JPH08501214A

JPH08501214A - バチルス・チュリンゲンシスの新菌株及び殺虫作用をもつそのタンパク質

Info

Publication number: JPH08501214A
Application number: JP6506777A
Authority: JP
Inventors: ランベルト，バルト; ヤンセンス，ステファン; ファン・アウデンホーフェ，カトリエン; ペフェロエン，マルニクス
Original assignee: Plant Genetic Systems NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1992-08-27
Filing date: 1993-07-12
Publication date: 1996-02-13
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: ES2250962T3; HU221339B1; AU4567693A; US7888471B2; US5885571A; WO1994005771A3; AU677956B2; HK1014374A1; ATE307879T1; HUT70296A; EP0654075B1; CA2143296C; CA2143296A1; US20090192290A1; HU9500573D0; WO1994005771A2; DE69333893D1; US20050097635A1; US7361751B2; EP0654075A1

Abstract

(57)【要約】受託番号ＬＭＧＰ−１２５９２、ＬＭＧＰ−１２５９３、ＬＭＧＰ−１２５９４及びＬＭＧＰ −１３４９３としてＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託された４つの新規なバチルス・チュリンゲンシス菌株は、鱗翅目、より特定的にはSpodoptera種及びAgrotisipsilonのようなヤガ科、Ostrinia nubilalisのようなメイガ科及びPlutella xylostellaのようなスガ科に対する毒性をもち、しかも新規の遺伝子によりコードされる新しい結晶タンパク質を胞子形成中に産生する。この結晶タンパク質は、トリプシン消化産物としてトキシンを生成することのできるプロトキシンを含んでいる。いずれか１つの菌株に由来し、それぞれのトキシンをコードするＤＮＡ配列で形質転換されたゲノムを有する植物は、鱗翅目に対して耐性をもつ。各々の菌株自体、又はその結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又はトキシンは、鱗翅目を撲滅するため、殺虫性組成物中の有効成分として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】バチルス・チュリンゲンシスの新菌株及び殺虫作用をもつそのタンパク質本発明は、バチルス・チュリンゲンシス（Bacillusthuringiensis）の４つの新しい菌株（「ＢＴＳ０２６１７Ａ菌株」、「ＢＴＳ０２６１８Ａ菌株」、「ＢＴＳ０２６５４Ｂ菌株」及び「ＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株」）に関し、それらは胞子形成中に、結晶（それぞれ「ＢＴＳ０２６１７Ａ結晶」、「ＢＴＳ０２６１８Ａ結晶」、「ＢＴＳ０２６５４Ｂ結晶」及び「ＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶」）の中に包まれている、結晶化されたタンパク質（それぞれ「ＢＴＳ０２６１７Ａ結晶タンパク質」、「ＢＴＳ０２６１８Ａ結晶タンパク質」、「ＢＴＳ０２６５４Ｂ結晶タンパク質」及び「ＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶タンパク質」）を各々産生する。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株は、ベルギー微生物調和収集物（Collection Laboratorium voor Microbiologie Belgium (「BCCM-LMG」), R.U.G., K. Ledeganckstraat 35,B-900 0 Gent）に、ブタペスト条約の規定要件に基づいて寄託されている。本発明はさらに、鱗翅目に対して活性をもち、しかも有効成分としてＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、又は好ましくはＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶、その結晶タンパク質又は有効構成要素を含有する殺虫作用をもつ組成物にも関する。本発明はさらに、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株のゲノムの中に存在し、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶の中に見い出される殺虫作用のあるタンパク質（「ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン」）をコードする遺伝子（ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」）にも関する。ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンは、そのぞれぞれのＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶中に包まれる前にＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株によって産生されるタンパク質である。本発明はさらに、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンから（例えばトリプシン消化によって）得ることのできるトキシン（「ＢＴＳ０２６１８Ａトキシン」）にも関する。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、それぞれＢＴＳ０２６１７Ａ菌株、ＢＴＳ０２６１８Ａ菌株、ＢＴＳ０２６５４Ｂ菌株及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株によって産生されるＢＴＳ０２６１７Ａ結晶、ＢＴＳ０２６１８Ａ結晶、ＢＴＳ０２６５４Ｂ結晶及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶から遊離されうる、殺虫剤として活性なタンパク質である。このトキシン及びそのプロトキシンは、広範囲の鱗翅目昆虫、特にヤガ科、特にSpodoptera及びAgrotis種に対してのみならず、メイガ科、特にヨーロッパコーン穿孔虫、Ostrinia nubilalis、及びPlutellaxylost ella のようなスガ科といったその他の重要な鱗翅目の毘虫に対しても、高い活性を有する。ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及びトキシン（「（プロ）トキシン」と呼ぶ）のもつこの新しい特徴、すなわち、ヤガ科、スガ科及びメイガ科のような経済的に重要なさまざまな鱗翅目昆虫に対する活性の組合せにより、この（プロ）トキシンは、これらの昆虫と接触させること、例えば植物関連細菌又は植物内でｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を発現させるか又は噴霧することによって広範な害虫を撲滅するために理想的に適した化合物である。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、鱗翅目に対して殺虫剤として有効であるＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの最小部分を表わすと考えられている。本発明はさらに、以下の作働可能な形で連結されたＤＮＡフラグメントを含む、植物細胞を形質転換するのに使用できるキメラ遺伝子にも関する：１）ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫剤として有効な部分をコードするｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の一部分（「殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分」）、好ましくは、ＢＴＳ０２６１８ＡトキシンだけをコードするｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の短縮部分（「短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」）；２）殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分の植物細胞内での転写に適したプロモーター；及び３）殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を植物細胞中で発現させるための適当な３′末端の転写物形成及びポリアデニル化シグナル。このキメラ遺伝子を、以下一般に「ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子」と呼ぶ。本発明は同様に、以下のものに関する：１）殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子で形質転換されたゲノムを有するトウモロコシ又は綿のような植物の細胞（「形質転換された植物細胞」）；及び２）殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子を含むゲノムを有し、鱗翅目に対して耐性をもつ、形質転換された植物細胞から再生されるか、又はこのようにして再生された植物及びその種子から産生される植物（「形質転換された植物」）。本発明はさらに又、以下のものにも関する：１）ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部で形質転換されたゲノムを有する、B.thuringiensis又はPseudomonas種のような微生物；及び、２）ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部で形質転換されたゲノムを含む微生物胞子。発明の背景 B.thuringiensis（「Ｂｔ」）は、胞子形成時点で内包性結晶を産生するグラム陽性菌である。これらの結晶は昆虫の幼虫に対して特異的に有毒なタンパク質で構成されている。これらの結晶タンパク質及び対応する遺伝子は、その構造及び殺虫スペクトルに基づいラスとしては、鱗翅目特異性遺伝子（ｃｒｙＩ）、鱗翅目及び双翅目特異性遺伝子（ｃｒｙII）、鞘翅目特異性遺伝子（ｃｒｙIII）及び双翅目特異性遺伝子（ｃｒｙIV）がある。大規模にＢｔ胞子を産生するのに、従来の液内発酵技術を使用することができるという事実により、Ｂｔ菌は、殺虫組成物の供給源として商業的に魅力あるものとなっている。これまで、殺虫作用あるタンパク質をコードするいくつかのＢｔ菌株からの遺伝子フラグメントが同定され、植物に昆虫耐性を付与するため植物ゲノム内に組込まれてきた。しかしながら、植物の中でかかるＢｔ遺伝子フラグメントの発現を得ることは、簡単な方法ではない。植物細胞内で殺虫タンパク質の最適な発現を達成するためには、その標的昆虫に対する実質的な毒性を保持するＢｔプロトキシンの一部分をコードするように、特異的な方法で各々のＢｔ遺伝子フラグメントを工学処理することが必要であるということが発見されてきた（欧州特許出願（「ＥＰＡ」）８６／３００，２９１．１及び８８／４０２，１１５．５号；米国特許出願８２１，５８２号、１９８６年１月２２日提出）。発明の要約本発明に従うと、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株という４つの新しいＢｔ菌株が提供される。胞子形成中に該菌株により産生されるＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶及び結晶タンパク質、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及びトキシン、及びＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫剤として有効な部分、ならびにこれらの結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、トキシン及び殺虫剤として有効なプロトキシン部分の等価物は、各々殺虫活性を有し、従って一般的に鱗翅目、特にヤガ科、例えば、Agrotis種(Agrotis ipsilonのようなヨトウムシ）、Mamestra種（例えばMamestra brassicaのようなコナガ）及びSpodoptera種（Spodoptera exiqua，Spodoptera frugiperda ，Spodoptera littoralis及びSpodoptera lituraのようなアワヨトウ）、メイガ科（例えばヨーロッパコーン穿孔虫、Ostrinianubilali s ）及びスガ科（例えばPlutella xylostella）のような、トウモロコシ、綿などの経済的に重要なさまざまな作物及びアブラナ属などの多くの野菜の主要な害虫に対する殺虫組成物の形態に処方することが可能である。同様に、本発明に従うと、植物細胞ゲノムは、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくは短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、又は修正された合成ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のようなその等価物で形質転換される。結果として得られる形質転換された植物細胞は、基本的に形質転換された植物細胞から成る形質転換された植物、その種子及びその植物細胞培養を生産するために使用できる。形質転換された植物の一部又は全ての組織の中の形質転換された細胞は、１）そのゲノム内に安定したインサートとして殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を含んでおり、２）そのＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫剤として有効な部分、好ましくはそのＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを産生することによって殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を発現し、かくして植物に鱗翅目に対する耐性を付与する。本発明の形質転換された植物細胞は同様に、回収目的でこのような殺虫作用があるＢｔタンパク質を産生させるためにも使用することができる。さらに本発明に従うと、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくは短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又はその等価物で、植物細胞ゲノムを形質転換することにより、植物に鱗翅目耐性を付与するための方法も提供される。これに関しては、植物細胞をｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子で形質転換することが好ましい。さらに本発明に従うと、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、かかるプロトキシンの殺虫剤として有効な部分及びＢＴＳ０２６１８Ａトキシン、ならびにＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの機能的部分ならびにｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及びキメラｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子ならびにその等価物が提供される。同様に、本発明に従うと、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又は殺虫剤として有効な部分、例えばトキシン、をコードする天然又は人工のＤＮＡ配列が提供される。同様に本発明に従うと、鱗翅目、特にヤガ科、メイガ科及びスガ科に対する殺虫組成物、及びかかる殺虫組成物を用いて、鱗翅目、特にヤガ科、メイガ科及びスガ科を防除する方法も提供され、かかる殺虫組成物には、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、結晶及び／又は結晶タンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン及び／又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分又はその等価物が提供される。発明の詳細な説明本発明のＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンは、受託番号ＬＭＧＰ−１２５９２としてＢＣＣＭ−ＬＭＧに１９９２年７月２日に寄託されたＢＴＳ０２６１７Ａ菌株、受託番号ＬＭＧＰ−１２５９３としてＢＣＣＭ−ＬＭＧに１９９２年７月２日に寄託されたＢＴＳ０２６１８Ａ菌株、受託番号ＬＭＧＰ−１２５９４としてＢＣＣＭ−ＬＭＧに１９９２年７月２日に寄託されたＢＴＳ０２６５４Ｂ菌株、又は受託番号ＬＭＧＰ−１３４９３としてＢＣＣＭ−ＬＭＧに１９９３年３月１日に寄託されたＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株から、通常の方法で分離することができる。例えば、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶は、それぞれの菌株の胞子形成させた培養から分離することができ（Mahilloｎ及びDelcour, （1986）の方法によって結晶から分離することができる。プロトキ的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製するために使用することができる。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンのプロテアーゼ（例えば、トリプシン）消化によって得ることができる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、通常の方法で分離できる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、１９８６年１月２２日に提出された米国特許出願８２１，５８２号及びＥＰＡ８６／３００，２９１．１号及び８８／４０２，１１５．５号（これらは本書に参考として内包される）に記述された手順を用い、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株中に同定することができる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、制限酵素で上述の菌株の１つからの全ＤＮＡを消化し、こうして産生されたＤＮＡフラグメントを５〜１０KbのＤＮＡ分画にサイズ分画し、これらの分画をクローニングベクターに連結し、そのクローニングべクターで形質転換されたE．coliを、ｃｒｙＩＧ遺伝子のある領域から構築されたＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることによって同定された（Smulevitch et al., 199 1; Gleave et al.,1992）。本書で用いる「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」という語には、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はトキシンをコードするＤＮＡ配列又は機能的に等価であるその変異体も含まれている。実際、遺伝コードの縮重のため、いくつかのアミノ酸コドンを、タンパク質のアミノ酸配列を変更することなく、その他のコドンと置換することが可能である。その上、タンパク質の殺虫活性を著しく変更することなく、いくつかのアミノ酸をその他の等価アミノ酸と置換することもできる。同様に、結合及び毒性に関連する領域以外の分子の領域内のアミノ酸組成の変化が、タンパク質の殺虫活性の差異をひき起こす可能性は比較的少ない。遺伝子のかかる等価物としては、配列番号４のＢＴＳ０２６１８Ａトキシン又はプロトキシンのＤＮＡ配列に対しハイブリッド形成し、しかも本発明のＢＴＳ０２６１８Ａ（プロ）トキシンと同じ殺虫特性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。ここで、「ハイブリダイゼーション」という語は、通常のハイブリダイゼーション条件、最も好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のことを指す。本書で用いられる「ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの機能的部分」という語は、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの少なくとも１つの機能的特性（例えば結合及び／又は毒性特性）をもつ新しいハイブリッドタンパク質を提供するため、別の（Ｂｔ）タンパク質に移行されうる特異的構造を有するトキシンのあらゆる部分又はドメインを意昧する（Ge et al., 1991）。このような部分は、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の結合及び／又は毒性特性をもつハイブリッドＢｔタンパク質の必須な構成を形成することができる。かかるハイブリッドタンパク質は、拡大した宿主範囲、改善された毒性を有する可能性があり、そして又は、昆虫の耐性増大を防ぐ１つの方法として使用できる（欧州特許公報（「ＥＰ」）４０８４０３；Visser etal., 1993）。代替的には、ＢＴＳ０２６１７Ａ又はＢＴＳ０２６１８Ａ又はＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の全ＤＮＡから調製された５〜１０Kbのフラグメントを、適当な発現ベクターに連結させ、E．coliを形質転換させることができ、次にクローンを、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンに対して生じさせたモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて、トキシンの発現に関して通常のコロニー免疫プローブ方法（French et al., 1986）によりスクリーニングすることができる。同様に、ＢＴＳ０２６１７Ａ又はＢＴＳ０２６１８Ａ又はＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の全ＤＮＡから調製された５〜１０Kbのフラグメントを、適当なＢｔシャトルベクター（Lereclus et al., 1992）に連結させ、結晶を産生しない〔結晶（−）〕Ｂｔ突然変異体を形質転換させることもできる。その後、クローンを、結晶（顕微鏡により検出される）又は結晶タンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される）の生産に関してスクリーニングする。このように同定されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、ＤＮＡ配列を得るため、通常の方法（Maxam及びGilbert, 1980）で配列決定された。サザンブロット法でのハイブリダイゼーション及び配列比較により、この遺伝子が以前に記述された鱗翅目に対する活性をもつプ 1989)とは異なるものであることがわかった。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の殺虫剤として有効な部分（そのプロトキシンの殺虫剤として有効な部分をコードする）、及びこの遺伝子の短縮部分（そのトキシンのみをコードする）は、遺伝子の配列分析の後、通常の方法で作ることができる。ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及びトキシンのアミノ酸配列は、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及び短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のＤＮＡ配列から決定された。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の「殺虫剤として有効な部分」又は「部分」というのは、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンより少ないアミノ酸しか持たないが、まだ鱗翅目に対して毒性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のことを意味する。 E．coli、他のＢｔ菌株及び植物の中でｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又は等価遺伝子の全部又は殺虫剤として有効な部分を発現させるため、各遺伝子又は遺伝子部分と隣接して適切な制限部位を導入することができる。これは、周知の手順（ Stanssens et al., 1989;White et al,1989）を用いて、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。植物内での改善された発現をうるためには、ＰＣＴ公報Ｗ０９１／１６４３２及びＷ０９３／９２１８；ＥＰ０，３５８，９６２及びＥＰ０，３５９，４７２に従って、等価の、修正された又は人工的な遺伝子又は遺伝子部分を形成するため、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又は殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分のコドン利用を修正することが好ましい場合もある。トウモロコシのような単子葉植物内での発現を増強するために、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子に対して単子葉植物イントロンを付加することもでき、また、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分のＤＮＡ配列を翻訳的にニュートラルな方法でさらに変更して、部位特異的イントロン挿入の方法を用いて、及び／又はコドン利用を特定の植物に最も好ましいものに適合させる（Murray etal, 1 989）といった、コドン利用に対する変更を導入することによって、コードされたアミノ酸配列を大幅に変えることなく、その遺伝子部分内に存在し、かつ阻害性を持ちうるＤＮＡ配列を修正することができる。ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫剤として有効な部分をコードする、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分又はその等価物、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子は、単一植物細胞の核ゲノムの中に通常の要領で安定した形で挿入することができ、昆虫耐性のある形質転換された植物を生産するため、このように形質転換された植物細胞を通常の方法で使用することができる。この点において、植物細胞を形質転換するために、Agrobacterium tumefaciens内の、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を含む無害化されたＴｉ−プラスミドを使用することができ、その後、例えばＥＰ０，１１６，７１８、ＥＰ０，２７０，８２２、ＰＣＴ公報ＷＯ８４／０２，９１３及び欧州特許出願（「ＥＰＡ」）８７／４００，５４４．０（これらも同様に本書に参考として内包される）及びGould et a l.（1991）の中で記述されている手順を用いて、形質転換された植物細胞から形質転換された植物を再生することができる。好ましいＴｉ−プラスミドベクターは各々、そのＴ−ＤＮＡの境界配列の間、又は少なくともその右側境界配列の左側に位置した状態で、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を含んでいる。当然のことながら、直接遺伝子トランスファー（例えばＥＰ０，２３３，２４７に記述されているもの）、花粉媒介形質転換（例えばＥＰ０，２７０，３５６、ＰＣＴ公報ＷＯ８５／０１８５６及び米国特許４，６８４，６１１に記されているもの）、植物ＲＮＡウイルス媒介形質転換（例えばＥＰ０，０６７，５５３及び米国特許４，４０７，９５６に記されているもの）、リポゾーム媒介形質転換（例えば米国特許４，５３６，４７５号に記されているもの）のような手順、及び最近記述されたトウモロコシの或る種の系統を形質転換するための方法（Fromm et al, 1990; Gordon-Kamm et al., 1990）及びイネの或る種の系統を形質転換するための方法（Shimamoto et al., 1989;Datta et al., 1990）及び最近記述された単子葉植物全般を形質転換するための方法（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０９６９６）のようなその他の方法を用いて植物細胞を形質転換するのに、その他のタイプのベクターを使用することも可能である。結果として得られる形質転換された植物は、同じ特徴をもつより多くの形質転換された植物を生産するため、又は同じか又は関連する植物種のその他の品種に殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を導入するため、通常の植物育種スキーマにおいて使用することができる。形質転換された植物から得られた種子は、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を安定したゲノミックインサートとして含んでいる。形質転換された植物の細胞は、通常の方法で培養して、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫剤として有効な部分、好ましくはＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを産生させることができ、それを通常の鱗翅目に対する殺虫剤組成物中で使用するため回収することができる（米国特許出願８２１，５８２；ＥＰＡ８６／３００２９１．１）。殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくは短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、挿入された遺伝子が、植物細胞内で遺伝子部分の発現を誘導することのできるプロモーターの下流（すなわち３′）で、このプロモーターの制御下にあるように植物細胞ゲノム中に挿入される。このことは、好ましくは植物細胞ゲノム内にｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子を挿入することによって達成される。好ましいプロモーターとしては、分離株ＣＭ１８４１（Gardner et a l., 1981）、ＣａｂｂＢ−Ｓ（Franck et al.,1980）及びＣａｂｂＢ−ＪＩ（Hu ll及びHowell, 1987）のカリフラワーモザイクウイルスの強い構成的３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；及び、それぞれＴ−ＤＮＡの１’及び２’遺伝子の発現を誘導するＴＲ１′プロモーター及びＴＲ２′プロモーター（それぞれ「ＴＲ１′プロモーター」及び「ＴＲ’２プロモーター」という）（Ve lten et al.,1984）が含まれる。代替的には、構成的ではなく、むしろその植物の単数又は複数の組織又は器官（例えば葉及び／又は根）に対し特異的であり、かくして挿入されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分が特定の組織又は器官の細胞内でのみ発現されることになるようなプロモーターを利用することもできる。例えば、米国特許出願８２１，５８２号及びＥＰＡ８６／３００，２９１．１号に開示されているとおり、殺虫剤として有効な遺伝子部分を、その植物自体又はエンドウ豆のような別の植物のリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット遺伝子のプロモーターのような光誘導可能プロモーターの制御下に置くことによって、植物（例えばトウモロコシ、綿）の葉の中で、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を選択的に発現させることができた。もう１つの代替案は、その発現を誘導することのできる（例えば、温度又は化学因子によって）プロモーターを使用することである。殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分は、挿入された遺伝子部分が適当な３′末端転写調節シグナル（すなわち、転写物形成及びポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち、５′）にくるように、植物ゲノム内に挿入されている。このことは、好ましくは、植物細胞ゲノム内にｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子を挿入することにより達成される。好ましいポリアデニル化及び転写物形成シグナルとしては、形質転換された植物細胞中で３ ′−非翻訳ＤＮＡ配列として作用するオクトピンシンターゼ遺伝子（Gielenet a l., 1984）及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Velten及びSchell,1985）のシグナルが挙げられる。殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分は、場合によっては、植物が融合タンパク質を発現するように、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子（ＥＰ０，２４２，２３６）のような選択性マーカー遺伝子と同じプロモーターの制御下のハイブリッド遺伝子として植物ゲノム内に挿入されうる（ＥＰＡ８６／３００，２９１．１：Vaeck et al,1987）。抗鱗翅目タンパク質をコードするｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は部分は、鱗翅目又は鞘翅目に対する殺虫活性をもつB. thuringiensisのようなその他の細菌を形質転換するためにも使用可能である。かくして広範囲の鱗翅目及び鞘翅目害虫を撲滅するため、又はさらなる鱗翅目害虫を撲滅するために有用な、形質転換されたＢｔ菌株を生産することができる。適当なクローニング媒体（ベヒクル）中に取り込まれたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は部分をもった細菌の形質転換は、通常の方法で、好ましくはMahillon et al.（1989）及びＰＣＴ公報ＷＯ９０／０６９９９に記述されているとおりの通常の電気穿孔技術を用いて行うことができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株は同様に、ｂｔ１８遺伝子（ＥＰ０，３５８，５５７）又は抗鱗翅目タンパク質をコードする別のＢｔ遺伝子；及び抗鞘翅目タンパク質をコードするｂｔ１０９Ｐ遺伝子（ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１６４３３）のような１つ又は複数の外来性Ｂｔ遺伝子の全部又は殺虫剤として有効な部分で形質転換することもできる。かくして、さらに一層多様な害虫（例えば鞘翅目及び／又はさらなる鱗翅目）を撲滅するために有用な形質転換されたＢｔ菌株を生産することができる。通常のクローニングベクターの中に取込まれた外来性Ｂｔ遺伝子の全部又は一部を用いたＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の形質転換は、周知の方法で、好ましくは通常の電気穿孔技術（Chassy etal.,1988）、又は例えばLereclus et al.（1992）により記述されているとおりのその他の方法を用いて実施することができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の各々は、高い細胞収量を得るべく、通常の方法（Dulmage 19 81; Bernhard及びUtz, 1993）により発酵させることができる。充分に理解されている適切な条件下で（Dulmage,1981）、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株は、各々胞子形成して、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンを含む結晶タンパク質を高い収量で産生する。本発明の殺虫性の、特に抗鱗翅目性の組成物は、適切な担体、希釈剤、乳化剤及び／又は分散剤（例えばBernhard及びUtz, 1993により記述されているもの）と共に、有効成分として、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、又は好ましくはそのそれぞれの結晶、結晶タンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分を使用して、通常の方法で製剤化することができる。この殺虫剤組成物は、水和剤、ペレット、粒剤又は粉剤として、或いはフォーム、ゲル、懸濁液、濃縮物などとして水性又は非水性溶剤を伴う液体製剤として製剤化することができる。かかる組成物の中のＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、結晶、結晶タンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分の濃度は、製剤の性質及び意図されているその使用態様によって異なる。一般に本発明の殺虫剤組成物は、各回の適用で２〜４週間にわたり、畑を鱗翅目害虫から保護するために使用することができる。さらに拡大した保護（例えば生育期全体）のためには、付加的な量の組成物を定期的に適用すべきである。昆虫、特に鱗翅目を防除するための本発明に従った方法は、好ましくは、殺虫作用のある量のＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、胞子、結晶、結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン、又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分、好ましくはＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを、保護すべき場所（地域）に適用する（例えば噴霧する）ことを含んでいる。保護すべき場所としては、例えば害虫の生息場所又は生育中の植生又は植生を生育させるべき地域を含むことができる。ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はトキシンを得るためには、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の細胞を、通常の方法で適当な培地上で成長させ、次に酵素分解又は洗浄剤などのような通常の手法を用いて溶解させることができる。次にプロトキシンを、クロマトグラフィ、抽出、電気泳動などの標準的技術により分離し、精製することができる。その後、プロトキシンのトリプシン消化により、トキシンを得ることができる。同様に、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞を採取し、保護すべき場所に生きた状態又は死んだ状態、好ましくは乾燥した形でそのまま適用することができる。この点に関して、精製されたＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株（生菌又は死菌のいずれも）、特に、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株が９０．０〜９９．９％である細胞質量のものを使用することが好ましい。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞、結晶又は結晶タンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分は、特定の用途に応じて湿潤な又は乾燥したいくつかの通常の添加剤を用いて、さまざまな方法で殺虫剤組成物に製剤化することができる。添加剤としては、湿潤剤、洗浄剤、安定剤、付着剤、展着剤及び増量剤が挙げられる。かかる組成物の例としては、ペースト、粉剤、水和剤、粒剤、餌剤及びエアゾルスプレーがある。さらなる利点又は恩恵を得るべく、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞、結晶又は結晶タンパク質又はＢＴＳ０２６１８プロトキシン、トキシン又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分と共に、その他のＢｔ細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、トキシン及び殺虫剤として有効なプロトキシン部分及びその他の殺虫剤ならびに殺菌剤、殺生物剤、除草剤及び肥料を用いることができる。かかる殺虫剤組成物は、通常の方法で調製でき、利用されるＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞、結晶又は結晶タンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン又は殺虫剤として有効なプロトキシンの量は、標的となる害虫、使用される組成物、組成物を適用すべき地域のタイプ及び優勢な気候条件のようなさまざまな要因によって左右される。一般に、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、殺虫剤として有効なプロトキシン部分又はトキシンの濃度は、少なくとも製剤の約０．１重量％から約１００重量％であり、より頻繁には約０．１５重量％〜約０．８重量％である。実際には、防除地域内すなわちＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン及び／又は殺虫剤として有効なプロトキシン部分が適用された地域内で、若干の昆虫がこれらを餌とする可能性がある。代替的には、若干の毘虫がＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株又はその形質転換体の生きた細胞そのままを餌とすることができ、かくして、昆虫が菌株のプロトキシンの一部を摂取し、死又は損傷をこうむることになる。以下の例は、本発明を説明するものである。例中で参照指示されている図及び配列リストは以下のとおりである：図１ｃｒｙＩＧプローブ（配列番号１）を含む、ｃｒｙＩ結晶タンパク質遺伝子のためのＤＮＡ−プローブの混合物を使用した、Ｂｔ菌株ＨＤ１２７（レーン１）、ＢＴＳ０２６１８Ａ菌株( レーン２ )、Ｂｔ菌株ＢＴＳ０２４５９（ｃｒｙＩＡ（ｃ）、８１ｋ、ｃｒｙＩＣ及びｃｒｙＩＥを含む、レーン３）及びＢｔ菌株ＢＴＳ０２４８０Ｅ（ＨＤ−１２７と同じ遺伝子を含む、レーン４）のＡｌｕＩ消化された全ＤＮＡのサザンブロット分析。各々のバンドは特定の結晶タンパク質遺伝子に対応する。これらのプローブを用いて、ＢＴＳ０２６１８Ａ菌株がｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子、及び配列番号１のｃｒｙＩＧプローブとハイブリッド形成する約５３０bpのＡｌｕＩフラグメントによって同定されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子である新規の遺伝子を含んでいることがわかる。認識されたｃｒｙＩ遺伝子の名称ならびにいくつかのフラグメントのサイズが示されている。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は３つの星印で表わされている；「？」は未知の遺伝子フラグメントを表わしている。配列リスト配列番号１−ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を分離するために用いられたＤＮＡプローブのヌクレオチド配列。このプローブは、ｃｒｙＩＧＤＮＡ配列の一部分から誘導され、Smulevitch et al.（1991）により記述されているＤＮＡ配列のヌクレオチド２７３２〜２７５０と相補性をもつ。配列番号２−ヌクレオチド位置１９５〜１９７の推定上の翻訳開始コドンを含む、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の５’部分ヌクレオチド配列。配列番号３−ヌクレオチド位置１１４６〜１１４８の推定上の翻訳停止コドンを含む、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の３′部分ヌクレオチド配列（Ｎ：未知のヌクレオチド）。配列番号４−ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のヌクレオチド配列及びＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの翻訳されたアミノ酸配列。プロトキシンの読み取り枠はヌクレオチド６６８〜ヌクレオチド４１４１に達する。翻訳開始コドンはヌクレオチド位置６６８〜６７０にあり、翻訳停止コドンはヌクレオチド位置４１３９〜４１４１にある。例中に相反する記述が無いかぎり、組換え型ＤＮＡを作り操作するための全ての手順は、Sambrook et al., 「分子クローニング−実験室マニユアル（Molecul ar Cloning-A Laboratoy Mannual）、第２版」、Cold Spring Harbor Laborator y Press,NY（1989）に記述されている標準化された手順によって実施される。例１：ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の特徴づけＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ及びＢＴＳ０２６５４Ｂ菌株は、フィリピンのBicol地方Cadlanにおいてサンプリングされた穀粒粉末から分離され、それぞれＬＭＧＰ−１２５９２、ＬＭＧＰ−１２５９３及びＬＭＧＰ− １２５９４という受託番号で１９９２年７月２日にＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託された。菌株ＢＴＳ０２６５２Ｅも同様に、フィリピンの穀粒粉末から分離され、１９９３年３月１日ＬＭＧＰ−１３４９３という受託番号でＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託された。各々の菌株を、好ましくは２８℃で通常の標準培地、好ましくはＴ₃培地（トリプトン３ｇ／ｌ、トリプトース２ｇ／ｌ、酵母エキス１．５ｇ／ｌ、５mgのＭｎＣｌ₂、０．０５ＭのＮａ₂ＰＯ₄、pH６．８及び１．５％の寒天）上で培養することができる。長期貯蔵のためには、等しい体積の５０％のグリセロールと等しい体積の胞子−結晶懸濁液を混合し、これを−７０℃で貯蔵するか胞子−結晶懸濁液を凍結乾燥することが好ましい。胞子形成のためには、２８℃で４８時間Ｔ₃培地上で成長させ、次に４℃で貯蔵することが好ましい。この生長段階（veg etative phase）の間、各々の菌株は同様に任意の嫌気性条件下でも成長できるが、胞子形成は好気性条件下でのみ生じる。各菌株の滅菌は、１２０℃で２０分間（１バールの圧力）のオートクレーブ処理によって行われる。かかる処理は、胞子、及びＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅプロトキシンを完全に不活性化する。ＵＶ線（２５４nm）も同様に胞子を不活性化する。栄養寒天培地（「ＮＡ」、Difco Laboratories, Detroit,MI,USA）上で１日培養した後、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の各々のコロニーは、不規則な縁部をもつ不透明な白色コロニーを形成する。各菌株の細胞（１．７〜２．４×５．６〜７．７μmのグラム陽性桿状体）は、Ｔ₃寒天上で２８℃で４８時間培養した後、胞子形成する。胞子形成中に産生された結晶タンパク質は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株の結晶内に包含される。きわめて驚くべきことに、結晶は、胞子形成後、胞子に付着した状態にとどまる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株のＢｔ血清型（セロタイプ）は、昆虫病原性Bacillus（桿菌）についてＷＨＯ協カセンターによって行われたような従来の血清型決定方法によって決定され、これら全ての菌株の血清型はtolworthi Ｈ９であることが確認された。例２：ヤガ科、スガ科及びメイガ科に対するＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株及びＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫活性毒性検定は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はトキシンの１つからの胞子−結晶混合物を重層された人工的食餌での給餌を受けた新生幼虫（Plutella xylostellaについては、第３虫齢の幼虫を使用した）について実施した。人工的食餌はCostar２４ウエル平板のウエルの中に送り出された。食餌からホルムアルデヒドを除外した。食餌の表面上に５０μlの試料希釈液を塗布し、空気層流内で乾燥させた。ＬＣ₅₀の検定については、ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液中で希釈を行い、５回希釈液を塗布した。各ウエル中に２匹の幼虫を入れ、試料希釈液１つあたり２４匹の幼虫を用いた。５日目に、死んだ及び生きているM. brassica, S. frugiperda, H. virescens , O. nubilalis, Plutella xylostella及びS. exigua幼虫を計数し、６日目に死んだ及び生きているA. ipsilon及びS. littoralis幼虫を計数した。プロビット法（Finney, 1971）を用いてＬＣ₅₀及びＬＣ₉₅値（１ｃｍ²あたりの胞子−結晶数又は（プロ）トキシンng数で表わされた、試験対象の昆虫のそれぞれ５０％又は９５％を殺すのに必要とされる濃度）を計算し、以下にその結果を記した。Spodoptera Littoralis 精製されたＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンを用いた実験は、S.littoralis幼虫に対するこのプロトキシンの重要な毒性をも示している。Spodoptera exigua １．結晶／胞子混合物２．トキシン／プロトキシン検定 Mamestra brassica １．結晶／胞子混合物２．プロトキシン検定 Agrotis ipsilon １．結晶／胞子混合物２．トキシン／プロトキシン検定 MacIntosh et al （1990）がA．ipsilonに対するＣｒｙＩＡｃトキシンの幾分かの活性について記述していたことから、比較のため、この昆虫について精製ＣｒｙＩＡｃトキシンをテストしたが、A．ipsilonの有意な死亡率は全くひき起こされなかった。Heliothis virescens １．結晶／胞子混台物２．トキシン／プロトキシン検定 Ostrinia nubilalis １．結晶／胞子混合物２．精製プロトキシン検定精製ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン同様に、Ostriniaに対して最も活性であるＣｒｙＩトキシンと比較して、Ostrinianubilalis幼虫に対して有意な毒性を示した。Pulutella xylostlla Pulutella xylostella幼虫も同様に、複数の実験においてその人工的食餌に対し精製ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを適用した後、有意な死亡率を示した。Spodoptera frugiperda ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子で形質転換された結晶（−）Ｂｔ菌株の結晶／胞子混合物は同様に、昆虫給餌試験において、S.frugiperda幼虫の幼虫成長を著しく阻害するものであることがわかった。結論としては、本発明の菌株及び本発明のＢＴＳ０２６１７Ａタンパク質は、現在入手可能などの単一のＢｔタンパク質にも影響されない広範囲の昆虫に対し強い殺虫活性を有し、少なくとも３つのSpodoptera種、及びA. ipsilon、M. bra ssica 及びH. virescensのようなその他のヤガ科、ならびにO. nubilalisのようなメイガ科及びPlutella xylostellaのようなスガ科に対して活性を有する。これらの結果を、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の影響を受けやすい独特の昆虫範囲を示す表１中に、要約して、その他のｃｒｙＩ遺伝子（Van Frankenhuyzen, 1 993）についての結果と比較して示す。例３：ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の同定ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を、ＤＮＡプローブとして配列番号１のｃｒｙＩＧ遺伝子（Gleave et al., 1992）のＤＮＡ配列を用い、標準的ハイブリダイゼーション条件を用いて、ＡｌｕＩ消化されたＢＴＳ０２６１８Ａ菌株の全ＤＮＡのサザンブロット分析（図１）によりその菌株中で同定した。その５′及び３′末端部分を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の部分的ＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号２及び３に示されており、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全ＤＮＡ配列及びＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の全アミノ酸配列は、配列番号４に示されている。配列番号２及び３の部分的配列により、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子をＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株内で認識することが可能であり、これら及びその他のＢｔ菌株における全遺伝子配列を同定し分離するためのプローブの構築が可能である。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の翻訳開始コドンは、配列番号２のヌクレオチド位置１９５〜１９７に同定され、これは配列番号４のヌクレオチド位置６６８〜６７０に対応する。翻訳停止コドンは、配列番号３のヌクレオチド位置１１４６〜１１４８に同定され、これは配列番号４のヌクレオチド位置４１３９〜４１４１に対応する。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子はまた、プローブとして配列番号１のＤＮＡ配列を、ｃｒｙＩ遺伝子内の保存されたＤＮＡフラグメントのその他のＤＮＡプローブと同様用いて、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株内で同定された。全長ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、１２９．９kDのプロトキシンをコードすることがわかった。そのアミノ酸配列をその他の既知のＣｒｙＩタンパク質と比較すると、Ｃ−末端部分（保存された配列ブロック５のＣ−末端）がＣｒｙＩＧと相同であることがわかった（８８％）。Ｎ−末端部分（トキシン）についての最高の相同性はＣｒｙＩＢトキシンを用いて見い出されたが、これは５０％未満であることがわかった（相同性は、最長のフラグメントのアミノ酸の数で完全に一致するものの数を除したものとして表わされる）。最小の殺虫タンパク質は、配列番号４のアミノ酸番号４４からアミノ酸番号６５８まで広がる６９kD（６１５アミノ酸）のタンパク質であると考えられている。配列番号４でアミノ酸番号１６５からアミノ酸番号６５８までの、さらに小さい５５kD（４９４アミノ酸）のトリプシンフラグメントは、なおS. exiguaに対する殺虫活性を有するが、この活性は著しく低減している。従って、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又は等価の短縮遺伝子は、好ましくは、上述のとおり配列番号４のＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの６９kDタンパク質をコードする。例４：ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のクローニング及び発現ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を分離するために、ＢＴＳ０２６１８Ａ菌株からの全ＤＮＡを調製し、Ｓａｕ３Ａで部分的に消化した。消化したＤＮＡをショ糖勾配上でサイズ分画し、７Kb〜１０Kbの範囲のフラグメントを、ＢａｍＨ１で消化しＢＡＰ処理したクローニングベクターｐＵＣ１９に連結した（Yannisch Perro n et al.,1985）。ベクターを含む組換え型E. coliクローンを、次に、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含むクローンを同定するべく、例３に記されている配列番号１のｃｒｙＩＧＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。その後、このように同定されたＤＮＡフラグメントをMaxam及びGilbert（1980 ）に従って配列決定した。配列番号２及び３にｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の部分的配列が示され、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及びＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の全配列は配列番号４に示されている。ＤＮＡ配列分析に基づいて、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンをコードする短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を与えるように、適切な制限酵素を用いて遺伝子を切断した。E. coliにおける遺伝子の発現は、標準的手順を用いて誘導した（Sambrook et al,1989, 前出）。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子も同様に、日常的手順により、ＢｔプラスミドＰＧＩ２又はＰＧＩ３を用いて、結晶（−）Ｂｔ菌株内へ導入されている（Mahillon 及びSeurinck 1988； Mahillon et al.,1988）。例５：E. coli内へのｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及び短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の挿入及び植物内への短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の挿入 E. coli及び植物内で例４のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及び短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を発現させるために、ＥＰＡ８６／３００２９１．１及びＥＰＡ８８／４０２１１５．５に記述されている手順に従って、E. coli中に異なる遺伝子カセットを作る。植物内での有意な発現を可能にするため、ａ）短縮遺伝子又はｂ）ｉ）短縮遺伝子とii）ｎｅｏ遺伝子の融合したものであるハイブリッド遺伝子を含むカセットを、各々、ＥＰＡ（６／３００２９１．１に記述されているとおり中間体（in ter-mediate）植物発現ベクターのＴ−ＤＮＡ境界配列の間に挿入し；植物発現ベクター内の転写物形成及びポリアデニル化シグナルに融合させ；３５Ｓ３転写物を制御するカリフラワーモザイクウイルスからの構成的プロモーター（Hull及びHowell, 1987）又はオクトピンＴｉ−プラスミドのＴＲ−ＤＮＡからの２′プロモーター（Velten et al., 1984）の制御下に置き；オクトピンシンターゼ遺伝子の３′末端転写物形成及びポリアデニル化シグナルに融合させる（Gielen et al., 1984）。標準的手順（Deblaere et al., 1985）を用いて、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含む中間体植物発現ベクターを、無害化したＴｉ−プラスミドｐＧＶ２２６０（Vaeck et al., 1987）を担持するAgrobacterium菌株Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ^R（米国特許出願８２１，５８２；ＥＰＡ８６／３００，２９１．１）中にトランスファーする。スペクチノマイシン耐性について選択することにより、ｐＧＶ２２６０及びそれぞれの中間体植物発現ベクターから成る同時組込みされたプラスミドが生じる。これらの組換え型Agrobacterium菌株の各々を、次に、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子が異なる植物細胞内に含有され、これらの細胞により発現されるように、異なる綿植物を形質転換するのに用いられる。例６：植物中での短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の発現例５の形質転換された植物細胞から生成された、形質転換された植物の葉における短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の発現産物の鱗翅目に対する殺虫活性は、これらの葉を給餌されたAgrotis及びSpodoptera種の幼虫の成長速度及び死亡率を記録することにより評価される。これらの結果は、形質転換されていない植物の葉を給餌された幼虫の成長速度と比較される。Agrotis及びSpodoptera種に対する毒性検定は、ＥＰ０，３５８，５５７号、米国特許出願８２１，５８２号及びＥＰＡ８６／３００，２９１．１号に記述されているとおりに行う。形質転換されていない植物の葉を給餌された幼虫と比べ、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及び短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を含む形質転換された植物の葉を給餌された幼虫では、著しく高い死亡率が得られている。形質転換された植物は、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質を発現することにより、Ostrinia nubilalis、Mamestra brassica、Heliothis virescens及びPl utella xylostella の攻撃に耐えることもわかっている。言うまでもないことであるが、本発明は、ＢＴＳ０２６１７Ａ菌株（ＢＣＣＭ −ＬＭＧＰ−１２５９２）、ＢＴＳ０２６１８Ａ菌株（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ −１２５９３）、ＢＴＳ０２６５４Ｂ菌株（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ−１２５９４）、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ−１３４９３）に制限されるものではない。むしろ、本発明は同様に、それぞれのＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４ＢもしくはＢＴＳ０２６５２Ｅの結晶又は結晶タンパク質あるいはＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はトキシンと実質的に同じ特性、特に抗鱗翅目特性、かなり特定的には抗ヤガ科、抗スガ科及び抗メイガ科特性、特に抗Spodoptera、抗Plutella、抗Ostrinia、抗Mamestra、抗Heliothis 及び抗Agrotis特性を有する結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又はトキシンを産生する、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８ＡＮＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株のあらゆる突然変異体又は変異体をも含んでいる。本発明は同様に、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、及び短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のような、その遺伝子の殺虫剤として有効なあらゆる部分をも含む。この点において、本書で使用されている「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」という語は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株から分離され、しかも配列番号１のヌクレオチド配列に対しハイブリッド形成する遺伝子、及びＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンと実質的に同じアミノ酸配列及び殺虫活性を有するプロトキシンをコードし、好ましくは配列番号２及び３に示されている部分的ヌクレオチド配列又は配列番号４に示されている全配列を含むあらゆる等価の遺伝子を意味する。本発明は同様に、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子で形質転換された綿植物に制限されるものではない。本発明には、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又は等価の遺伝子の殺虫剤として有効な部分で形質転換された、トマト、タバコ、ナタネ、アルファルファ、ヒマワリ、レタス、ジャガイモ、トウモロコシ、コメ、ダイズ、アブラナ属（Brassica）、テンサイ及びその他のマメ科植物及び野菜のようなあらゆる植物が含まれる。さらに、本発明は、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分で植物細胞を形質転換するためのAgrobacteriumtumefaciens Ｔｉ−プラスミドの使用に制限されるものではない。リポソーム、電気穿孔法、及び植物ウイルス又は花粉に基づくベクターシステムを用いるような植物細胞形質転換のためのその他の既知の技術も、かかる遺伝子部分で単子葉植物及び双子葉植物を形質転換するために使用することができる。さらに、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株に天然に存在し、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及びトキシンをコードするもの以外のＤＮＡ配列を、植物及び細菌の形質転換のために使用することができる。この点において、これらの遺伝子の天然のＤＮＡ配列は、修正によってコードされているＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫剤として有効な部分（例えばトキシン）の特性、特に殺虫特性、特に抗鱗翅目特性が実質的に変更されないことを条件として、１）同じ又は異なる、好ましくは同じアミノ酸をコードする他のコドンでいくつかのコドンを置換することによって；２）いくつかのコドンを欠失させるか又は付加することによって；及び／又は３）Ge et al. （1991）により記述されているとおりの相互組換え（reciprocal r ecombination）によつて、修正可能である。例えば、或る種の状況下では、植物を形質転換するための本発明のｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子の中の、天然でかつ殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分の代りに、コドン利用が修正されている上述のとおりの本発明の人工的ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又は遺伝子部分を使用することができる。同じく、その他の外来性ＤＮＡ、特にE. coli以外の微生物及び植物を形質転換するのに適したベクターのＤＮＡと関連させたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部を含むその他のＤＮＡ組換え体も、本発明の中に包含されている。この点において、本発明は、以上で記述したｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又はその部分を含む特定のプラスミドに制限されるものではなく、むしろ本発明は、その等価物であるＤＮＡ配列を含むあらゆるＤＮＡ組換え体をも包含している。さらに、本発明は、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部を含むＤＮＡ組換え体であって、しかもその遺伝子の全部又は一部の発現及び微生物からの回収又は植物細胞へのトランスファーを可能にする条件下で、微生物（例えば他のBacillusthuringien sis 菌株、Bacillus subtilis、Pseudomonas、及びXanthomonasのような植物関連細菌又は酵母、例えばStreptomycescerevisiae）を形質転換するのに適している全てのＤＮＡ組換え体に関するものである。表１．いくつかの鱗翅目害虫に対するＣｒｙＩタンパク質の活性：＋及び−は殺虫活性の存在又は欠如を表わし、＋／−は低活性を表わし（Van Frankenhuyzen（199 3）に従う）、ＮＡはデータが入手できないことを意昧し、タンパク質ＢＴＳ０２６１８Ａは２６１８Ａと略されている（Van Frankenhuyzen（1993）及び本発明（A. ipsilon及び２６１８Ａについて）のデータ）。参考文献 −Bernard, K. 及びUtz. R., 「実験及び商業的用途のためのBacillus thuringi ensis 殺虫剤の生産」，「Bacillusthuringiensis, 環境的バイオ殺虫薬、その理論と実践（Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide：Theory andPractice）」中，pp.255-267. 編集刊行：Entwistle,P.F.,Cory, J.S. Baile y, M.J.及びHiggs, S., John Wileyand Sons, New York（1993）． −Chassy, B.M., Mercenier, A. 及びFlickinger, J., TrendsBiotechnol. 6, 3 03-309（1988）． −Datta S., Peterhans A., Datta K.及びPotrykus I., Bio/Technology 8, 736 -740（1990）． −Deblaere, R., Bijtebier, B. De Greve, H., Debock, F.,Schell, J., Van M ontagu, M.及びLeemans, J.,NucleicAcids Research 13, 4777-4788（1985）． −Dulmage, H.T., 「昆虫の生物学的防除のための細菌の生産」，「作物生産における生物学的防除（Biological Control inCrop Production）」中．編集発行：Paparizas,D.C., OsmunPublishers, Totowa, N.J., USA, pp.129-141（1981）． −Finney,「プロビット法（Probit Analysis）」，第３版，Cambridge Universi ty Press（1971）． −Franck, Guilley, Jonard, Richards及びHirth, Cell 21,285-294（1980）． −French, B.T., Maul, H.N.及びMaul, G.C., Anal. Biochem. 156 , 417-423（1986）． −Fromm M., Morrish F., Armstrong C., Williams R., Thomas J.及びKlein T. , Bio/Technology 8, 833-839（1990）． −Gardner, Howarth, Hahn, Brown-Luedi, Shepard及びMessing,Nucleic Acids Research 9, 2871-2887（1981）． −Ge A., Rivers D., Milne R.及びDean D., J. Biol. Chem.266, 17954-17958 （1991）． −Gielen, J., De Beukeleer, M., Seurinck, J., Deboeck, F.,De Greve, H., Lemmers, M., Van Montagu, M.及びSchell, J.,EMBO J. 3, 835-845（1984）． −Gleave, A.P., Hegdes, R.J.及びBroadwell, A.H., J. Gen.Microbiol. 138, 55-62（1992）． −Gordon-Kamm W., Spencer M., Mangano M., Adams T., DainesR., Start W., O'Brien J., Chambers S., Adams W., WilletsN., Rice T., Mackey C., Kruege r R., Kausch A.及びLemauxP., The Plant Cell 2, 603-618（1990）． −Gould, J., Devey, M., Hasegawa, O., Ulian, E.C., Peterson,G. 及びSmith , R.H., Plant Physiol. 95, 426-434（1991）． llon, J., Ampe, Vandakerckhove, J, Vanderbruggen, H.,VanMontagu, M., Zab eau, M. 及びVaeck, M., Eur. J. Biochem.161, 273-280（1986）． bruggen, H. 及びVaeck, M., Applied and Environmental Microbiology 54, 2010-2017（1988）． 242-255（1989）． −Hull及びHowell, Virology 86, 482-493（1987）． −Lereclus, D.,; Vallade, M.; Chaufaux, J.; Arantes, O. 及びRambaud, S., Bio/Technology 10, 418（1992）． −MacIntosh, S.C. et al, J. Invertebrate Patholog. 56,258-266（1990）． −Mahillon, J.及びDelcour, J., J. Microbiol. Methods 3,69-73（1984）． −Mahillon, J.及びSeurinck, J., Nucl. Acids Res. 16,11827-11828（1988）． −Mahillon, et al., Plasmid 19, 169-173（1988）． −Mahillon et al., FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210（1989）． −Maxam, A.M. 及びGilbert, W., Methods in Enzymol. 65,499-560（1980）． −Murray, E., Lotzer, J.及びEberle, M., Nucleic AcidsResearch 17（2）, 4 77-498（1989）． −Shimamoto K., Terada R., Izawa T. 及びFujimoto H., Nature338, 274-276 （1989）． −Smulevitch, S.V., Osterman, A.L., Shevelev, A.B., Kaluger,S.V., Karasi n, A.I., Kadyrov, R.M., Zagnitko, O.P.,Chestukhina, G.G. 及びStepanov, V .M., FEBS Lett. 293, 1 （2）, 25-28（1991）． −Stanssens P., Opsomer C., McKeown Y., Kramer W., Zabeau M.及びFritz H. J., Nucleic Acids Research 12, 4441-4454（1989）． eleer, M., Dean, C., Zabeau, M., Van Montagu, M.及びLeemans, J., Nature 327 , 33-37（1987）． −Van Frankenhuyzen, 「Bacillus thuringiensisのチャレンジ」，「Bacillus thuringiensis , 環境的バイオ殺虫薬；その理論と実践（Bacillus thuringiensi s , An Environmental Biopesticide：Theory and Practice）」中, pp.1-35,編集刊行：Entwistle,P. F., Cory, J. S., Bailey, M.J. 及びHiggs, S., JohnWi leyand Sons, New York（1993）． −Velten, J., Velten, L., Hain, R.及びSchell, J., EMBO J. 3,2723-2730（1 984）． −Velten, J.及びSchell, J., Nucleic Acids Research 13,6981-6998（1985）． −Visser, B., Bosch, D. 及びHonee, G, 「Bacillus thuringien-sis結晶タンパク質のドメイン構造研究：遺伝的アプローチ」，「Bacillus thringiensis, 環境的バイオ殺虫薬；その理論と実践（Bacillus thuringiensis, An Environme ntal Biopesticide：Theory and Practice）」中, pp.71-88, 編集刊行：Entwis tle,P.F., Cory, J. S., Bailey, M.J.及びHiggs, S., John Wileyand Sons, Ne w York（1993）． −Yannische -Perron, C., Vierra J.及びMessing, J., Gene 33,103-119（1985 ）．配列リスト（１）一般情報（i）出願人：（A）氏名：プラント・ジェネティック・システムズ，Ｎ．Ｖ．（B）街路名：Plateaustraat 22 （C）都市名：ゲント（E）国名：ベルギー（F）郵便番号（ＺＩＰ）：９０００（G）電話番号：３２９２３５８４５４（H）ファクシミリ番号：３２９２２４０６９４（I）テレックス番号：１１．３６１Ｐｇｓｇｅｎ（ii）発明の名称：バチルス・チュリンゲンシスの新菌株及び殺虫作用をもつそのタンパク質（iii）配列の数：４（iv）コンピュータ読取り可能書式（A）媒体タイプ：フロッピーディスク（B）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパティブル（C）演算システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（D）ソフトウェア：パテントイン（PatentIn）リリース＃１．０、ヴァージョン＃１．２５（ＥＰＯ）（２）配列番号１についての情報（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１９ヌクレオチド（B）配列の型：核酸プローブ（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類（分子タイプ）：合成ＤＮＡ（ix）特徴：プローブは、Smulevitch et al.（1991）により記述されているｃｒｙＩＧ遺伝子のコーディングＤＮＡ鎖の一部分である。（x）特性：このプローブは、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子をその含有菌株から分離するために用いられる。（xi）配列：配列番号１（３）配列番号２についての情報（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１５６１塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：２本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源：（A）生物名：Bacillus thuringiensis （B）株名：ＢＴＳ０２６１８Ａ（ix）特徴：（A）特徴を表す記号（名称／キー）：misc_feature （D）他の情報：/function＝「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の翻訳開始コドンを含む」（xi）配列：配列番号２（４）配列番号３についての情報（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１５５４塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：２本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源：（A）生物名：Bacillus thuringiensis （B）株名：ＢＴＳ０２６１８Ａ（ix）特徴：（A）特徴を表す記号（名称／キー）：misc_feature （B）存在位置：１１４６．．１１４８（D）他の情報：/function＝「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の推定上の翻訳停止コドン」（xi）配列：配列番号３（２）配列番号４についての情報（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：４３４４塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：２本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（ix）特徴：（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ（B）存在位置：６６８．．４１４１（D）他の情報：配列番号２の全配列、すなわち配列番号４内のヌクレオチド位置４７４〜２０３４を包含し；同様に配列番号３の配列の一部分、すなわち配列番号４内のヌクレオチド位置２９９４からヌクレオチド位置４３４４までをも包含し；配列番号３は配列番号４に示されている配列から下流（３′）にある付加的なヌクレオチドを示す（配列番号３内のヌクレオチド位置１３５２からヌクレオチド位置１５５４）。（xi）配列：配列番号４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ０１Ｎ 63/00 Ｆ 9155−4ＨＡ 9155−4Ｈ 63/02 Ｅ 9155−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ファン・アウデンホーフェ，カトリエンベルギー国、ベー―9000 ヘント、カプレイケストラート 29 (72)発明者ペフェロエン，マルニクスベルギー国、ベー―9000 ヘント、ベルナルド・スパエラーン 97

Claims

【特許請求の範囲】１．ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、又はその等価物。２．ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶又は結晶タンパク質、又はその等価物。３．ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及び殺虫剤として有効なプロトキシン部分、特にトキシン、又はその等価物。４．特にｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子が、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株から誘導され、配列番号１のＤＮＡプローブとハイブリッド形成し、特にｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子が配列番号２及び３に示されているヌクレオチド配列、より特定的には配列番号４のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含んでいる、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子、又はそれらの等価物、又はｎｅｏ遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子とのそのハイブリッド。５．配列番号４のＢＴＳ０２６１８ＡプロトキシンをコードするＤＮＡ配列、好ましくは殺虫剤として有効なＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン部分、特にＢＴＳ０２６１８Ａトキシン。６．鱗翅目、特にヤガ科、特にAgrotis種、Spodoptera種、Plutella種、Mamestr a 種、Heliothis種及びOstrinia種に対する殺虫剤組成物であって、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ菌株、結晶及び結晶タンパク質、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及び殺虫剤として有効なＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン部分、特にＢＴＳ０２６１８Ａトキシン、及びそれらの等価物より成るグループの中から選択された有効成分を含有する殺虫剤組成物。７．請求の範囲第４項のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、遺伝子部分、短縮遺伝子、キメラ遺伝子又はハイブリッドを特徴とする、形質転換された微生物、特にB. t huringiensis 。８．殺虫剤として有効なｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、短縮ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子、又はｎｅｏ遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子とのそのハイブリッドを特徴とする、形質転換された植物細胞。９．請求の範囲第８項に記載の複数の植物細胞を含む植物又はその種子。 10.請求の範囲第８項に記載のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、短縮遺伝子、キメラ遺伝子又はハイブリッドを、中に組み込まれた形で含んでいる植物ゲノム。 11.その細胞が請求の範囲第１０項に記載の植物ゲノムを有する植物組織。 12.鱗翅目、特にSpodoptera種及び Agrotis種のようなヤガ科、0. nubilalisのようなメイガ科及びPlutella xylostellaのようなスガ科に対する耐性を植物に付与するための方法であって、請求の範囲第１０項の植物ゲノムを植物に提供することを特徴とする方法。 13.植物ゲノム内に安定な形で組込まれ、かつ昆虫にとって有毒なタンパク質の形態でその植物において発現されうる異種遺伝物質を含む植物及びこの植物の種子のような生殖物質を生産する方法であって、非生物学的工程である、ａ）前記タンパク質を発現しない出発植物細胞又は植物組織から前記異種遺伝物質を含む形質転換された植物細胞又は植物組織を生産する工程、ｂ）前記異種遺伝物質を含む前記形質転換された植物細胞又は植物組織から再生された植物又はその植物の生殖物質又はその両方を生産する工程、及びｃ）場合により、前記再生された植物又は生殖物質又はその両方を生物学的に複製する工程を含むことを特徴とし、前記異種遺伝物質を含む前記形質転換された植物細胞又は植物組織を生産する前記工程が、請求の範囲第８項に記載のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、短縮遺伝子又はハイブリッド、ならびに前記植物細胞又は植物組織における前記遺伝子部分、短縮遺伝子又はハイブリッドの発現を可能にすることができる調節要素で前記出発植物細胞又は植物組織を形質転換して、形質転換された植物細胞又は植物組織において、ならびに世代を通してそれらから産生される前記植物及び生殖物質において、前記遺伝子部分、短縮遺伝子又はハイブリッドの安定な組込みをひき起こすことを特徴とする、方法。 14. 害虫、特に鱗翅目、特にヤガ科、メイガ科及びスガ科、より特定的にはSpo doptera 種、Mamestra種、Heliothis種、Ostrinia種、Plutella種及びAgrotis種、きわめて特定的にはAgrotis ipsilon 、Spodoptera exigua、Spodoptera litoralis、Spodoptera fru giperda 、Mamestra brassica、Heliothisvirescens、Ostrinia nubilalis及びPl utella xylostella を防除するための方法であって、前記害虫を、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はＢＴＳ０２６１８Ａトキシン、好ましくは請求の範囲第６項に記載の殺虫剤組成物と接触させる工程を特徴とする方法。