JPH09500275A

JPH09500275A - バシルスチューリンゲンシス単離体及び毒素

Info

Publication number: JPH09500275A
Application number: JP7504704A
Authority: JP
Inventors: ペイン，ジュエル; ナーヴァ，ケネス，イー．; ウエダ，ケンドリック，アキラ; スタルダー，クリスティン，ジェイ．; マイケルズ，トレイシー，エリス
Original assignee: マイコゲンコーポレーション
Priority date: 1993-07-15
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 1997-01-14
Also published as: AU698511B2; EP0708830A1; CA2166711A1; US5436002A; WO1995002693A1; NZ269438A; US5888976A; AU7332594A; US5635480A; US6150165A

Abstract

(57)【要約】開示され請求されているのは、双翅類及び／又はコーンルートウォーム活性を有しているB.t．PS92J、B.t．PS196S1、B.t．PS201L1、及び B.t．PS201T6と命名される新規なバシルスチューリンゲンシス単離体によって造られる毒素である。このように単離体又はその突然変異体は、そのような害虫を抑制するのに使用できる。更に、請求されているのは、他の宿主中で発現することが出来るこれらのδ-エンドトキシンをコードしている、新規な遺伝子である。そのような宿主中でのδ-エンドトキシンの発現は、そのような宿主の環境中の感受性の昆虫害虫を抑制することを生じる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称バシルスチューリンゲンシス単離体及び毒素関連出願に対するクロスリファレンス本願は、現在放棄されている1991年１月29日出願の米国出願番号07/647.399の一部継続出願である、現在放棄されている1991年５月28日出願の米国出願番号07 /708,266の一部継続出願である、1991年８月21日出願の継続中の米国出願番号07 /746,751の分割出願である、1992年11月17日に出願された継続中の出願番号07/9 77,350の一部継続出願に対応する。これはまた、1993年７月15日に出願された継続中の米国出願番号08/093,199の一部継続出願にも対応する。発明の背景土壌微生物バシルスチューリンゲンシス（B.t.）は、グラム陽性の胞子形成性の細菌であって、パラ胞子性の結晶蛋白質封入物によって特徴づけられる。これらの封入物はしばしば顕微鏡的に区別される形状の結晶として見える。この蛋白質は害虫に非常に毒性であり得、そしてそれらの毒性活性が特異的である。ある種のB.t.毒素遺伝子は、単離され配列が決定され、そして組替えＤＮＡに基づくB.t.生成物が作られ、使用の為に認可されている。更に、遺伝子工学技術の使用によって、B.t.エンドトキシン（内毒素）を農業環境に配達するための新しい方法が開発中であり、それには昆虫抵抗性の為にエンドトキシン遺伝子が遺伝子工学処理された植物を使用すること、及びB.t.エンドトキシン配達ビヒクルとしての安定化された無傷（細胞壁が破壊されていない）微生物細胞を使用することが含まれる（ガエルター.F.H.,L.キム[1988]TIBTECH 6:S4-S7）。従って、単離されたB.t.エンドトキシン遺伝子は、商業的に貴重なものとなりつつある。最近の十年間に至るまでは、B.t.殺虫剤の商業的な使用は鱗翅類の害虫（シャクトリムシ(caterpillar)類）の狭い範囲に主として制限されてきた。B.チューリンゲンシス subsp.（亜種）クルスタキの胞子及び結晶の製造は鱗翅類害虫に対する商業的な殺虫剤として何年も使用されてきた。例えば、B.チューリンゲンシス Var．クロスタキＨＤ-１は、多くの鱗翅類昆虫の幼虫に対し毒性であるδ -エンドトキシンと呼ばれる結晶を生じる。しかし最近、研究者らはずっと広い範囲の害虫に対する特異性を有しているB. t.殺虫剤を発見した。例えば、B.t.の他の種、即ちイスラエレンシス及びテネブリオニス（a.k.a.B.t．M-7，a.k.a.B.t．サンディエゴ）がそれぞれ双翅類および鞘翅類目の昆虫を抑制するために商業的に使用されてきている（ガエルトナー ,Ｆ.Ｈ.［1989］『殺虫蛋白質に対する細胞配達系：生きている及び生きていない微生物類』Controlled Delivery of Crop Protection Agents,Ｒ.Ｍ.ウィルキンズ,編,テイラー及びフランシス,ニューヨーク及びロンドン,1990,245-255ページ）。また、コーチ,Ｔ.Ｌ.（1980）『バシルスチューリンゲンシス var．イスラエレシシスのモスキート病原性』Develop ments in Industrial Microbiology 22:61-76,ビーグル.Ｃ.Ｃ.,（1978）『アグロエコシステム（農業生態系）中のエントモゲナス（虫生）細菌の使用』Develo pments in Industrial Microbiology 20:97-104。クレイグ,Ａ.,Ａ.Ｍ.ハンガー ,Ｇ.Ａ.ランゲンブルク,Ｗ.シュネッター（1983）Z.ang.Ent.96:500-508,はバシルスチューリンゲンシス var.テネプリオニスを記載しており、これは報告によると鞘翅目中の二つの甲虫に対し活性である。これらはコロラド・ポテト・ビートル、レプティノタルサ・デセムリネアタ(Leputinotarsa decemlineata)及びアゲラスティカ・アルニ（Agelasticaalni)である。最近、B.t.の新しいサブスビーシーズ（亜種）が同定され、活性δ -エンドトキシン蛋白質に対し役割を担っている遺伝子が単離された(ホフテ,Ｈ.,Ｈ.Ｒ.ホワイトレー[1989]Microbiological Reviews 52(2):242-255)。ホフテ及びホワイトレーは、B.t.結晶蛋白質遺伝子を４つの主要な類に分類した。それらの類は、 Cry I（鱗翅類特異的）、Cry II（鱗翅類及び双翅類特異的）、CryIII（鞘翅類特異的）、Cry IV（双翅類特異的）。他の害虫に対し特異的に毒性の菌株の発見が報告されている（フェイテルソン,Ｊ.Ｓ .,Ｊ.ペイン,Ｌ.キム［1992］Bio/Technology 10:271-275)。大腸菌中のB.t.結晶蛋白質遺伝子のクローニングと発現は、出版された文献中に記載されている（シュネップ，Ｈ.Ｅ.,Ｈ.Ｒ.ホワイトレー［1981］Proc．Nat l．Acad. Sci．USA 78:2893-2897）。米国特許4,448,885及び米国特許4,467,036 は、両方とも大腸菌中のB.t.結晶蛋白質の発現を開示している。米国特許4,797, 276及び4,853,331は、種々の環境中で鞘翅類害虫を抑制するのに使用することが出来るB.チューリンゲンシス菌株サンディエゴ（a.k.a．B.t．テネブリオニス， a.k.a．M-7）。米国特許4,918,006は双翅類に対し活性を有するB.t.毒素を開示している。米国特許4,849,217はアルファルファ・ウィービル(alphalfa weevil) に対し活性を有するB.t.単離体を開示している。米国特許5,151,363と米国特許4 ,948,734は、線虫に対し活性を有するB.t.のある種の単雌体を開示している。広範な研究を行い資源を投資した結果、他の特許が新しいB.t.単離体及びB.t.単雌体の新しい用途について発行されている。しかしながら、新しいB.t.単離体及び既知のB.t.単離体の新しい用途の発見は、経験的な予想の出来ない技術分野のままである。双翅類の昆虫は大変な厄介者であるとともにマラリヤ、糸状虫症、ウマ脳炎、及びイヌの糸状虫などの多くのヒト及び動物のベククー（運び屋）である。双翅類目の昆虫に対するB.t.δ-エンドトキシンの活性スペクトラムは、蚊に対する活性並びにブラックフライ（ブヨ）に対する活性を含んでいる。上記のコーチ、上記のビーグルを参照。蚊及びアラックフライを殺すことが知られている二つのB.t.の変種は、B.t.イスラエレンシス(israelensis)（B.t.i.）（ゴールドバーグ,Ｌ．J.、J．マルガリット[ 1977] Mosquito News 37:355-358）及びB.t.モリソニ(morrisoni)(B.t. m.) （バドゥア,Ｌ．Ｅ.、Ｍ.オオバ、Ｋ.アイザワ[ 1984]、J.Invertebrat.Pat hology 44:12-17）である。これらのB.t.は、標的でない生物に有害ではなく ( ムラ,Ｍ.Ｓ.、Ｂ.Ａ.フェデリッチ、Ｈ.Ａ.ダルワゼー[1982]Environmental Ent omology 11:788-795)、そして双翅類害虫の統合的なマネージメントにおいて重要な役割を果たす。これらは都市区域に於いて使用されるために安全であり、他の種に害を与えずに水性の環境中で使用することができる。双翅類の害虫は又、家禽および牧畜産業に於いて主要な問題でもある。ウシの重大な害虫であるホーンフライは幼虫段階でB.t.によって殺される（テメイヤー ,Ｋ.Ｂ.［1990］『ハエ抑制の為のバシルスチューリンゲンシスの可能性』 Fif th International Colloqiumu on Invertebrate Pathology and Microbial Cont rol,Society for Invertebrate Pathology,352-356）。ヨーロッパ特許出願90307204.9（公開番号0 409 438）は、バシルスチューリンゲンシスの双翅類活性単雛体PS71M３と PS123D1を開示している。ハエは殆どどこにても見いだすことが出来る種類の豊富な生物である。これらは通常は厄介者となる多数で発生する。双翅類の多くは害虫であると考えられ、経済的に重要なものである。幾つかの成虫種は吸血性であり、ヒト及び家畜動物に対し刺激を生じる。他の物は残飯にたかるハエであって、機械的に生物及び病原体を移動させ、それが食物を汚染する。両方の種類のハエは、例えばマラリヤ、黄熱病、フィラリア、スリーピングシックネス（眠り病）、腸チフス、及び赤痢などの病気の重要な運び屋である。幾つかの種の幼虫は主要な農作物の害虫である。幼虫は種子、根、葉及び果実等の植物の全ての部分上で餌を食べることが出来る。ある種の幼虫は菌類（茸）を食べ、マッシュルームの生産に損害を生じる。幼虫は動物中で発生する時に家畜動物を刺激し得る。双翅類の成虫形及び幼虫形の両方がヒト及び農業に於いて害虫と考えられる。イエバエ（ムスシダエ科）は双翅類目からの重要な害虫である。これらは厄介者と考えられ、ヒト及び動物の病気の運び屋である。それらがゴミ箱及び排泄物上で歩いて餌を取る習慣、及び人間及び食べ物上を歩いてそして餌を取る習慣は、それらを病気の伝播に対する理想的な媒体としている（メトカルフ,Ｃ.及びフリント,Ｗ．1962．「破壊的及び有用な昆虫」(Destructive an d Useful Insects),マグローヒルブックカンパニー(McGraw-HiII Book Co.),ニューヨーク州,1030-1035ページ）。イエバエは又、動物に対し害虫であり、開いた傷を通して病気を伝播させる。ムスシダエ科はリトルハウスフライ、フェースフライ、ステーブルフライ、及びホーンフライを含み、これらの全ては家畜に対し害虫である。これらの種は、ウシ、家禽、ウマおよび他の種類の家畜の害虫である。これらは堆肥及び動物の近くに位置する腐った藁中で繁殖する。ホーンフライ及びステーブルフライは、咬みつくハエであり、酪農の牛にストレスを生じ、ミルク生産を減少させる。ムスシダエ科は、国内及び世界中で経済的な問題を生じていると考えられる。リーフマイニングフライは、ジャガイモ、トマト、及びセロリなどの経済的に重要な作物に対し損傷と収量の損失を生じる。双翅類のリーフマイナー（ハモグリムシ）も装飾的な花産業に於ける主要な害虫と考えられる（パレラ,Ｍ.Ｐ.［1 987］『Bioligy of Liriomyza』Ann．Rev．Entomol．32:201-224）。最も一般的なリーフマイナー（ハモグリムシ）は、アグロマイジダエ(Agromyzidae)科に見いだされるが、アンソミイダエ(Anthomyiidae)科、ドロソフィリダエ(Drosophil idae)科及びエフィドリダエ(Ephydridae)科もリーフマイニングフライ（ハモグリハエ）を含有している（ヘスペンハイド,Ｈ.Ａ．[1991]『葉潜り昆虫の生態学(Bionomics of leafmining insects)』Ann．Rev．Entomolo．36:535-60) 。リリオマイザ属中のハエ（セルペンティン（曲がりくねった）リーフマイナーズとしても知られている）はそれらの世界中に広がった分布、雑食性、及び殺虫剤に対する抵抗性の為に特に重要である。カリフォルニア州に於いて、菊の産業は1981年と1985年の間にリリオマイザ・トリフォリイ(Liriomyza trifolii)に対しおよそ9300万ドルを失った。また、B.t．製品が非常に貴重であるヘッシンフライ(Hessian fly)、メドフライ(Medfly)及びメックスフライ(Mexfly)などの植物害虫の双翅類も存在する。別の重大な植物の害虫は、コーンルートウォーム（corn rootworm）である。コーンルートウォームは鞘翅類害虫である。コーンルートウォーム（ディアブロティカ種）の幼虫によって根が食べられるために、毎年米国のトウモロコシ作物に対し大きな損害が生じている。コーンルートウォームの３つの主要な種は、ウエスタンコーンルートウォーム（ディアブロティカ・ヴィルジフェラ・ヴイルジフェラ Diabrotica virgifera virgifera）、ノーザンコーンルートウォーム（ディアブロティカ・バルベリ Diabrotica barberi）、及びサザンコーンルートウォーム（ディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ Diabrotica undecimpunctata howardi）は米国のトウモロコシに対し程度の異なる損害を生じている。コーンルートウォームを抑制するための毎年の殺虫剤のコスト及びコーンルートウォームにより生じた毎年の作物の損失は、毎年米国に於いて合計１兆ドルを超えている（メイカーフ,Ｒ.Ｌ.[1986]「ディアブロティカ害虫試験法(Methods for the Study of Pest Diabrotica)」,ドリサン,Ｊ.Ｌ.及びＴ.Ａ.ミラー[編],Springer-Verlag,ニューヨーク州ニューヨーク,vii-xvページ）。米国でおよそ２億5000万ドルに値する殺虫剤がコーンルートウォームを抑制するために毎年適用されている。中西部では6000万ドル及び40 00万ドルに値する殺虫剤が、それぞれアイオワとネブラスカで1990年に適用された。殺虫剤の使用をもってしても、ルートウォームは毎年約７億5000万ドルに値する作物の損害を生じ、中西部に於いてこれらを最も重大なトウモロコシの昆虫害虫にしている。各ディアブロティカ種のライフサイクルは類似している。コーンルートウォームの卵は土壌中に産み落とされる。新たに孵化した幼虫（第１齢）は、地面の中に留まり、より小さな枝分かれしたトウモロコシの根を食べる。ウエスタンコーンルートウォーム及びノーザンコーンルートウォームの最後の齢は、植物に水及び鉱物元素を輸送する内部の根の組織に侵入する。殆どの場合に於いて幼虫は根の最も新しい成長した所を食べるために移動する。幼虫により根の中にトンネルが作られることは、根の表面上に茶色な細長い傷として、根の中のトンネルとして、又は異なる程度の刈込みとして観測できる損傷を生じる。刈込まれた根を有する植物は、大雨と強い風を伴う嵐の後に、通常は抜き取られてしまう。サザンコーンルートウォームの幼虫は、ウエスタンコーンルートウォーム及びノーザンコーンルートウォームの幼虫と同様な方法で根を食べる。サザンコーンルートウォームの幼虫は又、茎が土壌面近くにある間に茎の成長点をも食べるので、植物は枯れて死んでしまい得る。約３週間食べた後に、コーンルートウォーム幼虫は根を離れ、土壌中で蛹になる。成虫の甲虫は土壌から出現し、そしてトウモロコシの花粉、及び他の多くの種類の花粉、並びにトウモロコシの毛を食べる。緑色の毛を食べることは、受粉作用の水準を減少し得るものであり、穀物の苗が少なくなり、収穫量が少なくなる。ウエスタンコーンルートウォームの成虫もトウモロコシの葉を食べ、これも植物の成長を遅くするか、又はまれにはある種のトウモロコシ植物を枯れさせてしまう。トウモロコシに於けるコーンルートウォームの被害を抑制するための現在の方法は、作物の輪作及び殺虫剤の適用に限られている。しかし、農場の利用に対する経済的な要求は、作物の輪作の使用を制限する。更に、ノーザンコーンルートウォームの二年間の体眠期（即ち、越冬）の出現傾向は、幾つかの区域に於ける輪作を混乱させている。コーンルートウォームを抑制する殺虫剤の使用は幾つかの欠点を有している。殺虫剤の連続した使用は抵抗性の昆虫が発生することを可能にする。極端に高い幼虫の存在密度、大雨、及び殺虫剤の適用用具の不適切な検定（キャリブレーション）等の状況では、抑制がうまくいかない。殺虫剤の使用はしばしば土壌の汚染及び地上及び地下の水源の汚染等の環境的心配を生じる。殺虫剤を用いて作業することは、適用する人に対する危険も生じる。発明の簡単なまとめ本発明は、毒素に関し、バシルスチューリンゲンシス単離体から得られる毒素をコードした遺伝子に関する。これらの毒素は、双翅類及び鞘翅類の害虫に対し有利な活性を有している。特定すると、バシルスチューリンケンシス単離体及び毒素は、イエローフィーバーモスキート(エジプロシマカ)のアエデスアエジブチ(Aedes aegypti)、イエバエのムスカドメスティカ(Musca domestica)、リーフマイニング（葉潜り）ハエのリリオマイザエトリホリイ(Liriomyza trif olii)及びウエスタンコーンルートウォームに対し活性であることがわかった。より詳しくは、本発明は、B.t．PS92J、B.t．PS196S1、 B.t．PS201L1、及び B.t．PS201T6と命名される、新規なB.t.単離体及びそれらの突然変異体、及びそれらのB.t.単離体から得ることが出来、双翅類及び／又は鞘翅類害虫に対し活性である蛋白質をコードする新規なデルタエンドトキシン遺伝子に関する。双翅類害虫を抑制する時、バシルスチューリンゲンシス単離体又はそこからの毒素は、ゴミ、堆肥、水、植物及び他の表面の為のスプレーとして用いることができる。これらはまた家畜化された動物及び家畜の為のエサ桶として使用することが出来る。トランスジェニックな（毒素を外来遺伝子として組込んだ）植物及び種子は、茎、葉、及び種子を食べる蛆の抑制の為に使用することが出来る。種子は、単離体の又は単離体からの毒素のスラリーで処理することが出来る。コーンルートウォームの抑制の為には、トランスゲニックな植物が好ましい毒素配達方法である。土壌に対する適用もなされうる。更に、本発明は、実質的に無傷の細胞（細胞壁が破壊されていない細胞）が標的害虫の環境に適用された時に、その殺虫活性を長くする為に、本発明の遺伝子を含有している実質的に無傷のB.t.細胞又は組替え細胞を処理することを含んでいる。そのような処理は化学的又は物理的手段、又は化学的手段及び物理的手段の組合わせによるものであり得るが、その処理技術は殺虫剤の性質に悪影響を与えず、殺虫剤を保護する細胞の能力を減少させないものである限り、可能である。処理された細胞は、殺虫剤毒素の保護被膜として作用する。毒素は標的害虫によって摂取されると、そのまま作用を発揮できる。図面の簡単な記載図１は蚊に対し活性のB.t.菌株のアルカリ可溶性蛋白質を示す標準SDSポリアクリルアミドゲル（電気泳動）の写真である。配列の簡単な記載 SEQ ID No.1は、本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドブローブである。 SEQ ID No.2は、本発明に従って使用されるB.t.ブライマーである。 SEQ ID No.3は、本発明に従って使用される3'の逆オリゴヌクレオチドプライマーである。 SEQ ID No.4は、本発明に従って使用される遺伝子特異的プライマーである。 SEQ ID No.5は、本発明に従って使用されるプロモーター配列プライマーである。 SEQ ID No.6は、30kDaの201T6毒素をコードしているヌクレオチド配列である。 SEQ ID No.7は、30kDaの201T6毒素の導き出されるアミノ酸配列である。 SEQ ID No.8は、約25kDaの切断した201T6毒素のアミノ酸配列である。 SEQ ID No.9は、30kDaの201T6毒素のN-末端アミノ酸配列である。 SEQ ID No.10は、本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドプローブである。発明の詳細な開示本発明は、新規なB.t.単離体並びにB.t.毒素、及びこれらの毒素をコードする遺伝子に関する。B.t.単離体とそれらの毒素は、双翅類及び／又は鞘翅類活性を有することがわかった。全ての単離体は双翅類活性を有し、本明細書で記載のある種の単離体は鞘翅類活性も有している。本発明に従って有用な特定のバシルスチューリンゲンシス単離体は、生物学的に純粋な形態で次の特徴を有している。本発明の新規なB.t.単離体及びその突然変異体は標準の既知の培地及び醗酵技術を用いて培養できる。醗酵サイクルが完了すると細菌はまずB.t.胞子及び結晶を、この分野で良く知られた手段によって発酵ブロスから分離することによって収穫できる。回収されたB.t.胞子及び結晶は特定の標的害虫に対し取扱いと適用を容易にするために表面活性剤、分散剤、不活性担体及びその他の成分を添加することにより水和粉末、液体濃縮物、顆粒、又は他の処方に処方できる。これらの処方剤及び適用手順は全てこの分野で知られており、市販の菌株で用いられている。新規なB.t.単離体及びその突然変異体は、双翅類の害虫及び／又はコーンルートウォームを抑制するのに使用出来る。本明細書でコーンルートウォームと言うときは、幼虫の段階を含めたその種々の生命段階のものをさしている。本発明の培養基はアメリカ合衆国61604イリノイ州ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815のノーザンリージョナルリサーチセンター、リサーチサービスパテントカルチャーコレクション（NRRL）に寄託された。これらの培養基は37 CFRの1.14及び35 U.S.C 122のもとで特許商標庁長官により権限ありと決定されたものは、その特許の継続中に培養基を入手できることが保証されるという条件下で寄託されている。これらの寄託物は本出願又はその子孫の出願の対応が出願されている国々の外国法令で要求されるならば入手できる。しかし寄託物の入手可能性は行政行為によって付与された特許権を侵害して発明を実施する権利を構成するものではないことが理解されるべきである。さらにこれらの培養基は微生物寄託に対するブタペスト条約の規定に従って、貯蔵され一般公衆に入手可能とされる。即ちこれらは寄託物の寄託試料の提供の最も最近の要求後少なくとも５年間の期間、そしていかなる場合にも寄託日後少なくとも30年の期間、又は培養基を開示して発行され得るあらゆる特許の権利行使可能な期間、寄託物を生きたまま、そして汚染されないように保つために全ての必要な注意をもって保存される。寄託者は、寄託物の状態の為に要求された時に、寄託所が試料を提供することが出来ないならば、寄託物を置き換える義務を有することを認める。この培養基寄託物の一般への入手可能性についての全ての制限は、開示する特許の付与によって永久に取除かれる。遺伝子と毒素本発明に従う遺伝子と毒素は本明細書に開示される全長の配列のみならず、これらの配列の断片、バリアント、突然変異体、又は融合蛋白質であって、特定してここに例示している毒素の特徴的な殺虫活性を保有しているものも含んでいる。本明細書で使用する遺伝子の「バリアント」又は「バリエーション」という用語は、同じ毒素をコードするヌクレオチド配列、又は殺害虫活性を有する均等な毒素をコードするヌクレオチド配列をさす。本明細書で使用する「均等な毒素」とは、特許請求される毒素として標的害虫に対し同じ又は本質的に同じ生物活性を有する毒素をさす。当業者には活性毒素をコードする遺伝子は幾つかの手段を通じて同定でき得ることが明らかである。特定の遺伝子は上に記載される培養基寄託所から得ることができる。これらの遺伝子又はその一部分又はそのバリアントは例えば遺伝子マシシの使用によって合成的に造ることもできる。こらの遺伝子のバリエーション（変異体）は、点突然変異体を造る標準の技術を使用して容易に構築できる。又これらの遺伝子の断片は標準の手順に従って市販されたエクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを使用して造ることができる。例えばBal31等の酵素又は部位特異的突然変異誘発を、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切り取る為に使用することが出来る。また活性断片をコードする遺伝子は種々の制限酵素を使用して得ることができる。これらの毒素の活性断片を直接得る為に蛋白分解酵素を使用できる。均等な毒素及び／又はこれらの均等な毒素をコードする遺伝子も本明細書に提供ざれる技術を使用してB.t.単離体及び／又はDNAライブラリーから見つけることができる。天然に存在する本発明の殺虫毒素を得る為の幾つかの方法がある。例えば本明細書に開示され、特許請求される殺虫毒素の抗体は蛋白質の混合物から他の毒素を同定及び単離するために使用できる。特定していえば、最も一定で最も他のB.t.毒素と区別される殺虫毒素蛋白に対し抗体を生じさせ得る。これらの抗体を次にイムノプレシピテーション、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ(エリザ：ELISA) 又はウエスタンプロッティングによって特徴的な活性を有する均等な毒素を特定的に同定するために使用できる。本明細書に開示される毒素又は均等な毒素、又はこれらの毒素の断片に対する抗体はこの分野の標準手順を使用して容易に製造できる。これらの毒素をコードする遺伝子は次に微生物から得ることができる。例示される毒素の殺虫活性を保持する断片と均等物は本発明の範囲内である。また、遺伝子コードの縮重（redandancy）のため種々の異なるＤＮＡ配列が本明細書に開示されるアミノ酸配列をコード出来る。同じ又は本質的に同じ毒素をコードしているそれらの別のＤＮＡ配列を創造することは当業者の容易になしうる範囲内のことである。それらの変異体ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書で使用する「本質的に同じ」配列とは、殺虫活性に事実上影響を与えないアミノ酸の置換、欠失、付加、又は挿入を有している配列をさしている。殺虫活性を保持している断片もこの定義に含まれる。本発明の毒素及び遺伝子を同定する別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブを使用することを通じて行なう事である。これらのプローブは検出できる手段を有するヌクレオチド配列である。この分野で良く知られるようにもしプローブ分子及び核酸試料が２つの分子の間で強い結合を形成することによってハイブリッド形成するならば、プローブと試料は実質的に相同性を有すると推定する十分な理由が有り得る。プローブの検出可能な手段はハイブリダイゼーションが生じたかどうかを既知の方法で決めるための手段を提供する。そのようなプローブ分析は本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に従ってプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、標準手順を使用してDNAシンセサイザーの使用により合成できる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅する為にＰＣＲプライマーとしても使用できる。本発明のある種の毒素は、本明細書に特定して例示されている。これらの毒素は、本発明の毒素の単なる例示であるので、本発明が更に、例示された毒素の同じ又は本質的に同じ殺虫活性を有しているバリアント又は均等の毒素（及び均等の毒素をコードしているヌクレオチド配列）を含むことは明らかである。これらの均等な毒素は例示された毒素とアミノ酸の相同性を有し得る。このアミノ酸相同性は、典型的には75％より大きく、好ましくは90％よりも大きく、最も好ましくは95％よりも大きい。アミノ酸相同性は、生物活性の原因となっている毒素のある種の臨界領域、又は生物活性に対し究極的に責任のある３次元立体配置の決定に関与するある種の毒素の臨界領域に於て最も高いであろう。この点に関してある種のアミノ酸置換は、これらの置換が活性に対し臨界でない領域に於けるもの、又は分子の３次元立体配置に影響を与えないコンザーバティブなアミノ酸置換であるならば、受け入れられ、そして期待される。例えばアミノ酸は次のクラスに分類される。非極性、電荷のない極性、塩基性及び酸性。置換が化合物の生物活性を実質的に変更しない限り、一つの類のアミノ酸が同じタイプの別のアミノ酸と置き換えられるコンザーバティブな置換は本発明の範囲内に入る。表２は各クラスに属するアミノ酸の例を挙げている。ある場合には、非コンザーバティブ置換もなされ得る。臨界的な要因はこれらの置換が毒素の生物活性を有意義に減少してはならないということである。本発明の毒素は、上に記載された、毒素封入物の形状及び位置の点でも特徴付けることが出来る。組替え宿主本発明の単離体が宿す毒素をコードする遺伝子は広範囲な微生物又は植物宿主中に導入できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に、殺虫剤の細胞内生産及び維持を生じる。適当な微生物宿主、例えばシュードモナスでは微生物は害虫が増殖し、そしてその害虫によって摂取される、害虫のいる場所に適用できる。その結果害虫が抑制される。別の方法として、毒素遺伝子を宿している微生物は、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定させる条件下で処理できる。毒性活性を維持する処理された細胞は次に標的害虫の環境に適用できる。 B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを経由して微生物宿主に導入され、そしてその宿主が生きている状態で環境に適用される場合には、ある種の宿主微生物が使用されることが必須である。微生物宿主は１又はそれ以上の問題の作物の「植物界（phytosphere）」（フィロプレイン、フィロスフェアー、リゾスフェア及び／又はリゾプレイン）を占めることが知られているものが選択される。これらの微生物は野性型の微生物と特定の環境（作物及び他の昆虫の生息地）中で巧く競争できるように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持と発現を提供し、そして望ましくは環境中に於ける分解及び不活性化から殺虫剤の保護の改良を提供する。数多くの微生物が多種多様な重要作物のフィロプレイン（植物の葉の表面）及び／又はリゾスフェア（植物の根の周りの土壌）に生息することが知られている。これらの微生物には細菌、藻類、菌類が含まれる。これらの内で特に興味があるのは微生物、例えば細菌、例えば次の属のものである。シュードモナス(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwinia)、セラチア(Serratia) 、クリブシエラ(Klebsiella)、キサントモナス(Xanthomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、リゾビウム（Rhizobium)、ロドシュードモナス (Rhodopse udomonas)、メチロフィリウス(Methylophilius)、アグロバクテリウム (Agrobac terium)、アセトバクター(Acetobacter)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、アルスロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター(Azotobacter)、ロイコノストック(Leuconostoc)、及びアルカリゲネス(Alcaligenes)、菌類、特に酵母、例えば次の属のものである。サッカロミセス(Saccharomyces)、クリプトコッカス(Cr yptococcus)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、スポロボロマイセス(Sporo bolomyces)、ロドトルラ(Rhodotorura)、及びオーレオバシジウム(Aureobasidiu m)。特に興味が持たれるのは次の様なフィトスフェア細菌種である。シュードモナシリンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナススフルオレッセンス(Ps eudomonas fluorescens)、セラチアマルケスセンス(Serratia marcescens)、アセトバクタークシリナム（Acetobacter xylinum)、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、ロドシュードモナススフェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサントモナスカムペストリス(Xanthomonas campestris)、リゾビウムメリオチ(Rhizobium melioti )、アルカリゲネスエントロパス(Alcaligenes entrophus)及びアゾトバクタービンランディイ(Azotobacter vinlandii)；及び次の様な植物界酵母種、例えばロドトルラルブラ(Rhodotorula rubra)、ロドトルラグルティニス(R．glutinis)、ロドトルラマリナ(R. marina)、ロドトルラアウランティアカ(R．aurantiaca)、クリプトコッカスアルビダス(Cryptococcus albidus)、クリプトコッカスディフルエンス(C．diffluens)、クリプトコッカスラウレンティイ(C．laurentii)、サッカロミセスロゼイ(Saccharomyces rosei)、サッカロミセスプレトリエンシス( S．pretoriensis)、サッカロミセスセレビシアエ(S．cerevisiae)、スポロボロマイセスロゼウス(Sporobolomyces roseus)、スポロボロマイセスオドラス(S．o dorus)、クルイベロマイセスベロナエ（Kluyveromyces veronae)、及びアウレオバシジウムポルランス(Aureobasidium polluians)。特に興味があるのは色素微生物である。遺伝子の安定な維持と発現を可能とする条件下で、微生物宿主中に毒素をコードするB.t.遺伝子を導入するために種々の方法が利用できる。これらの方法は当業者によく知られ、例えば米国特許第5135867号に記載されており、これは参照により本明細書に取り込む。細胞の処理上記の様に、B.t.毒素を発現するB.t.又は組替え細胞が、標的害虫環境に適用の為、毒素活性を長期化させるためにそして細胞を安定化させるために処理される。適当な宿主細胞は、哺乳類等の高等生物に対し毒性である物質を造り出さない細胞に通常限定されるが、原核細胞、真核細胞のいずれかを含み得る。しかし高等生物に対し毒性の物質を造る生物も、哺乳類宿主に対する毒性の可能性をさけ得るほど毒素が不安定であるか十分低い適用水準であるならば使用できる。特に興味ある宿主は原核細胞及び低級真核細胞、例えば菌類である。細胞は、通常無傷（最防壁が壊れていない）であり、場合によっては胞子形も用い得るが、胞子形であるよりも、処理される時には実質的に増殖形である。微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物細胞の処理は、技術が毒素の性質に悪影響をしない限り、また毒素を保護する細胞の能力を減少させない限り化学的又は物理的手段、又は化学的及び／又は物理的手段の組合せによるものであり得る。化学剤の例はハロゲン化剤、特に原子番号17〜80のハロゲンによるものである。より詳しくは温和な条件下でヨウ素が使用でき、そして所望の結果を達成するために十分な時間行なわれる。他の適当な技術にはアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドでの処理、抗感染剤例えばゼフィランクロライド及びセチルビリジニウムクロライド、アルコール類例えばイソプロピルアルコール及びエタノール；種々の組織学的固定剤例えばルゴール沃素、ボウイン(Bouin)固定剤及び種々の酸とヘリー(Helly)固定剤(ヒューマソン，グレッチェン L.、アニマル組織技術 (Animal Tissue Technique)、W.H ．フリーマンアンドカンパニー 1967参照）での処理、又は細胞が宿主動物に投与された時に細胞中に造られる毒素の活性を保存し、長引かせる物理剤（熱）及び化学剤の組合せが含まれる。物理的手段の例はガンマー線照射、Ｘ線照射などの短波長照射、凍結、紫外線照射、凍結乾燥等である。微生物細胞処理する方法は米国特許4,695,455及び4,695,462号に開示されており、これらは参照により取り込まれる。細胞は、一般に、環境条件への抵抗性を強める、強化された構造的安定性を有する。殺虫剤がプロ型のときは、処理方法は、標的害虫病原体によって殺虫剤のプロ型から完成型への処理がなされるのを妨げないように選択されるべきである。例えばホルムアルデヒドは蛋白質を架橋し、ポリペブチド殺虫剤のプロ型を処理することを妨げ得る。処理方法は毒素の生物利用性又は生物活性の実質的な部分を少なくとも保持するものであるべきである。製造の目的の宿主細胞を選択するのに特に興味ある特徴は、宿主へのB.t.遺伝子の導入の容易さ、発現系の入手可能性、発現の効率、宿主中の殺虫剤の安定性、及び補助的な遺伝子的能力の存在が含まれる。殺虫剤ミクロカプセルとして使用するために興味ある特徴には、殺虫剤の保護性質、例えば厚い細胞壁、色素形成、細胞内のパッケージング又は封入体の形成：水性環境で生き延びる性質：哺乳類への毒性がないこと；害虫が摂取するのに魅力的かどうか：毒素の損傷なしに殺すことと固定できることの容易さ等である。他の考慮点には処方、取扱の容易さ、経済性、貯蔵安定性等である。細胞の増殖 B.t.殺虫遺伝子を含有している細胞宿主は、任意の都合のよい栄養培地中で成育することができ、そこでＤＮＡ構築物は選択的利点を与え、細胞の実質的な全て又は全てがB.t.遺伝子を保持するように選択培地を提供する。これらの細胞は次に慣用方法に従って収穫される。別の方法として、細胞は収穫前に処理できる。本発明のB.t.細胞は標準の技術の培地及び発酵技術を使用して培養できる。醗酵サイクルが完了すると細菌はまずB.t.胞子及び結晶を、この分野で良く知られた手段によって発酵ブロスから分離することによって収穫できる。回収されたB. t.胞子及び結晶は特定の標的害虫に対し取扱いと適用を容易にするために表面活性剤、分散剤、不活性担体及びその他の成分を添加することにより水和粉末、液体濃縮物、顆粒、又は他の処方に処方できる。これらの処方剤及び適用手順は全てこの分野で知られている。処方剤誘引剤と、B.t.単離体の胞子及び結晶又は本明細書に記載のB.t.単離体から得られる遺伝子を含有する組替え微生物を含有する処方された餌顆粒は、土壌に適用できる。処方生成物は、また、作物のサイクルの後の段階に於いて、種子被覆、根の処理、又は植物全体の処理として適用出来る。これらの処方は、コーンルートウォームの抑制に対し特に適している。生成物は飼い慣らされた動物及び家畜の為の餌桶として処方できる。B.t.単離体及び組替え微生物は、これらが動物を無傷のまま通過し糞の中に排泄されてそこで種々の害虫によって摂取され、それによって害虫を抑制する手段を提供するように、上記の様に処理されることが出来る。当業者に認められるように、殺虫濃度は特定の処方の性質、特にこれが濃縮物か直接使用されるかに依存して広く変り得る。殺虫剤は少なくとも１重量％で存在し、そして100重量％であり得る。乾燥処方剤は殺虫剤の約１〜95重量％を有するが、一方液体処方剤は一般に液相中の約１〜60重量％の固体である。処方剤は一般にmg当り約10²〜10⁴細胞を有する。これらの処方剤はヘクタール当り約50 mg（液体又は乾燥）〜１kg又はそれ以上投与される。処方剤は双翅類又はコーンルートウォームの害虫の環境、例えば土壌、堆肥、又は水に対し、スプレー、噴霧、散布（スプリンクル）などによって適用できる。突然変異体本発明の新規な単離体の突然変異体はこの分野で良く知られた手順で造られる。例えば無胞子性突然変異体は新規な単離体のエチルメタンスルホネート（EMS ）突然変異誘発を通じて得ることができる。これらの突然変異体はこの分野で良く知られた紫外線とニトロソグアニジンを使用して造られ得る。無胞子性突然変異体の小割合は無傷のままであり、延長された発酵期間の間溶解されない。これらの菌株は溶菌マイナス（−）と命名される。溶菌マイナス菌株は振盪フラスコ培地中で無胞子性突然変異体をスクリーニングし、そして無傷のままで、かつ発酵の終りに毒素結晶を含有している突然変異体を選択することによって同定できる。溶菌マイナス菌株は、保護されたカプセル化された毒素蛋白質を生じる細胞処理方法に適している。該無胞子性突然変異体のファージ抵抗性の変異菌を造る為にファージ溶菌物のアリコートを栄養寒天上に広げ乾燥させる。ファージ感受性の細菌菌株のアリコートを次に乾燥溶菌物上に直接プレートし、そして乾燥させる。プレートを30RC (=℃)で培養する。プレートを２日間培養し、そしてその時点で数多くのコロニーが寒天上で成育しているのが観測できる。これらのコロニーの幾つかを拾い上げて栄養寒天プレート上でサブカルチャーにする。これらの見掛け上抵抗性の培養基をファージ溶菌物でグロスストリーキングすることによって抵抗性を試験する。ファージ溶菌物の線をプレート上にストリークし乾燥させる。抵抗性と推測される培養基を次にファージラインと交差させてストリークする。抵抗性の細菌培養基は30RC(=℃)で一夜培養後、ファージの線を横切るストリークのどこにも溶菌を示さない。ファージに対する抵抗性を次に栄養寒天プレート上に抵抗性の培養基のローン(lawn)をプレート（片平培養）することによって確認する。感受性の菌株も同じ様にプレートして陽性対照として役立てる。乾燥後、ファージ溶菌物の一滴をプレートの中心に置き、そして乾燥させる。抵抗性の培養基は30RC(℃)で24時間培養後、ファージ溶菌物が置かれた区域に於て溶菌を示さない。以下は最良の態様を含めた本発明を実施する手順を説明する実施例である。これらの実施例は制限するものと解釈されるべきではない。別途記載されない限り全ての％は重量により、全ての溶媒混合物割合は容量による。実施例１新規なB.t.単離体の培養 B.t.単離体又はその突然変異体のサブカルチャーは次の培地、ペプトングルコース塩培地に接種するために使用できる。バクトペプトン 7.5g/l グルコース 1.0g/l ＫＨ₂ＰＯ₄ 3.4g/l Ｋ₂ＨＰＯ₄ 4.35g/l 塩溶液 5.0ml/l CaCl₂溶液 5.0ml/l pH7.2 塩溶液（100ml） MgSO₄.7H₂O 2.64g MnSO₄.H₂O 0.04g ZnSO₄.7H₂O 0.28g FeSO₄.7H₂O 0.40g CaCl₂ 溶液（100ml） CaCl₂.2H₂O 3.66g pH7.2 塩溶液及びCaCl₂溶液を瀘過滅菌し、接種の時にオートクレーブされた熱をかけられたブロスに加えた。フラスコを30RC(℃)でローターリーシェーカー上で20 0rpmで64時間培養した。上の手順はこの分野で良く知られた手順によって大規模醗酵に容易にスケールアップできる。上記醗酵で得られたB.t.の胞子及び結晶はこの分野で良く知られた手順で単離できる。よく使用される手順は収穫した醗酵ブロスを分離技術、例えば遠心分離にかけることである。実施例２精製とアミノ酸配列決定バシルスチューリンゲンシスは(B.t.)は、実施例１に記載したように又はこの分野で知られた他の標準の培地及び醗酵技術を使用して培養した。デルタエンドドキシンは、標準の沈降遠心によって、毒素蛋白質封入物を収穫することによって、単離精製できる。回収した蛋白質封入物は、臭化ナトリウム(28〜38％)密度勾配平行遠心(ファンネンスティール，M.A.、E.J．ロス、V.C. クラマー及びK .W.ニッカーソン [1984] FEMS Microbiol．Lett．21:39)によって部分的に精製した。その後、個々の毒素蛋白質はアルカリ緩衝液中の結晶性蛋白質複合体を溶解し、NaCl含有緩衝液の増加濃度の段階的な増加分によってDEAEセファロースCL -6B(ミズリー州セントルイスのシグマケミカルカンパニー)クロマトグラフィーによって個々の蛋白質を分画することによって分割できる(ライヒェンベルグディー，有機化学及び生化学てのイオン交換樹脂[シー.カルモン及びティー.アール.イー.クレスマン]，Interscience，ニューヨーク，1957)。 30kDaの201T6毒素を含有している分画を、ウエスタンブロッティング技術（トービンエイチ.、ティー.スタエヘリン、ケイ.ゴルドン [1979] Proc．Napl．Ac ad．Sci．USA，76: 4350）によってＰＶＤＦ膜（マサチューセッツベッドフォードのミリポア製）に結合し、そしてＮ末端アミノ酸配列を自動化された気相セクエネーターで標準のエドマン反応によっで決定した（フンカピラーエム.ダブリュ.、アール.エム.ヘウィック、ダブリュ.エル.ドレイヤー、エル.イー.フード[1983] Meth．Enzymol．91: 399)。得られた配列はNH₂-MKESIVYN EE-CO₂H（SEQ ID No.9）であった。他のB.t.毒素遺伝子の入手できる配列データから組み立てられたコドン頻度表を用いることによって、このオリゴヌクレオチドに対する配列データからプローブが設計された。SEQ ID No.9のN-末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、50-ATG AAA GAA (T/A)(G/C)(T/A) AT(T/A) TAT TAT ATT GAA G A-3Q(SEQ IDNo.10)である。プローブは、アブライドバイオシンセシス Inc．DNA 合成機械上で合成できる。実施例３バシルスチューリンゲンシス菌株PS201T6からの毒素遺伝子の分子クローニングと発現全細胞ＤＮＡを600nmに於ける光学密度1.0に成育されたバシルスチューリンゲンシス（B.t.）PS201T6菌体（細胞）から造った。細胞を遠心分離によってベレット化し、原形質緩衝液中に再懸濁した(0.3M蔗糖、25mMトリス-Cl(pH8.0)、2 5mMＥＤＴＡ中の20mg/mlリゾチーム)。37RCで１時間培養後、凍結と解答の二回のサイクルによって原形質体(プロトプラスト)を溶解した。0.1M NaCl, 0.1% SDS，0.1M トリス-Clの溶液の９容量を完全な溶菌のために加えた。透明化した溶菌物をフェノール：クロロホルム(1:1)て二回抽出した。核酸を２容量のエタノールで沈殿させ、遠心によりペレット化した。ペレットをＴＥ緩衝液中に再懸濁し、ＲＮaseを50μg/mlの最終濃度に加えた。37RCで１時間培養後、溶液を各々一度フェノール：クロロホルム(1:1)及ぴＴＥ飽和クロロホルムで抽出した。ＤＮＡを水相から3M ＮaＯＡcの1/10容量とエタノールの２容量の添加によって沈殿させた。ＤＮＡを遠心でペレット化し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。種々の制限エンドヌクレアーゼで消化したPS201T6ＤＮＡのサザンブロットの標準のハイブリダイゼーションによって、ＲＦＬＰ分析を実施した。30kDaの毒素のアミノ酸配列から導かれるオリゴヌクレオチドプローブをこのポリペプチドをコードしている遺伝子を検出するために使用した。このプローブの配列は、5' -GACTGGATCCATGAAAGAA(T又はA) (G又はC)(T又はA)AT(T又はA)TATTATAATGAAGA-３ '(SEQ ID No.1)であった。このプローブは４つの位置に於いて混合されそして5' BamHIクローニング位置を含有している。ハイブリダイジングバンドは、およそ4 .0kbpのEcoRI断片、及びおよそ2.7kbpのEcoRV断片を含んでいた。 130kDa毒素遺伝子の検出の為の285bpのプローブがB.t. 「ユニバーサル」フォーワードプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを使用して201T6細胞ＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって得られた。B.t.ユニバーサルプライマーの配列は、5'GGACCAGGAT TTACAGGAGG AGAT-3'(SEQ ID No.2)である。リバースプライマーの配列は、5'-TGGAATAAATTCA ATT(C又はT)(T又はG)(A又はG)TC(T又はA)A-3'(SEQ ID No.3)である。増幅されたＤＮＡ断片はBMB(インジアナ州インジアナポリス)ランダムプライミングキットを用いて、 ³²Ｐ-dATPで放射性標識された。このプローブでのPS201T6ＤＮＡのサザンブロット分析はおよそ9.3kbpのHindIII断片及び二つのEcoRI断片、及び1. 8及び4.5kbp寸法を含んでいるハイブリダイジングバンドを出現させた。 Sau3Aで部分的に消化したPS201T6ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを構築した。部分制限消化物をアガロースゲル電気泳動で分画した。寸法9.3〜23kbpのＤＮＡ断片をゲルから切り取り、ゲルスライスから電気溶出し、EIutip Dイオン交換カラム（ニューハンプシャー州キーンのシュライヒャーアンドシュール社製）上で精製し、そしてエタノール沈殿によって回収した。Sau3A挿入物をBamHI消化Lamb daGem-11(ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社製)に連結した。組み替えファージをパッケージ化し、大腸菌KW251細胞上にプレートにした。上記のプローブとのハイブリダイゼーシヨンによってプラークをスクリーニングした。ハイブリダイジングファージをプラーク精製し、標準手順によってＤＮＡの単離の為に大腸菌kW251細胞の液体培養基を感染するために使用した（マニアティスティー.、イー.エフ.フリッチ、ジェー.サンブルック[ 1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual，ニューヨークのコールドスプリングハーバー研究所）。 30kDa毒素遺伝子をコードしている遺伝子をサブクローニングするために、分離量のファージＤＮＡをEcoRIＤ消化し、アガロースゲル上で電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有しているおよそ4.5kbpのバンドをゲルから切り取り、ゲルスライスから電気溶出し、上記の様に印イオン交換クロマトグラフィーで精製した。精製されたＤＮＡ挿入物をEcoRI消化されたpBIuescript K/S(カリフォルニア州ラオラのストラテジーン社製）に連結した。連結混合物を凍結したコンピテントな大腸菌NM522細胞( ATCC 47000)を形質転換するために使用した。形質転換物を100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG及び0.5mM XGALを含有しでいるLB寒天上でプレートにした。プラスミッドはアルカリ溶菌（上記のマニアティス等）によって推定上の組み替え物から精製し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化とアガロースゲル電気泳動によって分析した。所望のプラスミド構築物pMYC2357は殺虫蛋白質をコードしている池の毒素遺伝子と比較して新規である毒素遺伝子を含有している。毒素遺伝子の配列分析はＤＮＡ配列から導き出される29906ダルトンのたんぱく質をコードしていることを明らかにした。このヌクレオチド及び導き出されるアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID No.6及び7に示される。 30kDaをコードしている遺伝子をベクターpBClac｛pBC16(ベルンハルドケー. 等の[1978] J．Bacteriol．133: 897-903) 及び pUC19(ヤニッシュ-ペロンシー .等[1985] Gene 33:103-119) からの複製オリジンからなる大腸菌/B.チューリンゲンシスシャトルベクター｝中に於いて、p52A1プロモーターとリボソーム結合位置の制御のもとで発現した。30kDaのオープンリーディングフレームと、3'のフランキング配列を、遺伝子の5'末端と相補性のフォーワードオリゴヌクレオチド、及びpBluescriptのT7プロモーター領域と相補性のリバースオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅した。遺伝子特異的プライマーの配列は、5'-GG AATTCCTC ATG AAA GAG TCA ATT TAC TAC A-3'(SEQ ID No.4)であった。このプライマーは5'BspHIクローニング位置を含有していた。p52A1プロモーター/rbs配列をプロモーター特異的なプライマーと、pMYC2321からのベクタープライマーを使用して増幅した。プロモーター特異的プライマーの配列は、5’GTAAACATGT TCAT ACCACC TTTTTAA-3'(SEQ ID No.5)であった。このプライマーは5'AflIIIクローニング位置を含有していた。p52A1プロモーター断片（BamHI及びAflIIIで消化された）、30kDa 毒素遺伝子断片（BspHI及びSaIＩで消化された）、及びpBClac（BamHＩ及びSa1 Ｉで消化された）を一緒に連結し、pMYC2358を生じた。この構築物を無結晶性(a crystalloferous)(Cry^-)B.t.宿主、CryB(エー.アロンソン、インジアナ州ウエストラファイエットのバーデューユニバーシティー）中にエレクトロポレーションによって導入した。30kDaの毒素の発現は、SDS-PAGE分析によって実証された。N aBr精製結晶を造った（上記のファンネンンシュテイール等）。 130kDa毒素をサブクローニングするために、分離量のファージＤＮＡをSalIで消化し、アガロースゲル上で電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有しているおよそ12.8kbpのバンドをゲルから切り取り、ゲルスライスから電気溶出し、上記の様にイオン交換クロマトグラフィーで精製した。精製したＤＮＡ挿入物をXhoI- 消化pHTBlueII｛pBluescript S/K（カリフォルニア州ラオラのストラテジーン社製）及びレジデントB.t.プラスミッドからの複製オリジン（上記のレレクラス等）からなっている大腸菌／B.チューリンゲンシスシャトルベクター｝中に連結した。連結混合物を凍結したコンビテントな大腸菌NM522細胞 (ATCC 47000)を形質転換するために使用した。上記の様にβ-ガラクトシダーゼ形質転換物をアルカリ性溶菌物プラスミドミニプレップ(minipreps)の制限消化によってスクリーニングした。所望のプラスミド構築物pMYC2362は、殺虫蛋白質をコードする他の毒素遺伝子と比較して新規である、130kDaの毒素をコードしている遺伝子を含有している。 pMYC2362をエレクトロポレーションによって無結晶性（Cry^-）B.t.宿主、CryB （インジアナ州ウェストラファイエットのバーデューユニバーシティーのエー. アロンソン）中に導入した。130kDaの毒素の発現は、SDS-PAGE分析によって実証された。NaBr精製結晶を上記の様に造った。実施例４イエバエ、ムスカドメスチカ（Musca domestica）幼虫に対するB.t. 単離体 PS201T6の活性イエバエ培地（ニュージャージー州フレンチタウンのバイオサーブ Inc.製）2 0gを、50mlの水あたりおよそ6mgのPS201T6毒素結晶と混合した。10匹の第一齢の幼虫を、餌／毒素調製物を有し、ペーパータオルで覆われたプラスチック製の６オンスのカップ中に入れた。インキュベーター中で27RCに於いてバイオアッセイを保ち、蛹形成について評価した。実施例５イエバエ成虫に対する活性イエバエ成虫に対しB.t.単離体PS201T6を試験した。PS201T6からの等級精製されたδ-エンドトキシンを2mg/mlの率で10％庶糖溶液中に懸濁した。生じる混合物は、透明プラスチックカップ中に入れた歯科用ガーゼを飽和する為に使用した。10匹のハエをカップに入れた。処理後24時間で致死率を評価した。PS201T6は、イエバエ、ムスカドメスチカ(Musca domestica)の100％致死率を生じた。水使用の対照実験は、致死率を示さなかった。実施例６ B.t.単離体のアエデスアエジプチ(Aedesaegypti)に対する活性アエデスアエジプチ(Aedes aegypti)、即ちイエローフィーバーモスキート( エジプトシマカ)を、蚊に対する活性を示すために使用した。バイオアッセイは胞子及び結晶懸濁液に対し、又は精製した結晶の懸濁液に対し実施した。懸濁液の希釈物を小さいカップ中の水に加えた。第３齢の幼虫を加え、48時間後に致死率を読んだ。 B.t.単離体PS201T6、PS201L1、PS196S1、及びPS92は、それぞれアエデスアエジプチ(Aedes aegypti)に対し活性であった。実施例７ B.t.単離体のリーフマイナー（ハモグリムシ）に対する活性 B.t.単離体PS201T6、PS201L1、PS196S1、及びPS92Jを標準技術を使用して成育した。第２齢幼虫を自由に吸い取り紙上で食べさせた。全ての四つの単離体は、リーフマイナーであるリリオマイザトリフォリイ(Liriomyza trifolii)に対し毒性であった。 PS201T6からの精製された30kDaの毒素の葉潜りハエ(リーフマイニングフライ) の葉潜り能力と致死率に対する影響を評価するために、バイオアッセイ条件を造り出した。試料を48時間培養後評価した。結果を表４に示す。実施例８ PS201T6培養基材料のプロナーゼ処理プロナーゼは、毒素断片の活性を評価するために、B.t.毒素組成物を蛋白質分解的に分断するために使用することの出来る市販された酵素製剤である。PS201T 6からの133kDa蛋白質を、低分子量ペプチドに加水分解した。驚くべきことに、P S201T6からの30kDa毒素は、本明細書で記載されるように、プロナーゼ処理された後に、およそ25kDaのリミットペプチドに消化された。 PS201T6の培養基を遠心により収穫し、0.5mg/mlプロナーゼＥ（シグマケミカルカンパニー社製の、ストレプトマイセスグリセウスからのP-5147型XIV細菌プロテアーゼ）を含有している0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃（PH 11.0）中で元の培養基容量の約1/9〜1/25に再懸濁された。懸濁液を撹拌しながら37RCで一夜培養した。懸濁液を、蒸留水又は0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃（PH 9.5）の何れかの、それぞれ50〜 100容量の２回の交換に対し透析し、透析懸濁液を生じた。 0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃ (PH 9.5)透析から生じる懸濁液を細胞、胞子及び残骸を除去する為に遠心した。胞子と残骸からの追加的な精製をワットマンのガラスミクロファイバーフィルター、0.8ミクロンセルロースアセテートフィルター、及び0.2ミクロンセルロースアセテートフィルターを通して濾過することにより達成し、濾過された上澄みを生じた。透析された懸濁液と、濾過された上澄み液は更に50〜100容量の蒸留水二回の交換に対し更に透析され、続いて凍結乾燥され、凍結乾燥試料を得た。透析された懸濁液、濾過された上澄み液、及び凍結乾燥された試料のプロナーゼ処理毒素物質が、歯科用ガーゼ上の10％庶糖溶液中で、成虫のイエバエに供給された時に、それぞれはイエバエに対し致死的であった。これらの物質のＬＣ₅₀ 値は、活性化されたポリペプチド含量に基づいてmlあたり40〜300μgの範囲である。実施例９ PS201T6からの活性毒素 201T6の30kDa毒素のN-末端からの43個のアミノ酸の除去は、その活性の範囲と効力を増加させるこの毒素の有利な活性化を生じることがわかった。切断された毒素の配列をSEQ ID No.8に示す。表５は、切断された毒素と、全長の30kDaの毒素の物理的な性質を比較する。更にN-末端からの約１〜約12の追加的なアミノ酸の除去も活性毒素を得るために行われ得る。C末端から約5〜10個のアミノ酸を除去することも可能である。実施例１０コーンルートウォームに対する活性 B.t.PS201T6の毒素含有懸濁液を、寒天に基づく昆虫の餌の表面上に分配した。ウェスタンコーンルートウォーム(WCR: ディアブロチカヴィルギフェラヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera))の幼虫を餌上に移す前に、表面から過剰の液体を蒸発させた。３日以内に、cm²あたり45μgの毒素の評価される率が、WCR幼虫の90％の致死率を生じた。水のみに暴露された対照の致死率は15 ％未満であった。実施例１１毒素遺伝子の植物細胞への挿入本発明の１つの面は双翅類又はコーンルートウォームに活性の毒素をコードする遺伝子で植物を形質転換することである。形質転換された植物は双翅類又はコーンルートウォームによる攻撃に対し抵抗性である。毒素をコードする本明細書に開示される遺伝子は、この分野で良く知られた種々の技術を使用して植物細胞中に挿入できる。例えば大腸菌中の複製系と形質転換細胞の選択を可能とするマーカーとを含んでいる多数のクローニングベクターが、外来遺伝子のより高等な植物中への挿入の為の調製に入手できる。そのベクターは例えばpBR322、pUC系、M13mp系、pACYC184などを含んでいる。従ってB.t. 毒素をコードする配列は適当な制限位置においてベクター中に挿入できる。生じるプラスミドは大腸菌中への形質転換のために使用される。大腸菌細胞は適当な栄養培地中で培養され、次に収穫されて溶菌される。プラスミドは回収される。配列分析、制限分析、電気泳動及び他の生化学-分子生物学的方法は一般に分析の為の方法として実施される。各操作の後、使用されたDNA配列は開裂され、そして次のDNA配列に結合される。各プラスミド配列は同じか又は他のプラスミドにクローニングできる。植物中に所望の遺伝子を挿入する方法に依存して他のDN A配列が必要かもしれない。例えばもしTi又はRiプラスミドが植物細胞の形質転換に使用される時は、Ti又はRiプラスミドT-DNAの少なくとも右のボーダー、しかししばしば右及び左のボーダーが、挿入されるべき遺伝子のフランキング領域として結合されなければならない。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は広く研究されており、そしてEP120 516；ホエケマ(1985)のザバイナリープラントベクターシステム、オフセットドゥルクケルジカンタース(Offset-durkkerij Kanters)B.V.、Alblasserdam( アルブラッサーダム)、チャプター５；フラーレー等 Crit．Rev．Plat Sci．4:1 -46;及びアン等（1985）EMBO J．4:277-287に十分に記載されている。挿入されたDNAがゲノムに一旦組込まれれば挿入されたDNAは比較的そこで安定であり、通常切出されない。これは普通なかでもカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコール等の殺生物剤又は抗生物質に対し抵抗性を形質転換された植物細胞に与える選択マーカーを含有している。独立に使用されたマーカーは従って挿入されたDNAを含有しない細胞ではなくて、形質転換された細胞の選択を可能とする。 DNAを植物宿主細胞に挿入するために数多くの技術が利用できる。これらの技術には、形質転換剤としてアグロバクテリウムツメファシエンス又はアグロバクテリウムリゾゲネスを使用するT-DNAでの形質転換、融合、注入又はエレクトロポレーションならびに他の可能な方法が含まれる。形質転換のためにアグロバクテリアが使用される時は、挿入されるべきDNAは特別なプラスミド、即ち中間体ベクター又はバイナリーベクターのいずれかにクローン化されなければならない。この中間体ベクターはT-DNAの配列に対し相同性である配列のために、相同組替えによってTi又はRiプラスミドに組込みできる。Ti又はRiプラスミドはまたT-DNAを移すのに必要なvir領域を含んでいる。中間体ベクターはそれら自体でアグロバクテリア中で複製できない。中間体ベクターはヘルパープラスミドによってアグロバクテリウムツメファシエンス中に移されることができる（コンジュゲーション）。バイナリーベクターは大腸菌中でもアグロバクテリア中でもそれら自体で複製できる。これらは選択マーカー遺伝子とリンカー又はポリリンカーを含んでおり、これらは右及び左T-DNAボーダー領域によりフレームされる。これらはアグロバクテリア中に直接形質転換できる（ホルスター等[1 978] Mol．Gen．Genet．163:181-187）。宿主細胞として使用するアグロバクテリウムはvir領域を持つプラスミドを含むべきである。vir領域はT-DNAを植物細胞に移すのに必要である。追加のT-DNAが含まれ得る。そのように形質転換された細菌は植物細胞の形質転換に使用される。そのDNAを植物細胞に移す為には、アグロバクテリウムツメファシエンス又はアグロバクテリウムリゾゲネスと植物外植体(explant)が培養されるのが有利であり得る。次に、選択のために抗生物質又は殺生物剤を含み得る適当な培地中で感染した植物物質（例えば葉の切れ端、茎のセグメント、根のみならず原形質体又は懸濁培養細胞も）から、全体の植物が再生できる。そのようにして得られたこの植物は次に挿入されたDNAの存在について試験される。注入及びエレクトロポレーションの場合にはプラスミドに特別な要求がなされない。例えばpUC誘導体などの通常のプラスミドの使用が可能である。形質転換された細胞は通常の方法で植物内で成長する。これらは性殖細胞を形成でき、そして子孫植物に対し形質転換された性質（群）を伝達する。そのような植物は通常の方法で成育でき、そして同じ形質転換された遺伝因子又は他の遺伝因子を有する植物と交配できる。生じる雑種個体は対応する表現型性質を有する。実施例１２新規なB.チューリンゲンシス遺伝子の昆虫ウイルスへのクローニング多くのウイルスが昆虫に感染することが知られている。これらのウイルスには例えばバクロウイルス及びエントモポックスウイルスが含まれる。本発明の一具体例中では本明細書に記載される双翅類及び／又は鞘翅類活性遺伝子を昆虫ウイルスのゲノムと共にいれることができ、従ってウイルスの病原性を強化できる。 B.t.毒素遺伝子を含む昆虫ウイルスを構築する方法はよく知られ、当業者に容易に実施される。これらの手順は例えばメリーウェザー等（メリーウェザー、A.T.、U.ウェイヤー、M.P.G.ハリス、M.ヒルスト、T.ブース、R.D.ポッシー(1990) J．Gen．Virol． 71:1535-1544)及びマルテンス等（マルテンス、J.W.N.、G.ホーニー、D.ズイデマー、J.W.M.バンレント、B.ビサー、J.M.ブラック(1990) Appl．Environmental Microbiol．56(9):2764-2770）に記載されている。本明細書に記載された実施例と具体例は説明目的のみの為であり、それをみて種々の変更又は修飾が当業者に示唆でき、そして添付の特許請求の範囲及び本願の精神と範囲の中に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＺ (72)発明者ウエダ，ケンドリック，アキラアメリカ合衆国 92109 カリフォルニア州サンディエゴシャルセドニーストリート 185 アパートメントシー (72)発明者スタルダー，クリスティン，ジェイ. アメリカ合衆国 92041 カリフォルニア州ラメーザモゼールレーン 9849 (72)発明者マイケルズ，トレイシー，エリスアメリカ合衆国 92027 カリフォルニア州エスコンディードファーンストリート 1110

Claims

【特許請求の範囲】１．双翅類害虫に活性であり、寄託物NRRL B-18747の同定特性を有するバシルスチューリンゲンシス PS92J、寄託物NRRL B-18748の同定特性を有するバシルスチューリンゲンシス PS196S1、寄託物NRRL B-18749の同定特性を有するバシルスチューリンゲンシス PS201L1、及び寄託物NRRL B-18750の同定特性を有するバシルスチューリンゲンシス PS201T6からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス単離体、及び双翅類害虫に対し活性の性質を保持しているその突然変異体からのＤＮＡによってコードされる精製された毒素。２．ＤＮＡ又はそのバリアントがバシルスチューリンゲンシスPS92J、バシルスチューリンゲンシスPS196S1、バシルスチューリンゲンシスPS201L1、及びバシルスチューリンゲンシスPS201T6からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス菌株及び双翅類害虫に対し活性の性質を保持しているその突然変異体からのものであり、双翅類害虫に対し活性である毒素をコードしているＤＮＡを含んでいる単離されたポリヌクレオチド配列。３．SEQ ID No.7の全部又は一部をコードするＤＮＡを含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。４．SEQ ID No.6の全部又は一部を有するＤＮＡを含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。５．SEQ ID No.8に示されるアミノ酸配列をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド配列。６．請求項２のポリヌクレオチドを含んでいる、組み替えＤＮＡトランスファーベクター。７．コーンルートウォームに対し活性であり、バシルスチューリンゲンシスPS2 01T6からの遺伝子によってコードされる蛋白質の全部又は一部を含んでいる毒素の有効量をコーンルートウォーム又はその環境に投与することからなる、コーンルートウォームを抑制する方法。８．該毒素がSEQ ID No.7に示されるアミノ酸配列の全部又は一部を含んでいる請求項７に記載の方法。９．該毒素がSEQ ID No.8に示されるアミノ酸配列を含んでいる請求項８に記載の方法。