CN1240002A - 芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质 - Google Patents

芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质 Download PDF

Info

Publication number
CN1240002A
CN1240002A CN97180416A CN97180416A CN1240002A CN 1240002 A CN1240002 A CN 1240002A CN 97180416 A CN97180416 A CN 97180416A CN 97180416 A CN97180416 A CN 97180416A CN 1240002 A CN1240002 A CN 1240002A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
thr
asn
ala
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97180416A
Other languages
English (en)
Inventor
尾山和彦
今村圭一
御堂直树
谷野茂树
加藤明子
岩田道显
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Seika Kaisha Ltd
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Seika Kaisha Ltd filed Critical Meiji Seika Kaisha Ltd
Publication of CN1240002A publication Critical patent/CN1240002A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明的目的是提供不仅具有针对鳞翅目昆虫，而且具有针对其它昆虫的杀虫活性的Bt菌，由所说的Bt菌产生的杀虫蛋白质，编码所说的蛋白质的基因，产生所说的杀虫蛋白质的宿主，以及虫害消除剂。根据本发明的新菌株是菌株SSK－10，其被分类为苏云金芽孢杆菌，以保藏号FERM BP－6162保藏。根据本发明的蛋白质包含(a)在SEQ ID NO：1中所描述的氨基酸序列，或者(b)SEQ ID NO：2中所描述的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加或插入。

Description

芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质
发明背景
发明所属技术领域
本发明涉及消除虫害有效的苏云金芽孢杆菌新菌株，由该菌株产生的晶状蛋白质包含体，包含所说的包含体的杀虫蛋白质，和编码这一蛋白质的基因。此外，本发明还涉及昆虫消除剂和消除昆虫的方法。
背景技术
与化学合成杀虫剂相比，微生物杀虫剂对天然环境影响小，而且被认为是化学合成杀虫剂的一种有效的替代品。事实上，从19世纪60年代早期起，含有作为有效成分的苏云金芽孢杆菌菌体细胞(下文称作″Bt菌″)或由这些细菌产生的晶状包含体(下文称作″CIs″)的微生物杀虫剂(下文称作″Bt剂″)已被用来防治鳞翅目的各种昆虫。
Bt菌是革兰氏-阳性菌，在孢子形成期细胞中产生CIs(H.Hofte和H.R.Whiteley；微生物评论，53，242，1989)。昆虫摄食一定的它们敏感的CIs后，几个小时内将终止摄食并死去。由于CIs的这种作用对昆虫是特异性的，Bt剂对其它动物与植物没有毒性，因此被认为是十分安全的杀虫剂。
包含CIs的杀虫蛋白质由Bt菌的质粒或基因组DNA中编码的基因的转录和翻译产生。迄今为止，已分离了一百种以上编码杀虫蛋白质的基因，但是已经知道所说的编码蛋白质的杀虫活性不同，是它们的氨基酸序列的函数(P.A.Kumar等，应用微生物进展，42，1，1996)。因此认为，具有新的杀虫活性的Bt菌株具有新的杀虫蛋白质基因。
苏云金芽孢杆菌血清变型Kurstaki HD-1(下文称作″HD-1″)(害虫和植物病害的微生物防治，1970-1980，编者H.D.Burges，学院出版社，pp.35-44，1981)是市售Bt剂中最常用的Bt菌株。
包含作为有效成分的HD-1的Bt剂已经在消除对合成农业化学品已产生显著抗性的鳞翅目小昆虫(如小菜蛾)方面有效。然而，最近报道了小菜蛾田间菌株的检测结果，发现其已产生了对HD-1的抗性，这在害虫防治中形成一个严重的问题。
此外，归类为鳞翅目的夜蛾科斜纹夜蛾大昆虫，由于对合成杀虫剂灵敏度低，防治起来困难，而且它们可以对植物造成毁坏性的破坏。事实上，没有这类昆虫(如夜蛾科的斜纹夜蛾)能通过常规的Bt剂有效地防治，开发有效的Bt剂是合乎需要的。
夜蛾科的昆虫，特别是Spodoptera sp对Bt剂极端不灵敏有以下可能的原因：
(1)Spodoptera sp没有任何可以结合到CIs中杀虫蛋白质上的受体(Shuichiro Inagaki，Seibutsu to Kagaku，30，74，1992)
(2)CIs中的蛋白质被消化，吸收，或者在Spodoptera的消化液中失活，使所说的蛋白质不可能达到靶受体。
同样，已经需要开发对夜蛾科昆虫具有杀虫活性的新CIs。
大多数由天然环境分离的Bt菌对鳞翅目昆虫或任何其它昆虫没有杀虫活性。极少数菌株显示出防治目标昆虫的实用的杀虫活性，可能是因为Bt菌产生的CIs通过以下过程杀死所说的昆虫：
(1)昆虫摄食CIs，
(2)CIs在消化道中溶解产生前毒素(杀虫蛋白质)，
(3)前毒素通过酶活化为毒素(加工过程)，
(4)活化的毒素(所加工的杀虫蛋白质)结合在昆虫的中肠(mid-gut)细胞的受体上，形成微孔，和
(5)昆虫的中肠细胞分解。
消化道环境因昆虫不同各异，并与昆虫的膳食密切相关。因此，只有当昆虫将它们和其它食物一起摄入时，CIs失活或活化成为杀虫的，不同昆虫也不同，因此相信，只有步骤(1)到(5)在昆虫中肠完成，CIs才对该昆虫具有杀虫活性。
另一方面，已知孢子(在Bt菌的生活史中的一个阶段)具有对CIs的杀虫活性的显著协同作用。R.Milne等(苏云金芽孢杆菌的分析化学，编者L.A.Hickle美国化学学会p22，1990)曾报道由于孢子的存在，两种CIs的杀虫活性被反转。W.J.Mear等(应用环境微生物61，2086，1995)曾报道仅摄食Bt菌产生的CIs的昆虫比摄食CIs和孢子混合物的昆虫易变得更有抗性。这些报道表明由Bt菌产生的两个组分，即CIs和孢子，在与昆虫相互作用中密切相关。因此，研究者正专心研究孢子在昆虫中抑制对Bt剂抗性的发展中的作用。
发明概要
本发明发明人现已成功地分离了一种Bt菌株，其可有效防治广谱昆虫。这一菌株在防治昆虫(包括夜蛾科家族的昆虫)上非常有效。
而且，本发明发明人已发现所说的Bt菌株产生的CIs与菌株HD-1产生的CIs相比，在碱性条件(pH9至10)下具有更大的可溶性和稳定性；单是CIs即对斜纹夜蛾和小菜蛾具有高水平的杀虫活性；CIs和孢子组合比单纯的CIs对斜纹夜蛾具有更高的杀虫活性；而且加溶的(solubilized)CIs和孢子共存时，杀虫活性可以再现。
此外，本发明发明人已确定了这一Bt菌株产生的杀虫蛋白质的氨基酸序列，并且分离了编码这一氨基酸序列的基因。
因此，本发明的一个目的是，提供不仅对鳞翅目昆虫而且对其它昆虫具有杀虫活性Bt菌。本发明的另一个目的是，提供由所说的Bt菌产生的杀虫蛋白质、编码所说蛋白质的基因、具有所说基因的载体、以及具有所说基因的宿主。
本发明的另一个目的是提供能产生杀虫蛋白质的转化的植物、消除虫害的药剂和消除虫害的方法。
按照本发明的新菌株是菌株SSK-10，其以保藏号PERM BP-6162保藏在工业科学技术机构的国立生物科学和人体技术研究所。这一菌株被分类为苏云金芽孢杆菌。
按照本发明的杀虫蛋白质具有以下氨基酸序列，(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或(b)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中在SEQ ID NO：2中的一个或多个氨基酸被取代或被缺失，或者一个或多个氨基酸被添加或被插入到SEQ ID NO：2的氨基酸序列中。微生物的保藏
按照本发明的新菌株SSK-10已于1996年11月12日保藏在工业科学技术机构的国立生物科学和人体技术研究所(1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba city，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-6162。
              附图简要描述
图1说明按照本发明的杀虫蛋白质的基因的转录分析的结果。有RT：利用有RT的反应溶液。没有RT：利用没有RT的反应溶液。
                发明详述微生物
SSK-10菌株是从Sakado市Saitama县的家庭尘埃中分离的。其特征在表1中显示。
                  表1菌落特性：典型的Bt菌大菌落，有一个无色的表面。生长期细胞形态：典型的Bt菌。形态特性：可变的杆菌(1.0~1.2μ×3.0~5.0μ)。革兰氏染色：阳性。孢子形态：椭圆。观察不到由孢子造成的孢子囊显著膨胀。鞭毛的血清型：分类为H7(或者血清变型aizawai)*细胞内含物：大的双金字塔形晶状蛋白质包含体(SDS-PAGE测得分子量大约130kDa)。杀虫蛋白质：分类为Cry9n。同源性研究显示即使与同源性最大的Cry9Cal(应用环境微生物，62，p80，1996)也仅有71％的同源性。需氧/厌氧特性：兼性厌氧细菌。生化特性：过氧化氢酶反应    阳性
      卵磷脂酶反应      阳性
      VP反应            阳性*H血清的制备和菌株的分类根据M.Ohba和K.Aizawa，无脊椎动物病理学杂志，15，139-140，1978进行。
有关本发明新菌株产生的CIs和孢子的非常特别的特性更具体地解释如下。
J.D.Tang(应用环境微生物，62，564，1996)曾报道CryI杀虫蛋白质的特征，已知CryIC对夜蛾科的noctuids特别有效，但是对小夜蛾的昆虫，它的杀虫活性大约仅是HD-1菌株产生的CryIA(a)的杀虫活性1/10。而且，包含CryIC和CryIA的Bt菌，正如日本公开专利出版物509235/1993所揭示的，其杀虫活性比HD-1菌株的杀虫活性对Spodoptera fruqiperda而言高三倍，对小夜蛾而言高两到数倍。相对而言，由菌株SSK-10的细胞产生的CIs比由菌株HD-1的细胞产生的CIs，对斜纹夜蛾的杀虫活性至少高30倍，对小夜蛾的杀虫活性至少高五倍。在碱性条件下(pH9～10)，菌株SSK-10的CIs比菌株HD-1的CIs有更特异的溶解性和更高的稳定性。
此外，菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因碱基序列的同源性检索(GenBank，EMBL，DDBJ，PDB序列)显示与已知Bt杀虫蛋白质基因的小的同源性。即使是与同源性最高的Cry9Cal相比，在氨基酸水平仅发现71％的同源性(B.Lambert等，应用环境微生物，62，80，1996)。Bt杀虫蛋白质以分子量为130kd～140kd的前毒素产生，然后在昆虫中肠中消化成60kd～70kd的毒素。事实上，已知这一毒素有杀虫活性，前毒素的C-末端位点是不需要的(H.Hofte和H.R.Whiteley，微生物回顾，53，242，1989)。这样，在有限的氨基酸序列(即对杀虫活性所需的从N-末端位点的第1个到第700个氨基酸)上进行同源性检索(GenBank CDS翻译物，PDB，SwissProt，PIR)。观察到所说的杀虫蛋白质基因与同源性最高的Cry9Cal只有60％的同源性，清楚地表明这一基因是一个新基因。
这些研究结果表明菌株SSK-10是一种新菌株，产生一种新的CI。
此外，杀虫活性由将菌株SSK-10细胞产生的孢子与CIs组合得到提高，杀虫活性由组合自身没有任何杀虫活性的加溶的CIs(下文称作SCIs)与所说的孢子得到恢复。而且发现，这些作用可以以与普通培养中相同的孢子/CIs比，达到相当可观的程度。因此，利用CIs(或SCIs)和本发明新菌株SSK-10产生的孢子，可提供一种虫害防治的高效Bt剂。
本发明的SSK-10菌株的细胞可在普通条件下培养。例如，利用包含碳源(如葡萄糖)和氮源(如大豆粉)的培养基，在20到40摄氏度间的一适当培养温度下，可进行培养。培养优选地在需氧条件下进行，同时通气搅拌1至4天。杀虫蛋白质及其基因
本发明提供了由菌株SSK-10的细胞产生的杀虫蛋白质。
按照本发明的杀虫蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。此外，按照本发明的杀虫蛋白质可以具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中一个或多个(例如一个到几个)氨基酸添加或者插入到SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，或者SEQ ID NO：2中的一个或多个(例如一个到几个)氨基酸被取代或缺失。应当清楚，通过参考SEQ ID NO：2的序列，本领域技术人员可以添加，插入，取代或缺失SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的氨基酸而没有任何特殊的困难。
在本发明中，术语“具有杀虫活性的蛋白质”指本领域技术人员评估为杀虫的蛋白质；例如，在与试验实施例1～3和5～7相同的条件下进行的实验中评估为杀虫的蛋白质。
如实施例所示，按照本发明杀虫蛋白质对鳞翅目，鞘翅目和/或双翅目具有杀虫活性。尤其对分类为鳞翅目夜蛾科的斜纹夜蛾和小菜蛾具有高的杀虫活性。
分类为鳞翅目的昆虫例子包括斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甘蓝夜蛾(Mamesta brassicae)，小菜蛾(Plutella xylostella)，美国白蛾(Hyphantria cunea)，褐带卷蛾的种(Adoxophyes sp.)，Autographa nigrisigna，及小菜粉蝶(Pieris rapae)。
分类为鞘翅目的昆虫例子包括Anomala cuprea，日本弧丽金龟(Popillia japonica)，Lissorhoptrus oryzophilus，及Aulacophora femoralis。
分类为双翅目的昆虫例子包括埃及伊蚊(Aedea aegypti)和尖音库蚊(Culex Pipiens)。
按照本发明杀虫蛋白质可以是晶状蛋白质包含体形式的。这种形式的蛋白质可以通过在微生物中(尤其是在转化的大肠杆菌中)表达本发明的杀虫蛋白质获得，或通过培养本发明新菌株SSK-10的细胞获得。在大肠杆菌中表达的方法将在下文阐述。
按照本发明杀虫蛋白质可以是加溶(solubilized)晶状蛋白质包含体形式的。这种形式的蛋白质可以通过在碱性溶剂中溶解本发明的蛋白质获得。
本发明提供了编码本发明的杀虫蛋白质的核苷酸序列。这一核苷酸序列的典型序列具有SEQ ID NO：1的全部或部分DNA序列。
当给出本发明的杀虫蛋白质的氨基酸序列时，也就容易确定编码这一蛋白质的核苷酸序列，可以选择编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，编码按照本发明的杀虫蛋白质的核苷酸序列包括，作为SEQ ID NO：1的DNA序列的遗传密码简并结果的DNA序列，相对应于所说DNA序列的RNA序列。
本发明的核苷酸序列可以是天然衍生物，采用部分天然序列全合成或半合成的。
编码本发明的杀虫蛋白质的基因可以从菌株SSK-10中分离，例如，按以下方法：首先，从菌株SSK-10的细胞中抽提DNA，用适当的限制性酶切割，然后用噬菌体载体或质粒载体构建包含菌株SSK-10的DNA的文库。从SEQ ID NO：1的核苷酸序列合成适当的引物，然后以来自SSK-10的DAN为模板进行PCR，扩增所说基因的DNA片段。以所说的DNA片段作为探针来筛选文库以分离所说基因的全长DNA。
或者，可以通过制备本发明的杀虫蛋白质的抗体，然后利用这一抗体筛选基因组文库或者cDNA文库来分离所说的基因。
此外，可以通过以来自菌株SSK-10的DNA为模板合成编码本发明的杀虫蛋白质的基因的开放读框的5’末端和3’末端引物，并利用它们进行PCR扩增来分离新基因全长DNA。
也可以用遗传工程领域的常规方法，经筛选染色体文库或cDNA文库来获得所说基因的全长DNA；例如，利用基于部分氨基酸序列构建的适当DNA探针。
突变可以引入到基因中，例如，通过利用市售的诱变试剂盒，或者利用包含突变的引物进行PGR(“PCR及其应用”，编者YoshiyukiSakakibara等，Yodosha，pp63-67，1990)。
本发明提供了一种载体，在该载体中本发明的核苷酸序列以这样的方式存在：在宿主细胞中其可复制，该核苷酸序列编码的蛋白质可以表达。
此外，本发明提供了一种载体转化的宿主细胞。这一宿主-载体系统不受特别限制；例如，可以利用与另一蛋白质融合的蛋白质的表达系统。
载体的例子包括质粒载体，如Ti质粒载体。
为了经把载体引入宿主细胞来表达靶蛋白，除本发明的核苷酸序列之外，本发明的载体可以具有控制表达的序列(例如，启动子序列，终止子序列，增强子序列，转录调节区和SD序列)，选择宿主细胞的基因标记(例如，新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因)。而且，载体可以具有重复形式(例如，一前一后形式)的本发明的核苷酸序列。所说的序列可用任何普通的方法置入载体，可以使用本领域常规的方法用这一载体转化宿主细胞。可以用遗传工程领域常用的方法和技术构建本发明的载体。
宿主细胞的例子包括微生物(例如，革兰氏-阴性菌如大肠杆菌和假单胞菌属的种，革兰氏-阳性菌如芽孢杆菌属的种，及真菌纲如真菌和酵母)。
转化的宿主细胞(例如，大肠杆菌)在合适的介质中培养，可以从这一培养产物获得本发明的杀虫蛋白质。因此，本发明的另一个实施方案提供了制备本发明的杀虫蛋白质的方法，转化的细胞可以在与源细胞实质上相同的条件下培养。而且，用常规方法回收和纯化从培养液得到的本发明的杀虫蛋白质。
因此，本发明的杀虫蛋白质稳定大量的供给不仅可以在Bt菌中进行，而且也可以在其它异种生物体(意即，微生物，植物，等等)中进行。本发明的核苷酸序列插入Bt菌(而不是插入菌株SSK-10)被认为提高杀虫活性，使得构建有效防治更广范围的昆虫的转化的Bt菌株成为可能。
此外，本领域技术人员清楚一个或多个外源Bt杀虫蛋白质基因可以导入菌株SSK-10以提高杀虫活性，以便产生可以有效防治或杀死更广范围的昆虫的转化的Bt菌菌株。
按照本发明，可以选择植物细胞或植物作为宿主。因此，本发明提供了对昆虫具有抗性的转化的植物。转化的植物的例子包括单子叶植物(例如，稻米，玉米，小麦，芦笋)和双子叶植物(例如，土豆，甜菜，胡萝卜，花椰菜，莴苣，番茄，茄子，烟草，甜瓜，黄瓜，黄豆，苹果，桔子，草莓，杨树，棉花，康乃馨，矮牵牛，苜蓿，薄荷)。
基因可以导入植物细胞或者植物，例如，通过直接基因转移(如粒子枪，PEG，电穿孔法，及显微注射)，或者利用农杆菌的Ti质粒载体进行间接基因转移。例如，用Vaeck M.等的方法(自然，328，33-37，1987)可以转化双子叶植物及其细胞，例如，用Hong Y.等的方法(Scientia Agricultura sinica，22，1-5，1989)可以转化单子叶植物及其细胞。本领域技术人员清楚，转化的植物细胞可以再分化以获得完整的植物。
本发明提供了具有对昆虫的抗性的转化的植物的种子。本发明的种子可以由转化的植物细胞再分化获得的植物、或转化的植物获得。虫害消除剂和虫害消除方法
按照本发明的蛋白质具有杀虫活性。因此，本发明可以提供包含作为有效成分的本发明的杀虫蛋白质的虫害消除剂。术语“用于消除虫害的药剂(虫害消除剂)”如本文所用的包括植物保护剂，昆虫防治剂，杀虫剂，以及虫害防护剂。
为了提高本发明的虫害消除剂中蛋白质的杀虫活性，优选地使用与菌株SSK-10产生的孢子组合的所说蛋白质。
如果与孢子组合起来，加溶晶状蛋白质包含体的杀虫活性将再生(参见实施例，稍后论述)。因此，如果的晶状蛋白质包含体用作有效成分，优选地利用所说的加溶蛋白质包含体与孢子的组合。优选地使用加溶蛋白质包含体消除有少量消化酶的害虫。
本发明的新菌株产生如上所述的杀虫蛋白质。因此，本发明的另一个实施方案提供了包含本发明的新菌株的虫害消除剂。
本发明的另一个实施方案提供了包含如此转化以产生本发明的杀虫蛋白质的微生物的虫害消除剂。
本发明的虫害消除剂可以包含本发明的新菌株的细胞，转化的微生物，或者杀虫蛋白质，单独地或者它们的任意组合体。
本发明的虫害消除剂可以用于被虫害侵染的植物或有可能被侵染的植物，可以用未稀释的药剂喷射或用以水或其它合适的稀释剂稀释的药剂喷射。
本发明的虫害消除剂可以用来保护宽范围的植物，在这些植物上虫害有可能成倍增加。用本发明的方法保护的重要植物的例子包括：蔬菜(如甘蓝，椰菜和其它有花的蔬菜)，玉米，棉花，土豆，稻米，柑橘类水果，以及落叶水果树。也包括非农业树木(如在街道上，公园中，人造林地和天然森林中的树木)。
可以用本发明的方法防治的虫害是以上所论及的那些。
本发明的虫害消除剂可以由例如以下方法得到：浓缩(例如，通过离心或者过滤)菌株SSK-10的培养液或转化的微生物(其中导入了编码本发明的杀虫蛋白质的基因)的培养液，然后将所说的浓缩物与所需的合适的药剂(例如，表面活性剂，润湿剂，固体稀释剂，分散剂，及UV稳定剂)组合，以产生所需的制剂，如可湿性粉剂，粉剂，可流动药剂等。
如果必要和/或如果需要，当制备制剂或者在喷射时，本发明的虫害消除组合物可以与各种杀虫剂，杀菌剂或杀真菌剂，杂草防治剂，植物生长调节剂，增效剂(包括培养上清液中包含的活性增强物质)，诱导剂，植物营养物，肥料等组合。此外，组合物可以含有不同于本发明的菌株的Bt菌菌株，以及不同于本发明的蛋白质的杀虫蛋白质。
本发明提供了用本发明的杀虫蛋白质、本发明的新菌株的细胞和/或被转化以产生本发明的杀虫蛋白质的微生物经处理植物(这些植物已被或可能被害虫侵染)来消除虫害的方法。
本文所使用的术语“用于消除虫害的方法”包括保护植物使之免受虫害侵害的方法，防治虫害的方法，杀虫方法，抗虫害的方法等。
按照本发明，在消除虫害中，本发明的杀虫蛋白质，本发明的新菌株的细胞，和/或被转化以产生本发明的杀虫蛋白质的微生物，可以不经进一步的配制即可喷射，或者在稀释或不稀释的情况下喷射。防治的虫害和保护的植物与以上有关虫害消除剂中的描述是相同的。
                实施例
本发明进一步通过下列实施例加以说明，但它们不用来限制本发明。实施例1：Bt菌的SSK-10菌株的选择
从日本各处收集土壤和尘埃样品，并根据Ohba等描述的方法(无脊椎动物病理学杂志，47，12，1986)分离Bt菌。将分离的Bt菌培养在常规的琼脂营养培养基(1.0％肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，2.0％琼脂，pH值7.2)上，然后到下所形成的孢子和CIs的混合物并悬浮在无菌水中，以制备特定浓度的孢子与CIs的悬液。用该悬浮处理一些甘蓝叶的小片(直径为5cm)，并喂给各种昆虫以估价Bt菌的杀虫活性。
结果，选择到对斜纹夜蛾具有最高杀虫活性的菌株SSK-10。实施例2：CIs的纯化
将本发明的SSK-10菌株的细胞悬浮在无菌水中，均匀地平板接种在常规琼脂营养培养基上，并在28℃下培养5天。当确认已形成孢子及产生CI后，添加无菌蒸馏水至平板培养基中，通过离心回收混合的孢子和CIs的离心沉淀，然后以无菌蒸馏水洗涤3次。接着，将所形成的离心沉淀悬浮在少量的无菌蒸馏水中，根据R.Milne的方法(无脊椎动物病理学杂志，29，230，1977)通过urografin密度梯度法(40％至70％)分离CIs，并且用水洗涤3次。再一次用urografin密度梯度法(60％至70％)纯化所分离的CIs，然后用水洗涤纯化的CIs 5次。用相差显微镜鉴定分离的CIs，其至少为99％，然后冻干。结果，从1g(湿重)孢子-CIs混合物离心沉淀中获得35mg(干重)的CIs。利用菌株HD-1以相同的方式制备CIs以作为对照。实施例3：菌株SSK-10细胞的液体培养物
将一铂环的SSK-10菌株的培养物(其培养在琼脂培养基上)接种在常规的液态营养培养基(0.3％肉膏，0.5％葡萄糖，0.4％蛋白胨，0.1％NaCl，pH值7.2，5ml/试管)上。将试管放置在往复运动的振荡器中并在28℃下培养10至24小时。将这样获得的培养液的0.5ml部分接种在位于500ml锥形瓶中的100ml常规液态营养培养基上。将该锥形瓶放置在旋转摇床(250rpm)上并在28℃培养2天，接着离心该培养液20分钟(15,000rpm)以获得离心沉淀的固体残渣。用适量的水洗涤离心沉淀3次，再一次以15,000rpm离心20分钟，然后冻干以获得每锥形瓶约400mg的冻干产物。称重这样获得的干燥产品，用蒸馏水稀释，然后进行抗各种昆虫的杀虫活性的试验。利用菌株HD-1以相同的方式制备干燥产物作为对照。试验实施例1：CI抗斜纹夜蛾的杀虫活性
将通过实施例2的方法所制备的CIs稀释至特定的浓度，并添加润湿剂。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡的情况，用概率值法计算中值致死浓度(LC50)。结果见表2。表2：CIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性
    样品     LC50(ppm)
SSK-10     7.5
HD-1(对照)     ＞250
该试验显示菌株SSK-10的CIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性比菌株HD-1的杀虫活性高30倍。试验实施例2：CIs抗小菜蛾的杀虫活性
将通过实施例2的方法所制备的CIs稀释至特定的浓度，并添加润湿剂。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放小菜蛾的第二龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况，用概率值方法计算中值致死浓度(LC50)。结果见表3。表3：CIs抗小菜蛾的杀虫活性
    样品     LC50(ppm)
SSK-10     0.79
HD-1(对照)     4.0
该试验显示菌株SSK-10的CIs抗小菜蛾的杀虫活性比菌株HD-1的杀虫活性高5倍。试验实施例3：菌株SSK-10对具有Bt-剂抗性能力的小菜蛾的作用
在Hyogo县Iwaoka区捕获小菜蛾昆虫(Iwaoka系)，这种昆虫对现有的由菌株HD-1的细胞作为主要组分组成的Bt剂具有抗性。将菌株SSK-10对这些抗性系的昆虫的功效与对敏感系昆虫的功效进行比较。将通过实施例3的方法所制备的干产物用补充了润湿剂的溶液稀释至特定的浓度。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放小菜蛾Iwaoka系的第二龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。利用Toaro-CT可湿性粉剂(Towagosei Chem.KK)作为对照化学药品。用概率值法计算中值致死浓度(LC50)，抗性比通过Iwaoka系昆虫的致死浓度值除敏感系昆虫的致死浓度值进行计算。
致死浓度＝(Bt-剂抗性昆虫的LC50)/(Bt-剂敏感系昆虫的LC50)
结果见表4。表4：抗Bt-剂抗性小菜蛾的杀虫活性
    样品     抗性比
SSK-10Toaro-CT可湿性粉剂(对照)     3.5950.1
*Towagosei Chem.KK试验实施例4：菌株SSK-10产生的CIs的溶解性和稳定性
将用实施例2的方法制备的菌株SSK-10的CIs和HD-1悬浮在50mM Na2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并保持在37℃。30分钟后，收取样品并离心。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析离心前的悬液及离心后的上清液。溶解度通过130kd蛋白质在上清液中的量除以离心前的悬液中的130kd蛋白质的量进行计算。结果见表5。表5：CIs的溶解度
    样品     死亡率
SSK-10HD-1     ＞90＜50
此外，在规定的时间从保持在37℃下的悬液中收取样品，并用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析130kd蛋白质的量。悬浮时(0小时)蛋白质量为100，时间稳定性以剩下蛋白质的百分比形式进行表达。结果见表6。表6：CIs的稳定性
    样品     剩余蛋白质(％)
0小时   2小时  6小时  24小时
SSK-10HD-1 100     100    100    15100     85     40     0
试验实施例5：CIs和SCIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性
(1)CI溶液的制备
添加补充了润湿剂的溶液至用实施例2的方法所制备的菌株SSK-10的CIs中，并将混合物稀释至特定的浓度。
(2)SCI溶液的制备
将用实施例2的方法制备的菌株SSK-10的CIs悬浮在50mMNa2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并将该悬液保持在37℃1小时。溶解后，离心得到上清液，添加补充了润湿剂的溶液至该悬液中，并将混合物稀释至特定的浓度。
(3)杀虫活性的测量及结果
用上述(1)和(2)制备的CI溶液和SCI溶液喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。
结果见表7。表7：CIs和SCIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性
    样品     死亡率
CI(100ppm)SCI(100ppm)     1000
试验实施例6：孢子对抗斜纹夜蛾的杀虫活性的作用
将用实施例3的方法制备的菌株SSK-10的细胞的干产物(其含有CIs和孢子)悬浮在50mM Na2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并将该悬液保持在37℃下1小时。在用显微镜下确认CIs完全溶解后，通过离心获得上清液(该组分含有SCIs)及沉淀(该组分含有孢子)。单独地，将用实施例2的方法获得的CIs制备成与菌株SSK-10的干产物的浓度相同的浓度，并进行试验。用补充了润湿剂的溶液稀释每个样品至特定的浓度，用该样品溶液喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。
结果见表8。表8：孢子对抗斜纹夜蛾的杀虫活性的协同作用
样品 CI或SCI浓度(ppm) 孢子浓度(ppm) 死亡率
SCICISCI＋孢子CI＋孢子孢子     252525250     00757575     060751000
试验实施例7：抗尖音库蚊的杀虫活性
用去离子水稀释通过实施例3的方法制备的菌株SSK-10细胞的干产物至特定浓度，并放置在陪替氏培养皿中。将孵育了4天的20只尖音库蚊幼虫释放在平皿中，将平皿放置在温箱中25℃。
24小时后观察存活或死亡情况，用概率值法计算中位值致死浓度(LC50)为37.2ppm。这样，该试验表明菌株SSK-10细胞的干产物也具有抗分类为双翅目的昆虫的杀虫活性。实施例4：菌株SSK-10产生的新杀虫蛋白质的基因的克隆
(1)菌株SSK-10的基因组文库的构建
28℃下在Luria-Bertani(LB)培养基中过夜培养菌株SSK-10(FERM BP-6162)的细胞。通过离心收集细胞，利用ISOPLANT(Nippon基因)按照所附手册分离DNA。利用Sau3部分消化分离的DNA，并用碱性磷酸酶进行处理，则所产生的DNA片段的5′端被去磷酸化。将该DNA片段插入到噬菌体载体中，λDASH II(Stratagene)。按照所附的手册利用Gigapack III Gold包装物(Stratagene)对这样获得的重组噬菌体载体进行体外包装。接着，用所说的重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)菌株的细胞，然后在平板上进行培养以获得噬菌斑。
(2)探针的构建
也假定菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因具有在已知Bt杀虫蛋白质基因中的完全保守区。因此，分析已知Bt的杀虫蛋白质基因中的碱基序列，并合成与2个完全保守区(SEQ ID NO：3和4)对应的引物。利用这些引物和从SSK-10分离的DNA作为模板经PCR扩增了约1kb的DNA片段。这证明利用这些引物可扩增菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因。在下述(3)描述的筛选中，将荧光素-标记的DNA片段(其通过反应溶液中混合了荧光素-11-dUTP(Amersham)的PCR进行扩增)作为探针。
(3)新杀虫蛋白质基因的筛选
将Hybond-N＋膜(Amersham)放置在平板上，上述(1)的噬斑在该膜上形成，并且噬斑粘附在该膜上。用碱处理膜，使膜上的重组噬菌体DNA变性成单链，变性的DNA吸附在膜上。将具有吸附的噬菌体DNA的膜放置在聚乙烯袋子中，添加利用杂交缓冲液片剂制备的缓冲液(Amersham)，然后密封袋子，并在65℃温育1小时。在添加荧光素-标记的探针(其通过加热已变性)后，65℃下杂交过夜。然后，洗涤膜，并用碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体标记荧光素标记的噬斑。利用氮蓝四唑氯化物和X-磷酸处理这些以碱性磷酸酶标记的噬斑以显色，其中这些与探针牢固杂交的噬斑是可视的，从这些中选择阳性克隆。利用限制酶从阳性克隆上切割下包含与探针同源的5′上游和3′下游区的DNA片段并亚克隆到pBluescript II(Stratagene)中。
(4)碱基序列的测序
由上述(3)构建的重组pBluescript II，利用Kilo-序列(Takara)的缺失试剂盒按照所附手册制备缺失克隆，这些缺失克隆每个均缺失一段已掺入的DNA片段的约300bp的序列。用染色终止循环测序制备反应仪(Perkin Elmer)按照所附手册对这些缺失克隆的序列进行测序，接着用373A DNA测序仪(Perkin Elmer)进行分析。这样测定的3867bp的DNA片段的碱基序列(其含有菌株SSK-1的新杀虫蛋白质基因)见SEQID NO：1。该碱基序列有3453bp的ORF，其编码129.9kd，pI4.79，并具有1150个氨基酸的蛋白质。该蛋白质的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。
(5)同源性检索
利用数据库(GenBank，EMBL，DDBJ。PDB序列)的同源性检索的结果表明：从菌株SSK-10获得的新杀虫蛋白质基因的碱基序列与已知的Bt杀虫蛋白质的基因几乎无同源性，并且在氨基酸水平上，与即使是最同源的Cry9Cal也仅仅为71％的同源性(B.Lambert等，环境微生物应用，62，80，1996)。Bt杀虫蛋白质先以130kd至140kd的毒素前体产生，然后其在昆虫的中肠内被消化成60kd至70kd的毒素。实际上已知，该毒素有杀虫活性，并且毒素前体的C端位点不为活性所需(H.Hofte和H.R.Whiteley，微生物回顾，53，242，1989)。因此，对一段有限的氨基酸序列上进行同源性检索(GenBank CDS翻译物，PDB，SwissProt，PIR)，即在杀虫性所需的从N端位点的第1个至第700个氨基酸的序列上进行同源性检索。即使是与最同源的Cry9Cal也只发现60％的同源性，这清楚地表明该基因是一个新基因。实施例5：新杀虫蛋白质基因的转录
(1)从菌株SSK-10中分离RNA
将一环SSK-10菌株的细胞接种在20ml的LB培养基上，并在28℃下培养。在开始培养后，在13.0，16.5，20.0，23.5小时分别取样0.5ml的培养物。开始培养后，16.5小时时用相差显微镜观察CIs。立即离心取样的培养液以收集细胞，利用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)按照所附手册分离RNA。用脱氧核糖核酸酶处理这样分离的RNA以分解任何DNA污染物，然后用于如下述通过反转录酶(RT)-PCR进行的分析。
(2)通过RT-PCR的转录分析
利用SEQ ID NO：5(与SEQ ID NO：1的461至480位氨基酸相对应)和SEQ ID NO：6(与SEQ ID NO：1的1021至1040位氨基酸相对应)作为PCR引物。通过RT-PCR利用RNA PCR试剂盒(AMV)Ver.2.1(Takara)分析转录。按照所附手册利用随机九-核苷酸作为逆转录反应的引物并利用上述的引物作为PCR的引物进行该反应。以相同的方式但无转录酶处理样品以确认RNA样品没有被DNA污染。在反应之后，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，之后在溴化乙锭溶液中培养凝胶，然后在紫外线灯下拍下所形成凝胶的照片。结果见图1。该分析结果表明菌株SSK-10的新杀虫蛋白质基因明显与CI产生协同转录。实施例6：新杀虫蛋白质在大肠杆菌中的表达及该蛋白质的杀虫活性
(1)蛋白质表达载体的构建
用CAT取代新基因中紧挨着翻译起始密码子(ATG，SEQ ID NO：1的211)上游的三个碱基(AGT)以将该位点改变成NdeI的识别序列(CATATG)。将从NdeI位点至位于新基因终止密码子的7个碱基下游的BamHI位点(GGATCC，SEQ ID NO：1的3670)的片段插入到pET-lla(一种蛋白质表达(Stratagene)的载体)的NdeI位点和BamHI位点之间。这样构建了在大肠杆菌中产生新杀虫蛋白质的载体。
(2)新杀虫蛋白质在大肠杆菌中的表达及该蛋白质的纯化
将上述(1)构建的载体引入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)内以表达蛋白质。按照所附手册以异丙基-β-D-巯基-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达从而使新杀虫蛋白质得以表达。通过SDS-聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳确认在IPTG存在下培养的大肠杆菌菌体已产生约130kd的新杀虫蛋白质。该蛋白质在大肠杆菌中以包含体的形式产生。利用溶菌酶和脱氧核糖核酸酶I处理大肠杆菌菌体，然后离心，纯化为沉淀的包含体。
(3)新杀虫蛋白质的杀虫活性
a)新杀虫蛋白质对斜纹夜蛾的杀虫活性
将上述(2)中纯化的新杀虫蛋白质作为试验样品，添加试验实施例6中制备的孢子直至最后的孢子浓度为100mg/L。用补充了润湿剂的溶液稀释每个样品至特定的浓度，用该样品溶液喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。结果见表9。表9：新杀虫蛋白质对斜纹夜蛾的杀虫活性
    样品 杀虫蛋白质的浓度(ppm) 昆虫死亡率(％)
新杀虫蛋白质     100     0
新杀虫蛋白质＋孢子*     100     50
孢子*     0     0
已知：由于夜蛾的消化液的强蛋白酶活性，加溶的CIs对Spodoptera sp.的杀虫活性通常比其在溶解前的活性更低。同样，已知Bt杀虫蛋白质(其由大肠杆菌产生，并且不具有晶状结构)与来源于Bt菌所产生的相同基因的CIs相比具有更低的抗夜蛾的杀虫活性(M.Keller等，昆虫生物，分子生物学，26，365，1996)。用菌株SSK-10的CIs也观察到了该现象，如表7所示，但是因溶解度而减少的活性通过添加孢子得到恢复。大肠杆菌菌体产生的新杀虫蛋白质单独无杀虫活性，如表9所示；然而，通过添加菌株SSK-10的孢子恢复了杀虫活性。这样，得出结论新杀虫蛋白质再现菌株SSK-10的CIs的活性。
b)新杀虫蛋白质对Bt-剂抗性的小菜蛾的作用
将新杀虫蛋白质抗Osaka区捕获的小菜蛾(抗性系)的作用与抗敏感系的作用进行比较。将通过实施例3的方法所制备的干产物用作为菌株SSK-10的试验样品。每个样品用补充了润湿剂的溶液稀释至特定的浓度。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放小菜蛾的抗性系或敏感系的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)，3天后观察存活或死亡情况。利用Toaro-CT可湿性粉剂(Towagosei Chem.K)作为对照化学药品。用概率值法计算中值致死浓度(LC50)，抗性比通过抗性系昆虫的致死浓度值除敏感系昆虫的致死浓度值进行计算。
结果见表10。表10：新杀虫蛋白质对Bt-剂抗性的小菜蛾的杀虫活性
    样品    抗性比
新杀虫蛋白质SSK-10Toaro-CT可湿性粉剂*(对照)     0.353.2150.1
*Towagosei Chem.KK
这表明，新杀虫蛋白质具有对Bt-剂抗性小菜蛾更高的杀虫活性。
如下给出了本发明各种制剂的组合物的例子：制剂实施例1：可湿性粉剂本发明的含有CI和孢子的物质                            50％Sorpol 807010％(阴离子型表面活性剂，商品名，Toho化学  10％工业有限公司)Newkalgen WG-2(阴离子型表面活性剂，商品名，Takemoto   5％Oil及Fat有限公司)Cellogen(羰甲基纤维素，商品名，Daiichi-Kogyo Seiyaku  3％有限公司中性无水硫酸钠                                        16％钠沸石#200                                            16％
将上述组分粉碎，并均匀地混合成可湿性粉剂。
应用时，将该可湿性粉剂稀释500至4000倍，然后喷射。制剂实施例2：粉剂本发明的含有CI和孢子的物质                            3％Carplex#80(碳黑，商品名，Shionogi有限公司)            1％二异丙基磷酸                                          2％滑石                                                  94％
将上述组分粉碎，并均匀地混合成粉剂。制剂实施例3：可流动的药剂本发明的含有CI和孢子的物质                           30％聚乙二醇                                             5％黄原胶                                               0.2％Newkalgen FS-1(阴离子型表面活性剂，商品名，Takemoto  3％Oil及Fat有限公司)Newkalgen FS-4(阴离子型表面活性剂，商品名，Takemoto  5％Oil及Fat有限公司)聚硅氧烷                                             0.1％水                                                   6.7％
除了本发明的含有CI和孢子的物质外，将上述组分均匀地溶解，添加本发明的含有CI和孢子的物质，然后充分振荡所形成的混合物，并在潮湿条件下粉碎以得到可流动的制剂。应用时，稀释可流动的药剂25至2000倍，并喷射。
                                序列表
SEQ ID NO：1
序列长度：3867
序列类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线型
分子类型：基因组DNA
假设：否
反义：否
原始来源
有机体：苏云金芽孢杆菌
菌株名称：SSK-10特征
名称/关键词：CDS
位置：211..3663
特征：P
名称/关键词：mat肽
位置：211..3660
特征：P序列描述GAACCGAAGG TTTGTAAAAA AGAAATTGGA ATAAATACCA TCCATTTTTT CAAGAAAGAT   60TTTTTTATTA GAAAGGAATC TTTCTTACAC AGGAGAATAC TAAGATTGAG AGTAGAGATA  120TATAGATGTC AATACAATAA AGAGTCTGTC AGGTTTTTTG AAAGATATGA TTTGAACATG  180TAATAGATTT ATAGTATAGG AGGAAAAAGT ATG AAT CGA AAT AAT CCA AAT GAA   234
                             Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu
                             1               5TAT GAA ATT ATT GAT GCC CCC TAT TGT GGG TGT CCG TCA GAT GAT GAT    282Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp
 10                  15                  20GTG AGG TAT CCT TTG GCA AGT GAC CCA AAT GCA GCG TTC CAA AAT ATG    330Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met25                  30                  35                  40AAC TAT AAA GAG TAT TTA CAA ACG TAT GAT GGA GAC TAC ACA GGT TCT    378Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser
             45                  50                  55CTT ATC AAT CCT AAC TTA TCT ATT AAT CCT AGA GAT GTA CTA CAA ACA    426Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr
         60                  65                  70GGT ATT AAT ATT GTG GGA AGA ATA CTA GGG TTT TTA GGT GTT CCA TTT   474Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe
     75                  80                  85GCG GGT CAA CTA GTT ACT TTC TAT ACC TTT CTC TTA AAT CAG TTG TGG   522Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp
 90                  95                 100CCA ACT AAT GAT AAT GCA GTA TGG GAA GCT TTT ATG GCG CAA ATA GAA   570Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu105                 110                 115                 120GAG CTA ATC GAT CAA AAA ATA TCG GCG CAA GTA GTA AGG AAT GCA CTC   618Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu
             125                130                 135GAT GAC TTA ACT GGA TTA CAC GAT TAT TAT GAG GAG TAT TTA GCA GCA   666Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala
        140                 145                 150TTA GAG GAG TGG CTG GAA AGA CCG AAC GGA GCA AGA GCT AAC TTA GTT    714Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val
    155                 160                 165ACA CAG AGG TTT GAA AAC CTG CAT ACT GCA TTT GTA ACT AGA ATG CCA    762Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro
170                 175                 180AGC TTT GGT ACG GGT CCT GGT AGT CAA AGA GAT GCG GTA GCG TTG TTG    810Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu185                 190                 195                 200ACG GTA TAT GCA CAA GCA GCG AAT TTG CAT TTG TTA TTA TTA AAA GAT    858Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp
            205                 210                 215GCA GAA ATC TAT GGG GCA AGA TGG GGA CTT CAA CAA GGG CAA ATT AAC    906Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn
        220                 225                 230TTA TAT TTT AAT GCT CAA CAA GAA CGT ACT CGA ATT TAT ACC AAT CAT    954Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His
    235                 240                 245TGC GTG GAA ACA TAT AAT AGA GGA TTA GAA GAT GTA AGA GGA ACA AAT   1002Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn
250                 255                 260ACA GAA AGT TGG TTA AAT TAC CAT CGA TTC CGT AGA GAG ATG ACA TTA  1050Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu265                 270                 275                 280ATG GCA ATG GAT TTA GTG GCC CTA TTC CCA TTC TAT AAT GTG CGA CAA  1098Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro Phe Tyr Asn Val Arg Gln
            285                 290                 295TAT CCA AAT GGG GCA AAT CCA CAG CTT ACA CGT GAA ATA TAT ACA GAT  1146Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp
        300                 305                 310CCA ATC GTA TAT AAT CCA CCA GCT AAT CAG GGA ATT TGC CGA CGT TGG  1194Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp
    315                 320                 325GGG AAT AAT CCG TAT AAT ACA TTT TCT GAA CTT GAA AAT GCT TTT ATT   1242Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile
330                 335                 340CGC CCG CCA CAT CTT TTT GAA AGG TTG AAC AGA TTA ACT ATT TCT AGA   1290Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg345                 350                 355                 360AAC CGA TAT ACA GCT CCA ACA ACT AAT AGC TTC CTA GAC TAT TGG TCA   1338Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr Asn Ser Phe Leu Asp Tyr Trp Ser
            365                 370                 375GGT CAT ACT TTA CAA AGC CAA CAT GCA AAT AAC CCG ACG ACA TAT GAA   1386Gly His Thr Leu Gln Ser Gln His Ala Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Glu
        380                 385                 390ACT AGT TAC GGT CAG ATT ACC TCT AAC ACA CGT TTA TTC AAT ACG ACT   1434Thr Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ser Asn Thr Arg Leu Phe Asn Thr Thr
    395                 400                 405AAT GGA GCC CGT GCA ATA GAT TCA AGG GCA AGA AAT TTT GGT AAC TTA   1482Asn Gly Ala Arg Ala Ile Asp Ser Arg Ala Arg Asn Phe Gly Asn Leu
410                 415                 420TAC GCT AAT TTG TAT GGC GTT AGC AGC TTG AAC ATT TTC CCA ACA GGT   1530Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser Ser Leu Asn Ile Phe Pro Thr Gly425                 430                 435                 440GTG ATG AGT GAA ATC ACC AAT GCA GCT AAT ACG TGT CGG CAA GAC CTT   1578Val Met Ser Glu Ile Thr Asn Ala Ala Asn Thr Cys Arg Gln Asp Leu
            445                 450                 455ACT ACA ACT GAA GAA CTA CCA CTA GAG AAT AAT AAT TTT AAT CTT TTA  1626Thr Thr Thr Glu Glu Leu Pro Leu Glu Asn Asn Asn Phe Asn Leu Leu
        460                 465                 470TCT CAT GTT ACT TTC TTA CGC TTC AAT ACT ACT CAG GGT GGC CCC CTT  1674Ser His Val Thr Phe Leu Arg Phe Asn Thr Thr Gln Gly Gly Pro Leu
    475                 480                 485GCA ACT CTA GGG TTT GTA CCC ACA TAT GTG TGG ACA CGT GAA GAT GTA  1722Ala Thr Leu Gly Phe Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr Arg Glu Asp Val
490                 495                 500GAT TTT ACG AAC ACA ATT ACT GCG GAT AGA ATT ACA CAA CTA CCA TGG  1770Asp Phe Thr Asn Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ile Thr Gln Leu Pro Trp505                 510                 515                 520GTA AAG GCA TCT GAA ATA GGT GGG GGT ACT ACT GTC GTG AAA GGT CCA  1818Val Lys Ala Ser Glu Ile Gly Gly Gly Thr Thr Val Val Lys Gly Pro
            525                 530                 535GGA TTT ACA GGA GGG GAT ATA CTT CGA AGA ACG GAC GGT GGT GCA GTT  1866Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asp Gly Gly Ala Val
        540                 545                 550GGA ACG ATT AGA GCT AAT GTT AAT GCC CCA TTA ACA CAA CAA TAT CGT  1914Gly Thr Ile Arg Ala Asn Val Asn Ala Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg
    555                 560                 565ATA AGA TTA CGC TAT GCT TCG ACA ACA AGT TTT GTT GTT AAT TTA TTT  1962Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Ser Phe Val Val Asn Leu Phe
570                 575                 580GTT AAT AAT AGT GCG GCT GGC TTT ACT TTA CCG AGT ACA ATG GCT CAA  2010Val Asn Asn Ser Ala Ala Gly Phe Thr Leu Pro Ser Thr Met Ala Gln585                 590                 595                 600AAT GGT TCT TTA ACA TAC GAG TCG TTT AAT ACC TTA GAG GTA ACT CAT  2058Asn Gly Ser Leu Thr Tyr Glu Ser Phe Asn Thr Leu Glu Val Thr His
            605                 610                     615ACT ATT AGA TTT TCA CAG TCA GAT ACT ACA CTT AGG TTG AAT ATA TTC  2106Thr Ile Arg Phe Ser Gln Ser Asp Thr Thr Leu Arg Leu Asn Ile Phe
        620                 625                     630CCG TCT ATC TCT GGT CAA GAA GTG TAT GTA GAT AAA CTT GAA ATC GTT  2154Pro Ser Ile Ser Gly Gln Glu Val Tyr Val Asp Lys Leu Glu Ile Val
    635                 640                 645CCA ATT AAC CCG ACA CGA GAA GCG GAA GAA GAT TTA GAA GAT GCA AAG  2202Pro Ile Asn Pro Thr Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Asp Ala Lys
650                 655                 660AAA GCG GTG GCG AGC TTG TTT ACA CGT ACA AGG GAT GGA TTA CAG GTA  2250Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val665                 670                 675                 680AAT GTG ACA GAT TAC CAA GTC GAT CAG GCG GCA AAT TTA GTG TCG TGC  2298Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys
            685                 690                 695TTA TCA GAT GAA CAA TAT GGG CAT GAT AAA AAG ATG TTA TTG GAA GCC   2346Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Gly His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala
        700                 705                 710GTA CGC GCA GCA AAA CGC CTC AGC CGC GAA CGC AAC TTA CTT CAA GAT   2394Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp
    715                 720                 725CCA GAT TTT AAT GAA ATA AAT AGC ACA GAA GAA AAT GGC TGG AAG GCA   2442Pro Asp Phe Asn Glu Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala
730                 735                 740AGT AAC GGT GTT ACT ATT AGC GAG GGC GGT CCA TTC TTT AAA GGT CGT   2490Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Phe Lys Gly Arg745                 750                 755                 760GCA CTT CAG TTA GCA AGC GCA CGT GAA AAT TAC CCA ACA TAC ATC TAT   2538Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr
            765                 770                 775CAA AAG GTA GAT GCA TCG ACG TTA AAA CCT TAT ACA CGA TAT AAA CTA   2586Gln Lys Val Asp Ala Ser Thr Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu
        780                 785                 790GAT GGA TTT GTG CAA AGT AGT CAA GAT TTA GAA ATT GAC CTC ATT CAT  2634Asp Gly Phe Val Gln Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His
    795                 800                 805CAT CAT AAA GTC CAC CTC GTG AAA AAT GTA CCA GAT AAT TTA GTA TCT  2682His His Lys Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser
810                 815                 820GAT ACT TAT TCT GAT GGC TCA TGT AGT GGA ATT AAC CGT TGT GAG GAA   2730Asp Thr Tyr Ser Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Asn Arg Cys Glu Glu825                 830                 835                 840CAA CAT CAG GTA GAT GTG CAG CTA GAT GCG GAG GAT CAT CCA AAG GAT   2778Gln His Gln Val Asp Val Gln Leu Asp Ala Glu Asp His Pro Lys Asp
            845                 850                 855TGT TGT GAA GCG GCT CAA ACA CAT GAG TTT TCT TCC TAT ATT CAT ACA  2826Cys Cys Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile His Thr
        860                 865                 870GGT GAT CTA AAT GCA AGT GTA GAT CAA GGC ATT TGG GTT GTA TTG CAG  2874Gly Asp Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Gln
    875                 880                 885GTT CGA ACA ACA GAT GGT TAT GCG ACG TTA GGA AAT CTT GAA TTG GTA  2922Val Arg Thr Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val
890                 895                 900GAG GTT GGT CCA TTA TCG GGT GAA TCT TTA GAA CGA GAA CAA AGA GAT  2970Glu Val Gly Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp905                 910                 915                 920AAT GCG AAA TGG AAT GAA GAG GTA GGA AGA AAG CGT GCA GAA ACA GAT  3018Asn Ala Lys Trp Asn Glu Glu Val Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp
            925                 930                 935CGC ATA TAT CAA GAT GCG AAA CAA GCA ATT AAC CAT CTA TTT GTA GAC  3066Arg Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Gln Ala Ile Asn His Leu Phe Val Asp
        940                 945                 950TAT CAA GAT CAA CAA TTA AGT CCA GAG GTA GGG ATG GCG GAT ATT ATT  3114Tyr Gln Asp Gln Gln Leu Ser Pro Glu Val Gly Met Ala Asp Ile Ile
    955                 960                 965GAT GCT CAA AAT CTT ATC GCA TCA ATT TCA GAT GTA TAT AGC GAT GCA  3162Asp Ala Gln Asn Leu Ile Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala
970                 975                 980GTA CTG CAA ATC CCT GGG ATT AAC TAC GAG ATG TAT ACA GAG TTA TCC  3210Val Leu Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu Met Tyr Thr Glu Leu Ser985                 990                 995                1000AAT CGA TTA CAA CAA GCA TCG TAT CTG TAT ACG TCT CGA AAT GTC GTG  3258Asn Arg Leu Gln Gln Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Ser Arg Asn Val Val
           1005                1010                1015CAA AAT GGG GAC TTT AAC AGT GGT TTA GAT AGT TGG AAT GCA ACA ACT  3306Gln Asn Gly Asp Phe Asn Ser Gly Leu Asp Ser Trp Asn Ala Thr Thr
       1020                1025                1030GAT ACA GCT GTT CAG CAG GAT GGC AAT ATG CAT TTC TTA GTT CTT TCC  3354Asp Thr Ala Val Gln Gln Asp Gly Asn Met His Phe Leu Val Leu Ser
   1035                1040                1045CAT TGG GAT GCA CAA GTT TCT CAA CAA TTT AGA GTA CAG CCG AAT TGT   3402His Trp Asp Ala Gln Val Ser Gln Gln Phe Arg Val Gln Pro Asn Cys1050                1055                1060AAA TAT GTG TTA CGT GTG ACA GCG AAG AAA GTA GGG AAC GGA GAT GGA    3450Lys Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala Lys Lys Val Gly Asn Gly Asp Gly1065               1070                1075                1080TAT GTT ACG ATC CAA GAT GGC GCT CAT CAC CGA GAA ACA CTG ACA TTC    3498Tyr Val Thr Ile Gln Asp Gly Ala His His Arg Glu Thr Leu Thr Phe
           1085                1090                1095AAT GCA TGT GAC TAC GAT GTA AAT GGT ACG CAT GTA AAT GAT AAT TCG    3546Asn Ala Cys Asp Tyr Asp Val Asn Gly Thr His Val Asn Asp Asn Ser
       1100                1105                1110TAT ATT ACA AAA GAA TTG GTG TTC TAT CCA AAG ACG GAA CAT ATG TGG    3594Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Val Phe Tyr Pro Lys Thr Glu His Met Trp
   1115                1120                1125GTA GAG GTA AGT GAA ACA GAA GGT ACC TTC TAT ATA GAC AGC ATT GAG    3642Val Glu Val Ser Glu Thr Glu Gly Thr Phe Tyr Ile Asp Ser Ile Glu
1130               1135                1140TTC ATT GAA ACA CAA GAG TAGAAGAGGG GATCCTAACG TATAGCAACT           3690Phe Ile Glu Thr Gln Glu1145               1150ATGAGGGGAC ACTCTGTATA AATAAAGATT AAAAAGAATA GAAAATGAAT AGAACCCCCT  3750ACTGGTCTTT TTACCAGTAG GGGGTTTTTC ACATAAAAAA ATGGATTTGT TTACTAAGGT  3810GTATAAAAAA CGGAATACCT GATAGAAAAA AGGGAGTACC TTATAAAGAA AGAATTC     3867SEQ ID NO：2序列长度：1150序列类型：氨基酸拓扑结构：线型分子类型：蛋白质原始来源
有机体：苏云金芽孢杆菌
菌株名称：SSK-10序列描述Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr1             5                   10                  15Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp
        20                  25                  30Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr
    35                  40                  45Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile
50                  55                  60Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile65                  70                  75                  80Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr
            85                  90                  95Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp
        100                 105                 110Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser
    115                 120                 125Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp
130                 135                 140Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro145                 150                 155                 160Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His
            165                 170                 175Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser
        180                 185                 190Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
    195                 200                 205Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu225                 230                 235                 240Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly
            245                 250                 255Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His
        260                 265                 270Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
    275                 280                 285Phe Pro Phe Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala305                 310                 315                 320Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe
            325                 330                 335Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg
        340                 345                 350Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr
    355                 360                 365Asn Ser Phe Leu Asp Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Gln Ser Gln His
370                 375                 380Ala Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Glu Thr Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ser385                 390                 395                 400Asn Thr Arg Leu Phe Asn Thr Thr Asn Gly Ala Arg Ala Ile Asp Ser
            405                 410                 415Arg Ala Arg Asn Phe Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser
        420                 425                 430Ser Leu Asn Ile Phe Pro Thr Gly Val Met Ser Glu Ile Thr Asn Ala
    435                 440                 445Ala Asn Thr Cys Arg Gln Asp Leu Thr Thr Thr Glu Glu Leu Pro Leu
450                 455                 460Glu Asn Asn Asn Phe Asn Leu Leu Ser His Val Thr Phe Leu Arg Phe465                 470                 475                 480Asn Thr Thr Gln Gly Gly Pro Leu Ala Thr Leu Gly Phe Val Pro Thr
            485                 490                 495Tyr Val Trp Thr Arg Glu Asp Val Asp Phe Thr Asn Thr Ile Thr Ala
        500                 505                 510Asp Arg Ile Thr Gln Leu Pro Trp Val Lys Ala Ser Glu Ile Gly Gly
    515                 520                 525Gly Thr Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu
530                 535                 540Arg Arg Thr Asp Gly Gly Ala Val Gly Thr Ile Arg Ala Asn Val Asn545                 550                 555                 560Ala Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Ser Thr
            565                 570                 575Thr Ser Phe Val Val Asn Leu Phe Val Asn Asn Ser Ala Ala Gly Phe
        580                 585                 590Thr Leu Pro Ser Thr Met Ala Gln Asn Gly Ser Leu Thr Tyr Glu Ser
    595                 600                 605Phe Asn Thr Leu Glu Val Thr His Thr Ile Arg Phe Ser Gln Ser Asp
610                 615                 620Thr Thr Leu Arg Leu Asn Ile Phe Pro Ser Ile Ser Gly Gln Glu Val625                 630                 635                 640Tyr Val Asp Lys Leu Glu Ile Val Pro Ile Asn Pro Thr Arg Glu Ala
            645                 650                 655Glu Glu Asp Leu Glu Asp Ala Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe Thr
        660                 665                 670Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val Asp
    675                 680                 685Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Gly His
690                 695                 700Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu Ser705                 710                 715                 720Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn Glu Ile Asn Ser
            725                 730                 735Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser Glu
         740                745                 750Gly Gly Pro Phe Phe Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala Arg
    755                 760                 765Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asp Ala Ser Thr Leu
770                 775                 780Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu Asp Gly Phe Val Gln Ser Ser Gln785                 790                 795                 800Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val His Leu Val Lys
            805                 810                 815Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Ser Asp Gly Ser Cys
        820                 825                 830Ser Gly Ile Asn Arg Cys Glu Glu Gln His Gln Val Asp Val Gln Leu
    835                 840                 845Asp Ala Glu Asp His Pro Lys Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln Thr His
850                 855                 860Glu Phe Ser Ser Tyr Ile His Thr Gly Asp Leu Asn Ala Ser Val Asp865                 870                 875                 880Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Gln Val Arg Thr Thr Asp Gly Tyr Ala
            885                 890                 895Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Ser Gly Glu
        900                 905                 910Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala Lys Trp Asn Glu Glu Val
    915                 920                 925Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Gln
930                 935                 940Ala Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu Ser Pro945                 950                 955                 960Glu Val Gly Met Ala Asp Ile Ile Asp Ala Gln Asn Leu Ile Ala Ser
            965                 970                 975Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln Ile Pro Gly Ile Asn
        980                 985                 990Tyr Glu Met Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Arg Leu Gln Gln Ala Ser Tyr
    995                1000                1005Leu Tyr Thr Ser Arg Asn Val Val Gln Asn Gly Asp Phe Asn Ser Gly1010                1015                1020Leu Asp Ser Trp Asn Ala Thr Thr Asp Thr Ala Val Gln Gln Asp Gly1025               1030                1035                1040Asn Met His Phe Leu Val Leu Ser His Trp Asp Ala Gln Val Ser Gln
           1045                1050                1055Gln Phe Arg Val Gln Pro Asn Cys Lys Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala
       1060                1065                1070Lys Lys Val Gly Asn Gly Asp Gly Tyr Val Thr Ile Gln Asp Gly Ala
   1075                1080                1085His His Arg Glu Thr Leu Thr Phe Asn Ala Cys Asp Tyr Asp Val Asn1090                1095                1100Gly Thr His Val Asn Asp Asn Ser Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Val Phe1105               1110                1115                1120Tyr Pro Lys Thr Glu His Met Trp Val Glu Val Ser Glu Thr Glu Gly
           1125                1130                1135Thr Phe Tyr Ile Asp Ser Ile Glu Phe Ile Glu Thr Gln Glu
       1140                1145                1150SEQ ID NO：3序列长度：21序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸/合成DNA序列描述AGRWCCAGGA TTTAYAGGAG GSEQ ID NO：4序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸/合成DNA序列描述CCCCTGTATC AATATAGRAASEQ ID NO：5序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸/合成DNA序列描述TAGGTGTTCC ATTTGCGGGTSEQ ID NO：6序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸/合成DNA序列描述TCTCTACGGA ATCGATGGTA

Claims (25)

1.一种菌株SSK-10，其以保藏号FERM-6162保藏。
2.一种蛋白质，其包含下列氨基酸序列(a)或者(b)：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中在SEQ ID NO：2中的一个或多个氨基酸被取代或被缺失，或者一个或多个氨基酸被添加或被插入到SEQ ID NO：2的氨基酸序列中。
3.一种核苷酸序列，其编码按照权利要求2的蛋白质。
4.按照权利要求3的核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
5.一种载体，其包含按照权利要求3的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
7.按照权利要求6的宿主细胞，其是微生物。
8.按照权利要求6的宿主细胞，其是大肠杆菌。
9.按照权利要求2的蛋白质，其是晶状蛋白质包含体形式的。
10.按照权利要求2的蛋白质，其是加溶晶状蛋白质包含体形式的。
11.按照权利要求2的蛋白质，其是由按照权利要求1的菌株或者按照权利要求6的宿主细胞产生的。
12.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求1的菌株、按照权利要求6的宿主细胞和/或按照权利要求2的蛋白质。
13.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求2的蛋白质和按照权利要求1的菌株的孢子。
14.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求9的晶状蛋白质包含体和按照权利要求1的菌株的孢子。
15.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求10的加溶晶状蛋白质包含体和按照权利要求1的菌株的孢子。
16.一种用于消除虫害的方法，该方法包括用按照权利要求1的菌株、按照权利要求7的微生物和/或按照权利要求2的蛋白质处理已经受到或者可能受到所说的虫害损害的植物。
17.按照权利要求16的方法，其中所说的虫害属于鳞翅目，鞘翅目或者双翅目。
18.按照权利要求16的方法，其中所说的昆虫是选自由斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，小菜蛾(Plutella xylostella)和尖音库蚊(Culex Pipiens)组成的组的昆虫。
19.一种植物细胞，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
20.按照权利要求19的植物细胞，其再生为能够产生种子的植物。
21.一种种子，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
22.按照权利要求21的种子，其可以被培育成能够产生种子的植物。
23.一种植物，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
24.按照权利要求23的植物，其能够产生种子。
25.一种植物，其可以通过使权利要求21的种子发芽获得。
CN97180416A 1996-12-10 1997-12-10 芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质 Pending CN1240002A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP329309/96 1996-12-10
JP32930996 1996-12-10
JP275497/97 1997-10-08
JP27549797 1997-10-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1240002A true CN1240002A (zh) 1999-12-29

Family

ID=26551494

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97180416A Pending CN1240002A (zh) 1996-12-10 1997-12-10 芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0945510A4 (zh)
KR (1) KR20000057484A (zh)
CN (1) CN1240002A (zh)
CA (1) CA2274582A1 (zh)
TW (1) TW490486B (zh)
WO (1) WO1998026073A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6369213B1 (en) 1996-07-01 2002-04-09 Mycogen Corporation Toxins active against pests
US6570005B1 (en) 1996-07-01 2003-05-27 Mycogen Corporation Toxins active against pests
WO1998000546A2 (en) 1996-07-01 1998-01-08 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins active against noctuidae pests
CA2395897C (en) 1999-12-28 2011-11-15 Bayer Cropscience N.V. Insecticidal proteins from bacillus thuringiensis
JP5322740B2 (ja) * 2009-04-01 2013-10-23 国立大学法人東京農工大学 有害生物防除方法
CN102329752B (zh) * 2011-09-23 2012-10-17 黑龙江大学 一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌
WO2024075782A1 (ja) * 2022-10-05 2024-04-11 住友化学株式会社 安定化有害生物防除剤、及び、安定化有害生物防除剤の製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0611229B2 (ja) * 1986-07-10 1994-02-16 東亞合成化学工業株式会社 抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌
ES2171391T3 (es) * 1990-04-26 2002-09-16 Aventis Cropscience Nv Nueva cepa de bacillus thuringiensis y su gen de codificado de toxina insecticida.
WO1994005771A2 (en) * 1992-08-27 1994-03-17 Plant Genetic Systems N.V. New bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins
US5736514A (en) * 1994-10-14 1998-04-07 Nissan Chemical Industries, Ltd. Bacillus strain and harmful organism controlling agents

Also Published As

Publication number Publication date
TW490486B (en) 2002-06-11
EP0945510A4 (en) 2002-07-24
CA2274582A1 (en) 1998-06-18
EP0945510A1 (en) 1999-09-29
KR20000057484A (ko) 2000-09-15
WO1998026073A1 (fr) 1998-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1102659C (zh) 重组杆状病毒杀虫剂
CA2956880C (en) Antifungal paenibacillus strains, fusaricidin-type compounds, and their use
Roberts et al. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: mycological aspects
JP3657593B2 (ja) ホトルハブダス殺虫性タンパク毒素
CN1335854A (zh) 控制植物病虫害的组合物及方法
CN1351652A (zh) 用于控制植物疾病的短小芽孢杆菌菌株
CN1017722B (zh) 具有改进杀虫性能的苏云金芽孢杆菌的制备方法
CN1119877A (zh) 新杀虫蛋白和菌株
CN1204366A (zh) 抗真菌蛋白
CN1377364A (zh) 杀虫剂大环内酯
CN1246890A (zh) 抗真菌生物控制剂,制备和处理该控制剂的方法
CA1328239C (en) Bacillus thuringiensis strain, method for their isolation and related insecticidal compositions
CN1321067A (zh) 控制地老虎害虫的方法
CN1085387A (zh) 苏芸金芽孢杆菌分离物在防治芽科害虫上的应用
CA1326640C (en) Bacterial strains
CN1037924A (zh) 改进昆虫毒素效力的方法
CN1102958C (zh) 用于植物疾病生物控制的微生物
CN1080303C (zh) 抗微生物蛋白
CN1240002A (zh) 芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质
JPH10504451A (ja) 新規の双翅類活性化合物及びバチルス チューリングエンシス株
CN1102858A (zh) 一种新菌株及其除草组合物和除草方法
WO1992019106A1 (en) Novel bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides
CN1142895A (zh) 杀真菌组合物及其应用
CN1030790A (zh) 有抗生作用的ksb-1939化合物、其制法及含有这类化合物的杀虫剂
CN1313604C (zh) 一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication