KR20000057484A - 바실루스속 세균 및 살충성 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나비목 곤충 뿐만 아니라 다른 곤충에 대해서도 살출 활성을 나타내는 Bt균, 이 Bt균이 생산하는 살충성 단백질 및 그의 유전자, 살충성 단백질을 생산하는 숙주, 및 해충 구제제의 제공을 목적으로 한다.
본 발명에 의한 신균주는, 수탁번호 FERM BP-6162로 기탁된 바실루스 튜림겐시스(Bacillus thuringiensis)에 속하는 균주 SSK - 10 이다. 본 발명에 의한 살충성 단백질은, (a) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열, 또는 (b) 1이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되고, 또한 살충활성을 갖는 서열번호 2 기재의 아미노산 서열로 이루어진다.

Description

바실루스속 세균 및 살충성 단백질{Strain belonging to the genus Bacillus and insecticidal proteins}
미생물 살충제는 화학합성 살충제에 비해서 자연환경에 대한 영향이 적고, 곤충 해충을 방제하기 위하여 화학합성 살충제 대신에 유효한 살충제인 것으로 생각되어진다. 실제로 1960년초 이래, 나비목(Leptidoptera)에 속하는 각종 곤충을 방제하기 위하여, 유효성분으로서 바실루스 튜링겐시스(이하,「Bt균」으로 약칭함)균세포 또는 이균이 생산하는 결정성 단백질 봉입체(이하「CI」로 약칭함)를 함유하는 미생물 살충제 (이하,「Bt 제」로 약칭함)가 사용되어 왔었다.
Bt균을 그람양성 간균으로, 포자형성기에 그의 세포내에서 CI를 생산한다 (H. Hofte and H.R.Whiteley; Microbiol. Rev., 53권, 242페이지, 1989년). 어떤 CI에 대해서 감수성을 갖고 있는 곤충이 이 CI를 섭취하면, 이 곤충을 수시간 이내에 CI 섭취를 중지하고, 이어서 죽게된다. 이와 같은 CI의 작용은 곤충에 대해서 특이적이므로, Bt제는 다른 동물 및 식물에 대해서 독성이 없고, 따라서 매우 안전한 살충제가 되는 것으로 생각된다.
CI의 구성 성분인 살충성 단백질은 Bt균의 플라스미드 또는 게놈 DNA 중에 코드된 유전자의 전사 및 번역에 의해서 생산된다. 이제까지 살충성 단백질을 코드하는 유전자로서 100개 이상의 유전자가 단리되어 있지만, 이들의 유전자가 코드한 단백질의 살충활성은 이들의 아미노산 서열의 기능이 다른 것으로 알려져 있다.(P. A. Kumar et al., Advances in Applied Microbiology, 42권, 1페이지, 1996년). 그러하여, 새로운 살충활성을 갖는 Bt균주는 새로운 살충성 단백질 유전자를 갖고 있는 것으로 생각되어진다.
시판용 Bt제로서 가장 일반적으로 사용되고 있는 Bt균주는 바실루스 튜링겐시스 세로바, 쿠르스타키 HD-1 (Bacillus thuringiensis serovar. kurstaki HD-1,이하「HD-1」로 약칭함)이다(Microbial Control of Pest and Plant Disease 1970-1980, H.D. Burges 편저, Academic Press 발행, 35-44 페이지, 1981년).
유효성분으로서 HD-1을 함유하는 Bt제는 합성 농약에 대해서 현저한 내성을 나타내는 플루텔라 키실로스텔라(Plutella xylostella) 등의 나비목의 작은 크기의 곤충구제에 유효하게 사용되어왔었다. 그러나, 근래 HD-1에 대한 내성을 나타낸 플루텔라 키실로스텔라 균주가 야외에서 발견된 보고가 있다. 이 것은 해충방제에 있어서 심각한 문제가 되고 있다.
또한, 나비목으로 분류되는 밤나방과(Noctuidae)의 큰 곤충인 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura)는 합성 살충제에 대한 감수성이 낮기 때문에 방제하기가 어렵고, 식물에 대해서 심한 피해를 미치게 하고 있다. 실제로, 밤나방과의 스포돕테라 리투라 등의 곤충은 종래의 Bt제에 의해 효과적으로 방제될 수 없으므로, 유효한 Bt제의 개발이 요망되어 왔었다.
밤나방과, 특히 스포톱테라종의 곤충이 Bt제에 대하여 극히 감수성이 없는 가능한 이유는 다음과 같다.
(1) 스포돕테라종이 CI 중의 살충성 단백질과 결합할 수 있는 수용체를 갖고
있지 않다(Shuichiro Inagaki 화학과 생물, 30권, 74페이지, 1992년).
(2) CI중의 단백질이 스포돕테라종의 소화액 중에서 분해, 흡착 또는 불활성
화 되어서 상기 단백질이 표적 수용체에 도달할 수 없게 해준다.
밤나방과에 대해서 살충활성을 갖는 새로운 CI의 개발이 그 자체로 요구되어 왔었다.
자연계로부터 단리시킨 Bt균의 대부분은 레피돕테라 곤충 또는 다른 곤충에 대하여 살충활성을 갖지 않는다. 표적 곤충을 방제하기 위하여 실용적인 살충활성을 나타내는 균주는 극히 적은데, 그 이유는 아마도 Bt균에 의해 생산되는 CI가 다음과 같은 과정을 거쳐서 상기곤충을 치사하기 때문이다.
(1) 표적 곤충이 CI를 섭취한다.
(2) CI가 소화관내에서 용해해서 프로톡신(살충성 단백질)을 생성한다.
(3) 프로톡신이 효소에 의해서 톡신(toxin)으로 활성화 된다.
(프로세싱 단계)
(4) 활성화 톡신(프로세싱된 살충성 단백질)이 곤충의 중장세포(中腸細胞)의
수용체와 결합하고, 미세공이 형성된다.
(5) 곤충의 중장세포가 분해한다.
소화관의 환경은 곤충에 따라 서로 다르고, 곤충의 식이(食餌)와 밀접한 관계가 있다. 그리하여, 곤충이 다른 먹이와 함께 CI를 섭취하는 경우에만 살충성이 되는 CI의 불활성화 또는 활성화는 또한 곤충에 따라서 서로 다르다. 그러므로, 곤충의 중장내에서 상기 (1)내지 (5)단계를 완수할 수 있는 CI만이 그 곤충에 대해서 살충활성을 갖게될 것으로 생각 되어진다.
한편, Bt균의 생활환의 한 단계인 아포(spores)는 CI의 살충활성에 대하여 현저한 상승효과를 갖는 것으로 알려졌다. R. Milne 등은 아포가 존재함으로써 2종류의 CI의 살충활성이 역전되는 것을 보고하였다(Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, L.A. Hickle 편저, American Chemical Society 발행, 22페이지, 1990년). 또, W.J.Moar등은 Bt균이 생산한 CI만을 섭취한 곤충이 CI와 아포의 혼합물을 섭취한 경우보다 쉽게 더욱 많은 내성을 갖는 것을 보고하고 있다.(Appl. Environ. Microbiol., 61권, 2086페이지, 1995년). 상기 보고들은 Bt균이 생산하는 2개의 성분, 즉 CI와 아포가 곤충과의 상호작용에 있어서 밀접한 관계가 있는 것을 나타내고 있다. 그리하여, 연구원들은 곤충 중에서 내성의 발달을 억압함에 있어서 아포의 역활에 집중하고 있다.
본 발명은 해충구제에 유효한 바실루스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)의 새로운 군규, 이 균주가 생산하는 결정성 단백질 봉입체, 이 봉입체를 구성하는 살충성 단백질 및 이 단백질을 코드하는 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 살충 주제제 및 살충 구제의 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 살충성 단백질의 유전자의 전사에 대해서 분석한 결과의 설명도 이다. 여기서, "With RT"는 RT를 함유하는 반응액을 사용하고, "Without RT"는 RT를 함유하지 않는 반응액을 사용했다.
본 발명자들은 광위의 해충 방제에 있어서 유효한 Bt균을 성공적으로 단리했다. 이 균주는 밤나방과를 포함해서 해충 방제에 있어서 매우 효과적이다.
또한, 본 발명자들은 Bt균주가 HD-1균주와 비교해서 알칼리성 조건(pH 9~10)하에서 더욱 특이적으로 용해성 및 안정성을 나타내는 CI를 생산하고, CI 단독으로 스포돕테라 리투라 및 플루텔라 키실로스텔라 해충에 대해서 높은 살충 활성을 나타내고, CI 및 아포의 조합이 CI 단독보다도 스포돕테라 리투라에 대하여 훨씬 좋은 살충활성을 나타내고, 용해된 CI 및 아포를 공존시킴으로써 살충활성이 재생될 수 있음을 발견했다.
또한, 본 발명자들은 Bt균이 생산한 살충성 단백질의 아미노산 서열을 확인했고, 이 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 관리했다.
따라서, 본 발명의 목적은 레피돕테라 뿐만 아니라 다른 곤충에 대해서도 살충활성을 갖는 Bt균을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 Bt균이 생산하는 살충성 단백질, 이 단백질을 코드하는 유전자, 이 유전자를 갖는 벡터 및 이 유전자를 갖는 숙주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살충성 단백질을 생산할 수 있는 형질전환된 식물, 해중 구제제 및 해충 구제방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 신균주는 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(National lnstitute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology)에 수탁번호 FERM BP-6162로 기탁된 균주 SSK-10이다. 이 균주는 바실루스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)이다.
본 발명에 의한 살충성 단백질은 다음과 같은 아미노산 서열, 즉(a) 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 (b) 살충활성을 갖고, 하나 이상의 아미노산이 치환,결실 되거나, 또는 부가 또는 삽입된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
미생물의 기탁
본 발명에 의한 신균주 SSK-10은 1996년 11월12일 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-조메 1반 3고)에 기탁 되었다. 수탁번호는 FERM BP-6162이다.
미생물
본 발명에 의한 균주 SSK-10은 사이타마켄 사까도시(埼玉縣坂戶市)에 소재하는 가옥의 먼지에서 단리했다. 이 균주의 특성을 표1에 나타낸 바와 같다.
표 1
집락형태 : Bt균에 전형적인 큰 집락으로, 표면은 무색이다.
증식기의 세포 형태 : Bt균에 전형적 이다.
형태적 성질 : 운동성 간균(1.0-1.2 μχ 3.0-5.0μ)이다.
그람 염색 : 양성이다.
포자의 형상 : 타원형 이다. 포자에 의해서 생기는 포자낭의 현저한 팽창은 관찰되지 않았다.
편모의 혈청형 : H7(또는 sendvar. aigawai)*로 분류된다.
세포내 함유물 : 대형 양 피라밋 모양의 (bi-pyramidal)결정성 단백질 봉입체 (SDS-PAGE에 의한 측정에서 약 130KDa의 분자량을 가짐).
살충성 단백질 : Cry9n으로 분류된다. 상동성(homology)을 검색한 결과, 가장 상동성이 있는 Cry9Cal(Appl. Environ. Microbiol., 62페이지, 제 80 페이지, 1996년)에 대해서도 겨우 71%의 상동성을 나타냈다.
호기성, 염기성의 구별 : 통성 염기성균이다.
생화학적 특성 : 카탈라제 반응 양성
레시티나제 반응 양성
VP 반응 양성
*H 혈청의 제조 및 균주의 분류는 M. Ohba and K. Aigawa, J. Invertebr. Pathol., 15, 139-140 (1978)에 따라서 행했다.
본 발명의 신균주에 의해서 생산한 CI 및 아포의 극히 특징적인 특성들을 이하에서 더욱 상세하게 설명한다. J.D. Tang(Appl. Environ. Microbiol., 62, 564, 1996)은 CryI 살충성 단백질 중에서 CryIC는 밤나방과의 야도충(noctuids)에 대해서는 특히 효과적이지만, 플루텔라 키실로스텔라 곤충에 대한 살충성은 HD-1 균주가 생산한 CryIA(a)의 살충활성의 약1/10에 지나지 않는다고 보고 하였다. 또한, 일본국 특허공개 제 509,235호/1993에 기재된 바와 같이, CryIC 및 CryIA를 함유하는 Bt균의 살충활성은, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 대해서는 HD-1균주보다 3배이고, 플루델라 키실로스텔라에 대해서는 HD-1균주보다 2내지 수배이다. 이와 대비해서, SSK-10 균주의 세포가 생산한 CI의 살충활성은, 스포돕테라 리투라에 대해서는 HD-1균주의 세포가 생산한 CI의 것보다 30배 이상이고, 플루델라 키실로스텔라에 대해서는 HD-1 균주의 세포가 생산한 CI의 것보다 50배 이상의 살충활성을 나타냈다. 또한, SSK-10 균주의 CI는 HD-1 균주의 CI와 비교해서 알칼리성 조건(pH 9~10)하에서 더욱 특이적인 용해성과 높은 안정성을 나타내고 있다.
또한, SSK-10 균주로부터 얻은 유전자의 살충성 단백질의 염기서열의 상동성 검색(GenBank, EMBL, DDBJ, PDB 서열)의 결과, 기지의 Bt 살충성 단백질의 유전자에 대해서 상동성이 거의 없었고, 가장 상동성이 있는 Cry9cal에 대해서도 아미노산 레벨에서 겨우 71% 상동성을 나타냈다. (B, Lambert et al. Appl. Environ. Microbiol., 62권, 80페이지, 1996년). Bt 살충성 단백질은 130 kd 내지 140 kd의 분자량을 갖는 프로톡신으로서 생산되며, 이어서, 이것은 곤충의 중장내에서 60kd 내지 70kd의 톡신으로 분해된다. 실제로, 이 톡신은 살충활성을 나타내고, 프로톡신의 C말단측은 본질적인 살충활성에 필요하지 않는 것으로 알려졌다(H. Hofte and H.R. Whitely, Microbiol. Rev. 53권, 242페이지, 1989년). 따라서 살충활성에 필요한 N-말단측에 있는 1 내지 700번째 아미노산 서열에 한정해서 상동성 검색(GenBank CDS translations, PDB, SwissProt, PIR)의 결과, 가장 상동성이 있는 Cry9Cal에 대해서도 살충성 단백질 유전자의 상동성이 겨우 60%에 지나지 아니하였으므로, 이 유전자는 명백히 새로운 유전자인 것을 알았다.
이상의 발견에서, SSK-10 균주는 신규한 CI를 생산하는 신균주인 것이 명백하다.
또한, SSK-10 균주의 세포가 생산하는 아포를 CI와 조합하면 살충활성은 증진되고, 자체로는 살충활성을 갖지 않는 용해된 CI(이후, SCI로 약칭한다)를 아포와 조합하면 살충활성은 회복된다. 또한, 이 작용은 통상의 배양에서 발견한 것과 동일한 아포/CI 비로 실질적인 정도로 달성될 수 있는 것을 알았다. 따라서, 배양종료 후, 배양물 중의 아포와 CI(또는 SCI)와의 비율을 조절함이 없이, 본 발명의 신균주 SSK-10이 생산하는 아포 및 CI(또는 SCI)를 사용함으로써 해충 방제에 매우 효과적인 Bt 제를 공급할 수 있다.
본 발명의 SSK-10 균주의 세포는 통상의 조건하에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 배양은 글루코스 등의 탄소원과 대두분 등의 질소원을 사용하여 20°내지 40℃ 사이의 적당한 배양온도에서 행할 수 있다. 배양은 호기성 조건하에서, 통기교반하면서 1내지 4일 동안 행하는 것이 바람직하다.
살충성 단백질 및 그의 유전자
본 발명은 SSK-10 균주의 세포가 생산한 살충성 단백질을 제공한다.
본 발명에 의한 살충성 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명에 의한 살충성 단백질은, 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 1이상(예, 1내지 수개)아미노산이 서열번호 2의 아미노산 서열에 부가 또는 삽입되거나, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 1이상(예, 1내지 수개)아미노산이 서열번호 2의 아미노산 서열에 치환 또는 결실되고, 살충성을 갖는 것을 포함한다. 당업자들은 서열번호 2의 아미노산 서열을 참조해서 특별한 곤란성 없이 서열번호 2의 아미노산 서열에 아미노산을 부가, 삽입, 치환 또는 결실할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 있어서, 살충성을 갖는 "단백질"이라 함은 살충성이 있는 것으로 당업자에 의해서 평가되는 단백질, 예를 들면 시험에 1-3 및 5-7과 동일한 조건하에서 행한 실험에서 살충성이 있는 것으로 평가되는 단백질을 의미한다.
본 발명에 의한 살충성 단백질은 시험예에 나타낸 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera) 및/또는 파리목(Diptera)에 대해서 살충성을 갖는다. 특히, 밤나방과 나비목으로 분류되는 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura)및 플루텔라 키실로스텔라(Plutella xylostella)에 대해서 높은 살충성을 나타낸다.
나비목으로 분류되는 곤충의 예로 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura), 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua), 마메스타 브라시캐(Mamesta brassicae), 플루텔라 키실로스텔라(Plutella xylostella), 하이판트리아 쿠니아(Hyphantria cunea), 아독소 피스 종(Adoxophyes sp.), 오토그라파 니그리시그나(Autogrpha nigrisigna), 및 피어리스 라패(Pieris rapae)를 포함한다.
딱정벌레목으로 분류되는 곤충의 예로 아노말라 쿠푸리아(Anomala cuprea) 포필리아 자포니카(Popillia japonica), 리소르 홉트러스 오리조필러스 (Lissorhoptrus oryzophilus), 및 오울라코포라 페모랄리스(Aulacophora femoralis)를 포함한다.
파리목으로 분류되는 곤충의 예로 열대숲모기(Aedea aegypti)및 홍모기 (Culex pipens)를 포함한다.
본 발명에 의한 살충성 단백질은 결정성 단백질 봉입체의 형태이어도 좋다. 이와 같은 형태의 단백질은, 본 발명에 의한 살충성 단백질을 미생물, 특히 형질전환한 대장균으로 발현시킴으로써, 또는 본 발명에 의한 신균주 SSK-10을 배양함으로써 얻을 수 있다. 대장균에 있어서 발현의 방법은 후술한다.
본 발명에 의한 살충성 단백질은 용해한 결정성 단백질 봉입체의 형태이어도 좋다. 이와 같은 형태의 단백질은, 예를 들면, 본 발명에 의한 단백질을 알칼리성 용매에 용해시켜서 얻을 수 있다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 살충성 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 이 뉴클리오티드 서열의 전형적인 서열은 서열번호 1의 DNA 서열의 일부 또는 전부를 갖는 것이다.
본 발명의 살충성 단백질의 아미노산 서열이 주어지면, 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 용이하게 결정되고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 여러가지의 뉴클레오티드 서열을 선택할 수 있다. 따라서 본 발명에 의한 살충성 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열번호 1의 DNA서열의 일부 또는 전부에 가해 동일 아미노산을 코드하는 DNA 배열에 있어서 축충관계에 있는 코돈을 DNA서열로서 갖는 서열도 의미하는 것으로 하고, 또한 이들에 대응하는 RNA 서열도 포함한다.
본 발명에 의한 뉴클레오티드 서열은 천연 유래의 것이어도, 전부 합성한 것이어도 좋고, 또 천연물 유래의 일부를 사용하여 합성을 행한 것이어도 좋다.
본 발명의 살충성 단백질을 코드하는 유전자는 예를 들면 이하의 방법에 의하여 SSK-10 균주로부터 단리시킬 수 있다. 우선, SSK-10 균주의 세포로 부터 DNA를 추출하고, 적당한 제한효소로 절단한 후, 파지 벡타(phage Vector)또는 플라스미드 벡타를 이용하여 SSK-10 균주의 DNA로 되는 라이브러리(library)를 제작했다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 부터 적당한 프라이머를 합성하고, 이어서 SSK-10 유래 DNA를 주형으로한 PCR를 행해서 유전자의 DNA 단편을 증폭한다. 이어서, 상기 DNA 단편을 프루브(probe)로서 사용하여, 유전자의 전장쇄 DNA를 단리하기 위하여 라이브러리를 스크리닝(screening)했다.
DNA 단편을 프로브로하여 스크리닝을 행하는 방법 이외에, 본 발명에 의한 살충성 단백질에 대하여 항체를 제작하고, 이 항체를 이용하여 염색체 라이브러리 또는 CDNA 라이브러리의 스크리닝을 행하여 유전자를 단리할 수가 있다.
또, SSK-10 균주 유래의 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 의한 살충성 단백질을 코드하는 유전자의 오픈리딩 프레임(Open Reading Frame(ORF))의 5'말단 및 3'말단의 프라이머를 합성하고, 이들을 이용해서 PCR 증폭을 행해서 신규 유전자의 전장쇄 DNA를 단리할 수 있다.
또한, 유전자의 전장쇄 DNA는 염색체 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 유전자 공학의 분야에서 관용되고 있는 방법 ; 예를들면 부분 아미노산 서열의 정보를 기초로하여 제작한 적당한 DNA 탐침을 이용하여 스크리닝을 행함으로써 얻어질 수 있다.
유전자에 변이를 도입하는 방법으로서는 시판되고 있는 뮤타지네시스 키트(mutagenesis kit)를 사용하는 방법, 또는 변이가 들어있는 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 방법("PCR와 그의 응용", 사카끼바라 요시유끼등 편, 요도사(羊土社)발행, 제 63-67 페이지, 1990년)등을 들 수가 있다.
본 발명에 의하면, 본발명에 의한 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포내에서 복제가능하고, 뉴클레오티드 서열이 코드하는 단백질이 발현 가능한 형태로 존재하는 벡타가 제공된다.
또한, 본 발명에 의하면 벡터에 의해서 형질전환된 숙주세포가 제공된다. 이 숙주 벡터계는 특히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 다른 단백질과 융합된 단백질의 발현계가 사용될 수 있다.
벡터의 예로, Ti 플라스미드 벡터등의 폴라스미드 벡터를 포함한다. 본 발명에 의한 벡터는 이 벡터를 실제로 숙주세포에 도입하여 목적 단백질을 발현시키기 위하여, 본 발명에 의한 뉴클레오티드 서열 이외에, 그의 발현을 제어하는 서열(예를들면, 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 인핸서 서열, 전사조절용역, 및 SD 서열)이나,숙주 세포를 선택하기 위한 유전자 마커(예를들면, 네오마이신 내성 유전자 및 가나마이신 내성 유전자)등을 함유해도 좋다. 또한, 벡터는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 반복한 형(예를들면, 직렬형 (tandem form))으로 포함해도 좋다. 이 서열은 통상의 방법에 의하여 벡터내에 존치시켜도 좋고, 이 벡터에 의한 숙주 세포의 형질전환은 이 분야에서 한용되고 있는 방법을 사용하여 행할 수 있다. 본 발명에 의한 벡터는 유전자 공학 분야에서 관용되고 있는 방법 및 기술을 사용하여 구축할 수 있다.
숙주세포의 예로 미생물, 예를들면 대장균, 수도모나스 종(Pseudomonas sp.)등의 그람음성균, 바실루스 종 등의 그람양성균, 및 곰팡이 및 효모등의 진균류(Eumycestes)를 포함한다.
형질전환된 숙주 세포(예를들면, 대장균)를 적당한 배지에서 배양하고, 이 배양물로부터 본 발명에 의한 살충성 단백질을 얻을 수가 있다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 살충성 단백질의 제조방법이 제공된다. 형질전환된 숙주세포의 배양 및 그의 조건은 사용하는 세포에 대해서 그 것과 실질적으로 동일한 것이 좋다. 또, 배양액으로 부터 본 발명에 의한 살충성 단백질의 회수 및 정제도 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 의하면 Bt균 뿐만 아니라, 그 이외의 이종생물(예,마생물,식물등)에 있어서도, 살충성 단백질을 안정적으로 또한 대량으로 생산할 수 있다. 또한, SSK-10균주 이외의 Bt균에 본 발명에 의한 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써, 살충활성이 증진되고, 보다 광범위의 곤충을 효과적으로 제어할 수 있는 형질절환된 Bt균을 제작할 수 있다.
또한, SSK-10 균주에 1개 이상의 외래 Bt 살충성 단백질 유전자를 도입함으로써 살충활성이 증진되고, 보다 광범위한 곤충을 효과적으로 제어 또는 구제할 수 있는 형질전환된 Bt균주를 생산하는 것은 당업자에게 명확하다.
본 발명에 의하면, 숙주로서 식물 세포 또는 식물을 선택할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 해충에 내성인 형질전환된 식물을 제공한다. 형질전환 식물로서, 단자엽 식물(예를들면, 벼, 옥수수, 밀 및 아스파라거스)및 쌍자엽 식물(예를들면, 감자, 사탕 무우, 당근, 콜리플라워(cauliflower), 상치, 토마토, 가지, 담배, 메론, 오이, 콩, 사과, 오렌지, 딸기, 포플라, 목화, 카네이션, 피튜니어(petunia), 자주개자리 및 민트)을 들 수가 있다.
식물세포 또는 식물로의 유전자 도입은, 파티클 건(particle gun)법, PEG법, 일렉트로포레이션(electroporation)법 및 마이크로인젝션(microinjection)법 등의 직접도입법, 또는 아가로박테리움(Agarobacterium)의 Ti 플라스미드 벡터에 의한 간접도입법에 의해 행할 수 있다. 쌍자엽 식물 및 그의 세포의 형질전환은, 예를들면, Vaeck M. et al.방법 (Nature, 328, 33-37, 1987)에 따라서, 그리고 단자엽 식물 및 그의 세포의 형질전환은, 예를들면, Hong Y. et al. 방법(Scientia Agricultura Sinica, 22, 1-5, 1989)에 따라서 실시할 수 있다.
형질전환된 식물 세포를 재분화시켜 완전한 식물체를 얻을 수 있는 것은 당업자에게 명확하다.
본 발명에 의하면 해충내성의 형질전환된 식물의 종자가 제공된다. 본 발명에 의한 종자는, 형질전환된 식물세포를 재생해서 얻은 식물, 또는 형질전환된 식물로 부터 얻을 수 있다.
해충구 제제 및 해충구제법
본 발명에 의한 단백질은 살충활성을 갖는다. 그러므로, 본 발명은 유효성분으로서 본 발명의 살충성 단백질로 되는 해충 구제제를 공급한다. 여기서 "해충구제제"라 함은 식물보호제, 해충 방제제, 살충제 및 방충제 등을 포함하는 의미로 사용되는 것이다.
본 발명에 의한 해충구제제에 함유되는 단백질의 살충활성을 증진시키기 위하여, 이 단백질을 SSK-10균주가 생산한 아포와 조합해서 사용하는 것이 바람직하다.
용해된 결정성 단백질 봉입체의 살충활성은 아포와 조합하여 사용하면 재생된다. (후술하는 시험에 참조). 그리하여, 용해된 결정성 단백질 봉입체를 유효성분으로서 사용하는 경우, 용해된 결정성 단백질 봉입체는 아포와 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 용해된 결정성 단백질 봉입체는 소화효소가 적은 해충의 구제이 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 신균주는 상기한 바와 같이 살충성 단백질을 생산한다. 그러므로, 본 발명의 또 하나의 실시태양은 본 발명에 의한 신균주로 이루어지는 해충구제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 실시태양은 본 발명에 의한 살충성 단백질을 생산하도록 형질전환된 미생물로 이루어지는 해충구제제를 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 해충구제제는 본 발명에 의한 신균주, 형질전환된 미생물, 또는 본 발명에 의한 살충성 단백질을 전부 또는 일부 조합해서 함유해도 좋다.
본 발명에 의한 해충구제제는, 일반적으로 해충이 만연했거나 또는 만연하는 것이 예상되는 식물에, 예를 들면 물 또는 기타 적당한 희석제로 희석한 해충 구제제 또는 희석하지 않은 해충구제제로 산포할 수 있다.
본 발명에 의한 해충구제제는 해충이 만연하기 쉬운 광범위의 식물을 보호하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 방법으로 보호되는 중요한 식물의 구체에는, 양배추 등의 야채류, 모란채(broccoli)등의 과채류, 옥수수, 목화, 감자, 벼, 감귤,및 낙엽과수 등을 열거할 수 있다. 이들 이외에도, 가로, 공원, 조림지 및 천연 삼림등의 비농경지 수목등을 들 수가 있다.
본 발명의 방법으로 박멸될 수 있는 해충은 상기한 것들이다.
본 발명에 의한 해충구제제는, 예를 들면 SSK-10균주의 배양액 또는 본 발명에 의한 살충성 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 형질전환 미생물의 배양액을 농축하고(예를들면, 원심 분리 또는 여과), 이어서 소망의 적당한 배합제(예를들면, 계면 활성제, 습윤제, 고체 희석제, 분산제 및 자외선 안정제등)를 첨가하여, 수화제,분제, 유출제(flowable agent) 등의 소망하는 제형으로 얻을 수 있다.
또, 본 발명의 해충구제제 조성물은, 필요에 의해 및/또는 소망에 의해, 제제시 또는 산포시에, 각종 살충제, 살균제 또는 살진균제, 제초제, 식물성장조절제, 공력제(供力劑)(배양 상징액 중에 함유되는 활성증강물질등 도 포함된다.), 유인제, 식물영양제, 비료 등을 포함해도 좋고, 또한, 본 발명에 의한 균주 이외의 Bt균이나, 본 발명에 의한 단백질 이외의 살충성 단백질을 함유해도 좋다.
본 발명에 의하면, 해충의 피해를 받고 있거나, 또는 받을 우려가 있는 식물을, 본 발명에 의한 살충성 단백질, 본 발명에 의한 신균주 및/또는 본 발명에 의한 살충성 단백질을 생산하도록 형질전환된 미생물로 처리하는 해충구제방법이 제공된다.
여기서, 「해충구제방법」이라 함은, 해충으로 부터 식물을 보호하는 방법, 해충방제방법, 살충방법, 방충방법 등을 포함하는 의미로 이용되는 것이다.
본 발명에 의한 해충구제방법에 있어서는, 본 발명에 의한 살충성 단백질, 본 발명에 의한 신균주, 및/또는 본 발명에 의한 살충성 단백질을 생산하도록 형질전환된 미생물을 그대로 살포해도 좋고, 상기 해충구제제를 그대로 또는 희석하여살포해도 좋다. 해충구제방법에 의하여 박멸되는 해충 및 보호되는 식물은 해충구제제와 동일하다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 상술하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 본 발명의 Bt균 SSK-10 균주의 선발
일본 전국으로 부터 토양 및 먼지 샘플을 채집하고, 오바(大庭)등의 방법.(J. Invertebrate Pathology, 제47권, 제12페이지, 1986년)에 따라서 Bt균을 단리했다. 단리한 Bt균을 보통영양한천 배지(육 엑기스 1.0% , 펩톤 1.0% , Nacl 0.5% ,한천 2.0%, pH 7.2)로 배양한 후, 생성되는 아포와 CI와의 혼합물을 긁어내어 멸균수에 현탁하여 소정농도의 아포와 CI의 혼합현탁액을 제조했다. 이 현탁액을 직경 5㎝의 양배추 잎 절편에 처리하며 여러가지의 해충에 섭식시켜서 Bt균의 살충활성을 판정했다.
그 결과, 스포돕테라 리투라에 대하여 가장 살충활성이 높은 SSK-10 균주를 선택했다.
실시예 2 : CI의 정제
본 발명의 SSK-10균주를 멸균수에 현탄한 후, 보통 영양한천배지 균일하게 도포하여 28℃에서 5일 동안 배양했다. 아포 형성 및 CI생산이 확인된 후, 평판배지에 멸균 증류수를 첨가하고, 원심분리하여 아포 및 CI 혼합물의 펠릿을 회수하여 멸균 증류수로 3회 세정했다. 이어서, 생성되는 펠릿을 소량의 멸균 증류수에 현탁 시킨 후, R. Milne법(J. Invertebrate Pathology, 제 29권, 제 230 페이지, 1977년)에 의한 우로그라핀(urografin) 밀도구배(40 ~ 70%)에 의해 CI를 단리시키고, 물로 3회 세정했다. 단리한 CI를 다시 우로그라핀 밀도구배 (60 ~ 70%)법으로 정제한 후, 물로 5회 세정했다. 단리한 CI를 위상차 현미경하에서 순도 99% 이상인 것을 확인하고, 이어서 동결건조했다. 그 결과, 아포-CI 혼합물 펠릿 1g(습중량)으로부터 CI 35㎎(건조 중량)을 얻었다. 대조물로 사용하기 위하여, HD-1 균주를 사용하여 동일한 방법으로 CI를 제조했다.
실시예 3 : SSK-10균주의 액체배양
보통 영양액체배지(육엑기스 0.3%, 글루코스 0.5%, 펩톤 0.4%, Nacl 0.1%, pH7.2, 5㎖/6분 시험관)에 할천배지상에서 생육한 SSK-10균주의 1백금이(白金耳)를 식균하고, 28℃에서 10 ~ 24시간 동안 왕복진탐 배양했다. 이와 같이하여 얻은 배양액 0.5㎖를 보통영양액체 배지 100㎖를 넣은 500㎖용 에를렌 마이어 플라스크 중에서 접종하고, 28℃에서 2일동안 회전진탕 (250rpm)배양시킨 후, 배양액을 원심분리(15,000rpm, 20분)하여 고형 잔류물로서 펠릿을 얻었다.얻어진 펠릿을 적당량의 물로 3회 세정하고, 다시 원심분리(15,000rpm, 20분)하고, 이어서 동결건조해서 삼각 플라스크 1개당 약 400㎎의 동결건조물을 얻었다. 이와 같이하여 얻은 건조물을 칭량하고, 증류수로 희석한 후, 각종 해충에 대한 살충시험에 제공했다.
대조물로 사용하기 위하여, HD-1 균주를 이용하여 동일한 방법에 의해 건조물을 제조했다.
시험예 1 : 스포돕테라 리투라에 대한 CI의 살충활성
실시예 2의 방법으로 조제한 CI를 소정농도로 희석하고, 전착제를 첨가하고, 이 시험액을 양배추잎 절편에 살포하고, 플라스틱컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯마리의 스포돕테라 리투라 3령유충(令幼衷)을 방충했다. 이어서, 컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일 후에 생사를 판정하여 프로비트법(pwbit inethod)에 의해 중간치사농도(LC50)를 산출했다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.
표 2
스포돕테라 리투라에 대한 CI의 살충활성
시 료 명 LC50(ppm)
SSK- 10HD -1(대조) 7.5＞250
이와 같이, 스포돕테라 리투라에 대한 SSK-10 균주의 CI의 살충활성은 HD-1균주의 CI의 살충보다 30배 이상인 것을 알았다.
시험예 2 : 플루텔라 키실로스텔라에 대한 CI의 살충활성
실시예 2의 방법으로 조제한 CI를 소정농도로 희석하고, 전착제를 첨가하고, 이 시험액을 양배추잎 절편에 살포하고, 플라스틱컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯마리의 플루텔라 키실로스텔라 2령유충을 방충했다. 이어서,컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일 후에 생사를 판정하여 프로비트법(Probit method)에 의해 중간치사농도(LC50)를 산출했다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
표 3
플루텔라 키실로스텔라에 대한 CI의 살충활성
시 료 명 LC50(ppm)
SSK - 10HD - 1(대조) 0.794.0
이와 같이, 플루텔라 키실로스텔라에 대한 SSK-10 균주의 CI의 살충활성은 HD-1 균주의 CI의 살충활성보다 5배 이상인 것을 알았다.
시험예 3 : Bt제 내성 플루텔라 키실로스텔라에 대한 SSK-10 균주의 효과
효고켄 이와오까(兵庫縣岩岡)지구에서 HD-1균주를 주성분으로 하는 기존의 Bt제에 내성인 플루텔라 키실로스텔라(이와오까계) 곤충을 채집하고, 이 내성 곤충계에 대한 SSK-10 균주의 효과를 감수성 곤충계에 대한 효과와 비교했다. 실시예 3의 방법으로 제조한 건조물을 전착제를 첨가한 용액으로 소정농도로 희석하고, 이 시험액을 양배추잎 절편에 산포하고, 플라스틱컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯마리의 이와오까계 플루텔라 키실로스텔라 또는 감수성계 플루텔라 키실로스텔라 2령유충을 방충했다. 이어서, 컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일후에 생사를 판정했다. 대조약으로서는, 토아로(Toaro) CT 수화제〔東亞合成化學工業(株)〕를 이용했다.
프로비트법에 의해 중간치사농도(LC50)를 산출하고, 이와오까계 곤충에 대한 LC50을 감수성계 곤충에 대한 LC50으로 나누어서 저항성비를 산출했다.
그 결과를 표 4에 나타냈다.
표 4
Bt제 내성 플루텔라 키실로스텔라에 대한 살충활성
시 료 명 저 항 성 비
SSK - 10토아로 CT수화제*(대조) 3.5950.1
*東亞合成化學工業(株)
시험예 4 : SSK-10 균주가 생산하는 CI의 용해성과 안정성
실시예 2의 방법으로 제조한 SSK-10 균주 및 HD-1 균주의 CI를 50mM Na2C03-NaNCO3용액(pH 9.5)에 현탁하고, 37℃에서 유지했다. 30분 후에, 샘플링하여 원심분리했다. 원심분리하기 전의 현탁액 및 원심분리한 후의 상징액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다. 용해율을 상징액 중의 130kd 단백질의 양을 원심분리 전의 현탁액 중의 130kd 단백질의 양으로 나누어서 산출하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
표 5
CI의 용해도
시 료 명 용 해 율(%)
SSK - 10HD - 1 ＞90＜50
또한, 37℃로 유지한 현탁액에서 소정시간 후 샘플링하여, 130kd 단백질의 양을 SDS - 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 분석했다.
현탁 직후(0시간)의 단백질의 양을 100스로 하고, 시간경과에 따른 안정성을 잔존하는 단백질의 백분율로서 나타냈다. 그 결과를 하기 표6에 나타냈다.
표 6
CI의 안정성
시 료 명 단백질 잔존율 (%)
0시간 후 2시간 후 6시간 후 24시간 후
SSK - 10HD - 1 100 100 100 15 100 85 40 0
시험예 5 : 스포돕테라 리투라에 대한 CI 및 SCI의 살충활성
(1) CI 용액의 제조
실시예 2의 방법으로 제조한 SSK - 10 균주의 CI에 전착제를 함유한 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 소정 농도가 되도록 희석했다.
(2) SCI 용액의 제조
실시예 2의 방법으로 제조한 SSK - 10 균주의 CI를 50mM Na2Co3-NaHCO3용액(pH 9.5)에 현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 가온했다. 용해시킨 후, 원심분리에 의해 상징액을 얻었다. 이 상징액에 전착제를 함유한 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 소정농도로 희석했다.
(3) 살충활성의 측정 및 결과
상기 (1) 및 (2)의 방법으로 제조한 CI 및 SCI 용액을 양배추잎 절편에 산포하고, 플라스틱 컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯마리의 스포돕테라 리투라 3령유충을 방충했다. 이어서, 컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일 후에 생사를 판정했다. 그 결과를 하기 표 7에 나타냈다.
표 7
CI 및 SIC의 스포돕테라 리투라에 대한 살충활성
시 료 명 사 망 율
CI (100 ppm)SCI (100 ppm) 1000
시험예 6 : 스포돕테라 리투라에 대한 살충활성에 미치는 아포의 효과
실시예 3의 방법으로 제조한 CI 및 아포를 함유하는 SSK-10 균주 건조물을 50mM Na2CO2-NaHCO3용액(pH 9.5) 에 현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 가온했다. CI가 완전히 용해한 것을 현미경으로 확인한 후, 원심분리하여 상징액 (SCI를 함유하는 획분) 및 침전물 (아포를 함유하는 획분)을 얻었다.
또, 실시예 2의 방법으로 얻은 CI를 SSK-10 균주 건조물 중에 함유되는 CI와 같은 농도가 되도록 조제하여 시험에 제공했다.
각각의 시료를 전착제를 함유한 용액으로 소정농도로 희석하여, 양배추잎 절편에 산포했다. 플라스틱컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯 마리의 스포돕테라 리투라 3령유충을 방충했다. 컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일 후에 생사를 단정했다. 그 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
표 8
스포돕테라 리투라에 대한 살충활성에 미치는 아포의 상승효과
시 료 명 CI 또는 SCI의 농도(ppm) 아포의 농도(ppm) 사 망 율 (%)
SCICISCI + 아포CI + 아포아포 252525250 757575 60751000
시험예 7. 홍모기(Culex pipiens)에 대한 살충활성
실시예 3의 방법으로 제조한 SSK-10균주 건조물을 탈이온수로 소정농도로 희석하여 페트리 접시에 옮겼다. 이 접시에 부화 4일째의 홍모기 유충 20마리를 방충하고, 25℃의 항온실에 수용했다.
24시간 후, 생사를 판정하여 프로비트법에 의하여 중간치사 농도(LC50)를 산출한 결과 37.2ppm이였고, SSK-10균주 건조물은 파리목(Diptera)곤충에도 살충활성을 나타내는 것이 판명되었다.
실시예 4 : SSK-10 균주가 생산하는 신규 살충성 단백질 유전자의 클로닝
(1) SSK-10 균주(FERM BP-6162)를 Luria-Bertani (LB) 배지에서 28℃에서 철야 배양했다. 원심분리하여 집균한 후, ISOPLANT (Nippon Gene사)를 사용하여 첨부된 매뉴얼을 따라 DNA를 단리했다. 단리한 DNA는 Sau3 A에 의해 부분 분해한 후, 알칼리 포스파타제로 처리하여, DNA 단편의 5'말단을 탈일산화했다. 이 DNA 달편을 파지 벡터의 Lambda DASH Ⅱ(Stratagene사)에 삽입했다. 이와 같이하여 얻어진 재조합 파지 벡터를 Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract(Stratagene사)에 의해 첨부된 매뉴얼에 따라서 시험관내 패키징(in vitro packaging)을 행했다. 그 후, 이 재조합 파지를 대장균 XL1-Blue MRA(P2)균주에 감염시키고, 평판 배양하여 플래크(plagues)를 형성시켰다.
(2) 프로브(probes)의 제조
SSK-10 균주의 살충성 단백질 유전자도 기지의 Bt살충성 단백질 유전자 사이에서 양호하게 보존된 영역을 갖는 것으로 생각되었다. 그리하여, 기지의 Bt살충성 단백질 유전자의 염기서열을 분석하여, 양호하게 보존된 2개소의 영역에 상당하는 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 합성했다. 이들의 프라이머를 사용하여, SSK-10 균주로 부터 단리한 DNA를 주형으로하여 PCR를 행한 결과, 약 1Kb의 DNA단편이 증폭하여, 이들의 프라이머에 의해 SSK-10균주의 살충성 단백질 유전자를 증폭할 수 있는 것이 분명해졌다. 하기 (3)의 스크리닝(screening)에는, 반응액 중에 fluoresclin-11-dUTP(Amersham사)를 혼입한 PCR에 의해서 증폭하는 플루어레신 표지 DNA를 프로브로서 사용했다.
(3) 신규 살충성 단백질 유전인자의 스크리닝
(1)에서 제조한 플래크상에 형성된 플레이트상에 Hybond-Nt 멤브레인 (Amersham사)을 놓고, 플래크를 부착했다. 이 멤브레인을 알칼리로 처리하여, 멤브레인상의 재조합 파지 DNA를 1본쇄(本鎖)에 변성시켜 멤브레인에 흡착시켰다. 파지 DNA가 흡착한 멤브레인을 폴리에틸렌 자루에 넣고, Hybridization Buffer Tablets(Amersham사)을 사용하여 제조한 완충액을 첨가하여 밀봉한 후, 65℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 여기에, 상기 플루어레신 표지 프로브를 열변성하여 첨가하고, 65℃에서 철야 교잡(hybridization)을 행했다. 그 후, 멤브레인을 세정하고, 플루어레신 표지 플래크를 알카리 포스포타제 표지 항플루어레신 항체로 표지했다. 이와 같이하여, 알카리 포스파타제로 표지한 플래크를 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드와 X-포스페이트로 발색시켜 프로브에 감하게 교잡하는 플래크를 가시화하여 양성 클론을 선발했다. 이 양성 클론으로 부터 프로브에 상동한 영역의 5'상부 영역과 3'하부 영역을 포함하는 DNA 단편을 제한효소에 의해 분할시켜서 pBluescript Ⅱ(Stratagene사)에 서브클로닝(subcloning)했다.
(4) 염기서열의 결정
(3)에서 제조한 재조합 pBluescript Ⅱ로 부터, Kilo-seguence용 Deletion Kit(寶酒造社)를 사용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라서 결합한 DNA 단편의 길이가 약 300 bp씩 짧아진 결실 클론(deletion clone)을 제작했다. 이들 결실 클론의 염기서열의 결정은 Dye Terminator Cycle Seguencing Ready Reaction (Perkin Elmer사)을 이용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라서 반응을 행하고, 373A DNA Sequencer(Perkin Elmer사)에 의해 분석함으로써 행했다. 이와 같이하여 결정한 SSK-10 균주의 신규 살충성 단백질 유전자를 함유하는 3867bp의 DNA 단편의 염기서열을 서열표의 서열번호 1에 나타냈다. 이 염기서열은 3453bp의 ORF를 포함하고, 이 ORF는 1150 아미노산, PI 4.79, 129.9kd의 단백질을 코드했다. 이 단백질의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 2에 나타냈다.
(5) 상동성 (homology) 검색
SSK-10균주의 신규 살충성 단백질 유전자의 염기서열은 데이타 베이스를 사용한 상동성 검색(GenBank, EMBL, DDBJ. PDB sequences)의 결과, 기지의 Bt살충성 단백질 유전자에 대하여 상동성이 낮고, 가장 유사한 Cry9Cal(B. Lambert et al., Appl. Environ. Microbiol., 제62권, 제80 페이지, 1996년)에 대해서도 아미노산 레벨에서 71%의 상동성 밖에 없었다. Bt 살충성 단백질은, 130kd로 부터 140kd의 프로톡신으로서 생산되고, 이 것이 곤충의 중장내에서 60kd로 부터 70kd의 톡신으로 분해된다. 실제로는, 이 톡신이 살충활성을 나타내고, 프로톡신의 C말단측은 본질적인 살충활성에 필요없는 것으로 알려져 있다(H. Hofte ＆ H.R. Whiteley; Microbiol. Rev., 제 53권, 제242 페이지, 1989년). 여기서, 활성에 필요한 N말 단측에 있는 1내지 700번째의 아미노산에 한해서 상동성 검색(Genbank CDS translations, PDB, SwissProt, PIR)를 행하면, 가장 유사한 Cry9Cal에 대해서도 60%의 상동성 밖에 나타내지 않으며, 이 유전자는 분명히 새로운 유전자인 것을 알았다.
실시예 5 : 신규 살충성 단백질 유전자의 전사
(1) SSK-10 균주로 부터 RNA의 단리
1백금이의 SSK-10균주를 LB배지 20㎖에 식균하고, 28℃에서 배양했다. 배양 개시 후, 13.0, 16.5, 20.0, 23.5 시간째에 배양액 0.5㎖를 샘플링했다. CI는 위상차현미경하에서 배양개시 후 16.5시간 째로 부터 관찰되기 시작했다. 샘플링한 배양액은 즉시로 원심분리하여 집균한 후, RNeasy Mini Kit(Qiagen사)를 사용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라서 RNA를 단리했다. 이와 같이하여 단리한 RNA는 DNase처리를 행하고, 혼입한 DNA를 분해한 후, 이하에 기술하는 Reverse Transcriptase(RT)-PCR에 의한 분석에 사용했다.
(2) RT - PCR에 의한 전사의 분석
PCR에 사용한 프라이머로서는, 서열번호 5의 서열 (서열번호 1의 461-480에 상당)과 서열번호 6의 서열(서열번호 1의 1021-1040에 상당)을 사용했다. 전사의 분석은, RNA PCR Kit(AMV) Ver.2.1(寶酒造社)을 사용한 RT-PCR에 의해 행하고, 역전사 반응의 프라이머로서 랜덤노나-뉴클레오티드(random nona-nucleotides)를, PCR의 프라이머로서 상기 프라이머를 사용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라서 반응을 행했다. 각 샘플에 대해서 리버스 트랜스크립타제(reverse transriptase)를 넣지 않고 동일한 반응을 행하여, RNA 샘플에 DNA가 혼입해 있지 않은 것을 확인했다. 반응 종료후, 2% 아가로스 겔로 전기영동을 행하고, 전기영동후 겔을 에티디움 브로마이드 용액(ethidium bromide solution)중에서 배양하고, 그 후 UV조사하에서 사진촬영을 행했다. 이 결과를 도 1에 나타냈다. 이와 같이, SSK-10 균주의 신규 살충성 단백질 유전자는, CI 생산에 수반하여 명백히 전사되어 있는 것을 알았다.
실시예 6 : 신규 살충성 단백질의 대장균에서의 발현과 얻어진 단백질의 살충활성
(1) 단백질 발현용 벡터의 제조
신규 운전자의 번역개시코돈(ATG, 서열번호 1의 211)의 상류 3염기(AGT)를 CAT로 치환하고, NdeI의 인식인결(CATATG)로 변경했다. 이 NdeI 사이트로부터 신규 운전자의 종지코돈(TGA)의 7염기 하류에 BamHI 사이트(GGATCC, 서열번호 1의 3670)까지의 단편을, 단백질 발현용 벡터인 pET-lla(Stratagen사)의 NdeI와 BamHI 사이트 사이에 삽입했다. 이와 같이하여, 신규 살충성 단백질을 대장균에서 생산하기 위한 벡터를 제조했다.
(2) 대장균에서의 신규 살충성 단백질의 발현과 정제
상기 (1)에서 제조한 벡터를, 단백질 발현용의 대장균 BL21(DE3)균주에 도입했다. 신규 살충성 단백질의 생산은, 첨부 매뉴얼에 따라, 이소프로필--D-티오-갈락토피라노시드(IPTG)에 의해서 단백질 발현을 유도함으로써 행했다.
IPTG의 존재하에서 배양한 대장균은, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로, 약 130kd의 신규 살충성 단백질을 생산하고 있는 것이 확인 되었다. 이 단백질은 대장균 중에서 봉입체로서 생산되고 있고, 이 봉입체는 균체를 리소짐(lysogyme)및 DNase I로 처리한 후, 원심분리함으로써 침전물로서 정제할 수 있다.
(3) 신규 살충성 단백질의 살충활성
a) 스포돕테라 리투라에 대한 신규 살충성 단백질의 살충활성 신규 살충성 단백질로서는 상기(2)에서 정제한 시료를 사용하고, 아포로서는 시험예 6에서 제조한 아포를 최종농도 100mg/l이 되도록 첨가했다. 각각의 시료를 전착제를 함유한 용액으로 소정농도로 희석하며, 양배추잎 절편에 산포했다. 이 절편을 플라스틱컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯 마리의 스포돕테라 리투라 3령유충을 방충했다. 컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일 후에 생사를 판정했다.
그 결과를 하기 표 9에 나타냈다.
표 9
스포돕테라 리투라에 대한 신규 살충성 단백질의 살충활성
시 료 명 살충성 단백질의 농도(ppm) 살 충 율
신규 살충성 단백질신규 살충성 단백질+아포*아포* 1001000 500
일반적으로, 밤나방과의 소화액 중의 강력한 프로테아제 때문에, 용해한 CI의 스포돕테라종에 대한 살충활성은, 용해하기 전의 CI에 비해 약해지는 것이 알려져 있다. 또, 대장균에 의해 생산되는 결정구조를 갖지 않는 Bt 살충성 단백질도, Bt에 의해 생산되는 동일한 유전자 유래의 CI에 비해 밤나방과에 대해서는 살충활성이 약한 것이 알려져 있다(M. Keller et al., Insect Biochem. Molec. Biol., 제 26권, 제 365 페이지, 1996년). 이 현상은 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, SSK-10 균주의 CI에 있어서도 관찰 되었지만, 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 용해에 의한 활성의 저하는 아포의 첨가에 의해 회복했다. 대장균에 있어서 생산한 신규 살충성 단백질의 활성도, 상기 표 9에 나타낸 바와 같이 단속으로는 인정되지 않았지만, SSK-10 균주의 아포를 첨가함으로써, 2의 살충활성이 회복되었고, 신규 살충성 단백질은 SSK-10 균주의 CI의 활성을 재현하고 있는 것으로 결론 되었다.
b) Bt제 내성 플루텔라 키실로스텔라에 대한 신규 살충성 단백질의 효과
오사까후에서 채집된 플루텔라 키실로스텔라(내성계)에 대한 신규 살충성 단백질의 효과를 감수성 계통에 대한 효과와 비교했다.
SSK-10 균주는, 실시예 3의 방법으로 제조한 건조물을 사용했다.
각각의 시료를 전착제를 첨가한 용액으로 소정농도로 희석하고, 양배추잎 절편에 산포하고, 이 절편을 플라스틱컵 중에서 공기 건조시킨 후, 컵당 다섯마리의 내성계 또는 감수성계 플루텔라 키실로스텔라 3령유충을 방충했다. 컵에 덮개를 하여 25℃의 항온실에 수용하고, 3일 후에 생사를 판정했다. 대조약으로서는, Toaro-CT 수화제(東亞合成化學工業(株))를 사용했다.
결과는 프로비트법에 의해 중간치사농도(LC50)를 계산하고, 내성계에 대한 LC50을 감수성계에 대한 LC50으로 나눠서 저항성비를 산출했다. 결과를 하기 표10에 나타냈다.
표 10
Bt제 내성 플루텔라 키실로스텔라에 대한 신규 살충성 단백질의 살충활성
시 료 명 저 항 설 비
신규 살출성 단백질SSK - 10Toaro - CT 수화제*(대조) 0.353.2116.3
*東亞合成化學工業(株)
이와 같이, 신규 살충성 단백질은 Bt제 내성 플루텔라 키실로스텔라에 대하여 높은 살충활성을 나타내는 것이 명백해졌다.
다음에, 본 발명의 각종 제제의 배합비율 및 종류의 예를 이하에 기재한다.
제제예 1 : 수화제
본 발명의 CI 및 아포함유물 50%
Sorpol 8070 (음이온 계면활성제, 東邦化學工業(株) 상품명) 10%
Newkalgen WG-2 (음이온계면활성제, 竹本油脂(株) 상품명) 5%
Cellogen (카복시메틸셀룰로스, 第一工業製藥(株) 상품명) 3%
중성 무수 황산나트륨 16%
Radiolite #200 16%
이상을 균일하게 혼합분쇄하여 수화제로 한다.
사용시에는, 상기 수화제를 500 ~ 4000 배로 희석하여 살포한다.
제제예 2 : 분제(粉劑)
본 발명의 CI 및 아포함유물 3%
Carplex #80 (화이트 카본: 鹽野義製藥(株) 상품명) 1%
인산 디이소프로필 2%
활석 94%
이상을 균일하게 혼합 분쇄하여 분제로 한다.
제제예 3 : 플로아블제 (flowable agent)
본 발명의 CI 및 아포 함유물 30%
폴리에틸렌 글리콜 5%
키산탄 검(Xanthan gum) 0.2%
Newkalgen FS-1(비이온형 계면활성제, 竹本油脂(株) 상품명) 3%
Newkalgen FS-4(음이온형 계면활성제, 竹本油脂(株) 상품명) 5%
실리콘 0.1%
물 6.7%
본 발명의 CI및 아포함유 성분을 제외하고,
상기 성분을 균일하게 용해하고, 여기에 본 발명의 CI 및 아포함유물을 첨가해서 양호하게 교반한 후, 습식 분쇄하여 플로아블제를 얻는다. 사용시에는, 상기 플로아불제를 25 ~ 2000배로 희석하여 살포한다.

Claims (25)

  1. 수탁번호 FERM BP-6162의 것으로 기탁된 균주 SSK-10.
  2. 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
    (a) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열, 또는
    (b) 1이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 또는 삽입되고,
    또한 살충활성을 갖는 서열번호 2 기재의 아미노산 서열.
  3. 제 2항 기재의 단백질을 코드하는 뉴클레오티드.
  4. 제 3항에 있어서, 서열번호 1기재의 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드.
  5. 제 3항 기재의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 벡터.
  6. 제 3항 기재의 뉴클레오티드 서열 또는 제 5항 기재의 벡터로 이루어지는 숙주세포.
  7. 제 6항에 있어서, 숙주세포가 미생물인 숙주세포.
  8. 제 6항에 있어서, 숙주세포가 대장균인 숙주세포.
  9. 제 2항에 있어서, 단배질이 결정성 단백질 봉입체의 형태인 단백질.
  10. 제 2항에 있어서, 단백질이 용해된 결정성 단백질 봉입체의 형태인 단백질.
  11. 제 2항에 있어서, 단백질이 제 1항 기재의 균주 또는 제 6항 기재의 숙주세포에 의해서 생산되는 것인 단백질.
  12. 제 1항 기재의 균주, 제 6항 기재의 숙주세포, 및/또는 제 2항 기재의 단백질을 유효성분으로서 함유하는 해충 구제제.
  13. 제 2항 기재의 단백질과 제 1항 기재의 균주의 아포를 함유하는 해충 구제제.
  14. 제 9항 기재의 결정성 단백질 봉입체와 제 1항 기재의 균주의 아포를 함유하는 해충 구제제.
  15. 제 10항 기재의 용해된 결정성 단백질 봉입체와 제 1항 기재의 균주의 아포를 함유하는 해충 구제제.
  16. 해충의 피해를 받고 있거나, 또는 해충의 피해를 받을 우려가 있는 식물을, 제 1항 기재의 균주, 제 7항 기재의 미생물, 및/또는 제 2항 기재의 단백질로 처리하는 것으로 이루어진 해충 구제 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 해충이 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 또는 파리목(Diptera)에 속하는 것인 해충 구제 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 해충이 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura), 플루텔라 키실로스텔라(Plutella xylostella), 또는 홍모기(Culex pipiens)로 되는 군 중에서 선택되는 것인 해충 구제 방법.
  19. 제 3항 기재의 뉴클레오티드 서열 또는 제 5항 기재의 벡터로 이루어지는 식물세포.
  20. 제 19항에 있어서, 식물세포가 종자를 생산할 수 있는 식물로 재생되는 것인 식물세포.
  21. 제 3항 기재의 뉴클레오티드 서열 또는 제 5항 기재의 벡터로 이루어지는 종자.
  22. 제 21항에 있어서, 종자가 종자를 생산할 수 있는 식물로 생장된 것이 종자.
  23. 제 3항 기재의 뉴클레오티드 서열 또는 제 5항 기재의 벡터로 이루어지는 식물.
  24. 제 23항에 있어서, 식물이 종자를 생산할 수 있는 것인 식물.
  25. 제 21항에 기재의 종자를 발아시킴으로써 얻어질 수 있는 식물.
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