 139-14
6)），そして，いくつかの機能が明らかになった（ジェ
イ．リーマンズ等（1982）イーエムビーオー ジェイ．
1 : 147-152 （J.Leemans et al．（1982) EMBO J. 1
: 147-152)）。これらの領域のいくつか，特にtmrとtm
sをコードした領域，は原核生物中でも転写され得る
（ジー．シュローダー等（1983）イーエムビーオー ジ
ェイ．2 : 403-409 （G.Schroder et al．（1983) EM
BO J. 2 : 403-409)）。トランスポソン突然変異によっ
て良く明らかにされたオクトピン型プラスミドの４つの
遺伝子はtms ，tmr ，tml およびocs である（ディー．
ジェイ．ガーフィンクル等（1981）セル 27 : 143-153
（D.J.Garfinkeletal．（1981) Cell 27 : 143-15
3)）。エフ．ハイデカンプ等（1983）ニュークレイック
アシッズ アールイーエス．11 : 6211-6223，（F.He
idekamp etal．（1983）Nucleic Acids Res. 11 : 6211
-6223,）は，オクトピン型プラスミド，pTiAch5 のtmr
の配列を報告した。これら遺伝子に突然変異を持つTiプ
ラスミドはそれぞれ，シュート，激増した根の発生，お
よび正常より巨大な，ニコチアナ・タバカムの腫瘍カル
スを刺激する。他の宿主では，これら遺伝子の突然変異
は異なる表現型を誘導することができる（エム．ダブリ
ュー．ビーバンおよびエム．−ディー．チルトン（198
2）エイエヌエヌ．アールイーブイ．ジーイーエヌイー
ティー．16 : 357- 384 （M.W.Bevan α M.-D.Chilton
(1982) Ann. Rev.Genet. 16 : 357-384）を参照）。tms
とtmrの表現型は，腫瘍中に存在する植物ホルモンのレ
ベルの相違に互いに関係がある。サイトカイニン対オー
キシンの比率の相違は，培養で形質転換されてないカル
ス組織でのシュートあるいは根形成を誘導するものと同
様である（ディー．イー．アキヨシ等（1983）ピーアー
ルオーシー．エヌエイティーエル．エイシーエイディ
ー．エスシーアイ．ユーエスエイ 80:407-411 および
エイ．キャプラン等（1983）サイエンス 222 : 815-82
1 （D.E.Akiyoshi et al．(1983) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80 : 407-411および A.Caplan et al．(198
3) Science 222 : 815-821)）。tms あるいはtmr のど
ちらかひとつの機能する遺伝子，但し機能するtml では
ない，を含むＴ−ＤＮＡは，顕著な腫瘍増殖を促進でき
る。シュートと根の促進はtml の機能によってそれぞ
れ，刺激され，阻害される（エル．ダブリュー．レイム
等（1983）ピーアールオーシー．エヌエイティーエル．
エイシーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエイ 80:
1660-1664（L.W.Ream et al．(1983) Proc. Natl.Aca
d.Sci.USA 80:1660-1664) ）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子での
突然変異は植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの挿入に影響しな
いようである（リーマンズ等（1982）前出，レイム等
（1983）前出（Leemans et al．（1982) 前出，Ream
et al．（1983) 前出））。ocs遺伝子をコードしたオ
クトピンTiプラスミドは，オクトピン合成酵素（リソピ
ンデヒドロゲナーゼ）をコードしており，当酵素はエイ
チ．デグリーブ等（1982）ジェイ．エムオーエル．エイ
ピーピーエル．1 : 499-511,（H.DeGreve etal．(1982)
J.Mol.Appl.Genet. 1 : 499-511,）によって配列決定さ
れた。当酵素はイントロン（ｍＲＮＡの成熟中，メッセ
ンジャー前駆体の転写後に取り除かれる，真核生物の遺
伝子で一般に見られる介在配列）を含まない。当酵素
も，真核生物の転写シグナル（“TATA box”）に類似し
た配列とポリアデニル化部位を持つ。ocs遺伝子の発現
に必要なすべてのシグナルがocs の転写開始部位の 295
bp内で見つけられた（シー．コンツ等（1983）イーエム
ビーオー ジェイ．2 : 1597-1603（C.Koncz et al．
（1983) EMBO J. 2 : 1597-1603)）。ピー．ダース等
（1983）イーエムビーオー ジェイ．2 : 419-426 （P.
Dhaese et al．(1983) EMBOJ.2:419-426）は，“転写
物７”（本発明のオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）３）の配列と，“転写物７”とocsによる様々なポ
リアデニル化部位の利用を報告した。組織内にオクトピ
ン合成酵素の存在することが，様々なアミノ酸アナログ
の毒性効果から，その組織を保護できる（ジー．エイ．
ダールおよびジェイ．テンプ（1983）ティーエイチイー
オーアール．エイピーピーエル．ジーイーエヌイーティ
ー．66 :233-239 ，ジー．エイ．ダール等，ユーエスパ
テントアプリケーション，エスイーアール．エヌオー．
532,280 （G.A.Dahlα J.Tempe(1983) Theor. Appl.Gen
et. 66 : 233-239, G.A.Dahl etal., US Patent applic
ation, ser.no.532,280) ）。

【００２２】ノパリンTiプラスミドはノパリン合成酵素
遺伝子（nos）をコードしており，その酵素はエイ．デ
ピッカー等（1982）ジェイ．エムオーエル．エイピーピ
ーエル．ジーイーエヌイーティー．1 : 561-573 （ A.
Depickeret al．（1982) J.Mol.Appl.Genet. 1 : 561-
573 ）によって配列決定された。ocs遺伝子で見られた
ように，nos はイントロンによって分断されていない。
nosは２ケ所のポリアデニル化部位と潜存性“TATA bo
x”を持つ。ocs と対照的に，nosは“CAT box”として
知られる転写シグナルであるような配列によって先行さ
れる。nos遺伝子の発現に必要なすべてのシグナルはnos
転写開始部位の261bp内で見つけられた（シー．コンツ
等，（C.Koncz et al.,）前出）。アグロシノピン合成
酵素の遺伝子およびtmsとtmrに対応する遺伝子はノパリ
ン型プラスミド上に同定されており（エイチ．ジョース
等（1983）セル 32 : 1057-1067（H.Joos et al．(1
983)Cell 32 : 1057-1067)），そして多くの転写物が，
マッピングされた（エル．ウィルミッツァー等（1983）
セル 32 : 1045-1056（ L. Willmitzer et al．（19
83) Cell 32 : 1045-1056) ）。ジェイ．シー．マクフ
ァーソン等（1980）ピーアールオーシー．エヌエイティ
ーエル．エイシーエイディー．エスシーアイ．ユーエス
エイ．77 : 2666-2670（J.C.McPhersson et al．（19
80) Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77 : 2666-2670 ）は，
クラウンゴール組織のＴ−ＤＮＡをコードしているｍＲ
ＮＡのインビトロ翻訳を報告した。

【００２３】毛状根Ｔ−ＤＮＡからの転写も観察された
（エル．ウィルミッツァー等（1982）エムオーエル．ジ
ーイーエヌ．ジーイーエヌイーティー．186 : 16-22
（L.Willmitzer et al．（1982) Mol.Gen.Genet.186
: 16-22)）。機能的に，毛状根症候群は，tmr中で突然
変異が起こったTiプラスミドによって刺激されるクラウ
ンゴール腫瘍と，同じようなものらしい（エフ．エフ．
ホワイトおよびイー．ダブリュー．ネスター（1980）ジ
ェイ．ビーエイシーティーイーアールアイオーエル．14
4 : 710-720（F.F.White α E.W.Nester (1980) J.Bac
teriol. 144 : 710-720））。

【００２４】真核生物で，ＤＮＡのメチル化（特にシト
シン残基）は転写の不活性化を相互関係がある。すなわ
ち，比較的メチル化の少ない遺伝子は，ｍＲＮＡへ転写
される。エス．ビー．ゲルビン等（1983）ニュークレイ
ック アシッズ アールイーエス．11 : 159-174（ S.
B.Gelvin et al．(1983) Nucleic Acids Res. 11 :1
59-174 ）は，クラウンゴール中のＴ−ＤＮＡが，少な
くともメチル化されていないコピーで，いつも存在する
ことを発見した。同じゲノムが，メチル化されたＴ−Ｄ
ＮＡのおびただしい他のコピーを含むかもしれないこと
は，ひとつ以上のＴ−ＤＮＡのコピーは生物学的に不活
性であるかもしれないことを示唆する（ジー．オームズ
等（1982）セル 30 : 589-597（G.Ooms et al．（19
82) Cell 30:589-597 ）を参照）。

【００２５】TiプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域にあり，そ
して感染過程に必要である他の遺伝子をコードしてい
る。（ノパリンプラスミドについては エム．ホルスタ
ーズ等（1980）プラスミド 3 : 212-230 （ M.Holster
s et al．(1980) Plasmid 3 :212-230 ）そしてオクト
ピンプラスミドについてはエイチ．デグリーブ等（198
1）プラスミド 6: 235-248 ，ディー．ジェイ．ガーフ
ィンクルおよびイー．ダブリュ．ネスター（1980）ジェ
イ．ビーエイシーティーイーアールアイオーエル144:73
2-743.（ H.De Greve et al．（1981) Plasmid 6 : 23
5-248, D.J.Garfinkel and E.W.Nester (1980) J.Bacte
riol 144 : 732-743,）およびジー．オームズ（1980）
ジェイ．ビーエイシーティーイーアールアイオーエル
144 : 82-91 （G.Ooms (1980) J.Bacteriol 144 :82-91
）参照）。最も重要なのはonc遺伝子であり，それは，
突然変異が起こるとTiプラスミドは発癌能力を失う。
（これらの位置も，毒性に対してvir として知られてい
る。）いくつかのonc 遺伝子は正確にマッピングされ，
様々なTiプラスミドの間に維持される領域に配置されて
いることが発見された（エイチ．ジェイ．クリー等（19
83）ジェイ．ビーエイシーティーイーアールアイオーエ
ル．153 : 878-883 ，ブイ．エヌ．イヤー等（1982）エ
ムオーエル．ジーイーエヌ．ジーイーエヌイーティー．
188 : 418-424 （H.J.Klee et al．(1983) J.Bacteri
ol.153 : 878-883, V.N.Iyer et al．(1982) Mol.Gen.
Genet. 188 : 418-424) ）。onc遺伝子はトランスで機
能し，異なるプラスミド型で物理的に他のプラスミド上
に位置するＴ−ＤＮＡと共に植物細胞の形質転換を起こ
すことができる（ジェイ．ヒル等（1982）プラスミド
7 :107 118 ，エイチ．ジェイ．クリー等（1982）ジェ
イ．ビーエイシーティーイーアールアイオーエル 150
: 327-331 ，エイ．ジェイ．ドゥ フラモンド等（198
3）ビーアイオーティーイーシーエイチエヌオーエル．1
: 262-269 （J.Hilleet al．(1982) Plasmid 7 : 107
-118, H. J.Klee et al．（1982) J.Bacteriol 150 :
327-331,A.J.de Framond et al．（1983) Biotechno
l. 1 : 262-269)）。ノパリンTiーＤＮＡは，Tiプラス
ミドからの除去，あるいは宿主ゲノムへの組み込みのど
ちらかに関与するらしいＴ−ＤＮＡのすぐ左と右端に隣
接した約25ベースペアの直接繰り返し配列を持ち（エ
ヌ．エス．ヤダフ等（1982）ピーアールオーシー．エヌ
エイティーエル．エイシーエイディー．エスシーアイ．
ユーエスエイ 79 : 6322-6326（N.S.Yadav et al．
（1982) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 79 : 6322-632
6)），相同性のある配列がオクトピンＴ−ＤＮＡの端に
近接したところで観察された（アール．ビー．シンプソ
ン等（1982）セル 29 : 1005-1014（R.B.Simpson et a
l．（1982) Cell 29 : 1005-1014)）。オピン異化作用
は，オクトピン型プラスミドのocc遺伝子と，ノパリン
型プラスミドのnoc 遺伝子によって特異的に起こる。Ti
プラスミドは複製開始点を含むそれ自身の再生に必要な
機能もコードする。Tiプラスミド転写は，エス．ビー．
ゲルビン等（1981）プラスミド 6 : 17-29,（S.B.Gelv
in et al．（1981) Plasmid 6 : 17-29,）によってア
グロバクテリウム・チューメファシエンス細胞で観察さ
れた。彼らは，Ｔ−ＤＮＡ領域が，非Ｔ−ＤＮＡ配列と
伴に弱く転写されることを発見した。Tiプラスミドの決
定された性格はマーロ（Merlo）, 前出（特に表４を参
照），およびリームおよびゴードン（Ream α Gordon）
前出によって示されている。

【００２６】ＴＩＰプラスミドＤＮＡ 異なるオクトピン型Tiプラスミドは，ＤＮＡハイブリダ
イゼーション（ティー．シー．カリーアおよびイー．ダ
ブリュー．ネスター（1976）ジェイ．ビーエイシーティ
ーイーアールアイオーエル．126 : 157-165 （T.C.Curr
ier α E.W. Nester (1976) J.Bacteriol. 126 : 157-1
65) ），あるいは制限酵素分析（ディー．スキアキィ等
（1978）プラスミド 1 : 238-253 （D.Sciaky et a
l．（1978) Plasmid 1 : 238-253)）によって調べる
と，相互にほとんど 100％相同性があった。ノパリン型
Tiプラスミドは相互に67％程の相同性しか持たない（カ
リーアおよびネスター，（Currier α Nester,）前
出）。ある調査では異なるRiプラスミドは相互に非常に
相同性があることを示した（ピー．コスタンティノ等
（1981）プラスミド 5: 170-182 （P.Costantino et
al．（1981) Plasmid 5 : 170-182)。エヌ．エイチ．ド
ゥラモンドおよびエム．−ディー．チルトン（1978）ジ
ェイ．ビーエイシーティーイーアールアイオーエル．13
6:1178-1183 （N.H.Drummond α M.-D.Chilton （197
8) J.Bacteriol.136 : 1178-1183 ）は，オクトピン型
とノパリン型Tiプラスミドの比較的小さい部分は相互に
相同性があることを示した。これらの相同性はジー．イ
ングラー等（1981）ジェイ．エムオーエル．ビーアイオ
ーエル．152 : 183-208 （ G.Engler et al．（1981)
J.Mol.Biol.152 : 183-208 ）によって詳細にマッピン
グされた。彼らは４つの相同性領域の３つが，３つ（Ｔ
−ＤＮＡをオーバーラップしている）４つ（いくつかの
onc 遺伝子を含む）および９つ（onc 遺伝子を持つ）の
相同性配列にさらに分けられることを発見した。連続し
た相同性は，少なくとも，ひとつのtra 遺伝子（他の細
菌細胞へのTiプラスミドの接合伝達に関与する）と，複
製と不和合性に必要とされる遺伝子を含む。この連続し
た領域は，リゾビアッシー科の異なる属であるリゾビウ
ムの一種からのSym プラスミド（共生的窒素固定に必要
な）と相同性を持つ（アール．ケイ．プラカッシュ等
（1982）プラスミド 7 : 271-280 （R.K.Prakash et
al．（1982) Plasmid 7 : 271-280)）。この４領域は，
すべて同じ方向へ向くけれども順序は保存されない。Ｔ
−ＤＮＡ配列の部分はノパリンプラスミドとオクトピン
プラスミドの間に非常に高く保存されている（エム．−
ディー．チルトン等（1978）ネイチャー 275 : 147-14
9 ，エイ．デピッカー等（1978）ネイチャー 275 : 15
0-153 （M.-D.Chilton et al．（1978) Nature 275 :
147-149, A.Depicker et al．（1978) Nature 275 :
150-153））。Riプラスミドは，それら自身の間，およ
び主としてonc 遺伝子をコードしている領域でオクトピ
ン（エフ．エフ．ホワイトおよびイー．ダブリュー．ネ
スター（1980）ジェイ．ビーエイシーティーイーアール
アイオーエル．144 : 710-720 （F.F.White α E.W.Ne
ster (1980) J.Bacteriol. 144 : 710-720) ）とノパリ
ン（ジー．リスレオ等（1982）プラスミド 7 : 45-51
（G.Risuleo et al．（1982) Plasmid 7 : 45-51)）Ti
プラスミドに対して，広範な相同性を持つことが示され
た。RiのＴ−ＤＮＡはTiプラスミドの両型から由来のＴ
−ＤＮＡに対して弱いけれども広範な相同性を含む（エ
ル．ウィルミッツァー等（1982）エムオーエル．ジーイ
ーエヌ．ジーイーエヌイーティー．186 : 16-22 （ L.
Willmitzer et al．（1982) Mol.Gen.Genet. 186:16-
22)）。感染していないニコチアナ・グラウカからの植
物ＤＮＡは，cＴ−ＤＮＡ（細胞内Ｔ−ＤＮＡ）として
呼ばれる配列を持ち，それは，RiのＴ−ＤＮＡの一部分
と相同性を示す（エフ．エフ．ホワイト等（1983）ネイ
チャー 301 : 348-350 ，エル．スパーノ等（1982）プ
ラントエムオーエルイーシー．ビーアイオーエル．1 :
291-300 （ F.F. White et al．（1983) Nature 301:3
48-350, L.Spano et al．（1982）Plant Molec. Biol.
1：291-300)）。ジー．エイ．ハフマン等（1983）ジェ
イ．ビーアイシーティーイーアールアイオーエル．（G.
A.Huffman et al．（1983) J.Bacteriol.は交叉ハイブ
リダイゼーションの領域をマッピングし，Riプラスミ
ド，pRiA4bが pTiT37（ノパリン型）よりpTiA6 （オク
トピン型）により密接に関係しており，このRiプラスミ
ドはtmr にではなくtms に対する相同性のある配列を保
持するらしいことを示した。その結果は，RiのＴ−ＤＮ
Ａが不連続でオクトピンＴ−ＤＮＡの場合と類似してい
ることも示唆する。

【００２７】Ti（エム．−ディー．チルトン等（1977）
セル11 : 263-271（M.-D. Chiltonet al．（1977) Cel
l 11 : 263-271)）あるいはRi（エム．−ディー．チル
トン（1982）ネイチャー 295 : 432-434 ，エフ．エ
フ．ホワイト等（1982）ピーアールオーシー．エヌエイ
ティーエル．エイシーエイディ．エスシーアイ．ユーエ
スエイ 79 : 3193-3197，エル．ウィルミッツァー（19
82）エムオーエル．ジーイーエヌ．ジーイーエヌイーテ
ィー．186 : 16-22 （M.-D.Chilton (1982) Nature 295
:432-434, F.F.White et al．（1982) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79 : 3193-3197, L.Willmitzer (198
2) Mol.Gen.Genet.186 : 16-22)）プラスミドの一部分
が，腫瘍性植物細胞のＤＮＡで見つけられたということ
が示された。転移ＤＮＡはＴ−ＤＮＡとして知られてい
る。Ｔ−ＤＮＡは，核の（エム．エフ．トーマショウ等
（1980）ピーアールオーシー．エヌエイティーエル．エ
イシーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエイ 77 :
6448 6452，エヌ．エス．ヤダフ等（1980）ネイチャー
287 : 458-461 （M.F.Thomashow et al．（1980）Pro
c.Natl.Acad.Sci. USA 77 : 6448 6452, N.S.Yadav et
al．（1980) Nature 287: 458- 461)）多数の部位で
（ディー．ウルスイック等（1983）エムオーエル．ジー
イーエヌ．ジーイーエヌイーティー．190 : 494-503 ，
ジェイ．メクリンク等（1983）エムオーエル．ジーイー
エヌ．ジーイーエヌイーティー．190 : 516-522 （D.Ur
sic et al．（1983) Mol.Gen.Genet. 190 : 494-503,
J.Memelinket al．（1983) Mol.Gen.Genet. 190 : 516
-522) 宿主ＤＮＡへ（エム．ピー．ニューティ等（198
0）プラント エスシーアイ．エルイーティーティー．1
8: 1-6, エル．ウィルミッツァー等（1980）ネイチャー
287 : 359-361,エム．−ディー．チルトン等（1980）
ピーアールオーシー．エヌエイティーエル．エイシーエ
イディー．エスシーアイ．ユーエスエイ 77 : 4060 40
64（M.P.Nuti et al．（1980) Plant Sci.Lett. 18 :
1-6, L.Willmitzer et al．（1980) Nature287 : 35
9-361, M.-D.Chilton et al．（1980）Proc.Natl.Aca
d.Sci. USA 77:4060 4064) ）組み込まれる。多くの非
Ｔ−ＤＮＡのTiプラスミドＤＮＡは，Ｔ−ＤＮＡ組み込
みの前に植物細胞へ転移される（エイ．キャプラン等
（1983）サイエンス222:815-821（A.Caplan et al．
(1983)Science 222 : 815-821)）。

【００２８】エム．エフ．トーマショウ等（1980）ピー
アールオーシー．エヌエイティーエル．エイシーエイデ
ィー．エスシーアイ．ユーエスエイ 77 : 6448-6452，
およびエム．エフ．トーマショウ等（1980）セル 19 :
729-739，（M.F.Thomashowet al．（1980) Proc.Nat
l.Acad.Sci. USA 77 : 6448-6452, and M.F.Thomashow
et al．（1980) Cell 19 : 729-739,）はＴＬ−ＤＮＡ
とＴＲ−ＤＮＡ，それぞれ左および右Ｔ−ＤＮＡ，とい
う２つの別の位置に組み込まれた，オクトピン型Tiプラ
スミドからＴ−ＤＮＡを見つけた。ＴＲとＴＬのコピー
数は変化し得る（ディー．ジェイ．マーロ等（1980）エ
ムオーエルイーシー．ジーイーエヌ．ジーイーエヌイー
ティー．177 : 637-643 （D.J.Merlo etal．（1980) Mo
lec.Gen.Genet. 177 :637-643)）。Ｔ−ＤＮＡの中芯は
ノパリンＴ−ＤＮＡに対して高い相同性があり（チルト
ン等（Chilton et al．）（1978) 前出，およびデピッ
カー等（ Depicker et al．）（1978）前出），腫瘍維
持にとって必要で，ＴＬで見出され，一般に細胞に対し
て１コピー存在し，そしてtms ，tmr ，およびtml遺伝
子をコードしている。一方，ＴＲは，高コピー数で見出
されるが（マーロ等（Merlo et al．）（1980) 前
出），全く不要にすることができる（エム．ドゥベッケ
ラー等（1981）エムオーエルイーシー．ジーイーエヌ．
ジーイーエヌイーティー．183 : 283-288 ，ジー．オー
ムズ等（1982）セ ル 30 : 589-597（M.De Beuckelee
r et al．（1981）Molec.Gen.Genet. 183 : 283-288,
G.Oomsetal．（1982) Cell 30 : 589-597)）。ジー．オ
ームズ等（1982）プラスミド 7: 15-29 （G.Ooms et
al．（1982) Plasmid 7 : 15-29 ）は，ＴＲがTiプラ
スミドから欠失しても高アグロバクテリウム・チューメ
ファシエンスが何らかの毒性を保有することを認めてい
るが，ＴＲはＴ−ＤＮＡの組み込みに必要とされるとい
う仮設をたてた。ジー．オームズ等（1982）セル 30 :
589-597（G.Oomset al．（1982) Cell 30 : 589-597
）は，Ｔ−ＤＮＡは時に植物ゲノムに組み込まれた後
欠失するけれど，一般には安定であり，Ｔ−ＤＮＡの構
成が異なる細胞混合物を含む腫瘍が，多重形質転換事象
の結果であることを示した。ocs はＴ_Lで見つけられた
が，腫瘍増殖に関係する表現型を失うことなく植物ゲノ
ムから欠失できる。組み込まれたＴＬの左端は，順方
向，あるいは逆方向のＴ−ＤＮＡ配列の繰り返しからな
る（アール．ビー．シンプソン等（1982）セル 29 : 1
005-1014（R.B.Simpson et al．（1982) Cell 29 : 10
05-1014)）。エム．ホルスターズ等（1983）エムオーエ
ル．ジーイーエヌ．ジーイーエヌイーティー．190: 35-
41 （M.Holsters et al．（1983) Mol.Gen.Genet. 19
0 : 35-41は，ＴＬの右端を同定した。ＴＬの右端は，
ＴＬの左端で見つけられた配列の 25bp の直接繰り返し
を持ち，ノパリンＴ−ＤＮＡのどちらかの端で見つけら
れた直接繰り返しと相同性もある。ＴＬは，植物とＴ−
ＤＮＡ配列の両方から由来する約 400bpの“リンカー”
によって分けられた連鎖コピーで，組み込まれているこ
とがわかった。

【００２９】オクトピン型腫瘍の状況と対照的にノパリ
ンＴ−ＤＮＡはひとつの連続断片で宿主ゲノムへ組み込
まれる（エム．レマーズ等（1980）ジェイ．エムオーエ
ル．ビーアイオーエル．144 : 353-376,ピー．ザンブリ
スキィ等（1980）サイエンス209:1385-1391（M.Lemmers
et al．（1980) J.Mol.Biol. 144 : 353-376, P.Zamb
ryski et al．（1980) Science 209 : 1385-139
1)）。順方向連鎖繰り返しが観察された。奇形腫から再
生した植物のＴ−ＤＮＡは挿入されたＤＮＡの端の断片
で少しの修飾を受けた（レマーズ等（Lemmers et a
l.,）前出）。右と左端の間の連結部の配列分析は，多
数の直接繰り返しとひとつの逆方向繰り返しがあること
を示した。逆方向繰り返し配列は，接合部に及んだ（ザ
ンブリスキィ等（Zambryski et al．）（1980) 前
出）。左接合部は右接合部が，単一ヌクレオチドも変化
しないにもかかわらず，少なくとも70ベースペアで変化
することが示された（ピー．ザンブリスキィ等（1982）
ジェイ．エムオーエル．アイピーピーエル．ジーイーエ
ヌイーティー．1 : 361-370 （P.Zambryski et al．
（1982）J.Mol.Appl.Genet. 1 : 361-370)）。左と右は
130ベースペア以上にあろうスペーサーによって分けら
れる繰り返し配列の接合部に面する。当スペーサーは起
源は知られておらず，いくつかのＴ−ＤＮＡ配列を含ん
でいた。Ｔ−ＤＮＡは，どちらの繰り返しにも組み込ま
れ，低コピー数の宿主配列であるとわかった。エイチ．
ジョーズ等（1983）セル 32 : 1057-1067（H.Joos et
al．（1983) Cell 32 : 1057-1067 ）は病毒性は，通
常のノパリンＴ−ＤＮＡのどちらかの端が欠失した後
も，除去されないことを示した。

【００３０】シンプソン等（Simpson et al．）（198
2) 前出，およびザンブリスキィ等（Zambryski et a
l．）（1980) 前出は，境界領域中の直接繰り返し配列
が，植物細胞へのＴ−ＤＮＡの組み込みに必要であると
示唆した。２種の異なるTiプラスミドからの境界を保持
するＴ−ＤＮＡが，相同性のある境界よりも，特異的に
組み込まれにくいことが，この示唆を支持している（ジ
ー．オームズ等（1982）プラント エムオーエルイーシ
ー．ビーアイオーエル．1 : 265-276 （G.Oomset al．
（1982) Plant Molec.Biol. 1 : 265-276)。

【００３１】エヌ．エス．ヤダフ等（1982）ピーアール
オーシー．エヌエイティーエル．エイシーエイディー．
エスシーアイ．ユーエスエイ 79 : 6322-6326（N.S.Ya
davet al．（1982) Proc.Natl.Acad. Sci. USA 79 : 6
322-6326 はchi 部位を発見した。その部位はバクテリ
オファージ入中で，Ｔ−ＤＮＡの左端のすぐ外側のノパ
リンTiプラスミド中の10キロベース程離れたあたりのＤ
ＮＡでの一般的組み換えを増大する。アール．ビー．シ
ンプソン等（1982）セル 29 : 1005-1014（R.B.Simpso
n etal．（1982) Cell 29 : 1005-1014 ）は，オクトピ
ンTiプラスミドには，相当する位置に，chi配列を観察
しなかった。Tiプラスミド中のchiの重要性は知られて
いない。

【００３２】ＴＩＰプラスミドの操作 シャトルベクターの項で詳述したようにＴＩＰプラスミ
ド上の望みの位置へ変化したＤＮＡ配列を導入する技術
が発達した。この技術を用いて，トランスポソンを容易
に挿入することができる（ディー．ジェイ．ガーフィン
クル等（1981）セル27 : 143-153（D.J.Garfinkel et
al．（1981) Cell 27 : 143-153)）。ジェイ．−ピー．
ハーネルスティーン等（1980）ネイチャー 287 : 654-
656 （J.-P.Hernalsteen et al．（1980) Nature 287
: 654-656）はTiプラスミド中のＴ−ＤＮＡへ挿入され
たＤＮＡ配列（ここでは細菌性トランスポソン）が，受
容植物のゲノムへ転移され，組み込まれることを示し
た。外来ＤＮＡの挿入は異なった起源からの多数のゲノ
ムでなされたが，現在まで，外来ＤＮＡはそれ自身のプ
ロモーターの制御下では通常発現していない。これらの
遺伝子の起源はうさぎβ−グロビン（シー．エイチ．シ
ョウ等（1983）ジーイーエヌイー 23 : 315-330 （C.
H.Shaw et al．（1983) Gene 23 : 315-330)），酵母
のアルコール脱水素酵素（Adh ）（ケイ．エイ．バート
ン等（1983）セル 32 :1033-1043 （K.A.Barton et
al．（1983) Cell 32 : 1033-1043)），とうもろこしの
Adh I（ジェイ．ベネッツェン（J.Bennetzen ）未発
表）とゼイン，哺乳類のインターフェロンとグロビン，
および哺乳類ウィルスＳＶ40（ジェイ．シェル（J.Sche
ll），公表されていない）を含む。しかしノパリン合成
酵素遺伝子がオクトピンＴ−ＤＮＡへ挿入され，植物組
織へ形質転換されると，充分に機能することがわかった
（シー．エル．フィンク（1982）エム．エス．シーズ，
ユニバーシティオブウィスコンシン−マジソン（C.L.Fi
nk (1982) M.S.thesis, University of Wisconsin-Madi
son)）。マメ科のファゼオラス・ブルガリスＬの種子で
見つけられた貯蔵タンパクであるファセオリンをコード
している遺伝子は，ひまわりの腫瘍へ転移され発現し
た。この後者の研究は他の植物組織中で，それ自身のプ
ロモーターの制御下で発現した，転移された植物遺伝子
の最初の実施例をもたらした。転写は正しい位置で開始
し停止した。そしてイントロンは転写後に正確に切断さ
れた（エヌ．ムライ等（1983）サイエンス 222 : 476-
482 ，およびティー．シー．ホール等，ユーエス アプ
リケーション エスイーアール．エヌオー．485,613
（N.Murai et al．（1983) Science 222 : 476-482, a
nd T.C.Hall et al.,US application ser.no.485,613)
）。エム．ホルスターズ等（1982）エムオーエル．ジ
ーイーエヌ．ジーイーエヌイーティー．185 : 283-289
（M.Holstersetal．（1982) Mol.Gen.Genet. 185 : 283
-289）はＴ−ＤＮＡに挿入された細菌性トランスポソン
（Tn7）は植物ゲノムへ組み込まれた後も，充分に機能
を有し，そして表面上，形を変えずに回収されたことを
示した。

【００３３】いくつかの方法によって，欠失をＴＩＰプ
ラスミドに作ることができる。シャトルベクターは，標
準組み換えＤＮＡ技術によって，欠失を誘導するために
使用される（エス．エヌ．コーエンおよびエイチ．ダブ
リュー．ボイヤー，ユーエスピーエイティー．4,237,22
4 （S.N.Cohen α H.W. Boyer, US Pat.4,237,224)）。
ひとつの決められた末端での欠失はトランスポソンの不
適当な切出しによって作り出すことができ（ビー．ピ
ー．コークマン等（1979）プラスミド 2 : 347-357，
およびジー．オームズ等（1982）プラスミド 7 : 15-
29（B.P.Koekman et al．（1979) Plasmid 2 : 347-35
7, and G.Ooms et al．（1982) Plasmid 7:15-29)）。
ジェイ．ハイルおよびアール．シルプルーツ（1981）プ
ラスミド6:151-154 （J.Hille α R. Schilperoot (198
1) Plasmid 6 :151-154 ）は決められた位置での両端を
持った欠失を，２つのトランスポソンを用いて，生成す
ることができることを証明した。この技術はインゼボで
の“組み換えＤＮＡ”分子を構築するためにも使用され
る。

【００３４】ノパリン合成酵素遺伝子が，形質転換され
た植物細胞を選択するために使用することのできる薬剤
耐性をコードしたＤＮＡ小片の挿入に用いられた。植物
細胞ではTn5からの細菌性カナマイシン耐性遺伝子は，
それ自身のプロモーター制御下で転写されない（ジェ
イ．ディー．ケンプ等（1983）イン ジエネティックエ
ンジニアリング：アプリケーション トゥ アグリカル
チャー，（ベルツビレエスヤイエムピー．エイジーアー
ルアイシー．アールイーエス．７），エーディー．：エ
ル．ディー．オーウェンズ，ピーピー．215-228;および
シー．エル．フィンク（1982）（J.D.Kempet al．(198
3) in Genetic Engineering : Applications to Agric
ulture, (Beltsville Symp.Agric.Res.7 ),ed. : L.D.
Owens, pp.215-228 ；および C.L. Fink (1982) ）前
出）。エム．ダブリュー．ビーバン等（1983）ネイチャ
ー 304 : 184-187 とアール．ティー．フレイリィ等
（1983）ピーアールオーシー．エヌエイティーエル．エ
イシーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエイ80 : 4
803-4807（M.W.Bevan et al．（1983) Nature 304 :18
4-187 と R.T.Fraley et al．（1983) Proc. Natl.Aca
d.Sci. USA 80 : 4803-4807 ）は，ノパリンプロモータ
ーの後（それの制御下）にTn5 由来のカナマイシン耐性
遺伝子（ネオマイシンリン酸転移酵素II）を挿入した。
この作成物は，培養でカナマイシンとＧ418 のようなそ
のアナログに対して耐性を示した植物を形質転換するた
めに用いられる。ジェイ．シェル等（18 ジャニュアリ
ィ 1983）フィフティーンス マイアミウィンター エ
スワイエムピー．（シー オルソージェイ．エル．マー
クス（1983）サイエンス219 : 830 （J.Schell et a
l．（18 January 1983)15th Miami Winter Symp. ( se
e also J.L.Marx (1983) Science 219:830) ）は，同
様の作成物を報告した。その作成物では，Tn7 由来のメ
トトレキサート耐性遺伝子（ジハイドロフォレイトレダ
クターゼ）をノパリン合成酵素プロモーターの後に置い
た。形質転換細胞はメトトレキセート耐性であった。同
様にエル．ヘレッラ−エストレッラ等（1983）ネイチャ
ー 303 : 209-213 （ L.Herrera-Estrella et al．
（1983) Nature 303 : 209-213）はオクトピン合成酵素
と，細菌でクロラムフェニコールに耐性を与える酵素で
あるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラー
ゼの植物細胞中での酵素活性の発現を，nos プロモータ
ーの制御下に２つの酵素の構造遺伝子を配置することに
よって得た。

【００３５】エヌ．ムライ等（1983）サイエンス 222
: 476-482 ，およびティー．シー．ホール等，ユーエ
スアプリケーション エスイーアール．エヌオー．485,
614 （N.Murai et al．（1983) Science 222 : 476-48
2, and T.C.Hall et al., USapplication ser.no.485,
614）は，豆の種子タンパクであるファセオリンの構造
遺伝子に対するocs プロモーターと，オクトピン合成酵
素の構造遺伝子の５’末端の融合を報告している。オク
トピン合成酵素のアミノ末端を持ち，ファセオリンのア
ミノ末端を欠いた融合タンパクが，Ｔ−ＤＮＡプロモー
ターの制御下で生み出された。ファセオリン配列によっ
て与えられるイントロンは，転写後正確に切断された。

【００３６】エイ．ジェイ．ドゥフレモンド等（1983）
ビーアイオーティーイーシーエイチエヌオーエル．1 :
262-269 （A.J.de Framond et al．（1983) Biotechnol. 1 : 262-269 は“ミニ Tiプラスミド”を
作成したことについて報告した。ノパリンＴ−ＤＮＡに
は，制限酵素 Kpn Iによって切断される唯一の部位が通
常は存在する。その部位を欠いた突然変異体を作成し，
無傷のノパリンＴ−ＤＮＡを含むKpn I断片を分離し
た。カナマイシン耐性遺伝子と共にこの断片をpRK290
へ挿入した。それによってアグロバクテリウム・チュー
メファシエンスで維持されることができ，ほとんどすべ
ての非−Ｔ−ＤＮＡ配列を欠いたプラスミドができた。
このプラスミドは，それ自身では，植物細胞を形質転換
することができなかった。しかし，オクトピンTiプラス
ミドを含むアグロバクテリウム・チューメファシエンス
株中に置かれると，オクトピンとノパリンの両方を合成
する腫瘍を誘導した。このミニTiプラスミドは，それ自
身のＴ−ＤＮＡを欠いたTiプラスミドと相補されると，
植物細胞へ転移された。これらの結果は，非Ｔ−ＤＮＡ
機能はＴ−ＤＮＡとトランスに働き，Tiプラスミド機能
は，オクトピンTiプラスミドによって相補され，ノパリ
ン“ミニ−Ti”は植物細胞の形質転換で機能することを
示唆した。夫々オクトピンＴ−ＤＮＡあるいはonc 遺伝
子を含んだ同様の相補するプラスミドの組は，エイ．ホ
ケマ等（1983）ネイチャー 303 :179-180 （A.Hoekema
et al．（1983) Nature303 : 179- 180 によって作
成された。

【００３７】チルトン等（18 ジャニュアリィ 1983）フ
ィフティーンス マイアミ ウィンター エイワイエム
ピー．（Chilton et al．（18 January 1983) 15th M
iamiWinter Symp.）もノパリン合成酵素遺伝子と左と右
端以外のＴ−ＤＮＡの必須はすべてを欠失させるため
に，Sma Iでミニ−Tiを再区分化することによる“ミク
ロ−Ti”の作成について報告した。このミクロ−TiはSm
a I部位をなくした，修飾された pRK290 プラスミドへ
挿入され，ミニ−Tiと同様の方法で使用され，かなりの
結果を収めた。

【００３８】

【発明の要旨】本発明の目的の１つは，前記遺伝子が前
記細胞に対して外来である，植物細胞中での構造遺伝子
の発現を促進するための方法を提供することである。こ
の目的の追求において，他の目的は，植物細胞中におい
て構造遺伝子の転写および翻訳を調節することのできる
ＤＮＡ配列である，Ｔ−ＤＮＡ由来プロモーターおよび
Ｔ−ＤＮＡ由来ポリアデニル化部位を，提供することで
ある。もう１つの目的は外来構造遺伝子にコードされて
いるタンパク，そしてそのタンパクが酵素である場合に
は，その遺伝子が挿入される細胞中に存在しない，また
は逆に存在する代謝産物もしくは化合物をそれぞれ，保
持するもしくは欠如するような特殊化された植物組織お
よび植物を提供することである。他の目的および利点は
以下の記述により明らかになるであろう。

【００３９】本発明の植物細胞を遺伝的に修飾する方法
は，プロモーター，外来構造遺伝子およびポリアデニル
化部位を含むように細胞の形質転換により植物細胞を遺
伝的に修飾する方法であって，該プロモーター，該構造
遺伝子および該ポリアデニル化部位は互いに，該構造遺
伝子が該プロモーターと該ポリアデニル化部位との支配
下で植物細胞内で発現しうるような位置と方向にあり，
該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位のうちの少
なくとも一方がＯＲＦ１，３，４，５，８，９，10, 1
8，19, 21, 24, 25および26から成る群から選択された
oＴ−ＤＮＡ遺伝子とハイブリダイズし得るいづれかの
ＴＩＰ遺伝子から得られ，そのことにより上記目的が達
成される。

【００４０】本発明のＤＮＡベクターは，プロモータ
ー，外来構造遺伝子およびポリアデニル化部位を有する
ＤＮＡベクターであって，該プロモーター，該構造遺伝
子および該ポリアデニル化部位は互いに，該構造遺伝子
が該プロモーターと該ポリアデニル化部位との支配下で
植物細胞内で発現しうるような位置と方向にあり，該プ
ロモーターおよび該ポリアデニル化部位のうちの少なく
とも一方はＯＲＦ１，３，４，５，８，９，10, 18, 1
9, 21, 24，25および26から成る群から選択されたoＴ−
ＤＮＡ遺伝子とハイブリダイズし得るいづれかのＴＩＰ
遺伝子から得られ，そのことにより上記目的が達成され
る。

【００４１】本発明のＤＮＡベクトルを有する細菌株
は，ＤＮＡベクターを有する細菌株であって，該ベクタ
ーがプロモーター，外来構造遺伝子およびポリアデニル
化部位を有し，該プロモーター，該構造遺伝子および該
ポリアデニル化部位は互いに，該構造遺伝子が該プロモ
ーターと該ポリアデニル化部位との支配下で植物細胞内
で発現しうるような位置と方向にあり，該プロモーター
および該ポリアデニル化部位のうちの少なくとも一方は
ＯＲＦ１，３，４，５，８，９，10, 18, 19, 21, 24,
25および26から成る群から選択された oＴ−ＤＮＡ遺伝
子とハイブリダイズし得るいづれかのＴＩＰ遺伝子から
得られ，そのことにより上記目的が達成される。

【００４２】本発明の遺伝的に修飾された植物細胞を有
する植物組織は，プロモーター，外来構造遺伝子，およ
びポリアデニル化部位を含むように形質転換された遺伝
的に修飾された植物細胞を有する植物組織であって，該
プロモーター，該構造遺伝子および該ポリアデニル化部
位は互いに，該構造遺伝子が該プロモーターと該ポリア
デニル化部位との支配下で植物細胞内で発現しうるよう
な位置と方向にあり，該プロモーターおよび該ポリアデ
ニル化部位のうちの少なくとも一方はＯＲＦ１，３，
４，５，８，９，10, 18, 19, 21, 24, 25および26から
成る群から選択された oＴ−ＤＮＡ遺伝子とハイブリダ
イズし得るいづれかのＴＩＰ遺伝子から得られ，そのこ
とにより上記目的が達成される。

【００４３】また，本発明の遺伝的に修飾された植物細
胞を有する植物は，プロモーター，外来構造遺伝子，お
よびポリアデニル化部位を含むように形質転換された遺
伝的に修飾された植物細胞を含む植物であって，該プロ
モーター，該構造遺伝子および該ポリアデニル化部位は
互いに，該構造遺伝子が該プロモーターと該ポリアデニ
ル化部位との支配下で植物細胞内で発現しうるような位
置と方向にあり，該プロモーターおよび該ポリアデニル
化部位のうちの少なくとも一方はＯＲＦ１，３，４，
５，８，９，10, 18, 19, 21, 24, 25および26から成る
群から選択されたoＴ−ＤＮＡ遺伝子とハイブリダイズ
し得るいづれかのＴＩＰ遺伝子から得られ，そのことに
より上記目的が達成される。

【００４４】ここに開示する本発明は，導入され，そし
てＴ−ＤＮＡ由来の植物の発現しうる転写制御配列（Ｔ
×ＣＳ）の制御下でそこで発現する，外来構造遺伝子を
保持する遺伝学的に修飾された植物細胞を有する植物を
提供することにある。さらに，本発明は，Ｔ−ＤＮＡ由
来の植物の発現しうるＴ×ＣＳに関して，それらの配列
の制御下で植物細胞内で発現できるような方向および配
置で挿入された外来構造遺伝子を有するＴ−ＤＮＡを，
そのゲノム中に含むような植物細胞を有する植物組織を
提供することである。その上に，Ｔ−ＤＮＡ由来の植物
の発現しうるＴ×ＣＳに関して，前記Ｔ×ＣＳの制御下
で植物細胞内で発現できるような方向および配置で挿入
された外来構造遺伝子を含むように修飾されたＴ−ＤＮ
Ａを含み，そして複製する細菌の新しい株を提供する。
さらに，本発明は，エセリシア・コリー内で複製する能
力を有し，そしてＴ−ＤＮＡを含み，さらにそれに含ま
れたＴ−ＤＮＡ中にＴ−ＤＮＡのＴ×ＣＳの制御下にあ
る植物細胞内で発現するように挿入された外来構造遺伝
子を有する，新しいベクターを提供する。さらにまた，
前記ベクターを保持する細菌株が開示される。

【００４５】ここに示す実験成果は完全なＴ−ＤＮＡ配
列の最初の発表であると思われる。この配列を用いるこ
とにより，植物の形質転換により外来構造遺伝子を発現
させる仕事，およびＴ−ＤＮＡとＴ−ＤＮＡ由来の配列
の他の操作の仕事を容易にする。この新しく開示された
Ｔ−ＤＮＡ配列なくしては，一般の当業者は，外来構造
遺伝子の植物細胞中での転写を促進するようになってい
る，この新しく開示されたプロモーターおよびポリアデ
ニル化部位を使用できないであろう。この開示された配
列は，いくつかの今まで知られていなかったＴ−ＤＮＡ
遺伝子の存在と，それに関連した転写制御部位を明らか
にし，そして今までは一般には使用できなかった配列で
ある，Ｔ−ＤＮＡ遺伝子からのプロモーターおよびポリ
アデニル化部位を用いての組み換えＤＮＡ分子の構築を
可能にする。

【００４６】本発明は植物細胞中において発現可能な，
あるＴ−ＤＮＡのプロモーターおよび／もしくは，ある
Ｔ−ＤＮＡのポリアデニル化部位の制御下にある外来構
造遺伝子を有し，前記プロモーター／遺伝子／ポリアデ
ニル化部位の結合体は，既知のどれかの方法により植物
細胞に挿入される。さらに明確に言えば，望ましい実施
態様では，ここに開示する本発明はさらに，Ｔ−ＤＮＡ
による導入の後，すなわちＴ−ＤＮＡプロモーター制御
下および／またはＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位の前，
に外来構造遺伝子をＴ−ＤＮＡ中に挿入し，既知の方法
により導入断切を含むＴ−ＤＮＡを植物細胞に導入する
ことにより，Ｔ−ＤＮＡ由来の植物での発現可能なＴ×
ＣＳの制御下において，植物細胞内での外来構造遺伝子
の発現を含む。ひとたびＴ−ＤＮＡのＴ×ＣＳ制御下に
おいて外来構造遺伝子を発現する植物細胞が得られる
と，当該分野の方法および技術により，植物組織および
植物全体を再生することができる。再生された植物はそ
の後，通常の方法により繁殖させ，導入遺伝子は，通常
の植物育種技術により他の株および栽培変種へ移入する
ことができる。本発明は原則的に，外来ＤＮＡ（もっと
具体的に言えばＴ−ＤＮＡ）がどんな方法によっても導
入することができ，前記ＤＮＡが安定に複製される，と
いういかなる植物種への外来構造遺伝子のいかなる導入
に対して適用される。一般的に言って，これらの分類群
は目下のところ，限定されてはいないが，裸子植物およ
び双子葉植物，例えばヒマワリ（コンポシタエ科），タ
バコ（ソラナシー科），アルファルファ，大豆，および
他のマメ科植物（レグミノシー科），ワタ（マルバシー
科），および大多数の野菜を含む。

【００４７】本発明は他の種，生物，または株からの有
用な構造遺伝子を挿入することにより，植物細胞，植物
組織，および植物全体を遺伝学的に修飾するのに役立
つ。そのような有用な構造遺伝子には，限定されるわけ
ではないが，例えば極端な高温または低温に対する改良
された耐性，乾燥または浸透圧に対する改良された耐
性，昆虫（例えば殺虫性毒素），節足動物，線形動物，
または着生植物の害虫，およびカビ，細菌，またはウイ
ルス病に対する改良された抵抗性または耐性，前記組織
または植物には通常存在しない酵素または二次代謝産物
の生産，繊維，または人間または動物の食物に使用され
る場合の栄養上の（例えば貯蔵タンパク，レクチン，お
よびまめレクチン），香味上の（例えば甘味タンパ
ク），または処理上における改良された性質，変化した
形態上の特徴または発達様式（例えば植物を昆虫から守
る葉毛，美的に好ましい色，変化した植物の生育習性，
小型植物，成熟までに必要な時間の短縮，組織中での遺
伝子の発現，もしくは通常は発現されない時の遺伝子の
発現，その他同種類のもの），雄性不稔，改良された光
合成能（光呼吸の低下化を含む），改良された窒素固定
能，改良された栄養吸収能，改良された除草剤に対する
耐性，増加した作物生産量，改良された他の植物に対す
る競争力，１つまたはそれ以上の特徴的な核酸配列，タ
ンパク，または遺伝子産物の存在，または同定された表
現型による改良された生殖質の同定（本発明により遺伝
的に修飾された植物を，連鎖した人為的に導入された表
現型を他の（例えば性的な）方法によって他の遺伝子型
への変換を容易にするようには，もしくは特許または植
物種保護証明により守られている植物の同定を容易にす
るようには，修飾されていない植物と区別するため），
細胞または組織培養中における選択薬剤に対する抵抗性
（すなわち選択可能なマーカー），その他同種類のも
の，を含む。本発明は，ファセオラス・ブルガリス豆の
主要な種子貯蔵タンパクであるファセオリンの構造遺伝
子の導入および発現により例証される。例えば，ファセ
オリンの構造遺伝子の導入および発現は，アルファルフ
ァまたは他の作物のタンパク含量および栄養価を増加さ
せるのに利用できる。本発明はまたレクチンの構造遺伝
子，この場合は同じくファセオラス・ブルガリスから得
られたが，の植物細胞中への導入および発現により例証
される。新しいレクチンの導入および発現は，植物組織
の栄養上のまたは共生の特徴を変化させるのに用いられ
る。本発明はまた他の具体例として，タウマチンおよび
その前駆体のプロタウマチン，プレタウマチン，および
プレプロタウマチンをコードするＤＮＡ配列の導入およ
び発現により例証される。成熟タウマチンは熱に弱く，
甘味のあるタンパクであり，カテンフェ（タウマトコッ
カス・ダニエリ）という，カロリー含量を大きく増加さ
せることなしに生野菜の香味を増すのに用いられるもの
に通常存在する。本発明はまた，バチルス・チューリン
ゲンシス van. クルスタキー ＨＤ−73由来の結晶性タ
ンパクの構造遺伝子の植物細胞への導入および発現によ
り例証される。殺虫性タンパクの構造遺伝子の導入およ
び発現は，昆虫の幼虫がはびこることから作物を守るの
に利用でき，その昆虫としては，限定されるわけではな
いが，ホーンウオーム（マンドカ種），ピンク ボール
ウオーム（ペクチノフォラ・ゴシピエラ），ヨーロッパ
コーンボーラー（オストリナ・ヌビラリス），タバコ
バッドウオーム（ヘリオティス・ビレセンス），および
キャベッジルーパー（トリコプラズマ・ニイ）が含まれ
る。発芽中のバチルス・チューリンゲンシスから調製さ
れた殺虫性タンパクを適用しても，ピンク ボールウオ
ームのような畑にいる昆虫を抑えることはできない。そ
れはそのような昆虫の特徴的な生活環および食物摂取習
性のためである。組織中に殺虫性タンパクを有する植物
は，この頑強に抵抗するタイプの昆虫を抑えることがで
き，よって前に述べたバチルス・チューリンゲンシスの
殺虫への使用に対して有利さをもたらす。殺虫タンパク
の植物細胞への組み込みにより，本発明はまた，不均一
な適用，および畑にまく殺虫性調合剤の購入および使用
のための費用，を削除するということにより，前に述べ
た使用に対して有利さをもたらす。また，本発明はその
ような調合剤の適用の時期を注意深く合わせる必要を削
除する。それは，小さな幼虫は殺虫性タンパクに最も敏
感であり，そのタンパクは常に存在するので，他の方法
で起こる適用前の幼虫の摂取からくる作物の損害を最小
とする。多様な植物種へ導入された他の構造遺伝子の特
性を開発する本発明の他の使用法は，当業者にはすぐに
明らかとなるであろう。

【００４８】添付の図面について簡単に説明する。

【００４９】図１〜図１９に連続して示す塩基配列は，
オクトピンTiプラスミド pTi15955のＴ−ＤＮＡ領域の
完全なヌクレオチド配列を明らかにしている。ＤＮＡの
１本鎖のみが示され，図２０で決定されているように，
５’側の左端から３’の右端へと方向づけられそれらは
それぞれ配列の最初および最後を表す。

【００５０】図２０は配列決定された pTi15955の部位
の物理的部位である。５つの酵素に関 する制限地図が
示され，影をつけた部分は配列決定のためにサブクロー
ン化された断片を指している。既知の遺伝学的位置は囲
いの中に示されている。位置Ａ，Ｂ，ＣおよびＤに示さ
れる24塩基の境界付近の繰り返し配列は，Ｔ−ＤＮＡを
ＴＬ−ＤＮＡ，ＴＣ−ＤＮＡ，ＴＲ−ＤＮＡに分割す
る。Ｔ−ＤＮＡ領域中のリーディング・フレームは１か
ら26までの番号が付けられ，矢印は転写の長さおよび方
向を示す。暗色の矢印は真核生物のプロモーター配列を
もったリーディング・フレームを示す。リーディング・
フレームａおよびｂはＴ−ＤＮＡ領域の外側の側に接す
るTiプラスミドＤＮＡ中に現れる。

【００５１】図２１はＴ−ＤＮＡ中にある可能なステム
−ループ構造の位置を示すヒストグラムを含む。矢印は
転写を表す。24塩基の境界付近の繰り返し配列は位置
Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにあり，既知の遺伝学的位置が囲い
の中に示される。

【００５２】図２２は，一定の比では描かれてはいない
が，例の中で用いられたＤＮＡ操作方法の概要の図解で
ある。制限酵素の作用に対して影響を受け易い部位は，
酵素の名前もしくは表に示された場所によって示され
る。ある酵素にもはや影響を受けなくなった部位は，酵
素の名前に括弧をつけることにより示される。ＯＲＦの
長さおよび極性は図２０および図２１と同様に矢印で示
される。プラスミドの名前は，これもまたたびたび表の
中に掲げた場所によって指示されるが，プラスミドを表
す円の中に書かれている。“Ｅｘ”は特定の操作を記述
する実施例を表す。

【００５３】

【発明の構成】本発明の植物細胞を遺伝的に修飾する方
法は，プロモーター，外来構造遺伝子およびポリアデニ
ル化部位を含むように細胞の形質転換により植物細胞を
遺伝的に修飾する方法であって，(a)このプロモータ
ー，この構造遺伝子およびこのポリアデニル化部位は互
いに，この構造遺伝子がこのプロモーターとこのポリア
デニル化部位との支配下で形質転換可能な植物細胞内で
発現しうるような位置と方向にあり，(b)このプロモー
ターおよびこのポリアデニル化部位のうちの少なくとも
一方がＯＲＦ１，４，５，９，10, 18, 19, 21, 24, 25
および26から成る群から選択されたオクトピン型Ｔ−Ｄ
ＮＡ遺伝子またはそれと相同性のある遺伝子であるＴＩ
Ｐ遺伝子から得られる。

【００５４】この方法の好適な実施態様においては，上
記ＴＩＰ遺伝子はオクトピン型Tiプラスミドである。

【００５５】この方法の好適な実施態様においては,上
記TiプラスミドはpTi15955である。この方法の好適な実
施態様においては，上記プロモーター，上記構造遺伝
子，または上記ポリアデニル化部位は１つまたはそれ以
上のヌクレオチド対の挿入，欠失または置換を含む。

【００５６】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は極端な高温または低温に対し改良された
耐性の表現型を示す。

【００５７】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は乾燥または浸透圧の抑圧に対して改良さ
れた耐性の表現型を示す。

【００５８】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は昆虫，節足動物，線形動物，または，着
生植物に対して改良された耐性あるいは抵抗性の表現型
を示す。

【００５９】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子はバチルス・チューリンゲンシスの結晶タ
ンパクと同じ，あるいはそれに由来する殺虫毒素をコー
ドし，そしてこのオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ遺伝子はＯＲ
Ｆ１，９，18, 19, 21, 25,および26から成る群から選
択される。

【００６０】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子はかび，細菌，またはウイルス病に対して
改良された耐性または抵抗性の表現型を示す特許請求の
範囲第１項に記載の方法。

【００６１】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は新規２次代謝物の生産の酵素をコードす
るか，または関与する。

【００６２】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は改良された栄養，芳香，またはプロセッ
シングの特性を示す。

【００６３】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は貯蔵タンパクをコードする。

【００６４】この方法の好適な実施態様においては，上
記貯蔵タンパク遺伝子はファセオリン遺伝子とハイブリ
ダイズし得る。

【００６５】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は甘味タンパクをコードする。

【００６６】この方法の好適な実施態様においては，上
記甘味タンパクはタウマチンまたはタウマチンの前駆体
である。

【００６７】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子はレクチンをコードする。

【００６８】この方法の好適な実施態様においては，上
記レクチンはマメレクチンである。この方法の好適な実
施態様においては，上記構造遺伝子は変化した形態上の
性質または発達様式の表現型を示す。

【００６９】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は雄性不稔の表現型を示す。

【００７０】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は改良された光合成効率の表現型を示す。

【００７１】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は改良された窒素固定の表現型を示す。

【００７２】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は改良された栄養素取込みの表現型を示
す。

【００７３】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は除草剤に対して改良された抵抗性または
耐性，他の植物との改良された競合，あるいは増大した
作物収率の表現型を示す。

【００７４】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は改良された生殖質同一性の表現型を示
す。

【００７５】この方法の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は選択剤に対して細胞内でまたは組織培養
で耐性の表現型を示す。

【００７６】本発明の形質転換可能な植物細胞は，プロ
モーターおよびポリアデニル化部位によりフランクされ
た非Ｔ−ＤＮＡの外来構造遺伝子を含む形質転換可能な
植物細胞であって，(a)このプロモーター，この構造遺
伝子およびこのポリアデニル化部位は互いに，この構造
遺伝子がこのプロモーターとこのポリアデニル化部位と
の支配下でこの植物細胞内で発現しうるような位置と方
向にあり，(b)このプロモーターおよびこのポリアデニ
ル化部位のうちの少なくとも一方がＯＲＦ１，４，５，
９，10, 18, 19, 21, 24, 25および26から成る群から選
択されたオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ遺伝子またはそれと相
同性のある遺伝子であるＴＩＰ遺伝子から得られる。

【００７７】この植物細胞の好適な実施態様において
は，上記ＴＩＰ遺伝子はオクトピン型Tiプラスミドであ
る。

【００７８】この植物細胞の好適な実施態様において
は，上記植物細胞は双子葉類の植物細胞である。

【００７９】本発明の形質転換可能な植物細胞を有する
植物組織は，プロモーターおよびポリアデニル化部位に
よりフランクされたＴ−ＤＮＡの外来構造遺伝子を含む
形質転換可能な植物細胞を有する植物組織であって，
(a)このプロモーター，この構造遺伝子およびこのポリ
アデニル化部位は互いに，この構造遺伝子がこのプロモ
ーターとこのポリアデニル化部位との支配下で該植物細
胞内で発現しうるような位置と方向にあり，(b)このプ
ロモーターおよびこのポリアデニル化部位のうちの少な
くとも一方がＯＲＦ１，４，５，９，10, 18, 19, 21,
24, 25および26から成る群から選択されたオクトピン型
Ｔ−ＤＮＡ遺伝子またはそれと相同性のある遺伝子であ
るＴＩＰ遺伝子から得られる。

【００８０】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記ＴＩＰ遺伝子はオクトピン型Tiプラスミド由来
である。

【００８１】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記Tiプラスミドは pTi15955 由来である。

【００８２】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記プロモーター，この構造遺伝子またはこのポリ
アデニル化部位は１つのまたはそれ以上の塩素対の挿
入，欠失，または置換を含む。

【００８３】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は極端な高温または低温に対して改
良された耐性の表現型を示す。

【００８４】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は乾燥または浸透圧抑圧に対して改
良された耐性の表現型を示す。

【００８５】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は昆虫，節足動物，線形動物，また
は着生植物に対し改良された抵抗性または耐性の表現型
を示す。

【００８６】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子はバチルス・チューリンゲンシスの
結晶タンパクと同一，またはそれに由来する殺虫毒素を
コードし，このオクトピン型Ｔ−ＤＮＡはＯＲＦ１，
９，18, 19, 21, 25および26からなる一群から選択され
た。

【００８７】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子はかび，細菌，またはウイルス病に
対し改良された抵抗性または耐性の表現型を示す。

【００８８】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は新規２次代謝物の生産の酵素をコ
ードするか，またはそれに関与する。

【００８９】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は改良された栄養，芳香，またはプ
ロセッシング特性の表現型を示す。

【００９０】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は貯蔵タンパクをコードする。

【００９１】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記貯蔵タンパク遺伝子はファセオリン遺伝子とハ
イブリダイズし得る。

【００９２】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は甘味タンパクをコードする。

【００９３】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記甘味タンパクはタウマチン，またはタウマチン
の前駆体である。

【００９４】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子はレクチンをコードする。

【００９５】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は変化した形態上の性質または発達
様式の表現型を示す。

【００９６】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は雄性不稔の表現型を示す。

【００９７】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は改良された光合成効率の表現型を
示す。

【００９８】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は改良された窒素固定の表現型を示
す。

【００９９】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は改良された栄養源取込みの表現型
を示す。

【０１００】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は除草剤に対して改良された抵抗性
または耐性，他の植物との改良された競合，または増大
した作物収率の表現型を示す。

【０１０１】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は改良された生殖質同一性の表現型
を示す。

【０１０２】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記構造遺伝子は選択剤に対して細胞内でまたは組
織培養で抵抗性の表現型を示す。

【０１０３】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記植物は裸子植物である。

【０１０４】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記植物は単子葉類である。

【０１０５】この植物組織の好適な実施態様において
は，上記植物は双子葉類である。

【０１０６】本発明の遺伝的に修飾された再生可能な植
物は，プロモーターおよびポリアデニル化部位によりフ
ランクされた非Ｔ−ＤＮＡの外来構造遺伝子を含む形質
転換可能な植物細胞を有する再生可能な植物であって，
(a)このプロモーター，この構造遺伝子およびこのポリ
アデニル化部位は互いに，この構造遺伝子がこのプロモ
ーターとこのポリアデニル化部位との支配下で該植物細
胞内で発現しうるような位置と方向にあり，(b)このプ
ロモーターおよびこのポリアデニル化部位のうちの少な
くとも一方がＯＲＦ１，４，５，９，10, 18, 19, 21,
24, 25および26から成る群から選択されたオクトピン型
Ｔ−ＤＮＡ遺伝子またはそれと相同性のある遺伝子であ
るＴＩＰ遺伝子から得られ，天然に存在し，および／ま
たはあまり修飾されていない植物とこの遺伝的に修飾さ
れた植物とを区別して同定可能な表現型を伝える遺伝子
を含み，そして発現する。

【０１０７】この植物の好適な実施態様においては，上
記Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は pTi15955 由来である。

【０１０８】この植物の好適な実施態様においては，上
記プロモーター，この構造遺伝子またはこのポリアデニ
ル化部位は１つまたはそれ以上の塩基対の挿入，欠失，
または置換を含む。

【０１０９】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は極端な高温または低温に対して改良され
た耐性の表現型を示す。

【０１１０】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は乾燥，または浸透圧抑圧に対して改良さ
れた耐性を示す。

【０１１１】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は昆虫，節足動物，線形動物，または着生
植物に対して改良された抵抗性または耐性の表現型を示
す。この植物の好適な実施態様においては，上記構造遺
伝子は結晶タンパクのすべてまたは一部をコードし，こ
のオクトピン型Ｔ−ＤＮＡはＯＲＦ１，９，18, 19, 2
1, 25および26からなる一群から選択される。

【０１１２】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子はかび，細菌またはウイルス病に対して改
良された抵抗性または耐性の表現型を示す。

【０１１３】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は新規２次代謝物の生産の酵素をコードす
る，またはそれに関与する。

【０１１４】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は改良された栄養，芳香，またはプロセッ
シングの特性の表現型を示す。

【０１１５】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は種子貯蔵タンパク，植物レクチン，タウ
マチン，およびタウマチンの前駆体よりなる一群から選
択されたタンパクのすべてまたは一部をコードする。

【０１１６】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は変化した形態上の性質，変化した発達様
式，雄性不稔，改良された光合成効率，改良された窒素
固定，または改良された栄養源取込みの表現型を示す。

【０１１７】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は除草剤に対して改良された抵抗性または
耐性，他の植物との改良された競合，増大した作物収
率，または改良された生殖質同一性の表現型を示す。

【０１１８】この植物の好適な実施態様においては，上
記構造遺伝子は選択剤に対して細胞内で，または組織培
養で抵抗性の表現型を示す。

【０１１９】この植物の好適な実施態様においては，上
記植物は裸子植物である。

【０１２０】この植物の好適な実施態様においては，上
記植物は単子葉類である。

【０１２１】この植物の好適な実施態様においては，上
記植物は双子葉類である。

【０１２２】以下に述べる定義は，特許明細書および特
許請求の範囲における，それらの用法の意図もしくは範
囲に対する不明瞭さを除くためのものである。

【０１２３】Ｔ×ＣＳ：転写制御配列は，特定の構造遺
伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の
両側にあるプロモーター／ポリアデニル化部位を表す。
特定の外来構造遺伝子の両側にあるプロモーターおよび
ポリアデニル化のＤＮＡ配列は，同一源遺伝子由来であ
ること（例えば対をなす２つの異なった oＴ−ＤＮＡ
（オクトピン型ＤＮＡ）の転写産物）または同一の分類
学的起源（例えば oＴ−ＤＮＡ由来の配列を，他の型の
ＤＮＡ，植物，動物，カビ，酵母，および真核性ウイル
スなどの非− oＴ−ＤＮＡ源由来の配列とを組み合わせ
ること）であることを必要としない。それゆえにＴ×Ｃ
Ｓという用語は，特許請求するプロモーターと請求しな
いポリアデニル化部位との組合せ，特許請求しないプロ
モーターと請求するポリアデニル化部位との組合せ，も
しくは両方とも特許請求するプロモーターとポリアデニ
ル化部位との組合せ，のいずれかを表す。Ｔ−ＤＮＡの
ポリアデニル化部位との結合に用いることができる非−
Ｔ−ＤＮＡの植物内発現可能プロモーターの例として
は，限定されるわけではないが，ファセオリン，リブロ
ース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小
サブユニット，およびカリフラワーモザイクウイルス
（ＣＭＵ）の19Ｓと35Ｓの転写産物，の遺伝子由来のプ
ロモーターを含む。

【０１２４】プロモーター：翻訳もしくは転写の開始時
に必要な構造遺伝子の５’末端における配列を表す。Ｔ
−ＤＮＡプロモーター支配下の発現は，正常にプロモー
ターにより制御されている構造遺伝子の一部もしくは全
部が取り除かれ，挿入外来構造遺伝子により置き替えら
れる，開始コドンはＴ−ＤＮＡ構造遺伝子の残りとして
かまたは挿入構造遺伝子の一部としてもたらされる，ま
たはＴ−ＤＮＡ構造遺伝子中に正しいオープンリーディ
ングフレームで構造遺伝子の一部または全部の挿入によ
る融合タンパクの発現による直接発現の形をとるであろ
う。後者の場合，発現産物は融合タンパクと呼ばれる。
プロモーターはそれ自身，自然発生かまたは合成による
複数起源由来の切片の合成物であろう。真核生物のプロ
モーターは，ｍＲＮＡの５’末端（キャップ部位）の位
置から５’側の約10〜30bpの所にある典型的な 5'・・・TA
TAA・・・3' の形に相同なＤＮＡ配列の存在によって通常
認識される。TATAA 配列の５’側の約30bpの所には，も
う１つのプロモーター配列がよく存在し，それは，典型
的な 5'・・・CCAAT・・・3' の形に相同なＤＮＡ配列の存在
により認識される。翻訳の開始は，通常，キャップ部位
の３’側にある最初の5'・・・AUG・・・3' から始まる。

【０１２５】ポリアデニル化部位：転写終止を促進する
能力のあるあらゆる核酸配列を表す。さらに，転写終止
後にポリアデニン酸の“尾”が大部分のｍＲＮＡ前駆体
の３’末端に付けられる。ポリアデニル化部位のＤＮＡ
小片はそれ自身，自発発生かもしくは合成による複数起
源由来の小片の合成物であるか，ゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡ由来ｍＲＮＡに由来するのであろう。ポリアデニ
ル化部位は通常，典型的な形である 5'・・・AATAAA・・・3'
に相同なものの存在により認識されるが，いろいろな距
離，部分的”読み過ごし”，および典型的な多くの連続
した配列は珍しくない。典型的な”ポリアデニル化部
位”は実際はポリアデニル化そのものではなくて転写の
終止を引き起こすのであろう。ということは認識されな
くてはならない（C.Montell et al．（1983) Nature 3
05 :600-605)。

【０１２６】外来構造遺伝子：ここで用いられているよ
うに，外来ＲＮＡ，タンパク，ポリペプチドまたはその
一部をコードするＤＮＡ小片すなわち，多分翻訳開始コ
ドンを含むが一般にプロモーター領域およびポリアデニ
ル化部位と呼ばれる，転写の開始または終止および翻訳
の開始を調節するＴ×ＣＳの他の機能的要素を少なくと
も１つは欠失する，を有する遺伝子の部分を含む。（本
発明においては，このような機能的要素は，外来構造遺
伝子のＴ−ＤＮＡへの移入後も存在するかも知れない
が，ある特定の具体例においては，そのような要素が機
能的であるとは限らない，ということに注意）。外来構
造遺伝子は，その遺伝子が導入された植物細胞中には通
常存在しないタンパク質であるかも知れない。さらに，
この用語は細胞内に普通に存在するが，人為的に導入し
た構造遺伝子の複製物も表す。外来構造遺伝子はその一
部または全部がエピゾームＤＮＡ，プラスミドＤＮＡ，
プラスチドＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ウイルス
ＤＮＡ，ウイルスｃＤＮＡ，または化学合成ＤＮＡなど
から由来するであろう。さらにまた，外来構造遺伝子は
コードされた小片中もしくは非翻訳領域中に，１つもし
くはそれ以上の修飾を含むであろうと考えられる。そし
てその非翻訳領域は発現産物の生物学的活性もしくは化
学的構造，発現の割合もしくは発現制御の方法，に影響
を与えうる。そのような修飾には，限定されるわけでは
ないが，突然変異，挿入，欠失，１つまたはそれ以上の
ヌクレオチドの置換，および“静かな”修飾，すなわち
発現産物の化学構造は変化させないが，細胞内局在化，
輸送，分泌もしくは発現産物の安定性などに影響を与え
る修飾，などが含まれる。構造遺伝子は分断されないコ
ード配列を構成するかも知れない，もしくは，それは１
つもしくはそれ以上のイントロンを含む，それらは合成
もしくは自然発生により得られる適当に植物で機能する
接合部位に結合している。構造遺伝子は，自然発生もし
くは合成の複数の起源由来の小片の合成物であろう。そ
してそれは合成タンパク，すなわち遺伝子導入・発現さ
れた細胞に対して外来であり，一部が外来タンパク由来
であるようなタンパク，をコードしているだろう，外来
構造遺伝子は融合タンパクであろう。そして特に，Ｔ×
ＣＳがそうであったように，同一のＯＲＦ由来の構造遺
伝子の一部または全部に融合しているのであろう。

【０１２７】植物組織：分化および未分化植物組織を含
み，根，シュート，花粉，種子，腫瘍組織などに限定さ
れず，例えばクラウンゴールや，胚，カルスなどの培養
植物細胞の集合体のさまざまな形態，などを含む。植物
組織は栽培植物，または器官，組織または細胞培養に存
在する。

【０１２８】植物細胞：ここで用いられているように，
栽培植物の植物細胞および培養植物細胞，培養プロトプ
ラストを含む。 oＴ−ＤＮＡ由来のＴ×ＣＳの制御下に
おいて外来構造遺伝子を発現する遺伝学的に修飾された
植物の生産は，ここで明らかにされる特別の知識と，既
知の当該分野の多様な技術および手段とを組み合わせ
る。多くの場合，他の採りうる手段が全体の過程の各々
の段階において存在する。手段の選択は例えば， oＴ−
ＤＮＡ Ｔ×ＣＳ／構造遺伝子の結合体の導入および安
定な保持，修飾される植物種および望まれる再生方法，
および使用される特定外来構造遺伝子，などの可変項目
に依存し，それらのすべてに当業者が望まれる結果を得
るために選択，使用が可能である，他に採りうる過程段
階がある。例えば，oＴ−ＤＮＡ Ｔ×ＣＳ取得の第一歩
は，ここにおいては pTi15955 から oＴ−ＤＮＡを分離
することであるが，Ｔ×ＣＳの分離・操作手順に対して
適当な変更がなされる限り，他の，オクトピン型相同Ti
プラスミドのＤＮＡ配列で代用できる。それに加えて，
ここで明らかにするＴ×ＣＳを有する oＴ−ＤＮＡ遺伝
子に相同である他の型のＴ−ＤＮＡ由来のＴ−ＤＮＡ遺
伝子もまた，手順を適当に変更することにより代用とし
て用いてもよい。当業者は，よく知られている適当な厳
重さの条件の下での核酸のクロスハイブリダイズする能
力を用いることにより，相同な遺伝子を同定できるだろ
う。ここの適用の中で利用されるかまたは明らかにされ
る遺伝子配列には小さな配列の変化が存在しうる：とい
うことが理解されるであろう。当業者がそのような相同
遺伝子のＴ−ＤＮＡプロモーターおよびポリアデニル化
部位を操作し，利用することができるようにする：標準
的な技術を用いることにより，これらの変化を確認する
ことができる。（外来構造遺伝子に相同なものは，本発
明における pTi15955 に相同なものの時に用いたのと同
じ方法により同定，分離，配列決定，および操作される
であろう。）植物細胞に外来遺伝子を挿入する新しい方
法が開発されても，当業者は望まれる結果を得るのに，
それらの選択可能な過程段階の中から選択することがで
きるだろう。本発明の基本的な見地は外来構造遺伝子の
性質および構造，そして植物ゲノム内への遺伝子の挿入
および発現の方法，である。遺伝学的に修飾された植物
の取得における具体例のうちで残っている段階は， oＴ
−ＤＮＡ Ｔ×ＣＳ／構造遺伝子の結合体のＴ−ＤＮＡ
への挿入，修飾されたＴ−ＤＮＡを植物細胞へ移入し，
そこで修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノムの一部として安
定して組み込まれること，インビトロ培養のための技
術，および植物全体の実質的な再生，などが含まれる。
そしてそれらには，形質転換された植物細胞の選択およ
び検出の段階，および最初に形質転換された株から得ら
れた導入遺伝子を商業的に満足できる栽培変種への移入
の段階，などが含まれる。

【０１２９】より具体的な本発明の主要な特徴は， oＴ
−ＤＮＡ Ｔ×ＣＳの制御下において，すなわち前に定
義したように２つのうちの少なくとも１つが oＴ−ＤＮ
Ａ由来であるようなプロモーターおよびポリアデニル化
部位の間に，挿入外来構造遺伝子を保持するＴ−ＤＮＡ
の構築である。構造遺伝子は得られた oＴ−ＤＮＡプロ
モーターに関して正しい位置および方向で挿入されなけ
ればならない位置には２つの見地がある。まず最初は構
造遺伝子がプロモーターのどちら側に挿入されたかに関
連している。大多数のプロモーターがＤＮＡの一方向の
みにしか転写・翻訳の開始を制御しない，ということが
知られている。プロモーターの制御下にあるＤＮＡ領域
はプロモーターの“下流に”ある，またはその替わりに
“うしろに”または“の３’側に”あるなどと呼ばれ
る。それゆえ，プロモーターに制御されるためには外来
構造遺伝子の正しい挿入位置は，プロモーターの“下流
に”なくてはならない。（少数の非−Ｔ−ＤＮＡプロモ
ーターが２方向の制御を示すことが知られており，その
場合は，プロモーターの両側とも“下流”であると考え
られることができる。）位置に関する第２の見地は，プ
ロモーターの既知の機能要素間の塩基対距離，例えば構
造遺伝子の転写開始部位と翻訳開始部位間の距離，であ
る。この距離に関しては各プロモーター間には実質的な
変種が存在する。それゆえに，これに関しての構造的な
必要事項は機能に関する用語により最もよく記述され
る。第１の近似では，プロモーターと挿入外来構造遺伝
子との距離が，プロモーターと通常はそれが制御するＴ
−ＤＮＡ遺伝子との距離に近い場合には，まともな作動
が達成される。方向は構造遺伝子の方向性を表す。外来
タンパクのアミノ酸末端を最終的にコードする構造遺伝
子の部分は構造遺伝子の５’末端と呼ばれ，タンパクの
カルボキシル末端付近のアミノ酸をコードする末端は構
造遺伝子の３’末端と呼ばれる。外来構造遺伝子の正し
い方向はプロモーターの近くに５’末端があるものであ
る。融合タンパクの発現をもたらす構築にさらに必要な
ものは，外来構造遺伝子の oＴ−ＤＮＡプロモーター付
与の構造遺伝子配列中への挿入は，２つの遺伝子のコー
ド配列が同じリーディングフレームになければならない
という，当該分野でよく知られた構造上の必要条件を満
たさなければならない。この必要条件の例外としては，
イントロンが外来構造遺伝子由来のコード配列と oＴ−
ＤＮＡの構造遺伝子のコード配列とを分割している場合
がある。その場合，両方の構造遺伝子は一致する接合部
位を持っていなければならず，そしてイントロンが転写
後のプロセッシングにより除かれた後においても oＴ−
ＤＮＡプロモーター付与の構造遺伝子および外来構造遺
伝子の正しいリーディングフレームが保たれているよう
に，イントロン接合部位が位置する必要がある。ある外
来構造遺伝子が異なった oＴ−ＤＮＡのＴ×ＣＳの制御
下におかれた場合には，発現または発生の制御の割合に
違いが見られるであろう。発現の割合はまた，その結果
生じるｍＲＮＡの２次構造，特にステム−ループ構造の
細かい点によっても大きく影響されるであろう。それら
に限定されるわけではないが，発現されたタンパク自身
の安定性，細胞内または細胞外の局在化または分泌，溶
解性，標的特異性，および他の機能的特徴などを含む異
なった特徴は，融合タンパクが挿入部位に依存する場
合，融合タンパク中に含まれた oＴ−ＤＮＡタンパクの
長さおよび性質に依存する場合，および折りたたみ構造
に影響する融合タンパク構成成分間の相互作用に依存す
る場合に見られる。そしてそれらのすべての場合が，植
物細胞，植物組織，および植物全体中における形態的に
望まれる特徴によって，外来タンパク生成物の機能的特
徴の操作および制御できる数多くの機会を提供する。プ
ロモーターと同様にポリアデニル化部位はコードされた
配列の３’末端に関して正しい位置および方向で位置さ
れなければならない。外来構造遺伝子タンパクの３’末
端と，ポリアデニル化部位の起源であるＤＮＡによりコ
ードされているポリペプチドとの間においてもまた，融
合タンパクが可能である。

【０１３０】Ｔ×ＣＳは２つの主要な機能性より成る：
構造遺伝子の各々５’および３’側に位置するプロモー
ターおよびポリアデニル化部位。より具体的に言えば，
これらＴ×ＣＳの２つの部位は同じ遺伝子から得られる
が，これは本発明の必要条件ではない。５’または３’
の配列は別種の oＴ−ＤＮＡ遺伝子より得られる，また
はこれらの配列のうちの１つは非− oＴ−ＤＮＡ遺伝子
からでも得られる。例えば，プロモーターは oＴ−ＤＮ
Ａ遺伝子より得られる一方，ポリアデニル化部位は植物
遺伝子もしくはｃＤＮＡに由来することがある。 望ま
れる具体例においては，外来構造遺伝子は oＴ−ＤＮＡ
Ｔ×ＣＳ中に入っており，構造遺伝子はNde I部位で
Ｔ×ＣＳ中に結合しており，Ｔ×ＣＳ／構造遺伝子の結
合体のすべてがBam HI部位の対の中に位置する。当業者
には明らかとなるであろうが，Ｔ×ＣＳ／遺伝子の結合
体は，プラスミドから切出しやすいような，および植物
の形質転換のための挿入または選択したシャトルベクタ
ーの挿入がしやすいような制限部位中に置かれる。ＡＴ
Ｇの翻訳開始部位における，Nde I部位（5'・・・CATATG・・
・3'）の対の使用に替わるものとしては，限定されるわ
けではないが，Cla I（5'・・・（非 G）ATCGAT(G)・・・3'）
もしくはNco I（5'・・・CCATGG・・・3'）部位の使用があ
る。当業者には理解されるであろうが，結合部位の配列
が翻訳および転写の機能に一致したままである限り，他
の部位もプロモーター／構造遺伝子の接合に用いること
ができる。ＡＴＧの翻訳開始部位における外来構造遺伝
子とプロモーターとの結合に替わるものとしては，転写
開始部位すなわちキャップ部位における結合がある。こ
の場所を使用する利点は，外来構造遺伝子のｍＲＮＡの
２次（ステム−ループ）構造が損なわれないために，ｍ
ＲＮＡが遺伝子源の生体内で見られた活性により近い翻
訳の活性をもつようになることである。構造遺伝子の
５’および３’末端における制限部位は一致する必要は
ない。２つのＴ×ＣＳ／構造遺伝子の接合部位に２種の
制限酵素を用いて切断した部位を用いると，Ｔ×ＣＳへ
の挿入時に自動的に正しい方向に構造遺伝子が挿入され
るが，余分な制限酵素を使用すればＴ×ＣＳと構造遺伝
子の中にできる不便な制限部位を取り除く必要が出てく
る。特定の構造遺伝子／ポリアデニル化部位の結合をつ
くるのにただ１つだけの制限酵素を使うということは要
求されない。 oＴ−ＤＮＡ構造遺伝子中で外来構造遺伝
子の翻訳終止部位の３’側にある便利な部位を用いるこ
とができる。これらの部位が一致しない末端を保持する
場合は，当該分野の方法により平滑末端に変換されて，
それらが結合される。

【０１３１】Ｔ×ＣＳ／外来構造遺伝子の結合体挿入部
位のＴ−ＤＮＡ内での位置は，Ｔ−ＤＮＡの境界のすぐ
隣の配列の伝達機能が損なわれない限り，そう厳密では
ない；なぜなら，先の研究からこれらの領域は，修飾さ
れたＴ−ＤＮＡの植物ゲノムへの挿入に必要であること
が分かったからである。望まれる挿入部位は最も活発に
転写される区域にあり，特にＯＲＦ10（tml遺伝子とＯ
ＲＦ24（“1.6 領域”）を含む領域）である。Ｔ×ＣＳ
／構造遺伝子結合体が挿入されているＴ−ＤＮＡは，Ｔ
ＩＰプラスミドのどれからでも得られる。Ｔ×ＣＳ／構
造遺伝子結合体は当業者がよく知っている標準的な技術
により挿入される。内生Ｔ−ＤＮＡもしくはベクター遺
伝子の転写および翻訳の方向に関して挿入植物遺伝子の
方向はそう厳密ではなく，２つの可能な方向のどちらで
も機能する。ある遺伝子を異なったＴ−ＤＮＡ中の場所
に挿入すると，発現の割合に違いが見られる。それは多
分，ＤＮＡのメチル化または染色体構造のような因子の
ためであろう。融合タンパク遺伝子の形でその結合体を
アグロバクテリウム・チューメファシエンスのオクトピ
ン型プラスミドである pTi15955のocs（ＯＲＦ11）に挿
入した場合，ファセオリン構造遺伝子のＯＲＦ11（ocs
）プロモーターからの簡単に検出できるほどのレベル
の発現が得られている。

【０１３２】Ｔ×ＣＳ／外来構造遺伝子の結合体をＴ−
ＤＮＡに挿入する便利な方法の一つは，シャトルベクタ
ーの使用であり，背景で述べたように，それはエセリシ
ア・コリー内で複製可能なプラスミドに組み込まれたＴ
−ＤＮＡの小片（それら小片の間に挿入されるのが望ま
れる）を保持している。Ｔ−ＤＮＡ小片は，好ましいこ
とにシャトルベクター内に唯一の制限部位を含む。Ｔ×
ＣＳ／構造遺伝子の結合体をＴ−ＤＮＡ配列内の唯一の
部位に挿入することができ，シャトルベクターは都合の
いいことにそのＴ−ＤＮＡがシャトルベクターＴ−ＤＮ
Ａ小片と相同である，アグロバクテリウム株の適当なも
のの細胞に移入される。形質転換したアグロバクテリウ
ム株は都合よく二重相同部位組み換えの選択を許す条件
下で生育し，その二重相同部位組み換えにより，前から
存在しているTiプラスミド小片とシャトルベクターのＴ
−ＤＮＡ小片とが組換わる結果となる。しかし，本発明
が二重相同部位組換え機構によるＴ×ＣＳ／構造遺伝子
結合体のＴ−ＤＮＡへの導入に限定されているわけでは
ない，ということを留意しなければならない；シャトル
ベクター（たぶんただ１つのＴ−ＤＮＡ相同の連続領域
を保持する）との１ケ所での相同部位組換え，もしくは
プロモーター／遺伝子を運ぶバクテリアのトランスポソ
ンの挿入も，結合体のＴ−ＤＮＡへの挿入の効率のよい
方法となるであろう。

【０１３３】上述の方法に続いて，修飾されたＴ−ＤＮ
Ａを当該分野のどの方法によっても植物細胞に移入する
ことができる。例えば，Ｔ−ＤＮＡ中に組み込まれた外
来構造遺伝子を含むアグロバクテリウムの新しい株で植
物を直接感染させる方法か，またはアグロバクテリウム
株を植物細胞との共存培養法により，この移入は最も都
合よく行われる。前者の技術，すなわち直接感染では，
しばらくすると感染部位に腫瘍の固まりまたはクラウン
ゴールが出現することとなる。クラウンゴールはその後
培養により生育させることができ，当業者には知られて
いる適当な環境の下で，挿入されたＴ−ＤＮＡ小片を保
持する全植物体へと再生させることができる。共存培養
法を用いて，ある割合の植物細胞が形質転換される，い
い換えればＴ−ＤＮＡが移入され植物細胞ゲノムに挿入
される。どちらの場合でも形質転換した細胞を非形質転
換細胞と区別するために選択もしくは選抜されなければ
ならない。選択可能マーカーをＴ×ＣＳ／外来構造遺伝
子に付け加えてＴ−ＤＮＡ中に組み込むことにより最も
容易に選択することができる。例としては，ノパリンシ
ンターゼのプロモーターの制御下で発現されるジヒドロ
フォレートリダクターゼまたはネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼなどがある。これらのマーカーはそれぞ
れメトトレキセートまたはカナマイシン，もしくはこれ
らのアナログを含む培地中での増殖により選択される。
それに加え，Ｔ−ＤＮＡは内生的マーカー，例えば，培
養におけるTi誘導腫瘍のホルモン非依存性増殖を制御す
る遺伝子，Ri誘導の根の腫瘍の異常な組織を制御する遺
伝子，アミノ酸アナログのような毒性化合物に対する抵
抗性を制御する遺伝子を保持している。そして，そのよ
うな抵抗性はオピンシンターゼ（例 ocs ）により与え
られる。当業者によく知られた選抜の方法としては，オ
ピン生産検定特質のあるＲＮＡまたはＴ−ＤＮＡ配列に
対する特異的ハイブリダイゼーション，ELISAs（" enzy
me linked immunosorbant assay " の頭文字）を含む特
殊タンパクの免疫学的検定，ラジオイミュノアッセイ，
および“ウエスタン”ブロットなどである。さらに，発
現された外来遺伝子の表現型を形質転換された組織の同
定に用いることができる（例えば，結晶性タンパクの殺
虫性の特性）。

【０１３４】シャトルベクターの方法に替わるものとし
ては，Ｔ×ＣＳ／外来構造遺伝子が挿入されているＴ−
ＤＮＡもしくは修飾されたＴ−ＤＮＡを有するプラスミ
ドの使用がある。そしてそのプラスミドはアグロバクテ
リウム株中で独立して複製する能力をもっている。背景
で述べた最近の証拠は，アグロバクテリウム株がＴ−Ｄ
ＮＡの植物細胞への移入を促進する機能をもつ，あるト
ランスに作用する遺伝子を保持する場合に，そのような
プラスミドのＴ−ＤＮＡがアグロバクテリウム株から植
物細胞へ移入されうることを指摘している。Ｔ−ＤＮＡ
を有し，アグロバクテリウム株中で独立に複製できるプ
ラスミドをここでは“サブＴＩＰ”プラスミドと名付け
る。Ｔ−ＤＮＡの含量においてサブＴＩＰプラスミドが
異なることによる，ある範囲の変化が可能である。範囲
の一方の端のものはＴＩＰプラスミドからのＴ−ＤＮＡ
をすべて保有しており，ときどき“ミニ−ＴＩＰ”プラ
スミドと呼ばれる。範囲のもう一方の端ではＴ−ＤＮＡ
の境界の周りのＤＮＡ以外のすべてが欠落し，残りの部
分は，サブ−ＴＩＰプラスミドが宿主細胞に移入され，
組み込まれるのに必要な最小部分である。そのようなプ
ラスミドは“ミクロ−ＴＩＰ”と呼ばれる。サブ−ＴＩ
Ｐプラスミドは小さくて直接扱い易く，相同部位組替え
によるシャトルベクターからＴ−ＤＮＡへの遺伝子の移
入の必要がない，という点で有利である。求める構造遺
伝子が挿入された後，それらはＴ−ＤＮＡの移入を促進
するトランスに作用する遺伝子を保持する植物細胞に簡
単に直接導入することができる。アグロバクテリウム株
への導入はアグロバクテリウム株の形質転換，または供
与バクテリア細胞からの性殖的移入，という当業者には
よく知られた技術により容易に行われる。新しいＤＮＡ
配列を植物ゲノムに導入する目的には，ＴＩＰプラスミ
ドおよびサブＴＩＰプラスミドは機能的に同等であると
考えられるべきである。

【０１３５】本発明の望ましい実施態様は，転換する植
物ゲノムへＴ×ＣＳ／外来構造遺伝子の結合体を組み込
むためのＴ−ＤＮＡを基本としたアグロバクテリウムの
仲介によるシステムを組み入れているが，遺伝子の移入
および組み込みのための他の方法もまた本発明の範囲内
に含まれる。結合体の植物ゲノムへの安定な組み込みの
ための他の方法としては，限定されるわけではないが，
ウイルスゲノム，ミニクロモソーム，トランスポソンを
基本にしたベクターの使用，植物染色体へのおよび相
同，非相同組み込みなどがさらに含まれる。これらのベ
クターを植物細胞に送入する型の替わりのものとして
は，限定されるわけではないが，さらに核酸の直接の取
得，ベクター含有のリポソームまたはバクテリアのスフ
ェロプラストとの融合，マイクロインジェクション，お
よびウイルス，コートタンパク中への封入それに続く感
染に似たプロセス，などが含まれる。アグロバクテリウ
ム細胞およびＴＩＰを基本としたシステムは，ＤＮＡの
バクテリアから植物細胞への移入により，双子葉類およ
び裸子植物を形質転換するのに用いることができる。他
に択りうるベクターを基本としたシステム，またはベク
ターの送入の方法は，単子葉類および双子葉類を含むす
べての裸子植物およびすべての被子植物の形質転換に用
いることができる。

【０１３６】形質転換した細胞および組織の再生は，既
知の技術に頼ることにより遂行される。再生の段階の目
的は普通に生育，増殖するが組み込まれたＴ−ＤＮＡを
保持する植物全体を得ることである。再生の技術は，Ｔ
−ＤＮＡの起源，なされた修飾の性質および形質転換さ
れた植物種などに依存する当該分野の原則により幾分か
異なる。Ri型のＴ−ＤＮＡにより形質転換された植物細
胞は，余分な実験をしないで，当該分野の技術を用いる
ことにより簡単に再生できる。Ti型Ｔ−ＤＮＡにより形
質転換された植物細胞は，ある場合においては培養中の
ホルモンレベルの適当な操作により再生することができ
る。しかし都合よくtmr およびtms の片方または両方に
Ｔ−ＤＮＡが突然変異を起こした場合に，Tiにより転換
された組織は最も容易に再生される。これらの遺伝子の
不活性化は転換組織のホルモンのバランスを正常にもど
し，培養中の組織のホルモンのレベルの安静および操作
性を大きく増大することにより，より正常なホルモンの
生理機能となるため容易に再生する植物となる。シャト
ルベクターとの二重相同部位組換えによりＴ−ＤＮＡ中
にtmrおよびtmsにおける突然変異が導入された場合に
は，突然変異の組み込みはＴ×ＣＳ／構造遺伝子結合体
の組み込みとは異なった方法で選択されなければならな
いということに注意することは重要である。例えば，前
者においてはtmr およびtms の不活性化はクロラムフェ
ニコール耐性により選択されるが，一方Ｔ×ＣＳ／外来
遺伝子の選択にはカナマイシン耐性が用いられる。tms
およびtmrの位置の不活性化は，これらの遺伝子のコー
ド領域もしくはプロモーター中の挿入，欠失，１つまた
はそれ以上のヌクレオチドの置換，などによってプロモ
ーターの不活性化もしくはタンパク構造をこわすことに
より行われる（ふさわしい突然変異の構築は T.C.Hall
らによって例証されている，US application ser. nos.
485,613 and 485,614 ）。ある例では，Ｔ−ＤＮＡを組
み込み，ノパリンシンターゼのようなＴ−ＤＮＡ遺伝子
を発現し，挿入された植物構造遺伝子もまた発現するシ
ュートを腫瘍細胞が再生することができる。シュートは
有根植物へつぎ木することにより生育した状態で保つこ
とができ，稔性のある花をつけることができる。ゆえに
シュートはＴ−ＤＮＡを運び挿入された外来構造遺伝子
を発現する通常の子孫植物の親植物としての働きをす
る。

【０１３７】形質転換された植物組織の遺伝子型はイン
ビトロ培養により生育，再生できるという容易さ，およ
び使用される選択薬剤への感受性によりしばしば選ばれ
る。農業的な興味のある栽培変種がこれらの操作に不適
当である場所には，もっと扱い易い変種がまず転換され
る。再生後に，新しく導入されたＴ×ＣＳ／外来構造遺
伝子結合体は，植物育種および植物遺伝学の当業者によ
く知られた技術によって，望みの農業的栽培変種へ容易
に移入される。転換された植物と農業的栽培変種との有
性交雑により第１代雑種が得られる。これらの雑種は次
の望みの遺伝学的背景をもつ植物と交雑することができ
る。組み込まれたＴ−ＤＮＡが継続して存在すること，
または挿入外来遺伝子の発現による新しい表現型，を調
べるために子孫は継続的に選択，選抜される。この方法
により，何回かの戻し交雑および選択の後に，挿入され
たＴ×ＣＳ／外来構造遺伝子を保持する農業的に望まれ
る親に，本質的に同一の遺伝子をもつ植物を生産するこ
とができる。

【０１３８】

【実施例】以下の実施例は，ＴＩＰやアグロバクテリウ
ムの分子生物学や操作の当業者にはよく知られて，使い
やすい多くの技術を利用する；このような方法は，ここ
で詳細に述べていなくても，引用した参考文献の１つか
それ以上に充分に述べられている。酵素は市販品を入手
し，販売者の推薦状あるいは当該分野に知られている他
の変法により使用した。試薬や緩衝液や培養条件もまた
当該分野に知られているものである。このような標準的
な技術を含む参考文献の著作は，以下のものを含む。ア
ール．ウ．イーディー．（1979）エムイーティーエイ
チ．イーエヌズィーワイエムオーエル．68，アール．
ウ，等，イーディーエス．（1983）エムイーティーエイ
チ．イーエヌズィーワイエムオーエル．100および101
，エル．グロスマンおよびケイ．モルディブ，イーデ
ィーエス．（1980）エムイーティーエイチ．イーエヌズ
ィーワイエムオーエル．65，ジェイ．エイチ．ミラー
（1972）エクスペアリメンツ イン モレキュラー ジ
ェネティクス，アール．デェイビス等（1980）アドバン
スド バクテリアル ジェネティクス，アール．エフ．
シュレイフおよびピー．シー．ウェンスインク（1982）
プラクティカル メソッズイン モレキュラー バイオ
ロジー，およびティー．マニエイティス等（1982）モレ
キュラー クローニング（R.Wu,ed.(1979) Meth.Enzymo
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lecular Genetics, R.Davis et al．（1980) Advance
d Bacterial Genetics, R.F. Schleifα P.C.Wensink
(1982) Practical Methods in Molecular Biology, お
よび T.Maniatis et al．（1982) Molecular Clonin
g）。さらにアール．エフ．ラッセ等（1983）ジーイー
エヌイーティー．イーエヌジーアイエヌ．4 : 1-56，
（R.F.Lathe et al．（1983) Genet.Engin. 4 : 1-5
6,）はＤＮＡ操作における有益な注釈を加えている。

【０１３９】単独である制限酵素の名前をそのまま用い
ることは，例えば“Bcl I”は，その酵素の作用を受け
る配列部位，例えば制限部位，にそれを適用できる図解
以外は，酵素分解時にその酵素を使用することに適用す
る。本文中で，制限部位は、“部位”という語を付加的
に使用し，例えば“Bcl I部位”で示している。“断
片”という語を付加的に使用すること，例えば“Bcl I
断片”により，その名の酵素の作用で生じた末端を有す
る線状二重鎖ＤＮＡ分子（例えば 制限断片）を示して
いる。“Bcl I／Sma I断片”のような語法は，２つの異
なる酵素，ここではBcl IやSma I，の作用で生じ，異な
る酵素の作用の結果生じた２つの末端である制限断片を
示している。末端は“粘着”（すなわち，相補的な一本
鎖オリゴヌクレオチドと塩基対を成し得る一本鎖の突出
部を持つ）あるいは“平滑”であるという特徴を持って
いること，そして，ある粘着末端の配列は，それを生じ
る酵素の特異性により決まるということに注意された
い。

【０１４０】表や以下に続く本文で，プライマーあるい
は他の配列の特定のヌクレオチドにある下線は，自然に
見られる配列とは異なり１つかそれ以上のヌクレオチド
の挿入かあるいは置換であるようなヌクレオチドを示し
ている。２つの隣接しているヌクレオチドに小文字を使
用するのはもとの配列から欠失してしまっている１つか
それ以上のヌクレオチドを括弧でくくるときである。他
に注釈をつけていなければ，すべてのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを５’末端でリン酸化し，５’から３’へ
と表記し，実施例５で述べているように合成し使用し
た。

【０１４１】プラスミドは，プラスミドだけは，“ｐ”
と前書きし，例えば pTi15955 あるいは p8.8 ，括弧で
示した株はその中にプラスミドを保有していることを示
し，例えばアグロバクテリウム・チューメファシエンス
（ pTi15955 ）あるいはエセリシア・コリー HB101 (p
8.8) とする。バクテリオファージＭ13に由来する自己
複製できるＤＮＡ分子は“ｍ”と前書きする，例えばｍ
ＷＢ2341，またそれらは一本鎖かあるいは二本鎖の形で
あろう。 pTi15955 は ATCC 15955 として寄託してあ
る。他の寄託された株は表１２のＴ9.3 に挙げている。

【０１４２】この実施例で述べているＤＮＡ構成はpTi1
5955の14の真核細胞のＴ×ＣＳｓのうちの１つのどれで
もが４つの外来の構造遺伝子のいずれかと結合できるよ
うに設計されている。その目的に対し，構造遺伝子，Ｔ
×ＣＳｓおよびＴ×ＣＳ／構造遺伝子結合物をＤＮＡ
“カセット”に置いた；ＤＮＡ“カセット”は初期修飾
を受けた後どの構造遺伝子も，さらに修飾することな
く，どのＴ×ＣＳに容易に挿入し，Ｔ×ＣＳ／構造遺伝
子結合物をすべてのそういう結合物に適用できる単純な
手順で分離できるような特徴を持っている。すべての結
合物はそれにより，選んだ植物の形質転換ベクターに挿
入した場合，同等である。Ｔ×ＣＳｓの初期修飾は互い
にすべて類似しており，構造遺伝子の初期修飾もまた互
いに類似している。これらの実施例はしばしば，制限酵
素，ＤＮＡ断片の大きさ，コードしているＯＲＦ，生じ
たりあるいは出発原料として用いたりしたプラスミド，
変異に用いたオリゴヌクレオチドの特異的な数や配列，
プラスミドの起源，そして用いた酵素反応といった選択
項目だけが異なる多くの部分からなる作成に対して，共
通の方針の使用を含む。簡単にするため，ＤＮＡ操作や
作成を特定の表の特定の欄を参照することで詳述してい
る違う項目，その表内の横の行に書いてある特定の作成
に使う特定の一連の操作，について一度述べておく。例
えば，特定の制限酵素の使用を指示するとき，表８の欄
１，これを“Ｔ6.1 ”と示すが，では“・・・はＴ6.1
で分解した・・・”と言い表すであろうし，またＯＲＦ
５，８および９（Ｔ6.3)をコードしているｍＬＣの作成
（Ｔ6.4)はSma Iで分解し（Ｔ6.1)，6.4 kbp の断片を
分離（Ｔ6.2)することである。

【０１４３】次に述べるものは，図２２に図解してい
る。ＤＮＡ作成の例に用いるのに好ましい方針の概略で
ある。内在のNde I部位をＭ13を基礎としたベクターｍ
ＷＢ2341 より除き，ｍＷＢ2341（Nde）と表されるベク
ターができる（実施例3・1）。Ｔ−ＤＮＡの大きい方の
断片をベクターのBam HI部位を除くようにして ｍＷＢ2
341 （Nde）に導入した（実施例3・2)。それからＴーＤ
ＮＡ内在のNde IとBam HI部位を除き（実施例3・3)，新
しい部位を導入した。Nde I部位を翻訳開始部位および
終結部位のその部分およびその近傍にそれぞれ導入し，
したがってNde I断片上 の外来遺伝子は内在ＯＲＦ構造
遺伝子と置換される。 Bam HI部位を転写開始お よび終
結シグナルの５’側へおよび３’側からだいたい 0.3kb
pのところにそれ ぞれ導入するので，結果的に構成され
たＴ×ＣＳと構造遺伝子との結合物はBam HI断片から除
かれている（実施例3・4)。幸運にも内部にNde Iあるい
は Bam HI部位を持たない構造遺伝子をｍＷＢ2341（Nd
e）に導入し（実施例4・1)，Nde I部位を翻訳開始および
終結部位に，およびその後に導入する（実施例4.2, 4・
3)。この構造遺伝子をNde Iでの分解により“ＤＮＡカ
セット”上のベクターから除き，Nde I分解により除い
た内在構造遺伝子を持っていた，望みのどんなＴ×ＣＳ
にもこの構造遺伝子を挿入する(実施例6・1)。それから
Ｔ×ＣＳ／外来の構造遺 伝子結合物をBam HI分解によ
りベクターから除き，任意の植物の形質転換ベクターに
挿入する(実施例6・2)。幸運にも存在している制限部位
を利用する作成方針 は，ここで用いている一般化され
ているＤＮＡカセット方針よりもある特定のＴ×ＣＳ／
構造遺伝子結合物にとってより簡単になるように普通の
技量の人により設計されているだろうことが判る。しか
し，ＤＮＡカセットは選択するときの融通性や多くの別
種のＴ×ＣＳと構造遺伝子を合わせることを成し遂げよ
うとしているとき，よりよいアプローチである。例とし
て挙げた結合のうちの１つである。結晶タンパク質構造
遺伝子とＯＲＦ19 Ｔ×ＣＳの結合は実施例７で詳細に
繰 り返されている。その中では，実施例7・1, 7・2, 7・
3, 7・4, 7・5, 7・6および7・7 は実施例3・2, 3・3, 3・4, 4
・1, 4・2, 6・1および6・2 にそれぞれ対応している。

【０１４４】＜実施例１＞この実施例は pTi15955 Ｔ−
ＤＮＡ配列の結果の発見，分析，および考察を提供す
る。

【０１４５】１．１ 要約 アグロバクテリウム・チューメファシエンス（pTi1595
5）由来のオクトピン腫瘍誘導性（Ti）プラスミドの転
移した領域（Ｔ−ＤＮＡ）の完全なヌクレオチド配列が
決定された。最も外側のＴ−ＤＮＡ境界の両側に約 900
塩基伸びた全24,595ヌクレオチドの配列を決めた。Tiプ
ラスミドの配列を決めた部分のコンピューターによる解
析で72の制限酵素の認識部位が少なくとも１ケ所はＤＮ
Ａ配列に存在することが明らかとなった。EcoK 部位は
このＤＮＡ配列には存在しない。２つの不完全な24塩基
の繰り返しがＴ−ＤＮＡ配列と境を接していることがわ
かった。左側の方は 909の位置で決まり，右側の方は2
3,872の位置で終わっており，Ｔ−ＤＮＡ領域は全長が2
2,874ヌクレオチドとなる。他の２つのよく似ている24
塩基の繰り返しがＴ−ＤＮＡ内に見つかり，Ｔ−ＤＮＡ
を３つの明瞭な領域に分割していた；見かけ上真核生物
起源のＴ−左側（ＴＬ−ＤＮＡ）13,175bp (basepairs,
塩基対），原核生物起源Ｔ−中心（ＴＣ−ＤＮＡ）1,81
6bp そして真核生物起源のＴ−右側（ＴＲ−ＤＮＡ）7,
883bp である。Ｔ−ＤＮＡは以前に報告されている９つ
の転写物を含むが，ＡＴＧ開始コドンで始まる 300塩基
以上の長さの26個のオープンリーディングフレームが見
出された。14個のＯＲＦは真核生物のプロモーター，リ
ボゾーム結合部位，そしてポリ（Ａ）付加部位により分
けられており，ＴＬ−ＤＮＡとＴＲ−ＤＮＡだけに見ら
れる。真核生物のプロモーター配列を持つＯＲＦはＴＣ
−ＤＮＡ内には存在していなかった。

【０１４６】１．２ ＤＮＡ配列および制限酵素認識部
位 Ｔ領域を含む pTi15955 の部分のヌクレオチド配列を図
１〜図１９に連続して示している。ＤＮＡ配列の一方の
鎖だけを載せている。５’から３’への方向で，またBa
m 断片８の左側の BamHI部位からEco 断片Ｄの右側の E
coRI部位までの24,595塩基を連続的に並べている（C.Wi
llmitzer et al．(1983) Cell 32: 1045-1056)（図２
０）。両鎖はＤＮＡの90％の配列を決定した。残りの10
％は一方の鎖について配列決定を行ったが，この配列は
異なる制限酵素部位からの配列決定によりしばしば重複
した。配列から決まった制限エンドヌクレアーゼ部位の
リストを表１，表２および表３に挙げている。これらの
制限部位に関する知識は，組み換えＤＮＡ操作を行うと
きに必須である。調べた73の酵素のうち EcoKの部位だ
けはTi配列に存 在しなかった。30ケ所以上もＤＮＡを
分解する酵素の部位の位置は表１，表２および表３には
明白に示していないが，図１〜図１９に連続して表して
いる配列には本質的に存在している。

【０１４７】以下に表１，表２および表３を示す。

【０１４８】

【表１】

【０１４９】

【表２】

【０１５０】

【表３】

【０１５１】１．３ Ｔ−領域の範囲 21-25塩基の長く伸びた順方向の繰り返しがＴ−ＤＮＡ
の境界にあるということが報告されている（ピー．ザン
ブリキィ等（1982）ジェイ．エムオーエルイーシー．エ
イピーピーエル．ジーイーエヌイーティー．1 : 361-37
0 ，エヌ．エス．ヤダフ等（1982）ピーアールオーシ
ー．エヌエイティーエル．エイシーエイディー．エスシ
ーアイ．ユーエスエイ 79 : 6322-6326，アール．ビ
ー．シンプソン等（1982）セル 29: 1005-1014（P.Zam
bryski et al．(1982) J.Molec.Appl.Genet. 1 : 361-
370, N.S.Yadav et al．（1982) Proc. Natl.Acad.Sc
i. USA79 : 6322-6326, R.B.Simpson et al．（1982)
Cell 29 : 1005-1014)）これら２つの繰り返しはそれぞ
れ909-932と23,759−23,782の位置の間に位置してお
り，図２０ではＡとＤという印をつけた。それらは12bp
の順方向の繰り返しであり，表４に示しているように24
bpの不完全な繰り返しとして広がっていた。繰り返し配
列ＡとＤが外側の限界と仮定すると，全Ｔ領域の長さは
22,874ヌクレオチドだった。これらの繰り返される配列
はまたpTi15955のＴ領域内の２つの位置，つまり14,060
-14,083(B)および15,900-15,923(C)に見られた（図２０
と表４）。

【０１５２】以下に表４を示す。

【０１５３】

【表４】

【０１５４】４つの24bpの境界の繰り返しが存在するこ
とから，オクトピンＴ−ＤＮＡが１つの連続した23kbp
(kilobase pairs,キロ塩基対）の小片として，あるいは
２つの個々の小片，つまり13kbp のＴＬ−ＤＮＡと８kb
p のＴＲ−ＤＮＡとしてのどちらかで植物のゲノムに組
み込まれることができるというメカニズムの鍵を与え
た。ＴＬ−ＤＮＡは感染した植物でクラウンゴールの形
成を引き起こす腫瘍誘導性遺伝子を含むので，ＴＬ−Ｄ
ＮＡの組み込みはよりはっきりとしていた。しかし，Ｔ
Ｒ−ＤＮＡはこういう遺伝子を欠き，その組み込みはオ
ピン分析試験を使うことにより検出できた。ノパリンＴ
−ＤＮＡはその境界に２つの既知の境界の繰り返しだけ
を含み，そして22kbp の連なった小片として転移され
る。こういう境界の繰り返しがオクトピンとノパリンTi
プラスミドの両方に存在するので，それらがＴ−領域の
植物のゲノムへの転移時に基本的な機能を持っていると
考えられている（ザンブリスキィ等（1982）前出，エ
ヌ．エス．ヤダ等，前出，シンプソン等，前出（Zambry
ski et al．（1982) 前出，N.S.Yada etal.,前出，Si
mpson et al.,前出））。

【０１５５】2,000 の異なるＤＮＡ源由来の約2,500,00
0ヌクレオチドを有するLos AlamosやEMBLデータバンク
を通して，24塩基の順方向配列の初めの12塩基を調べ
た。繰り返しはオクトピンやノパリンＴ−ＤＮＡ領域の
報告されている境界にだけ見られた。

【０１５６】１．４ リーディングフレームと転写物の
分析 全Ｔ−領域の中で，９個の転写物が以前に報告されてい
る（エヌ．ムライおよびジェイ．ディー．ケンプ(1982)
エヌユーシーエル．アシッズ アールイーエス．10: 16
79-1689，ウィルミッツァー等（1983）（N.Murai α J.
D.Kemp (1982)Nucl.Acids Res. 10: 1679-1689, Willmi
tzer et al．（1983) ）前出）が，ＡＴＧ開始コドン
で始まる300 ヌクレオチド以上の長さの26ＯＲＦが見出
された（図２０）。こういうＯＲＦの転写物は11.2kdか
ら83.8kdという大きさの範囲のあるポリペプチドをコー
ドしている（表５参照）。これらのオープンリーディン
グフレームのうちの14個は，ゴールドバーグ（Goldber
g）および ホグネス（Hogness）の共通配列（アール．
ブリーツナックおよびピー．チャンボン（1981）エイ
エヌエヌ．アールイーブイ．ビーアイオーシーエイチイ
ーエム．50: 349-383（R.Breathnach α P. Chambon
(1981) Ann.Rev.Biochem. 50: 349-383）に総説があ
る）に近い類似性のある真核細胞のプロモーターに特徴
的な配列を示した。それらはまたエム．コザック（198
1）エヌユーシーエル．アシッズ アールイーエス．9 :
5233-5252 （M.Kozak (1981) Nucl.Acids Res. 9: 523
3-5252）により 提唱されている典型的なリボゾーム結
合部位に一般的に一致しており，そして実際転写終結シ
グナルとして作用する３’末端の典型的なポリアデニル
化部位を含んでいた（エム．フィッツジェラルドおよび
ティー．シェンク（1981）セル 251-260 ，ピー．ダー
ゼ等（1983）イーエムビーオー ジェイ．2: 419-426，
シ ー．モンテル等（1983）ネイチャー 305: 600-605
（M.Fitzgerald αT.Shenk (1981) Cell 251-260, P.Dh
aese et al．(1983) EMBO J. 2: 419-426, C.Montell
et al．（1983) Nature 305 : 600-605) ）（表６）。
ＯＲＦ18とＯＲＦ19は ポリアデニル化部位の位置して
いるところが普通ではないという特徴を持っており，そ
れらの転写物の３’側の未転写な領域の部分は，相補的
ではあるが，Ｔ−ＤＮＡ配列に共通な領域によりコード
されていることに注目されたい。

【０１５７】以下に表５および表６を示す。

【０１５８】

【表５】

【０１５９】

【表６】

【０１６０】ＴＬ−ＤＮＡ領域は，真核細胞のプロモー
ターを有する８つの，番号１，３，４，５，８，９，1
0, 11のオープンリーディングフレームを含んでいた。
これらのすべては，以前にマップされている転写物に対
応していた（シー．ウィルミッツァー等（1983）前出，
エイチ．デグリーブ等（1983）ジェイ．エムオーエルイ
ーシー．エイピーピーエル．ジーアールイーエヌイーテ
ィー．1: 499-511，ピー．ダーゼ等（1983）イーエムビ
ーオー ジェイ．2: 419-426（C.Willmitzer etal．（1
983) 前出，H. DeGreve et al．（1983) J.Molec. Ap
pl. Grenet. 1 :499-511, P. Dhaese et al．（1983)
EMBO J. 2 : 419-426)），（表７参照）。オクトピンTi
プラスミド Ach５のＴ−ＤＮＡ領域にコードされている
４つのタンパク質をエセリシア・コリー ミニセルで合
成した（ジー．シュロッダー等（1983）イーエムビーオ
ー ジェイ．2 : 403-409 （G.Schroder et al．(198
3)EMBO J. 2 : 403-409)）。これらのタンパク質のうち
の３つはオープンリーディングフレーム４，５および８
から予想されるタンパク質に大きさが非常によく対応し
ているが，フレーム５と８の間で報告されている28kdの
タンパク質を生産できるというオープンリーディングフ
レームは，この間には存在しなかった。小麦の胚芽の無
細胞系で発現するこの３つのタンパク質（ジェイ．シ
ー．マックファーソン等（1980）ピーアールオーシー．
エヌエイティーエル．エイシーエイディー．エスシーア
イ．ユーエスエイ 77: 2666-2670（J.C.McPherson et
al．(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2666-
2670)）の遺伝子の位置を確かめるのは，調べたＴ−Ｄ
ＮＡ断片内には多くのリーディングフレームがあるの
で，難しい。30,000ダルトンのタンパク質はリーディン
グフレーム11（オクトピンシンターゼ）に対応している
可能性はありうる。

【０１６１】以下に表７を示す。

【０１６２】

【表７】

【０１６３】真核細胞型のプロモーターを有する残りの
６つのＯＲＦ（表６の番号18, 19,21, 24, 25および26)
はすべてＴＲ−ＤＮＡ内にあった。１つの転写物だけ
がこの領域で報告されており，そして，それはＯＲＦ24
に対応し現在の適用の以前は“1.6 領域”にコードされ
ている 1.6kbの転写物と呼ばれていた。この転写物の機
能はまだ充分には判っていないが，転写物内のHind III
部位に挿入すると見かけ上オピンアグロピンの生産に欠
失を起こす（ムライおよびケンプ，（Murai αKemp,）
前出）。

【０１６４】残りのオープンリーディングフレームは真
核細胞型の転写シグナルに対応している共通配列を含ん
でいなかった。原核細胞型のプロモーター配列，（エ
ム．ロセンバーグおよびディー．コート（1979）（M.Ro
senberg α D.Court (1979) ）による総説エイエヌエ
ヌ．アールイーブイ．ジーイーエヌイーティー．13 : 3
19-353（ Ann. Rev.Genet. 13 : 319-353)の−10プリブ
ノーボックスや−35領域内にあるヌクレオチドの変化の
ため，そのような領域をこれらのリーディングフレーム
について確かめることは困難だった。しかしＯＲＦ２，
13, 14および16は，ジェイ．シーネおよびエル．ダルガ
ーノ（1974）ピーアールオーシー．エヌエイティーエ
ル．エイシーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエイ
71 : 1342-1346（J.Shine α L. Dalgarno (1974) Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA 71 : 1342-1346 ）により報告
された配列に似ている原核細胞型のリボゾーム結合部位
があることがわかった。繰り返し配列ＢとＣの間のＴ−
ＤＮＡ領域は５つの転写物（ＯＲＦ13-17)を含む，その
うち３つ（ＯＲＦ 13, 14 および 16)はシーネおよびダ
ルガーノ（Shine α Dalgarno）のリボゾーム結合部位
を含み，それゆえに起源は原核細胞であるように思え
る。Ｔ−領域のこの中心区分はここではＴＣ−ＤＮＡと
呼ぶが，それは側面にあるＴＬ−ＤＮＡやＴＲ−ＤＮＡ
とは明らかに異なっているからである。我々の配列のデ
ータの分析は，ＴＬやＴＲ領域が現実にあるいはその起
源が真核細胞型であるということを支持している。14個
の真核細胞型のオープンリーディングフレームのうち，
８個はＴＬ−ＤＮＡ内にあり，６個はＴＲ−ＤＮＡ内に
あった。それに比べて，これら２つの真核細胞に似た領
域を分断しているＴＣ−ＤＮＡは，４個の原核細胞型の
リーディングフレームのうちの３個を含んでいた。さら
に，Ｔ−ＤＮＡと塩基組成を比較してもまたＴＣ−ＤＮ
Ａは原核細胞が起源であるという論旨を支持した。ＴＣ
−ＤＮＡ領域の高いＧ＋Ｃ含量（56.0％）は，大きなTi
プラスミドが58.8％という報告値に近かった（エス．シ
ェイコールスラム等（1979）フィトパソル．69: 54-58
（S.Sheikholeslam etal．（1979) Phytopathol. 69 :
54-58)。しかし，ＴＬ−ＤＮＡとＴＲ−ＤＮＡ領域のＧ
＋Ｃ含量はそれぞれ44.1％，44.5％で，完全なTiプラス
ミドやＴＣ−ＤＮＡ領域の両方よりも有意に低く，高等
植物のＤＮＡのＧ＋Ｃ組成に非常に似ていた（エイ．ジ
ェイ．ベンディッチおよびビー．ジェイ．マックカーシ
ー（1970）ジーイーエヌイーティー．65: 545- 565（A.
J.Bendich α B.J.McCarthy (1970)Genet. 65 : 545-56
5)）。図２０にマップされているリーディングフレーム
(a)と(b)を含むＴ−ＤＮＡ領域に隣接している範囲の塩
基組成はまた，予想されたように57.4％，54.2％と高か
った。

【０１６５】１．５ コドン使用 すべての転写物を個々にコドン使用を，原核細胞型や真
核細胞型の転写物のコドンの偏りを重視して，調べた。
コドン使用の偏りは，Ｔ−領域内でどのＯＲＦでも検出
されなかった。Ｔ−ＤＮＡ領域内で真核細胞型や原核細
胞型の転写物の間でもまた偏りはなかった。このことは
Ｔ−ＤＮＡ Ｔ×ＣＳs の支配下では，通常の植物遺伝
子のコドンの偏りがないような遺伝子は発現するだろ
う，ということを示している。

【０１６６】１．６ 二次構造 挿入された繰り返しはＤＮＡ上の認識や調節に寄与して
いるかもしれなかったので（ディー．エム．ジェイ．リ
ッレィ（1980）ピーアールオーシー．エヌエイティーエ
ル．エイシーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエイ
77 : 6468-6472，エヌ．パナヨタトスおよびアール．
ディー．ウェルズ（1981）ネイチャー289 : 466-470
（D.M.J.Lilley (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
7 : 6468-6472, N. Panayotatos α R. D. Wells (198
1) Nature 289 : 466-470) ，Ｔ−領域の二次構造をそ
の長さに従ってステム−ループの位置を決めることで分
析した。選択したステム−ループのパラメーターは，結
合価20（Ｇ−Ｔ＝１；Ａ−Ｔ＝２およびＧ−Ｃ＝３）の
10塩基という最小のステム長であったり，20塩基という
最大のループの大きさであったりした。ステム−ループ
の数や位置を図２１に示している。存在し得るステム−
ループの数とオープンリーディングフレームの位置との
間に注目すべき相関関係があった。このことからここで
明らかになったＯＲＦは真正なｍＲＮＡに転写されると
いうことが示される。

【０１６７】＜実施例２＞この実施例は一般的にＤＮＡ
の配列を決めるに用いた材料や方法，および特にpTi159
55のＴ−ＤＮＡを明らかにしている。

【０１６８】２．１ 材料 超純粋な尿素はＢＲＬ(Gaithersburg, Maryland)より入
手し，ポリアクリルアミドはＢＤＨ（Poole,England)よ
り，子牛の腸のアルカリホスファターゼは Boehringer
(Mannheim, W. Germany)より，ポリヌクレオチドキナー
ゼは P. L.Biochemicals，Inc. (Milwaukee, Wisconsi
n)より，〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰは New England Nuclear
(Boston, Massachusetts)より入手した。制限酵素 BamH
I，BglII，Eco RI，Hinc II，Hind III，Pst I，Sal
I，Sma I，Sst I，Sst II，XbaI，およびXho Iは Prome
ga Biotec (Madison, Wisconsin)より，Acc I，Bcl I，
BglI，Bst ＥII，Cla I，Eco ＲＶ，Hpa I，Kpn I，Mbo
II，Mlu II，Mst II，NcoI，Nde I，Nru I，Pvu IIお
よびRsa Iは，ニュー イングランド バイオラブズ（ベ
バーリィ，マサチューセッツ）（New England Biolabs
(Beverly, Massachusetts)）より購入した。すべてを供
給者の推薦に必ず従い使用した。ＤＮＡ配列決定の反応
に用いた化学薬品は，エイ．エム．マキシムおよびダブ
リュー．ギルバート(1980)エムイーティーエイチ．イー
エヌズィーワイエムオーエル．65: 499 : 560（A.M.Max
am α W.Gilbert (1980) Meth. Enzymol.65 : 499 : 56
0 ）が推薦している販売元から一般に入手した。Ｘ線フ
ィルムのＸ−Omat ＡＲ−５は，コダック（ロチェスタ
ー，ニューヨーク）（Kodak (Rochester, New York) ）
より長い一巻で購入した。他のすべての試薬は，他に述
べてなければ試薬特級であった。

【０１６９】２．２ 方法 配列を決定したTiプラスミドpTi15955の領域を図２０に
示している。陰をつけた領域は，pBR 322にサブクロー
ニングしてエセリシア・コリー株 HB101あるいはGM33の
どちらかで増やした断片を示している。それから個々の
クローンをマキシ ム（Maxam）とギルバート（Gilber
t）（前出）の方法を用い，本質的には，彼が述べてい
るように配列を決定した。配列を決定するため，クロー
ン化したＤＮＡ10μｇを適当な制限酵素で切断し，それ
から反応管に1.0Ｍトリス−塩酸を1/10 容を加えてpHを
8.4に調整した後，子牛の腸のアルカリホスファターゼ
2.5単位 で55℃，30分間処理した。アルカリホスファタ
ーゼは３回フェノール抽出を行って除去し，続いて２回
エタノール沈澱を行った。脱リン酸化したＤＮＡを乾燥
し，15μlの水と15μlの変性緩衝液（20mMトリス−塩
酸，pH 9.5，１mMスペルミジン，0.1mM EDTA）に溶解し
た。この混合液を70℃で５分間保温し，それからすぐに
氷水に入れた。冷却後，４μlのキナーゼ緩衝液（500 m
M トリス−塩酸，pH 9.5, 100mM MgCl₂, 50 mMジチオス
レイトール，50％(v/v)グリセロール），100μCiの〔γ
−32Ｐ〕ＡＴＰ，ポリヌクレオチドキナーゼ 2.0単位を
加え，反応溶液を37℃で30分間保温した。反応はエタノ
ール沈澱により停止し，サンプルを真空下で乾燥させ
た。末端を２ケ所ラベルしたＤＮＡを適当な制限酵素で
分解し，片方の末端をラベルした断片をつくり，次いで
この断片をポリアクリルアミドゲルで分離し，それから
溶出した（Maxam α Gilbert ，前出，手順４，５ａ，
７および９）。ＤＮＡ配列決定反応は次に示す修飾を行
うと完了する。制限Ｇ＋Ａ反応を，30μlの88％ギ酸を
反応液に加え，20℃で３分間保温し， 0.3Ｍ酢酸ナト
リウム（ヒドラジン停止液）を400 μl加えて停止させ
ることにより行った。Ｇ の反応時間は，20秒に減ら
し，20℃で保温した。Ｃ＋ＴとＣの反応は，20℃で３分
間に減らし，ヒドラジン停止液 400μlを加えることに
より停止させた。すべ ての反応は，Maxam と Gilbert,
前出に述べられているように続けた。

【０１７０】幅20cm，長さ110cm，厚さ0.2mmの長い配列
決定用ゲルをオリゴヌクレオチドを分離するために用い
た1)。ゲル板を，H.Garoffα W.Ansorge (1982) Analy
t. Biochem. 115 : 450-457 に述べられているようにア
クリルアミドが化学的に一方の板の面に結合するよう
に，シランで処理した。他の支持用の板は，電気泳動中
50℃に保持できるような自動調温装置のある板だった。
装填のための時間差は，各サンプルを同時に，４％，６
％および16％ポリアクリルアミドゲルに負荷することに
より避けられた。ゲルにより配列決定の段がうまく交差
するように，ゲルを14時間，3,000 ボルトで泳動した。
電気泳動後，まだ板の面に付着しているゲルを10％酢酸
で15分間固定し，水で洗った。乾燥したゲルを，厚さ約
0.01mmに縮めてある板の面に直接乗せた。Ｘ線フィルム
を乾燥したゲルに直接接触させて置き，バンドの強さや
解像度を増した。オートラジオグラフィーを，増感用ス
クリーンを使わずに室温で行った。これらの方法を用い
ると，断片あたり 500塩基はふつうに配列決定された。
また，３枚のゲルの各セットに５断片を負荷することに
よって，2,500 塩基配列が得られた。ＤＮＡやタンパク
質の配列のコンピューターによる分析は，当該分野に使
用することが可能なプログラムも用いることはできた
が，Dr. O.SmithiesとDr. F. Blattner (University of
Wisconsin, Madison) により作られたコンピュータープ
ログラムを用いて完遂した。

【０１７１】＜実施例３＞この実施例は外来構造遺伝子
の挿入のための準備としての oＴ−ＤＮＡ Ｔ×ＣＳs
の操作を教示する。

【０１７２】３．１ Ｍ13を基礎としたベクターからNd
e I部位の除去 Ｍ13を基礎としたベクターｍＷＢ2341（実施例５，Barn
es et al．（1983)および Barnes αBevan (1983)参
照）のウイルス型である一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）を分
離し，実施例３．３および５で述べているように，5'CA
ATAGAAAATTCATAGGGTTTACC3', 5'CCTGTTTAGTATCATAGCGTT
ATAC3', 5'CATGTCAATCATTTGTACCCCGGTTG3'にハイブリダ
イズ後，これによりコードされているタンパク質の翻訳
の特性を変化させずに後に不都合となると判明している
３つのNde I部位を除去したが，オリゴヌクレオチド規
定特定部位突然変異に供した。３ケ所のNde I部位を欠
いている変異ｍＷＢ2341を同定し，ｍＷＢ2341（Nde）
と表す。

【０１７３】３．２ Ｍ13を基礎としたベクターへの o
Ｔ−ＤＮＡのサブクローニング アグロバクテリウム・チューメファシエンス ATCC15955
より pTi15955 ＤＮＡを分離し，表８のＴ6.1 に従い
完全に分解する。５’側の突出した末端は，エセリシア
・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント
と適当なヌクレオチド３リン酸とともに保温し平滑末端
に変換する。結果として生じたＤＮＡ断片の混合液をア
ガロースゲル電気泳動で分離し，Ｔ6.2kbp断片をゲルか
ら溶出する。

【０１７４】Ｍ13を基礎としたベクターｍＷＢ2341（Nd
e ）の複製型（ＲＦ）の供給結合的閉環状ＤＮＡ（ccc
ＤＮＡ）を分離し，Eco RIとHind IIIで分解する。結果
として生じた粘着末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ーフラグメントとともに保温し平滑末端に変換し，細菌
のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）と保温し５’リン
酸を除去する。結果として生じる線状化ベクターをゲル
電気泳動で精製し，上記で分離したＴ−ＤＮＡ断片に混
合させ連結する。結果生じた混合液でエセリシア・コリ
ーＷＢ373 を形質転換後，ウイルス型ＤＮＡとＲＦ型を
形質転換体から分離する。さらに，一本鎖ウイルス型の
とき図１〜図１９で示した全配列に相補的であり，ＯＲ
ＦＴ6.3 の完全なＤＮＡ配列を有するような挿入物の存
在を制限酵素およびハイブリダイゼーションによる分析
で選択する。選択したコロニーに感染するウイルスをＴ
6.4 と呼ぶ。

【０１７５】以下に表８を示す。

【０１７６】

【表８】

【０１７７】３．３ oＴ−ＤＮＡ由来の内在するNde
Iおよび BamHI部位の除去 表９のＴ7.1 をＴ7.3 に挙げているオリゴヌクレオチド
にハイブリダイゼーション後，プライマー伸長によりＴ
7.2 から調製する。この操作により後の操作に不都合で
あるかもしれない生来存在しているかもしれない BamHI
部位とNde I部位を除去する。一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮ
Ａ）ウイルス型Ｔ6.4 に特定なオリゴヌクレオチドをハ
イブリダイゼーションさせ，エセリシア・コリーＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノーフラグメント，全４種のデオ
キシヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼと共に，プライ
マー／ウイルスＤＮＡ複合体を保温し，生じる cccＤＮ
Ａ分子を増やし，ＷＢ373 を形質転換し，形質転換体を
選択し，ＲＦを分離して望ましくない制限部位が欠けて
いるクローンを同定するために，制限酵素分析を行うこ
とにより一度に１つ部位を除去できうる。これらの段階
は除去しようとしている各部位について反復する。他に
は，表８のＴ6.4 を，表９のＴ7.3 に挙げたオリゴヌク
レオチドのすべてに一斉にハイブリダイズさせ，単一操
作ですべての部位を除く変異手順を通して行いうる。

【０１７８】以下に表９を示す。

【０１７９】

【表９】

【０１８０】３．４ oＴ−ＤＮＡにおける新たなNde
Iおよび BamHI部位の設置 上記および実施例５で述べているように，表10および表
11においてＴ8.3に挙げたオリゴヌクレオチドにハイブ
リダイゼーションさせた後プライマーを伸長させること
によりＴ8.2から調製する。これは，Nde I部位（5'・・・C
ATATG・・・3'）を翻訳開始部位（ＡＴＧ）や翻訳終結部位
（ＴＡＡ，ＴＧＡ，あるいはＴＡＧ）の近傍に導入で
き，転写開始部位およびポリアデニル化部位から約 0.3
kbp のＴ−ＤＮＡ遺伝子の側面にある配列に BamHI部位
（5'・・・GGATCC・・・3' ）を導入できる，という効果を有
する。

【０１８１】以下に表１０および表１１を示す。

【０１８２】

【表１０】

【０１８３】

【表１１】

【０１８４】＜実施例４＞この実施例は，oＴ−ＤＮＡ
Ｔ×ＣＳに挿入するために調製する４つの典型的な外
来構造遺伝子の操作を教示している。その遺伝子は，タ
ンパク質であるファセオリン（ファセオラス・ブルガリ
ス（Phaseolus vulgaris）由来の栄養的に重要な種子の
貯蔵タンパク質），ファセオラス・ブルガリスのレクチ
ン（種子や共生的窒素固定に関与し，草食動物に食べら
れないような種子をつくりあげる他の植物組織にみられ
る栄養学的に重要なタンパク質），タウマチン（霊長類
には甘く感じられるタンパク質で，タウマトコッカス・
ダニエリ（Thaumatococcus daniellii）に自然に見られ
る），そして結晶性タンパク質（鱗翅類の昆虫種の多数
の幼虫の害毒を制御するのに商業的に使われているバチ
ルス・チューリンゲンシスにより生産されるタンパク
質）である。ここで使用した結晶性タンパク質の構造遺
伝子はその３’末端が欠けているが，自然にある活性化
した毒素と等価な昆虫の幼虫に対して有害なタンパク質
を生産する。ファセオリン，レクチン，およびタウマチ
ンは真核細胞型の遺伝子であるが，結晶性タンパク質は
原核細胞型である。ファセオリンはイントロンを含む
が，レクチンや結晶性タンパク質は含まない。レクチン
遺伝子それ自身はイントロンを含まず，ゲノムクローン
から得られるだろうが，この実施例ではレクチンの構造
遺伝子はｃＤＮＡクローンから得て，タウマチンも同様
である。

【０１８５】４．１ Ｍ13へ構造遺伝子のサブクローニ
ング 表１２において、Ｔ9.1遺伝子はプラスミドＴ9.2に保有
されており，プラスミドＴ9.2はＴ9.3より分離でき得
る。Ｔ9.2をＴ9.4で完全に分解し，突出している末端を
Ｔ9.5と保温することにより除去する。Ｔ9.6kbpという
ＤＮＡ断片を電気泳動で分離後，アガロースゲルより溶
出して分離する。生じた断片を実施例３．１で述べたよ
うに，脱リン酸化した平滑末端の線状化したｍＷＢ2341
（Nde）と混ぜ，連結し，そしてエセリシア・コリーＷ
Ｂ373 を形質転換した。ウイルス型ＤＮＡおよびＲＦを
形質転換体より分離し，ｍＲＮＡに存在するように一本
鎖のウイルス型となっているときに配列に相補的な挿入
物の存在を，制限酵素やハイブリダイゼーションによる
分析で選択する。選択したコロニーに感染するウイルス
をＴ9.7 と呼ぶ。

【０１８６】以下に表１２を示す。

【０１８７】

【表１２】

【０１８８】４．２ ３つの構造遺伝子の側面にあるNd
e I部位の設置 実施例３．３および５で述べたように，表１３において
Ｔ10.3に挙げたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼー
ションさせた後プライマーを伸ばしてＴ10.2を調製する
ためにＴ10.1を使用する。このことは翻訳開始部位や翻
訳停止部位近傍にNde I部位を導入できるという効果を
有する。他の方法で除去し得たであろう構造遺伝子内に
BamHIあるいはNde I部位は存在しない。バチルス・チュ
ーリンゲンシスの結晶性タンパク質遺伝子の場合，翻訳
停止コドン(ＴＡＡ)をさらに導入する。表１２のＴ9.1
の構造遺伝子は，Nde IでＴ10.2を完全に分解後Ｔ10.4k
bpＤＮＡ断片として単離しうる。

【０１８９】以下に表１３を示す。

【０１９０】

【表１３】

【０１９１】４．３ タウマチンの変異 タウマチンｃＤＮＡを含むベクターがシー．ティー．ベ
リップス等，イーユーアール．ピーエイティー．アプリ
ケーション 54,330および54,331，（C.T.Verripset a
l., Eur.Pat. application 54,330および54,331，）そ
してエル．エデンズ等（1982）ジーイーエヌイー 18 :
1-12 （L. Edens et al．(1982) Gene18 : 1-12 によ
り明確にされた。タウマチンは元来プレプロタウマチン
として合成される。接頭辞“プレ”は，細胞質から合成
の場となっている細胞の小胞体へとタウマチンの輸送を
起こす機能を有する“シグナルペプチド”が存在してい
ることを表し，接頭辞“プロ”はそのタンパク質が成熟
型ではないということを表している。タウマチンｃＤＮ
Ａ構造遺伝子は，Ｍ13-101-B (イーユーアール．ピーエ
イティー，アプリケーション 54,331（Eur.Pat.applic
ation 54,331 ））内にタウマチンｍＲＮＡに相補体と
して存在している。このベクターのウイルス型は，表１
４に挙げてあるオリゴヌクレオチドによる部位特異的な
変異処理後，タウマチン構造遺伝子の起源として用い
る。構造遺伝子の５’末端と３’末端にそれぞれ結合す
るオリゴヌクレオチド(a)と(c)で変異を起こすと，プレ
プロタウマチンの配列が，得られたベクターのNde I分
解により抽出される。５’および３’末端にそれぞれ結
合するオリゴヌクレオチド(b)および(d)による変異では
成熟型タウマチン配列が同様に抽出される。(a)と(d)，
(b)と(c)という組合せを用いると，それぞれプレタウマ
チンおよびプロタウマチンと呼ばれるであろうものをコ
ードする断片が生じる。これらの配列のすべてを，ゲル
電気泳動により通常に単離し得る内部にNde Iあるいは
BamHI部位を持たない約 0.7kbp の大きさの断片として
得る。

【０１９２】以下に表１４を示す。

【０１９３】

【表１４】

【０１９４】４．４ 他の可能な操作 ファセオリンおよびレクチンは，そのアミノ末端にシグ
ナルペプチドを持つように初め翻訳されるが，それはタ
ウマチンと同様であった。もし望むならば，これらシグ
ナルペプチドは，シグナルペプチドと成熟型タンパク質
の間の接合点を形成するコドン間に５’−Nde I部位を
設置することにより除去できる。植物細胞の核でＴ−Ｄ
ＮＡの支配下にあるとき，そういう構造遺伝子は細胞の
細胞質から輸送されないファセオリンあるいはレクチン
タンパク質の合成を引き起こすであろう。そういうファ
セオリンやレクチンの構造遺伝子を構成するオリゴヌク
レオチドの設計に有益な配列は，それぞれジェイ．エ
ル．スリグトン等（1983）ピーアールオーシー．エヌエ
イティーエル．エイシーエイディ．エスシーアイ．ユー
エスエイ．80: 1897-1901 およびジェイ．エム．ホフマ
ン等（1982）エヌユーシーエル．アシッズ アールイー
エス．10 : 7819-7828（J.L.Slightom et al．（1983）
Proc.Natl.Acad. Sci. USA 80 : 1897-1901,および J.
M.Hoffman etal．（1982) Nucl.Acids Res.10 : 7819-
7828）により報告されている。

【０１９５】＜実施例５＞この実施例は合成オリゴヌク
レオチドの合成とその使用の技術を述べている。他の有
益な参考文献はこの実施例への導入節に引用してある研
究のリストを見ればわかる。

【０１９６】５．１ オリゴヌクレオチドの合成 この実施例で用いたＤＮＡ断片の化学合成の技術は，Ｄ
ＮＡ合成の当業者によく知られている多くの技術を利用
する。ヌクレオチドの修飾は，エイチ．シャッロー等
（1963）ジェイ．エイエムイーアール．シーエイチイー
エム．エスオーシー．85 : 3820 およびエイチ．ブッチ
およびエイチ．ジー．コラナ（1965）ジェイ．エイエム
イーアール．シーエイチイーエム．エスオーシー．87 :
2990（H.Schallor et al．(1963) J. Amer. Chem. So
c. 85 : 3820 および H. Buchi αH. G.Khorana (1965)
J. Amer. Chem. Soc. 87 : 2990）に述べられている。
デオキシヌクレオシド ホスホルアミジト（deoxynucle
oside phosphoramidites)の調製は，エス．エル．ビュ
カゲとエム．エイチ．カルチャーズ（1981）テトラヘド
ロン レット22 : 1859 （S. L. Beaucageと M. H. Car
uthers (1981) Tetrahedron Lett 22 : 1859）に述べら
れている。固相樹脂の調製は，エス．ピー．アダムズ等
（1983）ジェイ．エイエムイーアール．シーエイチイー
エム．エスオーシー．（S. P. Adams et al．（1983)
J. Amer. Chem. Soc. ）に述べられている。二重鎖分子
形成中に有用なハイブリダイゼーションの手順は，ジェ
イ．ジェイ．ロッシー等（1982）ジェイ．ビーアイオー
エル．シーエイチイーエム．257 : 11070 （J. J. Ross
i et al．(1982) J. Biol.Chem. 257 : 11070）に述べ
られている。

【０１９７】５．２ オリゴヌクレオチド規定特定部位
変異 規定された変異の一般法は最近ではディー．ショートル
等（1981）エイエヌエヌ．アールイーブイ．ジーイーエ
ヌイーティー．15 : 265-294（D.Shortle etal．(1981)
Ann.Rev.Genet. 15 : 265-294 ）により総説が出され
ている。オリゴヌクレオチド規定特定部位変異は遺伝子
操作で特別に有益で，最近ではエム．ジェイ．ゾラーお
よびエム．スミス（1983）エムイーティーエイチ．イー
エヌズィーワイエムオーエル．100 : 468-500 およびエ
ム．スミスおよびエス．ギッラン（1981）ジェネティッ
ク エンジニアリング；プリンシパルズおよびメソッ
ズ，ブイオーエル．3, イーディーエス．：ジェイ．ケ
イ．セットローおよびエイ．ホッラエンダーおよびエ
ム．スミス(1982)トレンズ イン バイオチェン 7: 4
40-442 （M. J. Zollerα M. Smith (1983) Meth.Enzym
ol. 100 : 468-500および M. Smith α S. Gillam (198
1) Genetic Engineering ; Principals andMethods, v
ol. 3, eds. : J.K.Setlow α A. Hollaenderおよび
M.Smith (1982) Trends in Biochem 7 : 440-442 ）に
まとめられている。この技術によりＤＮＡ配列中の１つ
かそれ以上の塩基対の変化あるいは，小さな挿入あるい
は欠失の導入ができる。オリゴヌクレオチド規定変異を
用いた最近の例は エム．ジェイ．ゾラーおよびエム．
スミス（1983）前出，エム．ジェイ．ゾラーおよびエ
ム．スミス（1982）ニュークレイック アシッズ アー
ルイーエス．10: 6487-6500，ジー．ダルバダイ−マッ
クフェラルド等(1982)ピーアールオーシー．エヌエイテ
ィーエル．エイシーエイディー．エスシーアイ．ユーエ
スエイ 79: 6409-6413，ジー．エフ．エム．シモンズ
等（1982）ニュークレイック アシッズ アールイーエ
ス．10 : 821-832，およびシー．エイ．フッチソンIII
等（1978）ジェイ．ビーアイオーエル．シーエイチイー
エム．253: 6551-6560（M.J.Zoller αM.Smith (1983)
前出，M.J.Zoller α M.Smith (1982) Nucleic Acids R
es.10: 6487-6500, G.Dalbadie-McFarland et al．(198
2) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79:6409-6413, G.F.M.Sim
ons et al．(1982) Nucleic Acids Res.10: 821-832,
および C.A.Hutchison III et al．(1978) J.Biol.Ch
em. 253 : 6551-6560）がある。有用なＭ13に基づくベ
クター（例えばｍＷＢ2344）はダブリュー．エム．バー
ンズ等（1983）エムイーティーエイチ．イーエヌズィー
ワイエムオーエル．101:98-122，およびダブリュー．エ
ム．バーンズおよびエム．ビーバン（1983）ニュークレ
イック アシッズ アールイーエス．11 : 349-368（W.
M.Barnes et al．(1983) Meth. Enzymol. 101:98-122,
および W.M.Barnes αM. Bevan (1983)Nucleic Acids
Res.11 :349-368）によって報告された。

【０１９８】ふつうに修飾しようとする配列を，当業者
にはよく知られている標準的な技術により，一本鎖バク
テリオファージベクター，ここではＭ13に由来するも
の，に移す。ベクターＤＮＡは一般的に二本鎖の複製可
能な型（ＲＦ）であり，一本鎖ウイルス型はふつう制限
酵素やリガーゼにより“切ったり継いだり”できない。
インビトロで断片を連結しＲＦにした後では，適当な宿
主を形質転換しても，ベクターの生活史の一部として一
本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）を生じるのである。ssＤＮＡを
ファージ粒子から単離し，適した位置でベクターにハイ
ブリダイズできるような充分な長さと配列の相同性を有
するオリゴヌクレオチドに，ハイブリダイズさせる。オ
リゴヌクレオチドは最終産物として望まれる配列を持
ち，そして一方，変化させる配列とは異なるべきであ
る。末端を“鉄で止め”たり，ハイブリッドな末端での
“息つぎ”を減じるため１つかあるいはそれ以上のＧか
あるいはＣにより両末端で終結するオリゴヌクレオチド
を持つことは有利である。オリゴヌクレオチドが結合物
の片方の部分にだけハイブリダイズするであろうという
ことを確かめるために，ベクターとＤＮＡの断片の結合
物の配列とオリゴヌクレオチドの配列を比較することは
賢明である。このことは，プライマーとしてヌクレオチ
ドを使いジデオキシリボヌクレオチド配列決定により実
験的に容易にチェックでき得る；というのは１つ以上の
オリゴヌクレオチド結合部位がある恐れがあり，また標
的としている部位に隣接している配列に加えて，“隠れ
た”配列が認められるかもしれないからである。２次的
なハイブリダイゼーション部位が認められるかもしれな
いが，適当な厳密さのある焼戻し条件下では，望むよう
な特異性をふつう持つ，より長いオリゴヌクレオチドを
合成できる。もし変異を起こそうとしている配列がステ
ム−ループ構造を形成するならば，オリゴヌクレオチド
プライマーは弱く結合しているかもしれないし，あるい
は他のほとんど相同性のない配列に優先的に結合してい
るかもしれないということにも気付かねばならない。し
かし，このことはプライマー濃度を大いに増加させる
（例えば，1000倍）ことにより克服できるだろう。いく
つかの異なるオリゴヌクレオチドをベクターを変更させ
るのに用いていると，それらは優先的にすべて一斉にベ
クターにハイブリダイズする。うまく変異しないと見ら
れているどんな部位でも，オリゴヌクレオチド規定特定
部位変異をさらに繰り返すことにより変化するかもしれ
ない。また，複数部位が１度に変化するかもしれない。
変異配列を有するオリゴヌクレオチドと塩基対を形成し
ている環状ssＤＮＡを含むハイブリッドがいったん形成
すると，オリゴヌクレオチドは，５'から３'へのエキソ
ヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼであるエセリシア
・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント
によりＤＮＡの相補鎖の合成を開始する。ベクターを任
意ＤＮＡリガーゼとともに保温し，ポリメラーゼとリガ
ーゼの反応を一斉に行ってもよい。優先的に共有結合的
閉環状二重鎖ＤＮＡ（ccc ＤＮＡ）分子を，アルカリ蔗
糖勾配遠心分離，アルカリ条件下でのフェノール抽出，
あるいはＳ１ヌクレアーゼとともに保温するというよう
な技術により，形質転換以前に選択できる。こうしてベ
クターは適当なバクテリア宿主細胞を形質転換できる。
この初めの感染によりできるウイルス粒子を単離し，バ
クテリアのローンの面に感染させることによるプラーク
形成に用いる。制限部位を変換させる場合，すぐに制限
酵素分析によりＲＦを選択できる。また，プローブとし
て合成変異オリゴヌクレオチドプライマーを用いて，注
意して選択した条件下でハイブリダイズさせることによ
り，あるいは，ＤＮＡの配列を決めたりすることによっ
て選択できる。望んでいるような変化を含むクローンが
単離されると，当業者にはよく知られている技術を用い
て望むようにこの変異ＤＮＡを操作できる。

【０１９９】＜実施例６＞この実施例は， oＴ−ＤＮＡ
Ｔ×ＣＳsおよび実施例３および４でそれぞれ操作した
外来構造遺伝子の使用を教示している。

【０２００】６．１ Ｔ×ＣＳ／構造遺伝子の結合物の
組立て 表１０および表１１のＴ8.1に挙げてあるプラスミドをN
de Iで分解し，ＢＡＰで脱リン酸化し，開環したベクタ
ーをＴ×ＣＳs 内に納まっているＴ−ＤＮＡの構造遺伝
子より分離する。表１３のＴ10.2で挙げたプラスミドを
Nde Iで分解し，表１２のＴ9.1の構造遺伝子をアガロー
スゲル電気泳動により表１３のＴ10.4kbpの断片として
単離してゲルから溶出させる。さらにタウマチンをコー
ドしている断片を実施例４．３で述べたように単離す
る。開環したＴ×ＣＳベクターと単離した外来遺伝子を
ここで思い通りに組合わさるような方法でそれぞれと混
ぜ，互いに連結させる。連結混合液を個々にＷＢ373 を
形質転換し，ＲＦを得られた形質転換体から単離し，制
限酵素分析を行う。内在Ｔ−ＤＮＡ構造遺伝子を欠き，
Ｔ×ＣＳ内に挿入された外来構造遺伝子１コピーを有
し，この外来構造遺伝子とこのＴ×ＣＳが植物細胞内で
Ｔ×ＣＳ支配下でこの遺伝子が発現できるような方向に
互いにあるように，各形質転換からコロニーを選ぶ。

【０２０１】６．２ 植物形質転換ベクターの組立て Ｔ×ＣＳ／外来構造遺伝子の結合物を BamHIで分解し，
アガロースゲル電気泳動し，溶出させることにより，実
施例６．１で構築したＭ13を基礎とするベクターから除
去できる。Ｔ×ＣＳ／遺伝子の結合物を， BamHI，Bcl
I，Bgl II，MboI，あるいはSau 3AI で生じる 5'GATC ・
・・3' 粘着末端に直接挿入できる。他に，粘着末端を平
滑末端に変換し平滑末端連結を行ったり，あるいは適当
なオリゴヌクレオチドリンカーを用いたりすることによ
り，結合物をどんな望む制限酵素部位にでも挿入でき
る。

【０２０２】６．３ ベクターの選択，形質転換，植物
再生 Ｔ×ＣＳ／遺伝子の結合物を挿入しようとする植物の形
質転換ベクターは，ＴＩＰプラスミド，ＴＩＰプラスミ
ドに新奇なＤＮＡを導入するためのシャトルベクター，
あるいは，サブＴＩＰプラスミド，例えばミニ−Tiある
いはミクロ−TiというようなＴＩＰを基礎にした系であ
る。他に，ＤＮＡウイルスを基礎としたベクター，ミニ
クロモソーム，トランスポソン，そして植物染色体への
相同性を利用したあるいは利用しない組み換えが利用さ
れている。初めに形質転換しようとする植物細胞へのど
んな伝達様式も使え，それはＴ×ＣＳ／遺伝子結合物を
挿入する特定の植物の形質転換ベクターに適用なもので
ある。伝達のこういう型は，アグロバクテリウム細胞か
らの転送，ベクターを含んでいるリポゾームあるいはバ
クテリアのスフェロプラストとの融合，核酸の直接的な
取込み，ウィルスコートタンパク質への封入に続く感染
様過程，あるいはミクロインジェクシェンということを
含む。

【０２０３】初めに形質転換した植物細胞を増やし，植
物の形質転換ベクターや用いている伝達様式に適当な当
該分野で知られているどのような方法ででも植物組織や
植物全体を生産するのに用いる。ＴＩＰを基礎にした形
質転換系に適当な方法は，エム．−ディー．チルトン等
（1982）ネイチャー 295:432-434 （M.-D. Chiltonet
al．（1982) Nature 295 : 432-434）でにんじんに対
してや，ケイ．エイ．バートン等（1983）セル 32 : 1
033-1043（K.A.Barton et al．（1983) Cell32 : 103
3-1043 ）でタバコに対してや，そして背景で議論した
他のいろいろな参考文献，例えばひまわりについて，な
どで述べられているものを含む。形質転換された細胞を
選抜することは，薬剤や背景で述べた選択マーカー（Ｔ
ＩＰプラスミドの操作），あるいは約10μｇ／ mlのＳ
−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）や
ocs遺伝子（ジー．エイ．ダールおよびジェイ．テンプ
（1983）ティーエイチイーオーアール．エイピーピーエ
ル．ジーイーエヌイーティー．66 : 233-239，およびジ
ー．エイ．ダール等，ユーエス アプリケーションエス
イーアール．エヌオー．532,280 （G.A.Dahl α J.Tem
pe (1983) Theor.Appl.Genet. 66 : 233-239, および
G.A. Dahl et al., US application ser.no.532,280)
）を用いて行う。的確な薬剤，濃度，植物組織，植物
種，そして栽培変種は注意して適合させ，再生能力や効
果的な選抜を目的として選ばなければならない。外来構
造遺伝子を発現する組織に対して形質転換した組織をふ
るいにかけることは，ミクロ−ＥＬＩＳＡ（enzyme-lin
ked immuno-sorbantassay,酵素に連関したイムノソルベ
ントアッセイ）を含む免疫学的手法，これは免疫化学の
分野の当業者によく知られた技術で，そしてＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動後抗体を用いる“ウェスタ
ン”ブロット（例えば，アール．ピー．レゴッキおよび
ディー．ピー．エス．バーマ（1981）エイエヌエイエル
ワイティー．ビーアイオーシーエイチイーエム．111 :
385-392 （R.P.Legockiα D.P. S.Verma (1981) Analy
t.Biochem.111 : 385-392）で述べられているように）
により行う。サザン，ノザン（例えば，ピー．エス．ト
ーマス（1980）ピーアールオーシー．エヌエイティーエ
ル．エイ．シーエイディー．エスシーアイ．ユーエスエ
イ 77:5201-5205（P.S.Thomas (1980) Proc.Natl.Aca
d.Sci. USA 77 :5201-5205)）そしてドットブロット，
これらは分子生物学の分野の当業者にはよく知られた方
法であるが，を取り込まれたＤＮＡおよび発現したＲＮ
Ａを検出するのに使用できる。＜実施例７＞この実施例
は，実施例３，４および６で述べられている多くのうち
の１つで，特異的な構築法を提供する。特に，それはバ
チルス・チューリンゲンシス結晶性タンパク質の構造遺
伝子を， oＴ−ＤＮＡ ＯＲＦ19遺伝子のプロモーター
およびポリアデニル化部位の支配下で植物細胞内で転写
される BamHI断片に挿入することを述べている。

【０２０４】７．１ oＴ−ＤＮＡのｍＷＢ2341（Nd
e）へのサブクローニング pTi15955 ＤＮＡをアグロバクテリウム・チューメファ
シエンスATCC 15955より単離し，Sma IとXba Iとで完全
分解する。５’の突出している末端をエセリシア・コリ
ーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントと適当
なヌクレオチド３リン酸と保温し平滑末端に変換する。
生じたＤＮＡ断片の混合液をアガロース電気泳動で分離
し，6.8kbpの断片をゲルから溶出する。

【０２０５】Ｍ13を基礎としたベクターｍＷＢ2341（Nd
e）の複製型（ＲＦ）の共有結合的閉環状ＤＮＡ(cccＤ
ＮＡ）を単離し，EcoRIとHind IIIで分解する。生じた
粘着末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメン
トと保温して平滑末端に変換し，５'のリン酸を細菌ア
ルカリホスファターゼ(ＢＡＰ)と保温し除去する。生じ
た線状化ベクターをゲル電気泳動で精製し，上記で単離
したＴ−ＤＮＡ断片と混合し，連結させる。生じた混合
液でエセリシア・コリーＷＢ373を形質転換後，ウイル
ス型ＤＮＡとＲＦを形質転換体より単離し，図１〜図１
９で示してあるようにＯＲＦ11, 18および19の完全なＤ
ＮＡ配列を有する配列に一本鎖ウイルス型のときに相補
的な挿入体の存在を制限酵素やハイブリダイゼーション
を用いた分析によりふるいにかける。選んだコロニーに
感染するようなウイルスをｍＲＬとする。

【０２０６】７．２ oＴ−ＤＮＡから内部にある Bam
HI部位の除去 ｍＲＬ1 をオリゴヌクレオチド CGGTAAAAAGGAGCCCTGAAA
GCG にハイブリダイゼーションさせた後，プライマーを
伸張しｍＲＬより調製する。この操作は後の操作で不都
合となる固有の BamHI部位を除去する。この部位をオリ
ゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）のウイルス
型ｍＲＬにハイブリダイゼーションにより除去し，エセ
リシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグ
メント，全４ヌクレオチド３リン酸，とＤＮＡリガーゼ
とともにプライマー／ウイルスＤＮＡの複合体を保温
し，生じる cccＤＮＡ分子を増加させ，ＷＢ373 を形質
転換し，形質転換体を選抜し，そしてＲＦを単離し，望
まない制限酵素部位がなくなっているクローンを同定す
るため制限酵素分析する。これらの手順を除去しようと
する各部位について反復する。

【０２０７】７．３ oＴ−ＤＮＡ内に新たなNde Iと
BamHI部位の設置 ｍＯＲＦ19を，オリゴヌクレオチド CAAATTCCGGATCCCAG
CGAAGTTG, CCTACTGACATATGTTACAAAAATGTTGTCTC, CAGGGT
GGTGTAGCATGCGCACCCCATATGTAATTAACTG, CCATGTTTGCACGG
ATCCTGATTTCGに上記および実施例５で述べたようにハイ
ブリダイゼーションさせた後，プライマーを伸張させる
ことによりｍＲＬ1 より調製する。このことは，Nde I
部位（5'・・・CATATG・・・3' ）を翻訳開始部位（ＡＴＧ）
および翻訳停止部位（ＴＡＡ，ＴＧＡ，あるいはＴＡ
Ｇ）の近くに導入するという効果と，転写開始とポリア
デニル化部位から約 0.3kbp のところに，側面にあるＴ
−ＤＮＡ遺伝子の配列に BamHI部位（5'・・・GGATCC・・・3'
）を導入するという効果を有する。

【０２０８】７．４ ｍＷＢ2341（Nde ）への結晶性タ
ンパクの構造遺伝子のサブクローニング 結晶性タンパク質は，NRRL B-15612より単離できるプラ
スミド p123/58-10 にある。p123/58-10をHind IIIで完
全分解し，突出末端をエセリシア・コリーＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノーフラグメントと保温し除去する。電
気泳動による分離後，アガロースゲルより溶出し，6.6k
bp ＤＮＡ断片を単離する。生じた断片を実施例３．１
で述べたように調製した脱リン酸化した平滑末端の線状
化ｍＷＢ2341（Nde）と混合し，連結させて，エセリシ
ア・コリーＷＢ373 を形質転換する。ウイルスＤＮＡと
ＲＦを形質転換体より単離し，ｍＲＮＡにあるときのよ
うに一本鎖のウイルス型のとき配列に相補的である挿入
体の存在を確かめるため制限酵素とハイブリダイゼーシ
ョンによる分析でふるいにかける。選択したコロニーに
感染するウイルスを mBtCPとする。

【０２０９】７．５ 結晶性タンパク質構造遺伝子の側
面へのNde I部位の設置 実施例７．２と５で述べたように mBtCPを，オリゴヌク
レオチド GGAGGTAACATATGGATAACAATCCG と GCGGCAGATTA
ACGTGTTCATATGCATTCGAG にハイブリダイゼーション後プ
ライマーを伸張させて mBtCP1 を調製するために用い
る。このことは，翻訳開始部位や翻訳停止部位近傍にNd
e Iを導入できる効果を有する。構造遺伝子内には他の
方法で除去できるような BamHIあるいはNde I部位はな
い。翻訳停止コドン（ＴＡＡ）をもまた導入する。結晶
性タンパク質構造遺伝子は，mBtCP1をNde Iで完全分解
後 2.8kbp ＤＮＡ断片として単離できる。

【０２１０】７．６ ＯＲＦ19Ｔ×ＣＳ／結晶性タンパ
ク質の構造遺伝子の結合物の組立て ｍＯＲＦ19をNde Iで分解し，ＢＡＰで脱リン酸化し，
開環したベクターをＴ×ＣＳ内に納まっているＴ−ＤＮ
Ａ構造遺伝子から単離できる。

【０２１１】mBtCP1 をNde Iで分解し，結晶性タンパク
質の構造遺伝子をアガロースゲル電気泳動後ゲルから溶
出して 2.8kbp の断片として単離する。開環したＯＲＦ
19Ｔ×ＣＳベクターと単離した結晶性タンパク質構造遺
伝子をここで混合し，互いに連結させる。連結溶液でＷ
Ｂ373 を形質転換し，ＲＦを生じた形質転換体より単離
し，制限酵素分析で性格づける。ＯＲＦ19構造遺伝子を
欠き，植物細胞内でＴ×ＣＳの支配下で遺伝子が発現す
るような互いの位置関係にある結晶性タンパク質とＴ×
ＣＳで，ＯＲＦ19 Ｔ×ＣＳ内に挿入されている結晶性
タンパク質構造遺伝子を唯一だけコピーを保有する，コ
ロニーを選択する。

【０２１２】７．７ 植物の形質転換ベクターの組立て ＯＲＦ19 Ｔ×ＣＳ／結晶性タンパク質構造遺伝子の結
合体を， BamHIで分解後アガロースゲル電気泳動をし溶
出させて，実施例７．５で構築したＭ13を基礎とするベ
クターより除去する。ＯＲＦ19Ｔ×ＣＳ／結晶性タンパ
ク質遺伝子の結合体を，BamHI，Bcl I，Bgl II，Mbo
I，あるいはSau 3AIで生じる5'GATC ・・・3'の粘着末端に
直接挿入する。他に，粘着末端を平滑末端に変換し平滑
末端で連結させることにより，あるいは適当なオリゴヌ
クレオチドリンカーを用いることにより，結合体を，望
む制限酵素部位に挿入できる。ベクターの選択，形質転
換，そして植物再生は実施例６．３で述べられている。

【０２１３】アグロバクテリウム・チューメファシエン
ス ATCC 15955に発見されたオクトピン型Tiプラスミド
のＴ−ＤＮＡの配列を開示した。真核プロモーター，リ
ボゾーム結合部位，およびポリアデニル化部位に接する
14のオープンリーディングフレームが見つかった。 pTi
15955 のプロモーターおよびポリアデニル化部位を外来
構造遺伝子の発現制御への利用を，ファセオラス・ブル
ガリスの貯蔵タンパクのファセオリン，ファセオラス・
ブルガリスのレクチン，タウマチン，およびバチルス・
チューリンゲンシスの結晶タンパクの構造遺伝子を例に
して示した。構造遺伝子およびＴ−ＤＮＡの配列の操作
に有効なベクターをもまた提供した。

【図面の簡単な説明】

【図１】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図２】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図３】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図４】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図５】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図６】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図７】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図８】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図９】アグロバクテリウム・チューメファシエンスの
オクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を示
す図である。

【図１０】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１１】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１２】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１３】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１４】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１５】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１６】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１７】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１８】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図１９】アグロバクテリウム・チューメファシエンス
のオクトピン型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡの塩基配列を
示す図である。

【図２０】このＴ−ＤＮＡの制限酵素地図，遺伝子座，
オープンリーディングフレーム（矢印）を示す図であ
る。

【図２１】Ｔ−ＤＮＡのステム−ループの存在場所およ
びオープンリーディングフレームを示す図である。

【図２２】ここで作成した種々プラスミドの作成の系統
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） 7804−4Ｂ (72)発明者 ジョン ディ．ケンプ アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53719 マジソン，ハンマースレー ロード 6733

Claims (72)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモーター，外来構造遺伝子およびポ
   リアデニル化部位を含むように細胞の形質転換により植
   物細胞を遺伝的に修飾する方法であって，(a)該プロモ
   ーター，該構造遺伝子および該ポリアデニル化部位は互
   いに，該構造遺伝子が該プロモーターと該ポリアデニル
   化部位との支配下で形質転換可能な植物細胞内で発現し
   うるような位置と方向にあり，(b)該プロモーターおよ
   び該ポリアデニル化部位のうちの少なくとも一方がＯＲ
   Ｆ１，４，５，９，10, 18, 19, 21, 24, 25および26か
   ら成る群から選択されたオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ遺伝子
   またはそれと相同性のある遺伝子であるＴＩＰ遺伝子か
   ら得られる，植物細胞を遺伝的に修飾する方法。
2. 【請求項２】 前記ＴＩＰ遺伝子がオクトピン型Tiプラ
   スミドである，請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記Tiプラスミドが pTi15955 である，
   請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記プロモーター，前記構造遺伝子，ま
   たは前記ポリアデニル化部位が，１つまたはそれ以上の
   ヌクレオチド対の挿入，欠失または置換を含む，請求項
   １に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記構造遺伝子が極端な高温または低温
   に対し改良された耐性の表現型を示す，請求項１に記載
   の方法。
6. 【請求項６】 前記構造遺伝子が乾燥または浸透圧の抑
   圧に対して改良された耐性の表現型を示す，請求項１に
   記載の方法。
7. 【請求項７】 前記構造遺伝子が昆虫，節足動物，線形
   動物，または着生植物に対して改良された耐性あるいは
   抵抗性の表現型を示す，請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記構造遺伝子がバチルス・チューリン
   ゲンシスの結晶タンパクと同じ，あるいはそれに由来す
   る殺虫毒素をコードし，そして該オクトピン型Ｔ−ＤＮ
   Ａ遺伝子がＯＲＦ１，９，18, 19, 21, 25, および26か
   ら成る群から選択される，請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記構造遺伝子がかび，細菌，またはウ
   イルス病に対して改良された耐性または抵抗性の表現型
   を示す，請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記構造遺伝子が新規２次代謝物の生
    産の酵素をコードするか，または関与する，請求項１に
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記構造遺伝子が改良された栄養，芳
    香，またはプロセッシングの特性を示す，請求項１に記
    載の方法。
12. 【請求項１２】 前記構造遺伝子が貯蔵タンパクをコー
    ドする，請求項11に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記貯蔵タンパク遺伝子がファセオリ
    ン遺伝子とハイブリダイズし得る，請求項12に記載の方
    法。
14. 【請求項１４】 前記構造遺伝子が甘味タンパクをコー
    ドする，請求項11に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記甘味タンパクがタウマチンまたは
    タウマチンの前駆体である，請求項14に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記構造遺伝子がレクチンをコードす
    る，請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記レクチンがマメレクチンである，
    請求項16に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記構造遺伝子が変化した形態上の性
    質または発達様式の表現型を示す，請求項１に記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 前記構造遺伝子が雄性不稔の表現型を
    示す，請求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記構造遺伝子が改良された光合成効
    率の表現型を示す，請求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記構造遺伝子が改良された窒素固定
    の表現型を示す，請求項１に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記構造遺伝子が改良された栄養素取
    込みの表現型を示す，請求項１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記構造遺伝子が除草剤に対して改良
    された抵抗性または耐性，他の植物との改良された競
    合，あるいは増大した作物収率の表現型を示，す請求項
    １に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記構造遺伝子が改良された生殖質同
    一性の表現型を示，す請求項１に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記構造遺伝子が選択剤に対して細胞
    内でまたは組織培養で耐性の表現型を示す，請求項１に
    記載の方法。
26. 【請求項２６】 プロモーターおよびポリアデニル化部
    位によりフランクされた非Ｔ−ＤＮＡの外来構造遺伝子
    を含む形質転換可能な植物細胞であって，(a)該プロモ
    ーター，該構造遺伝子および該ポリアデニル化部位は互
    いに，該構造遺伝子が該プロモーターと該ポリアデニル
    化部位との支配下で該植物細胞内で発現しうるような位
    置と方向にあり，(b)該プロモーターおよび該ポリアデ
    ニル化部位のうちの少なくとも一方がＯＲＦ１，４，
    ５，９，10, 18, 19, 21, 24, 25および26から成る群か
    ら選択されたオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ遺伝子またはそれ
    と相同性のある遺伝子であるＴＩＰ遺伝子から得られ
    る，形質転換可能な植物細胞。
27. 【請求項２７】 前記ＴＩＰ遺伝子がオクトピン型Tiプ
    ラスミドである，請求項26に記載の植物細胞。
28. 【請求項２８】 前記植物細胞が双子葉類の植物細胞で
    ある，請求項26に記載の植物細胞。
29. 【請求項２９】 プロモーターおよびポリアデニル化部
    位によりフランクされたＴ−ＤＮＡの外来構造遺伝子を
    含む形質転換可能な植物細胞を有する植物組織であっ
    て，(a)該プロモーター，該構造遺伝子および該ポリア
    デニル化部位は互いに，該構造遺伝子が該プロモーター
    と該ポリアデニル化部位との支配下で該植物細胞内で発
    現しうるような位置と方向にあり，(b)該プロモーター
    および該ポリアデニル化部位のうちの少なくとも一方が
    ＯＲＦ１，４，５，９，10, 18, 19, 21, 24, 25および
    26から成る群から選択されたオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ遺
    伝子またはそれと相同性のある遺伝子であるＴＩＰ遺伝
    子から得られる，形質転換可能な植物細胞を有する植物
    組織。
30. 【請求項３０】 前記ＴＩＰ遺伝子がオクトピン型Tiプ
    ラスミド由来である，請求項29に記載の植物組織。
31. 【請求項３１】 前記TiプラスミドがpTi15955 由来で
    ある，請求項30に記載の植物組織。
32. 【請求項３２】 前記プロモーター，該構造遺伝子また
    は該ポリアデニル化部位が１つのまたはそれ以上の塩素
    対の挿入，欠失，または置換を含む，請求項29に記載の
    植物組織。
33. 【請求項３３】 前記構造遺伝子が極端な高温または低
    温に対して改良された耐性の表現型を示す，請求項29に
    記載の植物組織。
34. 【請求項３４】 前記構造遺伝子が乾燥または浸透圧抑
    圧に対して改良された耐性の表現型を示す，請求項29に
    記載の植物組織。
35. 【請求項３５】 前記構造遺伝子が昆虫，節足動物，線
    形動物，または着生植物に対し改良された抵抗性または
    耐性の表現型を示す，請求項29に記載の植物組織。
36. 【請求項３６】 前記構造遺伝子がバチルス・チューリ
    ンゲンシスの結晶タンパクと同一，またはそれに由来す
    る殺虫毒素をコードし，該オクトピン型Ｔ−ＤＮＡがＯ
    ＲＦ１，９，18, 19, 21, 25および26からなる一群から
    選択された，請求項35に記載の植物組織。
37. 【請求項３７】 前記構造遺伝子がかび，細菌，または
    ウイルス病に対し改良された抵抗性または耐性の表現型
    を示す，請求項29に記載の植物組織。
38. 【請求項３８】 前記構造遺伝子が新規２次代謝物の生
    産の酵素をコードするか，またはそれに関与する，請求
    項29に記載の植物組織。
39. 【請求項３９】 前記構造遺伝子が改良された栄養，芳
    香，またはプロセッシング特性の表現型を示す，請求項
    29に記載の植物組織。
40. 【請求項４０】 前記構造遺伝子が貯蔵タンパクをコー
    ドする，請求項29に記載の植物組織。
41. 【請求項４１】 前記貯蔵タンパク遺伝子がファセオリ
    ン遺伝子とハイブリダイズし得る，請求項40に記載の植
    物組織。
42. 【請求項４２】 前記構造遺伝子が甘味タンパクをコー
    ドする，請求項39に記載の植物組織。
43. 【請求項４３】 前記甘味タンパクがタウマチン，また
    はタウマチンの前駆体である，請求項42に記載の植物組
    織。
44. 【請求項４４】 前記構造遺伝子がレクチンをコードす
    る，請求項39に記載の植物組織。
45. 【請求項４５】 前記構造遺伝子が変化した形態上の性
    質または発達様式の表現型を示す，請求項29に記載の植
    物組織。
46. 【請求項４６】 前記構造遺伝子が雄性不稔の表現型を
    示す，請求項29に記載の植物組織。
47. 【請求項４７】 前記構造遺伝子が改良された光合成効
    率の表現型を示す，請求項29に記載の植物組織。
48. 【請求項４８】 前記構造遺伝子が改良された窒素固定
    の表現型を示す，請求項29に記載の植物組織。
49. 【請求項４９】 前記構造遺伝子が改良された栄養源取
    込みの表現型を示す，請求項29に記載の植物組織。
50. 【請求項５０】 前記構造遺伝子が除草剤に対して改良
    された抵抗性または耐性，他の植物との改良された競
    合，または増大した作物収率の表現型を示す，請求項29
    に記載の植物組織。
51. 【請求項５１】 前記構造遺伝子が改良された生殖質同
    一性の表現型を示す，請求項29に記載の植物組織。
52. 【請求項５２】 前記構造遺伝子が選択剤に対して細胞
    内でまたは植物組織培養で抵抗性の表現型を示す，請求
    項29に記載の植物組織。
53. 【請求項５３】 前記植物が裸子植物である，請求項29
    に記載の植物組織。
54. 【請求項５４】 前記植物が単子葉類である，請求項29
    に記載の植物組織。
55. 【請求項５５】 前記植物が双子葉類である，請求項29
    に記載の植物組織。
56. 【請求項５６】 プロモーターおよびポリアデニル化部
    位によりフランクされたＴ−ＤＮＡの外来構造遺伝子を
    含む形質転換可能な植物細胞を有する再生可能な植物で
    あって，(a)該プロモーター，該構造遺伝子および該ポ
    リアデニル化部位は互いに，該構造遺伝子が該プロモー
    ターと該ポリアデニル化部位との支配下で該植物細胞内
    で発現しうるような位置と方向にあり，(b)該プロモー
    ターおよび該ポリアデニル化部位のうちの少なくとも一
    方がＯＲＦ１，４，５，９，10, 18, 19, 21, 24, 25お
    よび26から成る群から選択されたオクトピン型Ｔ−ＤＮ
    Ａ遺伝子またはそれと相同性のある遺伝子であるＴＩＰ
    遺伝子から得られ，天然に存在し，および／またはあま
    り修飾されていない植物と該遺伝的に修飾された植物と
    を区別して同定可能な表現型を伝える遺伝子を含み，そ
    して発現する，形質転換可能な植物細胞を有する再生可
    能な植物。
57. 【請求項５７】 前記Ｔ−ＤＮＡ遺伝子が pTi15955 由
    来である，請求項56に記載の植物。
58. 【請求項５８】 前記プロモーター，該構造遺伝子また
    は該ポリアデニル化部位が１つまたはそれ以上の塩基対
    の挿入，欠失，または置換を含む，請求項56に記載の植
    物。
59. 【請求項５９】 前記構造遺伝子が極端な高温または低
    温に対して改良された耐性の表現型を示す，請求項56に
    記載の植物。
60. 【請求項６０】 前記構造遺伝子が乾燥，または浸透圧
    抑圧に対して改良された耐性を示す，請求項56に記載の
    植物。
61. 【請求項６１】 前記構造遺伝子が昆虫，節足動物，線
    形動物，または着生植物に対して改良された抵抗性また
    は耐性の表現型を示す，請求項56に記載の植物。
62. 【請求項６２】 前記構造遺伝子が結晶タンパクのすべ
    てまたは一部をコードし，該オクトピン型Ｔ−ＤＮＡが
    ＯＲＦ１，９，18, 19, 21, 25および26からなる一群か
    ら選択される，請求項61に記載の植物。
63. 【請求項６３】 前記構造遺伝子がかび，細菌またはウ
    イルス病に対して改良された抵抗性または耐性の表現型
    を示す，請求項56に記載の植物。
64. 【請求項６４】 前記構造遺伝子が新規２次代謝物の生
    産の酵素をコードする，またはそれに関与する，請求項
    57に記載の植物。
65. 【請求項６５】 前記構造遺伝子が改良された栄養，芳
    香，またはプロセッシングの特性の表現型を示す，請求
    項56に記載の植物。
66. 【請求項６６】 前記構造遺伝子が種子貯蔵タンパク，
    植物レクチン，タウマチン，およびタウマチンの前駆体
    よりなる一群から選択されたタンパクのすべてまたは一
    部をコードする，請求項65に記載の植物。
67. 【請求項６７】 前記構造遺伝子が変化した形態上の性
    質，変化した発達様式，雄性不稔，改良された光合成効
    率，改良された窒素固定，または改良された栄養源取込
    みの表現型を示す，請求項56に記載の植物。
68. 【請求項６８】 前記構造遺伝子が除草剤に対して改良
    された抵抗性または耐性，他の植物との改良された競
    合，増大した作物収率，または改良された生殖質同一性
    の表現型を示す，請求項56に記載の植物。
69. 【請求項６９】 前記構造遺伝子が選択剤に対して細胞
    内で，または植物組織培養で抵抗性の表現型を示す，請
    求項56に記載の植物。
70. 【請求項７０】 前記植物が裸子植物である，請求項56
    に記載の植物。
71. 【請求項７１】 前記植物が単子葉類である，請求項56
    に記載の植物。
72. 【請求項７２】 前記植物が双子葉類である，請求項56
    に記載の植物。