JPH0558833A

JPH0558833A - 新規な双翅類害虫に活性の新規なバシラス・チユーリンゲンシス単離体

Info

Publication number: JPH0558833A
Application number: JP3290455A
Authority: JP
Inventors: Jewel M Payne; エム．ペインジユエル; Akira Ueda Kendrick; アキラウエダケンドリツク; Christine Julie Stalder; ジユリエスタルダ− クリスチン; Tracey Ellis Michaels; エリスマイケルストラシ−
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-10-11
Publication date: 1993-03-09
Also published as: CA2051562A1; DE69133345D1; DE69133345T2; EP0480762B1; EP0677583A1; EP0480762A2; EP0480762A3; CA2051562C; ATE256187T1

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明の目的は殺虫剤の提供である。【構成】双翅類に対して活性を有しているB.t.ＰＳ１
９２Ｎ１、B.t.ＰＳ９２Ｊ、B.t.ＰＳ１９６Ｓ１、B.t.
ＰＳ２０１Ｌ１、及びB.t.ＰＳ２０１Ｔ６と命名される
新規なバシラス・チューリンゲンシス単離体が開示され
特許請求されている。これらの単離体又はその突然変異
株は害虫の防除に使用できる。またこれらの単離体から
新規なδ−エンドトキシンをコ−ドしている遺伝子を除
き、他の宿主微生物又は植物に移すことが出来る。その
ような宿主でδ−エンドトキシンを表現すると宿主の環
境にいる感受性の害虫を防除できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は双翅類害虫に対して活性
のある新規なバシラス・チューリンゲンシス(Bacillus
thuringiensis)単離体に関する。

【従来の技術】何百ものバシラス・チューリンゲンシス
(B.t.)の系統は、δ-エンドトキシンと命名される昆虫
毒素を生産する。これらは胞子形成B.t.細胞によって合
成される。この毒素は感受性のある昆虫の幼虫によって
結晶型で摂取されると、昆虫の消化管の上皮細胞が破壊
される。B.t.の報告された活性スペクトルは、鱗翅目
（Lepidoptera）と鞘翅目（Coleoptera）内の昆虫種を
包含し、その多くは農林業の主要害虫である。活性スペ
クトルはまた、蚊とブヨ(black flies)を含む双翅目(Di
ptera)の昆虫を包含している。コウチ・ティー・エル(C
ouch, T.L.)(1980年)「バシラス・チューリンゲンシス・
バラエティ・イスラエレンシス(B.thuringiensis var.
israelensis)の蚊病原性」Developments in Industrial
Microbiology (工業微生物学の発展)22巻61-76頁；ビ
ーグル・シー・シー(Beegle, C.C.)(1978年)「農業生態
系における虫生細菌の使用」Developments in Industri
al Microbiology (工業微生物学の発展)20巻97-104頁を
参照のこと。双翅類の昆虫は重大なやっかいものであ
り、マラリア、糸状虫症（onchocerciasis）、馬の脳
炎、及び犬の糸状虫等の多くの重い人と動物の病気の仲
介物である。蚊及びブヨを殺すことが知られている二つ
のB.t.の変種は、B.t.イスラエレンシス（B.t.i.）（ゴ
ルドベルグ，Ｌ．Ｊ．、Ｊ．マルガリット［１９７７］
Mosquito News ３７：３５５−３５８）と、B.t.モリソ
ニ（B.t.m.）（パドゥア，Ｌ．Ｅ．、Ｍ．オオバ、Ｋ．
アイザワ［１９８４］J. Invertebrate Pathology ４
４：１２−１７）である。これらは非標的生物に対し有
害でなく（ムラ，Ｍ．Ｓ．、Ｂ．Ａ．フェデリッチ、
Ｈ．Ａ．ダルワゼエ［１９８２］ Environmental Entom
ology １１：７８８−７９５）、双翅類の害虫の統合
化された制御において重要な役割を果す。これらは都会
地域で使用するのに安全であり、他の種に対し害を及ぼ
すことなしに水性環境に於いて使用することが出来る。
双翅類の害虫はまた家禽及び家畜産業に於ける主要な問
題源でもある。重大な牛の害虫であるホ−ンフライ（ho
rn fly）は幼虫の段階でB.t.によって殺される（テルメ
イヤ−，Ｋ．Ｂ．［１９９０］「ハエの抑制のためのバ
シラスチューリンゲンシスの可能性」 Fifth Internati
onal Coloquium on Invertebrate Pathology and Micro
bial Control, Society forInvertebrate Pathology, 3
52-356）。ヨーロッパ特許出願９０３０７２０４．９
（公開番号０４０９４３８）はバシラスチューリンゲン
シスの双翅類に対し活性の単離体であるＰＳ７１Ｍ３及
びＰＳ１２３Ｄ１を開示している。ハエはおよそどこに
でも見出すことが出来る豊富な種である。これらは通常
やっかいものとなるほど多数発生する。双翅類の大多数
は害虫と考えられ、経済に重要な関連性をもつ。成虫種
は吸血性であり、人及び人の家畜に対し刺激を生じる。
他のものはゴミ処理のハエであり、食物を汚染する生物
及び病原体を機械的に運搬する。両方のハエともマラリ
ア、黄熱病、フィラリア、眠り病、チフス熱、及び赤痢
などの病気の重要な仲介物である。数種の幼虫は主要な
農作物の害虫であり、種子、根、葉及び果実等の植物の
全ての部分を食べ得る。ある種の幼虫はきのこを食べ、
きのこ生産に対する被害を生じる。幼虫は動物に発生す
るとき家畜を刺激し得る。成虫も幼虫も人及び農業に対
する害虫と考えられる。イエバエ（family Muscidae）
は双翅目の重要な害虫である。これらはやっかいもので
あり、人及び動物の病気の仲介物である。これらのハエ
の、ごみや排せつ物の上を歩いたりこれらを食べたりす
る習慣及び人と食べ物の上を歩いたり食べたりする習慣
は病源生物を運搬する理想的な媒体としている（メトカ
ルフ，Ｃ．及びフリント，Ｗ．１９６２，破壊的及び有
用な昆虫，ニューヨークのマグローヒルブックカンパニ
ー，１０３０−１０３５）。また、この種は動物に対し
ても害虫であり得、開いた傷を通じて病気をうつす。ま
た、ムスシダエ（Muscidae）は小イエバエ（little hou
se fly）、フェースフライ（face fly）、ステーブルフ
ライ（stable fly）及びホーンフライ（horn fly）を含
んでおり、これらは全て家畜の害虫である。これらの種
は牛、家禽、馬及び他の種の家畜の害虫である。これら
は動物の近くに位置している堆肥やくさったワラで卵を
かえす。ホーンフライやステーブルフライはかみつくハ
エであり、酪農家畜に対してストレスを生じ、ミルクの
生産を減少させる。イエバエは、国内のみならず世界中
で経済的な問題を起こしていると考えられる。リーフマ
イニングフライ（葉潜りバエ）は馬鈴薯、トマト、及び
セロリ等の経済的に重要な作物に対する被害と収率の損
失を生じる。また、双翅類のリーフマイナーは装飾的花
産業の主要な害虫と考えられる（パレラ，Ｍ．Ｐ．１９
８７ BBiology of Liriomyza. Ann. Rev. Entomol. ３
２：２０１−２２４）。最も一般的なリーフマイナーは
アグロマイジダエ（Agromyzidae）科に見出されるが、
アントマイイダエ（Anthomyiidae）科、ドロソフィリダ
エ（Drosophilidae）科、及びエフィドリダエ（Ephydri
dae）科も葉潜りハエを含んでいる（ヘスペンヘイデ，
Ｈ．Ａ．１９９１，Bionomics of leafmining insects.
Ann. Rev. Entomolo. ３６：５３５−６０）。リリオ
マイザ（Liriomyza）属のハエ（セルペンティンリーフ
マイナーとも知られている）は、その世界的な分布、多
食性の性質、及び殺虫剤に対する抵抗性の為に特に重要
である。カリフォルニア州で菊産業はおよそ９千３百万
ドルの損失を１９８１〜１９８５年の間にリリオマイザ
トリフォリイ（Liriomyza trifolii）に対して失って
いる。また植物の双翅類害虫、例えばヘシアンフライ
（Hessian fly）及びメドフライ（Medfly）及びメクス
フライ（Mexfly）が存在し、これらに対しB.t.製品は非
常に貴重である。

【課題を解決する手段】本発明は新規な双翅類害虫に対
する活性を有する新規なバシラスチューリンゲンシス単
離体に関する。特にバシラスチューリンゲンシス単離体
は、黄熱病蚊、アエデスアエジプチ（Aedes aegypti）
及びイエバエ（Musca domestica）及びリーフマイニン
グフライ（Liriomyza trifolii）に対し毒性であること
が見出された。より詳しくは、本発明はB.t.ＰＳ１９２
Ｎ１、B.t.ＰＳ９２Ｊ、B.t.ＰＳ１９６Ｓ１、B.t.ＰＳ
２０１Ｌ１、及びB.t.ＰＳ２０１Ｔ６と命名される新規
なB.t.単離体及びそれらの突然変異体、及び双翅類の害
虫に対し活性である蛋白質をコ−ドしたこれらのB.t.単
離体から得られる新規なδ−エンドトキシン遺伝子から
なる。バシラスチューリンゲンシス単離体、及びそれか
らの毒素は、ごみ、堆肥、水、及び植物及び他の表面に
対するスプレ−として使用できる。これらはまた、家畜
動物及び愛玩動物に対して飼料を通じても使用できる。
トランスゲニックな植物及び種子は、茎、葉、及び種子
を食べるウジの防除に使用できる。種子はまた単離体又
はそれからの毒素で処理することが出来る。本発明のバ
シラス・チューリンゲンシス単離体は以下の特性をもっ
ている。B.t.ＰＳ１９２Ｎ１の特徴集落形態 -- 大集落、表面はくすんでおり、
B.t.に典型的。増殖期の細胞形態 -- B.t.に典型的。培養方法 -- B.t.に典型的。鞭毛の血清型 -- 19, トチギエンシス。細胞内封入体 -- 非晶質。アルカリ可溶性蛋白質--SDS-ポリアクリルアミドゲル
は、140,122, 76, 72及び38キロダルトンの蛋白質を示
す。殺虫活性 -- B.t.PS192N1はアエデスアエジ
プチ（Aedes aegypti）に対し１０μｇ／ｍｌのＬＣ₅₀
を有する。表１双翅類に活性の既知のB.t.i.とB.t.m.菌株中の蛋白質と
B.t.ＰＳ１９２Ｎ１のものとの比較菌株蛋白質の分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ｋＤａ B.t.イスラエレンシス１３０，６７，２７ B.t.モリソニ１３８，１２８，１２５，６７，２７ B.t.ＰＳ１９２Ｎ１１４０，１２２，７６，７２，３８B.t.ＰＳ９２Ｊ、B.t.ＰＳ１９６Ｓ１、B.t.ＰＳ２０１
Ｌ１、及びB.t.ＰＳ２０１Ｔ６に共通の特徴集落形態 -- 大集落、表面はくすんでおり、B.t.
に典型的。増殖期の細胞形態--B.t.に典型的。培養方法 -- B.t.に典型的。殺虫活性 -- 封入体ははアエデスアエジプチ(Ae
des aegypti)を殺す。B.t.ＰＳ９２Ｊ、B.t.ＰＳ１９６Ｓ１、B.t.ＰＳ２０１
Ｌ１、B.t.ＰＳ１９２Ｎ１及びB.t.ＰＳ２０１Ｔ６を互
に、及び既知の蚊に活性の菌株と区別する特徴既知菌株セロバル(serovar) 封入体蛋白質の大きさ(kDa) B.t.ＰＳ７１Ｍ３ 8a8b,モリソニ非晶質 142,133タ゛フ゛レット,67,27 B.t.ＰＳ１２３Ｄ１ 14,イスラエレンシス非晶質 133,67,27 新規菌株 B.t.ＰＳ１９２Ｎ１ 19,トチキ゛エンシス非晶質 140,122,76,72,38 B.t.ＰＳ９２Ｊ新規なセロバル非晶質 102,81,67 B.t.ＰＳ１９６Ｓ１ 10,タ゛ルムスタシ゛エンシス非晶質 73,69,29 B.t.ＰＳ２０１Ｌ１反応なし非晶質 75トリフ゜レット,62,40 B.t.ＰＳ２０１Ｔ６ 24,ネオレオネンシス長円形& 133,31 ハ゛イヒ゜ラミタ゛ル本発明の新規なB.t.単離体又はその突然変異株は、標準
技術の培地及び発酵技術を用いて培養できる。発酵周期
の終了時に、この技術で周知の手段によって、まずB.t.
胞子及び結晶を発酵液から分離することによって細菌を
取り入れることができる。回収されたB.t.胞子及び結晶
は、扱いと特定の目標害虫への施用を容易にするため
に、表面活性剤、分散剤、不活性担体及び及びその他の
成分の添加によって水和剤、噴霧液、濃厚液、粒剤、そ
の他の処方剤へ処方できる。これらの処方及び施用手順
はこの技術で周知であり、市販の菌株で使用できる。こ
の新規なB.t.単離体、及びその突然変異体は、双翅類の
害虫を抑制するのに使用できる。本発明の培養基は、ア
メリカ合衆国61604イリノイ州ピオリア、ノース・ユニ
バーシティ・ストリート1815番地、北部研究センター、
農業研究サービス特許培養基保存施設(NRRL)に寄託され
た。培養基受託番号寄託期日バシラス・チューリンゲンシスPS92J NRRL B-18747 1991年1月9日バシラス・チューリンゲンシスPS196S1 NRRL B-18748 1991年1月9日バシラス・チューリンゲンシスPS201L1 NRRL B-18749 1991年1月9日バシラス・チューリンゲンシスPS201T6 NRRL B-18750 1991年1月9日バシラス・チューリンゲンシスPS192N1 NRRL B-18721 1990年10月5日これらの培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下に権
限があると特許庁長官に認められた者が本特許出願の係
属中に培養基を入手できることを保証されているという
条件の下に寄託された。また、本出願又はその子孫の対
応特許出願が提出されている国々の特許法で要求される
なら、寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入手でき
るからといって、行政行為によって付与された特許権を
損わしめて本発明を実施する権利を構成するものではな
いことを理解すべきである。更に、本培養基寄託物は、
ブタペスト微生物寄託条約の規定に従って保存され、一
般の人々に入手可能とされる。すなわち、寄託物の試料
提供に対する最も最近の請求後少なくとも5年間、かつ
どんな場合も、寄託期日から少なくとも30年間か、又は
培養基を開示して発行される特許の権利行使可能な期間
中、これらの寄託物は、生育可能で汚染されていない状
態に保つために必要なあらゆる配慮をもって保存され
る。要求を受けた受託施設が、寄託物の状態のために試
料を供給できない場合には、寄託者は寄託物を補充する
義務を認めるものである。本培養基寄託物の一般への入
手可能性に関するすべての制限は、これらを開示した特
許の付与に際して永久に取り除かれる。本発明の新規な
単離体に存在する毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホスト
へ導入できる。毒素遺伝子の表現は、直接又は間接に殺
虫剤の細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト、例
えばシュードモナスの場合、微生物は双翅目昆虫発生位
置に施用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。
その結果、望んでいない昆虫を防除できる。別の方法と
して、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられ
る毒素の活性を長期化させるような条件下に処理でき
る。次に処理細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる
生成物はB.t.毒素の毒性を保持している。B.t.毒素遺伝
子が適当なベクターを経て微生物ホストへ導入されて、
このホストが生きている状態で環境へ施用される場合
に、あるホスト微生物を使用することが必須である。微
生物ホストは、一つ以上の重要作物の「植物領域」(葉
面、葉領域、根領域、及び/又は根表面)を占有すること
が知られたものを選択する。これらの微生物は、特定環
境（作物及び他の昆虫生息地）中で野性型微生物とうま
く競合できるように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤を表現
させる遺伝子の安定な維持と表現を提供し、望ましくは
殺虫剤に対して環境的分解と不活性化からの改良された
保護を提供する。広範囲の重要作物の葉面(植物の葉の
表面)及び／又は根の領域(植物の根の周囲の土壌)に生
息する多数の微生物が知られている。これらの微生物は
細菌、藻類及び(真)菌類(fungi)を包含している。特に
興味あるものは、細菌、例えばバシラス(Bacillus)、シ
ュードモナス(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwinia)、
セラティア(Serratia)、クレブシェラ(Klebsiella)、キ
サントモナス(Xanthomonas)、ストレプトミセス(Strept
omyces)、リゾビウム(Rhizobium)、ロードシュードモナ
ス(Rhodopseudomonas)、メチロフィリウス(Methylophil
ius)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アセトバ
クター(Acetobacter)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、アー
スロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター(Azotoba
cter)、リューコノストック(Leuconostoc)、アルカリゲ
ネス(Alcaligenes)、及びクロストリジウム(Clostridiu
m)属の細菌；(真)菌類(fungi)、特に酵母、例えばサッ
カロミセス(Saccharomyces)、クリプトコッカス(Crypto
coccus)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、スポロボ
ロミセス(Sporobolomyces)、ロードトルラ(Rhodotorul
a)、及びオーレオバシジウム(Aureobasidium)属など、
ミクロ藻類（microalgae）、例えばシアノフィセアエ(C
yanophyceae)、プロクロロフィセアエ(Prochlorophycea
e)、ロドフィセアエ(Rhodophyceae)、ディノフィセアエ
(Dinophyceae)、クリソフィセアエ(Chrysophyceae)、プ
リムネシオフィセアエ(Prymnesiophyceae)、キサントフ
ィセアエ(Xanthophyceae)、ラフィドフィセアエ(Raphid
ophyceae)、バシラリオフィセアエ(Bacillariophycea
e)、エウスチグマトフィセアエ(Eustigmatophyceae)、
クリプトフィセアエ(Cryptophyceae)、エウグレノフィ
セアエ(Euglenophyceae)、プラシノフィセアエ(Prasino
phyceae)、クロロフィセアエ(Chlorophyceae)科、の微
生物である。特に重要なものは、シュードモナス・シリ
ンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フル
オレッセンス、セラティア・マルセスケンス(Serratia
marcescens)、アセトバクター・キシリヌム(Acetobacte
r xylinum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A
grobacterium tumefaciens)、ロードシュードモナス・
スフェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサ
ントモナス・カンペストリス(Xanthomonascampestri
s)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium melioti)、アル
カリゲネス・エントロフス(Alcaligenesentrophus)、及
びアゾトバクター・ヴィンランディ(Azotobacter vinla
ndii)のような植物領域の細菌種；及びロードトルラ・
ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルチニス(R. glutini
s)、R.マリーナ(R. marina)、R.オーランティアカ(R.au
rantiaca)、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptococc
us albidus)、C.ジフルエンス(C. diffluens)、C.ロー
レンティ(C. laurentii)、サッカロミセス・ロゼイ(S.
rosei)、S.プレトリエンシス(S. pretoriensis)、S.セ
レビシエ(S. cerevisiae)、スポロボロミセス・ロゼウ
ス(Sporobolomyces roseus)、S.オドルス(S. odorus)、
クルイベロミセス・ヴェローナエ(Kluyveromyces veron
ae)及びオーレオバシジウム・ポルランス(Aureobasidiu
m pollulans)のような植物領域の酵母種である。特に重
要なのは有色素微生物である。遺伝子の安定な保持と表
現を可能とするような条件下に、毒素を表現させるB.t.
遺伝子を微生物ホストに導入するには、さまざまな方法
を利用できる。毒素遺伝子表現用の転写翻訳調節信号と
その調節制御下の毒素遺伝子、及び組込みを行なうため
のホスト生物内の配列と相同のDNA配列、及び／又は組
込みや安定な保持が起こるための、ホスト内で機能的な
複製系などを含んだDNA構造体を用意することができ
る。転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包
含しよう。ある場合には、毒素の調節的表現を提供し
て、毒素の表現が環境への放出後にのみ生ずるようにす
るのが望ましいこともある。これはオペレータ、又はア
クチベータやエンハンサに結合する領域、によって達成
でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化に
よって誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用
すると、生物は毒素を表現せずに実験室で生育でき、環
境へ放出されると表現が始まる。他の手法は、実験室で
毒素の表現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方
環境中での栄養培地は毒素表現を可能とするものを使用
できる。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コド
ンが存在しよう。メッセンジャーRNAの安定性を強化す
る配列を使用すると共に、特に活性プロモータを使用し
てメッセンジャーＲＮＡの表現を強化するために種々の
操作を使用できる。転写及び翻訳終結領域は停止コド
ン、終結領域、及び任意にポリアデニル化信号を包含し
よう。内膜を経由する蛋白の分泌を促進するために、翻
訳されたポリペプチド配列のアミノ末端に疎水性「リー
ダー」配列を使用できる。転写の方向、すなわちコーデ
ィング又はセンス配列の5'から3'への方向で、構造体は
転写調節領域(これがある場合)とプロモータ（制御領域
はプロモータの5'又は3'のいずれかにある)、リボゾー
ム結合位置、開始コドン、開始コドンと同調する開放読
取り枠をもった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル
化信号配列(使用する場合)、及び終結領域を包含しよ
う。二本鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ホストの
転写に使用できるが、通常マーカーを含めたDNA配列を
伴っており、この第二のDNA配列はホストへのDNA導入中
に毒素表現構造体に結合させることができる。マーカー
とは、変更又は形質転換されたホストの選定を行なうた
めの構造遺伝子のことである。マーカーは通常、選択的
利点を提供するもので、例えば抗生物質や重金属への耐
性などの殺生物剤耐性や、栄養素要求ホストに原栄養性
を与える相補性を提供する。変更されたホストが選定さ
れるだけでなく、野外で競合的であるように、相補性を
使用するのが好ましい。構造体の開発に、またホストの
変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野外で他の
野性型微生物に対する競合的利点を提供することによっ
て、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート剤、
例えばシデロフォア類の表現用遺伝子を、毒素表現用の
構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。この方法で、
シデロフォアの強化された表現が毒素生産ホストに競合
的利点を提供するため、ホストは野性型微生物と効果的
に競合し、環境中で安定した生態的地位を占めるように
なる。機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホス
ト内の配列と相同な、少なくとも50塩基対(bp)、好まし
くは少なくとも約100 bp、及び通常約5,000 bpを越えな
い配列を包含しよう。こうして合法的な組換えの可能性
が強化されるため、遺伝子はホストへ組込まれ、ホスト
によって安定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提供
する遺伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接し
ているのが望ましい。従って、毒素遺伝子が失われる場
合、生ずる生物は相補性遺伝子及び/又は競合的利点を
提供する遺伝子も失う可能性が強く、このため無傷の構
造体を保持している遺伝子と環境中で競合できなくな
る。細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻
類、カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域は、trp
遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモ
ータ、Tacプロモータ、及びホスト中で機能的な場合は
毒素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータを包含す
る。例として合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832号
及び第4,356,270号を参照のこと。終結領域は、普通は
転写開始領域又は別の転写開始領域(二つの領域がホス
ト内で適合的で機能的である限りにおいて)と関連する
終結領域でありうる。安定なエピゾーム保持又は組込み
を所望する場合は、ホスト中で機能的な複製系をもった
プラスミドが使用されよう。複製系は染色体、ホスト又
は異なるホスト内に通常存在するエピゾーム要素から、
又はホスト内で安定なウイルスの複製系から誘導され
る。pBR322、pACYC184、RSF1010、pRO1614等のような多
数のプラスミドが入手できる。例として、オルソン(Ols
on)ら、(1982年) J. Bacteriol.150巻6069頁、及びバグ
ダサリアン(Bagdasarian)ら、(1981年) Gene 16巻237
頁、並びに合衆国特許第4,356,270号、第4,362,817号、
及び第4,371,625号を参照のこと。B.t.遺伝子は開始領
域の調節制御下にあるように、転写翻訳開始領域と転写
翻訳終結領域との間に導入できる。この構造体はプラス
ミドに含有され、プラスミドは少なくとも一つの複製系
を包含するが、一つ以上を包含でき、その場合一つの複
製系はプラスミドの開発中にクローニング用に使用さ
れ、第二の複製系は最終ホストでの機能発揮に必要であ
る。更に、すでに述べた一つ以上のマーカーが存在でき
る。組込みを望む場合は、プラスミドはホストゲノムと
相同の配列を含むのが望ましい。形質転換体は、通常、
未変更生物や運搬生物が存在する時は、それらに対して
所望生物を選定できるように、慣用の方法に従って選定
手法を使用して単離できる。次に形質転換体を殺虫活性
のために試験できる。処理細胞を目標害虫環境に施用す
る時に細胞内毒素の活性を持続させるために、殺虫剤含
有細胞を処理するのに適したホスト細胞は、原核生物か
真核生物を包含するが、通常、哺乳類のような高等動物
に有毒な物質を生じない細胞に限定される。しかし、毒
素が不安定か、哺乳類ホストへの毒性の可能性を回避す
るのに十分な低い施用水準である場合には、高等生物に
有毒な物質をつくる生物も使用できる。ホストとして特
に興味あるものは、原核生物と、カビのような低級真核
生物である。グラム陰性・陽性双方の原核生物の例はエ
シェリキア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、シ
ゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmonella)及びプロテウ
ス(Proteus)のような腸内細菌科(Enterobacteriacea
e)；バシラス科(Bacillaceae)；リゾビウム(Rhizobium)
のようなリゾビウム科(Rhizobiaceae)；発光細菌、ジモ
モナス(Zymomonas)、セラティア(Serratia)、アエロモ
ナス(Aeromonas)、ビブリオ(Vibrio)、デスルホビブリ
オ(Desulfovibrio)、スピリルム(Spirillum)のようなら
せん菌科；乳酸かん菌科;シュードモナス(Pseudomonas)
及びアセトバクター(Acetobacter)のようなシュードモ
ナス科；アゾトバクター科、放線菌科(Actinomycetale
s)及びニトロバクター科を包含する。真核生物には藻菌
類(Phycomycetes)と子のう菌類(Ascomycetes)のような
菌類があり、これはサッカロミセス(Saccharomyces)と
シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)のような酵
母、ロードトルラ(Rhodotorula)、オーレオバシジウム
(Aureobasidium)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)
のような担子菌類(Basidiomycetes)酵母を包含する。
生産目的のためにホスト細胞を選択する上で特に重要な
特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容易さ、表現系
の入手性、表現効率、ホスト中の殺虫剤の安定性、及び
補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプセ
ルとして使用するのに重要な特性は厚い細胞壁、色素形
成、及び細胞内パッケージング又は封入体の細胞内パッ
ケージング又は形成のような殺虫剤保護性；水性環境で
の生存性；対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂取させるため
の誘引力；毒素に損害を与えない殺菌固定の容易さ等を
包含する。他の考慮としては、処方と取扱いの容易さ、
経済性、保存安定性等がある。特に重要なホスト生物
は、ロードトルラの種、オーレオバシジウムの種、サッ
カロミセスの種、スポロボロミセスの種のような酵母；
シュードモナスの種、エルウィニアの種、及びフラボバ
クテリウムの種のような葉面に生息する生物；又はエシ
ェリキア、乳酸杆菌の種、バシラスの種、ストレプトミ
セスの種等の他の生物を包含する。特定的な生物は、シ
ュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonasaeruginos
a)、シュードモナス・フルオレッセンス(P.fluorescen
s)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev
isiae)、バシラス・チューリンゲンシス、大腸菌、枯草
菌(B.subtilis)、ストレプトミセス・リビダンス(Strep
tomyces lividans)を包含する。細胞は通常、無傷であ
って、処理時に胞子型よりも実質的に増殖型にあるが、
ある場合には胞子も使用できる。微生物細胞、例えばB.
t.毒素遺伝子を含有する微生物の処理は、毒素の性状に
悪影響を及ぼさないか、又は毒素を保護する細胞能力を
消滅させない限り、化学的又は物理的手段によるか、又
は化学的及び物理的手段の組合わせによる。化学的試薬
の例はハロゲン化剤、特に原子番号17-80のハロゲンで
ある。もっと特定的には、ヨウ素を温和な条件下に、所
望の結果を達成するのに十分な時間に使用できる。他の
適当な手法は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒド
のようなアルデヒド類；塩化ゼフィランと塩化セチルピ
リジニウムのような抗感染剤；イソプロピルアルコール
とエタノールのようなアルコール類；ルゴールヨウ素、
ブアン固定剤、及びヘリー固定剤［フマソン(Humaso
n)、グレッチェン・エル(Gretch-en, L.)「動物組織手
法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、1967年、を参
照］のような種々の組織学的固定剤等での処理；又はホ
スト動物に細胞を投与する時に細胞中につくられる毒素
の活性を保存し、持続させるような物理的処理（加熱）
と化学薬剤処理との組合わせを包含する。物理的手段の
例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長放射線、凍
結、UV照射、凍結乾燥等である。一般に細胞は、環境条
件に対する耐性を強化するような、強化された構造安定
性をもつであろう。殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫
病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型への加工を抑制
しないように、不活性化方法を選定すべきである。例え
ばホルムアルデヒドはタンパクを架橋し、プロ型ポリペ
プチド殺虫剤の加工を抑制しうる。不活性化ないし殺虫
方法は、毒素の少なくとも実質量の生物学的利用率又は
生物活性を保持する。B.t.殺虫剤遺伝子を含有する細胞
ホストは任意慣用の栄養培地で生育できるが、ＤＮＡ構
造体は選択的利点を提供するため、細胞の全量又は実質
的全量がB.t.遺伝子を保持するように選択培地となる。
次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り入れる。その
代わりに、細胞を取り入れる前に処理することもでき
る。B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これらを無機
鉱物(フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等)又は植
物材料(粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等)と
混合することにより、水和剤、粒剤又は粉剤として使用
できる。処方剤は展粘着助剤、安定化剤、その他殺虫添
加物、又は表面活性剤を包含できる。液体処方剤は水性
基盤又は非水性基盤のもので、フォーム、ゲル、懸濁
液、乳剤等として使用できる。成分は流動剤、表面活性
剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含できる。殺虫剤濃
度は特定処方剤の性質、特に濃縮液か直接使用されるか
によって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なくとも1重量%
で存在し、100重量%でありうる。乾燥処方剤は約1-95重
量%の殺虫剤をもつが、液体処方剤は一般に約1-60重量%
の固体を液相中にもつであろう。処方剤は概してmg当た
り約10²ないし約10⁴個の細胞をもつであろう。これらの
処方剤はヘクタール当たり約50 mg(液体又は乾燥)ない
し1 kg以上の率で投与されよう。処方剤は双翅目害虫環
境、例えば植物、土壌、又は水に噴霧、散布、散水等に
よって施用できる。本発明の新規な単離体の突然変異株
は、この技術で周知の手順によってつくることができ
る。例えば、非胞子形成突然変異株は新規な単離体のエ
チルメタンスルホネート（EMS）突然変異誘発によって
得られる。また、この技術で周知の手順により、紫外線
及びニトロソグアニジンを用いて突然変異株をつくるこ
とができる。小さな割合の非胞子形成突然変異株は無傷
にとどまり、長期の発酵のあいだ溶菌しない。これらの
菌株は溶菌マイナス（-）と指定される。溶菌マイナス
菌株は振とうフラスコの培地中で非胞子形成変異株を検
査し、発酵の終りにまだ無傷で毒素結晶を含有する突然
変異株を選定することによって確認できる。溶菌マイナ
ス菌株は、保護されカプセル封入された毒素蛋白を生ず
るような細胞固定化法に適している。上記の非胞子形成
変異株のファージ耐性変種をつくるには、ファージ溶菌
液のアリコートを栄養寒天上に広げ、乾燥させる。ファ
ージ感受性菌株のアリコートを乾燥した溶菌上に直接プ
レートし、乾燥させる。プレートを30℃で培養する。プ
レートを２日間培養し、この時点で多数の集落が寒天上
に生育しているのを観察できる。これらの集落の幾つか
を取り上げ、栄養寒天プレート上で二次培養する。これ
らの明白な耐性培養基をファージ溶菌液との交差線条接
種によって耐性について試験する。ファージ溶菌液の１
本の線をプレート上に線条接種し、乾燥させる。次に、
推定上の耐性培養基をファージ線に交差するように線条
接種する。耐性菌の培養基は、30℃で一夜培養後、ファ
ージ線に交差する線条のどこでも溶菌を示さない。次
に、ファージ耐性は、栄養寒天プレート上に耐性培養基
を一面にプレートすることによって再確認される。陽性
対照として役立たせるため、感受性菌株も同様にプレー
トする。乾燥後、ファージ溶菌液の一滴をプレート中心
部に撒き、乾燥させる。耐性培養基は、30℃で24時間培
養後、ファージ溶菌液を置いた場所で溶菌を示さなかっ
た。

【実施例】以下は、本発明を実施するために、最善の方
式を含めた手順を例示している実施例である。これらの
実施例は限定的に考えられてはならない。他に注意がな
ければ、百分率はすべて重量、溶媒混合物の割合はすべ
て容量による。実施例１ B.t.PS71M3の培養本発明の新規なB.t.単離体又はその突然変異株の二次培
養基を使用して次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖
・塩培地に接種した。バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH₂PO₄ 3.4 g/l K₂HPO₄ 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl₂溶液 5.0 ml/l 塩溶液(100 ml) MgSO₄・7H₂O 2.46 g MnSO₄・H₂O 0.04 g ZnSO₄・7H₂0 0.28 g FeSO₄・7H₂O 0.40 g CaCl₂溶液(100 ml) CaCl₂・2H₂O 3.66 g pH 7.2 塩溶液とCaCl₂溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処理
し調理ずみブロスに、接種時に添加する。200 rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。上の手順は、この技術で周知の手順により、大規
模発酵装置まで容易に規模拡大できる。上の発酵で得ら
れるB.t.胞子及び/又は結晶は、この技術で周知の手順
により単離できる。しばしば用いられる手順は、取り入
れた発酵液を分離手順、例えば遠心分離にかけることで
ある。実施例２蛋白質の精製 B.チュ−リンゲンシス単離体は実施例１に記載の用に培
養した。パラ胞子封入体（毒素結晶）は臭化ナトリウム
（２６〜４０％）密度勾配平衡遠心で部分的に精製した
（プファンネスタイル，Ｍ．Ａ．、Ｅ．Ｊ．ロス、Ｖ．
Ｃ．クラマ−及びＫ．Ｗ．ニッカ−ソン［１９８４］Ｆ
ＥＭＳ Microbiol.Lett.２１：３９）。実施例３イエバエ(Musca domestica)に対するB.t.
ＰＳ２０１Ｔ６の活性２０ｇのイエバエ培地（ニュ−ジャ−ジ−州フレンチタ
ウンのバイオサ−ブインコ−ポレ−テッド）を、５０ｍ
ｌの水あたりおよそ６ｍｇのＰＳ２０１Ｔ６毒素結晶と
混合した。１０匹の第１齢幼虫を餌／毒素調製物を有す
る６オンスのプラスチックのコップに入れ、ペ−パ−タ
オルで覆った。生物検定を２７℃のインキュベ−タ−中
で行ない、囲蛹殻形成について評価した。第１齢イエバエに対するバシラスチューリンゲンシス結晶の毒性 B.t.単離体囲蛹殻形成パ−セント（Ｓ．Ｄ）ＰＳ２０１Ｔ６０％対照９７％±５実施例４イエバエ成虫に対する活性 B.t.単離体ＰＳ２０１Ｔ６をイエバエ成虫に対して試験
した。２０１Ｔ６からの勾配精製デルタエンドトキシン
を１０％蔗糖溶液中に２ｍｇ／ｍｌの割合で懸濁した。
生じる混合物をきれいなプラスチックコップ中に入れた
歯科用ガ−ゼを浸して飽和させるのに使用した。１０匹
のハエをコップに加えた。死亡率は処理２４時間後に評
価した。ＰＳ２０１Ｔ６はイエバエ（Musca domestic
a）に対し１００％の死亡率を生じた。水を使用した対
照実験では全く致死は示されなかった。実施例５アエデスアエジプチ（Aedes aegypti）に対
するB.t.単離体の活性黄熱病の蚊であるアエデスアエジプチを蚊に対する活性
の指示物として使用した。生物検定を胞子及び結晶懸濁
液又は精製された結晶の懸濁液に対して実施した。懸濁
液の種々希釈物を小コップ中の水に加えた。第３齢の幼
虫を加え、４８時間後死亡率を読んだ。本発明の全ての
新規な単離体はアエデスアエジプチに対して活性であっ
た。例えばB.t.ＰＳ１９２Ｎ１はアエデスアエジプチに
対し、蛋白質１０μｇ／懸濁液ｍｌのＬＣ₅₀を有してい
る。実施例６リ−フマイナ−（葉潜り）に対するB.t.単離
体の活性 B.t.単離体ＰＳ２０１Ｔ６、ＰＳ２０１Ｌ１、ＰＳ１９
６Ｓ１及びＰＳ９２Ｊを標準技術を用いて成育した。第
２齢の幼虫に自由にブロスを食べさせた。全ての４つの
単離体はリ−フマイナ−であるリリオマイザトリフォ
リイ（Liriomyzatrifolii）に対して毒性であった。実施例７毒素遺伝子の植物への挿入本明細書に記載された、本発明の新規なB.t.単離体から
得られる新規な殺虫毒素をコ−ドした新規な遺伝子は、
アグロバクター・ツメファシエンス(Agrobacter tumefa
ciens)からのTiプラスミドを使用して、植物細胞へ挿入
できる。次に植物細胞を植物へ再生させる[ザンブリス
キ・ピー(Zambryski, P.)、ジョース・エッチ(Joos,
H.)、ジェンテロ・シー(Gentello, C.)、リーマンス・
ジェイ(Leemans, J.)、バン・モンタギュー・エム(Van
Montague, M.)、及びシェル・ジェイ(Schell, J.)(1983
年) Cell.32巻1033-1043頁]。この点で、特に有用なベ
クターはpEND4Kである[クリー・エッチ・ジェイ(Klee,
H.J.)、ヤノフスキー・エム・エフ(Yanofsky, M.F.)及
びネスター・イー・ダブリュー(Nester, E.W.)(1985年)
Bio/Technology 3巻637-642頁]。このプラスミドは、植
物細胞でも細菌中でも複製でき、パッセンジャー遺伝子
に対して複数のクローニング位置をもっている。例えば
毒素遺伝子はpEND4KのBamHI部位へ挿入され、大腸菌中
で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換される。実施例８新規なB.チューリンゲンシス遺伝子のバクロ
ウイルスへのクローニング本発明の新規なB.t.単離体から得られる新規な遺伝子
を、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa cali
fornica)核ポリヘドロシスウイルス(AcNPV)のようなバ
クロウイルスへクローン化できる。pUC8のような市販の
クローニングベクターにクローン化されたAcNPVゲノム
を含有するプラスミドを構築できる。AcNPVゲノムを変
更し、ポリヘドリン遺伝子のコード領域が除かれて、パ
ッセンジャー遺伝子の特異なクローニング位置がポリヘ
ドリンプロモータの真後ろに置かれるようにする。この
ようなベクターの例は、ペノックら［ペノック・ジー・
ディー(Pennock, G.D.)、シューメーカー・シー(Shoema
ker, C.)及びミラー・エル・ケイ(Miller, L. K.)(1984
年)Mol. Cell.Biol. 4巻399-406頁］に記述されたpGP-B
6874、及びスミスら[スミス・ジー・イー(Smith,G.
E.)、サマーズ・エム・ディー(Summers, M.D.)及びフレ
ーザー・エム・ジェイ(Fraser, M.J.)(1983年)Mol.Cel
l.Biol. 3巻2156-2165頁]に記述されたpAC380である。
本発明の新規なタンパク毒素をコードした遺伝子は、コ
ード領域から上流及び下流の適当な領域で、BamHIリン
カーによって変更でき、AcNPVベクター類の一つのもの
のパッセンジャー位置に挿入できる。

【図面の簡単な説明】

図１は蚊に活性のB.t.菌株のアルカリ可溶性蛋白質を示
している標準のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
の写真である。図２はB.t.i.、B.t.m.及びB.t.ＰＳ１９
２Ｎ１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/32 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/32 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号０７／７４６，７５１ (32)優先日 1991年８月21日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (72)発明者ケンドリツクアキラウエダアメリカ合衆国 92109 カリフオルニア州サンデイエゴカルセドニ− ストリ −ト 1856 アパ−トメントシ− (72)発明者クリスチンジユリエスタルダ− アメリカ合衆国 92041 カリフオルニア州ラメイサモ−ゼルレイン 9849 (72)発明者トラシ− エリスマイケルスアメリカ合衆国 92027 カリフオルニア州エスコンデイドフア−ンストリ− ト 1110

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９
２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バ
シラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・
チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６、又はそれらの突然
変異株からなる群から選ばれる微生物の昆虫抑制有効量
を双翅類昆虫害虫と接触させることからなる、双翅類昆
虫害虫の防除法。
【請求項２】該双翅類昆虫害虫が、蚊、イエバエ（Mu
sca domestica）、及びハモグリバエ（Leafmining flie
s）（Liriomyza trifolii）からなる群から選ばれる請
求項１に記載の方法。
【請求項３】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９
２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バ
シラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・
チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選ば
れる安定なｌｙｓｉｓ^-ｓｐｏ^-ｃｒｙ⁺バシラス・チュ
ーリンゲンシスの昆虫抑制有効量を双翅類昆虫害虫と接
触させることからなる、感受性の双翅類昆虫害虫の防除
法。
【請求項４】該双翅類昆虫害虫が、蚊、イエバエ（Mu
sca domestica）、及びハモグリバエ（Leafmining flie
s）（Liriomyza trifolii）からなる群から選ばれる請
求項３に記載の方法。
【請求項５】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９
２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バ
シラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・
チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選ば
れる親バシラス・チューリンゲンシスから造られる安定
なｌｙｓｉｓ^-ｓｐｏ^-ｃｒｙ⁺バシラス・チューリンゲ
ンシスと、殺虫剤担体とを組合せたものを含んでいる組
成物。
【請求項６】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９
２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バ
シラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・
チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選ば
れるバシラス・チューリンゲンシスと、殺虫剤担体とを
組合せたものを含んでいる組成物。
【請求項７】標的害虫の環境に適用されたときに延長
された殺虫活性とフィ−ディング域でのより大きな耐久
性を有する実質的に無傷の処理細胞又は処理菌体からな
る殺虫剤組成物に於いて、該殺虫剤が双翅類昆虫に毒性
のポリペプチドであり、細胞又は菌体内にあって、バシ
ラス・チューリンゲンシスＰＳ１９２Ｎ１、バシラス・
チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バシラス・チューリン
ゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス・チューリンゲンシ
スＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・チューリンゲンシス
ＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選ばれる微生物によって
製造されるものである殺虫剤組成物。
【請求項８】標的害虫の環境に適用されたときに延長
された殺虫活性を有する実質的に無傷の処理細胞又は処
理菌体からなる殺虫剤組成物の昆虫抑制有効量を、双翅
類昆虫害虫と接触させることからなる、双翅類昆虫害虫
の防除法に於いて、該殺虫剤が双翅類昆虫に毒性のポリ
ペプチドであり、細胞又は菌体内にあって、バシラス・
チューリンゲンシスＰＳ１９２Ｎ１、バシラス・チュー
リンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バシラス・チューリンゲンシ
スＰＳ１９６Ｓ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ
２０１Ｌ１、及びバシラス・チューリンゲンシスＰＳ２
０１Ｔ６からなる群から選ばれる微生物によって製造さ
れるものである双翅類昆虫害虫の防除法。
【請求項９】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９
２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バ
シラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・
チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選ば
れる微生物バシラス・チューリンゲンシスから得られ、
双翅類害虫に対して活性な毒素をコ−ドする遺伝子。
【請求項１０】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１
９２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、
バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラ
ス・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選
ばれる微生物バシラス・チューリンゲンシスから得られ
る遺伝子によってコ−ドされ、双翅類害虫に対して活性
な毒素。
【請求項１１】植物、微生物、及びバクロウィルスか
らなる群から選ばれる形質転換された宿主であって、バ
シラス・チューリンゲンシスＰＳ１９２Ｎ１、バシラス
・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、バシラス・チューリ
ンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラス・チューリンゲン
シスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス・チューリンゲンシ
スＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選ばれるバシラス・チ
ューリンゲンシスから得られる遺伝子によって形質転換
された宿主。
【請求項１２】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１
９２Ｎ１、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ９２Ｊ、
バシラス・チューリンゲンシスＰＳ１９６Ｓ１、バシラ
ス・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｌ１、及びバシラス
・チューリンゲンシスＰＳ２０１Ｔ６からなる群から選
ばれる生物学的に純粋な培養基。