JP3531872B2 - 鱗翅類害虫に対して活性のある新規なバランス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に活性のある新規な毒素をコートした遺伝子 - Google Patents

鱗翅類害虫に対して活性のある新規なバランス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に活性のある新規な毒素をコートした遺伝子

Info

Publication number
JP3531872B2
JP3531872B2 JP16585090A JP16585090A JP3531872B2 JP 3531872 B2 JP3531872 B2 JP 3531872B2 JP 16585090 A JP16585090 A JP 16585090A JP 16585090 A JP16585090 A JP 16585090A JP 3531872 B2 JP3531872 B2 JP 3531872B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
toxin
cells
amino acid
group
tables
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP16585090A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03224487A (ja
Inventor
ペイン ジユエル
ジエイ．シック オーガスト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mycogen Corp
Original Assignee
Mycogen Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/371,955 external-priority patent/US5126133A/en
Application filed by Mycogen Corp filed Critical Mycogen Corp
Publication of JPH03224487A publication Critical patent/JPH03224487A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3531872B2 publication Critical patent/JP3531872B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は鱗翅類害虫に対して活性のある新規なバシラ
ス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に活性のある
新規な毒素をコードした遺伝子に関する。
〔従来の技術〕
最も広く使用される微生物殺虫剤は細菌バシラス・ス
リンギエンシス（Bacillus thringiensis）に由来して
いる。この細菌薬剤は、葉を食べる広範囲のいも虫と甲
虫類、並びに蚊の防除に使用される。バシラス・スリン
ギエンシスは、感受性のある昆虫ホストに摂取されると
有毒な蛋白質性パラ胞子や結晶をつくる。例えば、バシ
ラス・スリンギエンシス・バラエティ・カースタキ（B.
th−ringienssis var.kurstaki）HD−１は、デルタ毒素
と呼ばれる生物毒素からなる結晶封入体をつくるが、こ
れは幾つかの鱗翅類昆虫の幼虫に有毒である。大腸菌
（E.coli）におけるこのB.t.結晶蛋白質遺伝子のクロー
ニング及び発現は、公表文献［シュネフ・エッチ・イー
（Schnepf,H.E.）及びホワイトリー・エッチ・アール
（Whitely,H.R.）（1981年）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
78巻2893−2897頁］中に記述されている。合衆国特許第
4,448,885号と第4,467,036号は、大腸菌でのB.t.結晶蛋
白質の表現を明らかにしている。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、試験されたすべての鱗翅類害虫に対して活
性のあるB.t.PS81 Iと指定される新規なバシラス・スリ
ンギエンシス分離体に関する。
また、鱗翅類昆虫に有毒な新規な毒素遺伝子が明らか
にされ、特許請求されている。これらの毒素遺伝子はプ
ラスミドベクターを経由して、適当なホストへ移すこと
ができる。
特定的には、本発明はB.t.PS81 Iと指定される新規な
B.t.分離体、その突然変異体、及び鱗翅類害虫に対して
活性のある蛋白質をコードした、このB.t.分離体に由来
する新規なデルタ内毒素（δ−endotoxin）遺伝子を含
めてなる。
〔課題を解決する手段〕
本発明の新規な毒素遺伝子は、鱗翅類に対して活性の
あるPS81 Iと指定される新規なB.スリンギエンシス（B.
t.）分離体から得られた。
［B.t.PS81 Iの特性］ 集落形態−−B.t.に典型的な大集落で、表面はくすんで
いる。
増殖期の細胞形態−−B.t.に典型的。
鞭毛の血清型−−7,アイザワイ。
細胞内封入体−−胞子形成細胞は両錘型結晶をつくる。
プラスミド製剤−−プラスミド製剤のアガロースゲル電
気泳動は、B.t.PS81 IをB.t.HD−１と区別している。第
１図を参照。
アルカリ可溶性蛋白質−−SDS−PAGE分析は約130,000ダ
ルトンに蛋白質帯を示す。
特異な毒素−−B.t.PS81 Iで四つの特異な毒素が確認さ
れた。
活性−−B.t.PS81 Iは試験されたすべての鱗翅類を殺虫
する。
生物検定結果： B.t.PS81 I胞子及び結晶を以下の昆虫に対して試験し
た。
ビートアワヨトウ（Beet Armyworm,Spodoptera exigu
a）；コナガ（Diamondback Moth,Plutella xylostell
a）；西部ハマキガ幼虫（Western Spruce Budworm,Chor
istoneura occidentalis）。
LC50値は以下の通りであった。
ビートアワヨトウ 2.53ppm コナガ 0.16ppm 西部ハマキガ幼虫 3.2ppm 検定手順： 胞子及び結晶ペレットの希釈物をつくり、合衆国農務
省の昆虫餌（技術ブレティン1528、合衆国農務省）と混
合し、小さなプラスチックトレーに注ぐ。幼虫を餌混合
物上に置き、25℃に保持する（後期第２齢コナガ幼虫、
初期第２齢ビートアワヨトウ幼虫、第４齢西部ハマキガ
幼虫）。死亡率を６日後に記録する。
B.スリンギエンシスPS81 I（NRRL B−18484）とその
突然変異体は、標準的な既知培地と発酵手法を用いて培
養できる。発酵サイクルの終了時にまずB.t.胞子と結晶
をこの技術で周知の手段によって発酵ブロスから分離す
ることによって、細菌を取り入れることができる。回収
されたB.t.胞子及び結晶は、取り扱いと特定目標害虫へ
の施用を容易にするための表面活性剤、分散剤、不活性
担体、及び他の成分の添加により、水和剤、濃厚液剤、
粒剤又は他の処方剤に処方剤できる。処方と施用手順は
この技術に周知であり、鱗翅類、例えばいも虫類に対し
て活性のあるB.スリンギエンシス（HD−１）の市販菌株
と一緒に使用される。B.t.PS81 Iとその突然変異体は鱗
翅類害虫の防除に使用できる。
本発明の毒素遺伝子を取り込んだB.t.PS81 Iと大腸菌
ホストの二次培養基は、合衆国イリノイ州ピオリア、合
衆国農務省北部地域研究所の永久保存施設に寄託され
た。呼出し番号と寄託期日は次のとおりである。
本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下で米国特
許商標庁長官に権限ありと認められた者が、本願に対応
する米国特許出願の係属中に、培養基を入手できること
を保証されるという条件の下に寄託された。また、その
出願又はその子孫の対応特許出願が提出されている米国
以外の国々の国内特許法で要求されるとおりに、寄託物
は入手できる。しかし、寄託物が利用できるからといっ
て、行政行為によって付与された特許権を損わしめて本
発明の実施する権利を構成するものではないことを理解
すべきである。
更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約
の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされ
る。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日か
ら少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発行され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関するすべ
ての制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久
に取り除かれる。
本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入
できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の
細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト、例えばシ
ュードモナスの場合、微生物は鱗翅類昆虫発生位置に施
用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結
果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わりに、毒
素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の
活性を持続させるような条件下に処理できる。次に処理
細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.
毒素の毒性を保持している。
B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを経て微生物ホスト
へ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ施
用される場合に、あるホスト微生物を使用することが必
須である。微生物ホストは、一つ以上の重要作物の「植
物領域」（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根表面）
を占有することが知られたものを選択する。これらの微
生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野性
型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリペプチ
ド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を提供
し、望ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と不活性化か
らの改良された保護を提供する。
広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領
域（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及び菌類を
包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばバシ
ラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、
エルウィニア（Erwinia）、セラティア（Serratia）、
クレブシェラ（Klebsiella）、キサントモナス（Xantho
monas）、ストレプトミセス（Streptomyces）、リゾビ
ウム（Rhizobium）、ロードシュードモナス（Rhodopseu
domonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、ア
グロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター
（Acetobacter）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、アース
ロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotob
acter）、リューコノストック（Leuconostoc）及びアル
カリゲネス（Alcaligenes）属の細菌；菌類特に酵母、
例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコ
ッカス（Cryptococcus）、クロイベロミセス（Kluyvero
myces）、スポロボロミセス（Sporobolomyces）、ロー
ドトルラ（Rhodotorula）、及びオーレオバシジウム（A
ureobasidium）属のカビなどの微生物である。特に重要
なものは、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas
syringae）、シュードモナス・フルオレッセンス、セラ
ティア・マルセスケンス（Serratia marcescens）、ア
セトバクター・キシリヌム（Acetobacter xylinum）、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）、ロードシュードモナス・スフェロイ
デス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナ
ス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾ
ビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリゲ
ネス・エントロフス（Alcaligenes entrophus）及びア
ゾトバクター・ヴィンランディ（Azotobacter vinlandi
i）のような植物領域の細菌種；及びロードトルラ・ル
ブラ（Rhodotorula rubra）、R.グルチニス（R.glutini
s）、R.マリーナ（R.marina）、R.オーランティアカ
（R.aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cr
yptococcus albidus）、C.ジフルエンス（C.diffluen
s）、C.ローレンティ（C.laurentii）、サッカロミセス
・ロゼイ（S.rosei）、S.プレトリエンシス（S.pretori
ensis）、S.セレビシエ（S.cerevisiae），スポロボロ
ミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、S.オド
ルス（S.odorus）、クロイベロミセス・ヴェローナエ
（Kluyveromyces veronae）及びオーレオバシジウム・
ボルランス（Aureobasidium pollulans）のような植物
領域の酵母種である。特に重要なのは有色素微生物であ
る。
遺伝子の安定な保持と発現を可能とするような条件下
に、毒素を発現させるB.t.遺伝子を微生物ホストに導入
するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺伝子発
現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の毒素遺伝
子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列と相
同のDNA配列、及び／又は組込みや安定な保持が起こる
ための、ホスト内で機能的な複製系などを含んだDNA構
造体を用意することができる。
転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含
しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、
毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするの
が望ましいこともある。これはオペレータで、又はアク
チベータやエンハンサに結合する領域によって達成で
き、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によ
って誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用す
ると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境
へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒
素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環
境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在しよう。
特に活性プロモータを使用し、並びにメッセンジャー
RNAの安定性を強化する配列を使用して、メッセンジャ
ーの発現を強化するために種々の操作を使用できる。開
始及び転写終結領域は停止コドン、終結領域、及び任意
付加的にポリアデニル化信号を包含しよう。内膜を横断
して蛋白質分泌を促進するために、翻訳されたポリペプ
チド配列のアミノ末端に疎水性「リーダー」配列を使用
できる。
転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の
5'から3'への方向で、構造体は転写調節領域（これがあ
る場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの5'又は
3'のいずれかにある）、リボゾーム結合位置、開始コド
ン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもった構造遺
伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列（使用する
場合）、及び終結領域を包含しよう。二本鎖としてのこ
の配列はそれ自体微生物ホストの形質転換に使用できる
が、普通はマーカーを含めたDNA配列を伴うようにし、
この第二のDNA配列は、ホストへのDNA導入中に毒素発現
構造体に結合させることができる。
マーカーとは、変更又は形質転換されたホストの選定
を行なうための構造遺伝子のことである。マーカーは通
常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重
金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要求ホストに
原栄養性を与える相補性を提供する。変更されたホスト
が選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、
相補性を使用するのが好ましい。構造体の開発に、また
ホストの変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野
外で他の野性型微生物に対する競合的利点を提供するこ
とによって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレ
ート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素
発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。この
方法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産ホス
トに競合的利点を提供するため、ホストは野性型微生物
と効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を占め
るようになる。
機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内
の配列と相同な、少なくとも50塩基対（bp）、好ましく
は約100bp、及び通常約1,000bpまでの配列を包含しよ
う。こうして合法的組換えの確率が強化されるため、遺
伝子はホストへ組込まれ、ホストによって安定に保持さ
れる。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合
的利点を提供する遺伝子に近接しているのが望ましい。
従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。
細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻
類、カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域はtrp遺
伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモー
タ、Tacプロモータ、及びホスト中で機能的な場合は毒
素遺伝子と関連した天然のプロモータを包含する。例と
して合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832号、及び第
4,356,270号を参照のこと。終結領域は、普通は転写開
始領域と関連する終結領域か、又は異なる転写開始領域
（二つの領域がホスト内で適合的で機能的である限りに
おいて）でありうる。
安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、
ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使用さ
れよう。複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常
存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安定なウイル
スの複製系から誘導される。pBR322、pACYC184、RSF101
0、pRO1614等のような多数のプラスミドが入手できる。
例として、オルソン（Olson）ら、（1982年）J.Bacteri
ol.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasarian）
ら、（1981年）Gene 16巻237頁、並びに合衆国特許第4,
356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を参照
のこと。
B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、転
写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を包含
でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開発中にク
ローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストで
の機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上
のマーカーが存在できる。組込みを望む場合は、プラス
ミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。
形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在す
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
殺虫剤含有細胞を処理して処理細胞を目標害虫環境に
施用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるのに適し
たホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通
常、哺乳類のような高等生物に有毒な物質を生じない細
胞に限定される。しかし、毒素が不安定か、哺乳類ホス
トへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準
である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も
使用できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核
生物と、菌類のような低級真核生物である。グラム陰性
・陽性双方の原核生物の例は、エシェリキア（Escheric
hia）、エルウィニア（Erwinia）、シゲラ（Shigell
a）、サルモネラ（Salmonella）及びプロテウス（Prote
us）のような腸内細菌科（Enterobacteriaceae）；バシ
ラス科（Bacillaceae）；リゾビウム（Rhizobium）のよ
うなリゾビウム科（Rhizobiaceae）；発光細菌、ジモモ
ナス（Zymomonas），セラティア（Serratia）、アエロ
モナス（Aeromonas）、ビブリオ（Vibrio）、デスルホ
ビブリオ（Desulfovibrio）、スピリルム（Spirillum）
のようならせん菌科；乳酸かん菌科；シュードモナス
（Pseudomonas）及びアセトバクター（Acetobacter）の
ようなシュードモナス科；アゾトバクター科、放線菌科
及びニトロバクター科を包含する。真核生物には藻菌類
（Phycomycetes）と子のう菌類（Ascomycetes）等の菌
類があり、これはサッカロミセス（Saccharomyces）と
シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）のような
酵母、ロードトルラ（Rhodotorula）、オーレオバシジ
ウム（Aureobasidium）、スポロボロミセス（Sporobolo
myces）のような担子菌類（Basidiomycetes）酵母を包
含する。
生産目的のためにホスト細胞を選定する上で特に重要
な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容易さ、発現
系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セルとして使用するのに重要な特性は厚い細胞壁、色素
形成、及び細胞内パッケージング又は封入体の形成のよ
うな殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害
虫に摂取させるための誘引力；毒素に損害を与えない殺
菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処方
と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。
特に重要なホスト生物は、ロードトルラ種、オーレオ
バシジウム種、サッカロミセス種、及びスポロボロミセ
ス種のような酵母；シュードモナス種、エルウィニア
種、及びフラボバクテリウム種のような葉面に生息する
生物；又はエシェリキア種、乳酸杆菌種、バシラス種等
の他の生物を包含する。特定的な生物は、シュードモナ
ス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュー
ドモナス・フルオレッセンス（P.fluorescens）、サッ
カロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）、バシラス・スリンギエンシス、大腸菌、枯草菌
（B.subtilis）、ストレプトミセス・リビダンス（Stre
ptomyces lividans）等を包含する。
細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実
質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。
微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物
の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒
素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は
物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合
わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子
番号17−80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ
素を温和な条件下に、所望の結果を達成するのに十分な
時間に使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒ
ドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼ
フィランと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤；
イソプロピルアルコールとエタノールのようなアルコー
ル類；ルゴールヨウ素、ブアン固定剤とヘリー固定剤
［フマソン（Humason）、グレッチェン・エル（Gretche
n,L.）「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマ
ン社、1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤
等での処理；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞
中につくられる毒素の活性を保存し、持続させるような
物理的処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含
する。物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような
短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。
一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するよう
な、強化された構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプ
ロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型か
ら成熟型への加工を抑制しないように、不活性化方法を
選定すべきである。例えばホルムアルデヒドは蛋白質を
架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制でき
る。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少なくとも実質
部分の生物学的利用率又は生物活性を保持する。
B.t.殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは任意慣用の
栄養培地で生育できるが、DNA構造体は選択的利点を提
供するため、細胞の全量又は実質的全量がB.t.遺伝子を
保持するように選択培地となる。次にこれらの細胞を慣
用方法に従って取り入れる。その代わりに、細胞を取り
入れる前に処理することもできる。
B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これらを無機鉱
物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植
物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等）
のような種々の不活性材料と混合することにより、水和
剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助
剤、安定剤、その他殺虫助剤、又は表面活性剤を包含で
きる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、
フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成
分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を
包含できる。
殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使
用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なく
とも１重量％で存在し、100重量％でありうる。乾燥処
方剤は約１−95重量％の殺虫剤をもつが、液体処方剤は
一般に約１−60重量％の固形分を液相中にもつであろ
う。処方剤は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞
をもつであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約
50mg（液体又は乾燥）ないし1kg以上の率で投与されよ
う。
処方剤は鱗翅類害虫環境、例えば植物、土壌、又は水
に噴霧、散布、散水等によって施用できる。
PS81 Iの突然変異体は、この技術で周知の手順によっ
てつくることができる。例えば、無胞子性突然変異体
は、PS81 Iのエチルメタンスルホネート（EMS）変異誘
発によって得られる。突然変異体は、この技術で周知の
手順により、紫外光やニトロソグアニジンを使用してつ
くることができる。
少パーセントの無胞子性突然変異体は長い発酵期間中
に無傷で残り、溶菌しない。これらの菌株は溶菌マイナ
ス（−）と指定される。溶菌マイナス菌株は、振とうフ
ラスコ培地中で無胞子性突然変異体を選定し、発酵終期
にまだ無傷であって、毒素結晶を含有する突然変異体を
選択することで確認できる。溶菌マイナス菌株は、保護
されたカプセル化毒素蛋白質を生ずるような細胞固定法
に適している。
上記の無胞子性突然変異体のファージ耐性種をつくる
には、ファージ溶菌液のアリコートを栄養寒天上に広
げ、乾燥させる。次に、ファージ感受性細菌菌株を乾燥
溶菌物の上に直接にプレートし、乾燥させる。プレート
を30℃で培養する。プレートを２日間培養し、この時点
で多くの集落が寒天上に生育しているのが見てとれる。
これらの集落の幾つかを拾い出し、栄養寒天プレート上
に二次培養する。これらの見かけの耐性培養基をファー
ジ溶菌液での交差線条接種によって耐性について試験す
る。ファージ溶菌液をプレート上に１本の線条接種を
し、乾燥する。次に推定的な耐性培養基をファージ線を
横断するように線条接種する。耐性菌の培養基は、30℃
で一夜培養後も、ファージ線と交差する線条のどこにも
溶菌を示さない。次にファージ耐性は、耐性培養基を栄
養寒天プレートの全面に耐性培養基をプレートすること
によって確認される。感受性菌株も陽性対照として役立
たせるために同じ方法でプレートする。乾燥後、ファー
ジ溶菌液の１滴をプレートの中心に蒔いて乾燥させる。
30℃で24時間培養後、ファージ溶菌液を置いた区域で溶
菌を示さない。
〔実施例〕
以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示し
た実施例である。これらの例は限定的に考えられてはな
らない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶
媒混合物割合はすべて容量による。
実施例１ B.t.PS81 Iの培養 B.t.PS81 I又はその突然変異体の二次培養基を使用し
て次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩培地に接
種した。
バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH2PO4 3.4 g/l K2HPO4 4.35g/l 塩溶液 5.0ml/l CaCl2溶液 5.0ml/l 塩溶液（100ml） MgSO4・7H2O 2.46g MnSO4・H2O 0.04g ZnSO4・7H2O 0.28g FeSO4・7H2O 0.40g CaCl2溶液（100ml） CaCl2・2H2O 3.66g pH7.2 塩溶液とCaCl2溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処
理し調理したブロスに、接種時に添加する。200rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。
上の手順は、この技術で周知の手順により、大発酵装
置まで容易に規模拡大できる。
上の発酵で得られるB.t.胞子及び／又は結晶は、この
技術で周知の手順により単離できる。しばしば用いられ
る手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例えば遠心分
離にかけることである。
実施例２ 分離体PS81 Iからの新規な毒素遺伝子のクロ
ーニングと大腸菌への形質転換 低光学密度（OD600＝1.0）に生育させたB.t.細胞から
全細胞DNAを調製した。細胞を遠心分離によって回収
し、20％庶糖と50mg/mlリゾチームを含有するTES緩衝液
（30mMトリス−Cl、10mMエチレンジアミン四酢酸［EDT
A］、50mM NaCl、pH＝8.0）中で細胞をプロトプラスト
化させた。プロトプラストを４％の最終濃度までドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）添加によって溶菌化した。細
胞材料を最終濃度100mMの中性塩化カリウム中、４℃で
一夜沈殿させた。上澄み液をフェノール／クロロホルム
（1:1）で２回抽出した。DNAをエタノール中で沈殿さ
せ、塩化セシウム勾配上の等密度バンディングによって
精製した。
PS81 IとB.t.k.HD−１からの全細胞DNAをEcoR Iで消
化させ、0.8％アガロースゲル−TAE（50mMトリス−Cl、
20mM NaOAc、2.5mM EDTA、pH＝8.0）緩衝化ゲル上の電
気泳動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、NR
RL B−18332のプラスミドpM3,130−７中に含まれる毒素
遺伝子のNsi IからNsi Iまでの3.2Kb断片、及び“4.5kb
クラス”の毒素遺伝子［クロンスタッド（Kronstad）及
びホワイトリー（Whitely）（1986年）Gene USA 43巻29
−40頁］のNsi IからKpn Iまでの2.4Kb断片に対して［
32P］放射性標識付きプローブとハイブリッド化した。
これらの二つの断片を一緒にし、プローブとして用い
た。結果は、PS81 Iのハイブリッド化断片がHD−１のそ
れと異なることを示している。特定的には、PS81 Iでは
1.5Kb〜2.5Kbの範囲で、2.3Kb、1.95Kb、及び1.6Kbのハ
イブリッド化バンドが、HD−１中の単一の1.9Kbハイブ
リッド化バンドの代わりに検出された。
以下の説明は、上記の三つのEcoR I断片のうち二つを
クローン化するために取られた段階をまとめたものであ
る。PS81 Iの全細胞DNA200μｇをEcoR Iで消化させ、分
離用0.8％アガロース−TAEゲル上の電気泳動によって分
離した。ゲルの1.5kbから2.3kbの領域を切り出し、そこ
からのDNAを電気溶離し、ELUTIPTM−ｄ（シュライヒャ
ー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー州キー
ン）イオン交換カラムをメーカーの仕様に従って用いて
濃縮した。単離されたEcoR I断片を、LAMBDA ZAPTM Eco
R Iアーム（ストラタジーン・クローニング・システム
ズ社、カリフォルニア州ラホラ）に再結合し、Gigapack
GOLDTM（ストラタジーン）抽出液を用いてパッケージ
した。パッケージにした組換えファージを大腸菌菌株BB
4（ストラトジーン）と一緒にプレートに撒くと、高プ
ラーク密度が得られた。プラークを放射性標識付きプロ
ーブによる標準的核酸ハイブリッド化手順によって選定
した。ハイブリッド化されたプラークを精製し、低プラ
ーク密度で再選定した。生ずる精製ファージをR408 M13
ヘルパーファージ（ストラトジーン）と一緒に生育さ
せ、組換えBluescriptTM（ストラタジーン）プラスミド
を自動的に切り出し、パッケージ化した。自動化切り出
し法の一部として、「ファージミッド」をXL1−Blue大
腸菌細胞（ストラトジーン）に再感染させた。感染XL1
−Blue細胞をアンピシリン耐性について選定し、所望の
プラスミドを見つけるため、生ずるコロニーを標準的な
急速プラスミド精製手順によって分析した。pM2,31−４
及びpM2,31−１で指定されるプラスミドは、それぞれ約
1.95Kb及び1.6KbのEcoR I挿入物を含有している。両挿
入体のDNA配列は、ストラタジーン社のT7及びT3オリゴ
ヌクレオチドプライマー、及び一組の既存内部B.t.内毒
素オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定し
た。pM2,31−４中の挿入体約500bpを配列決定した。同
様に、pM2,31−１中の挿入体約1.0Kbを配列決定した。
両配列を他のクローン化され配列決定されたB.t.内毒素
遺伝子と比較したデータ分析は、二つの明確な特異な部
分的毒素遺伝子配列が発見されたことを示した。他の特
性化されたB.t.内毒素遺伝子に対して最も相同性の小さ
い両配列中の領域に、合成オリゴヌクレオチドを構築し
た。pM2,31−４中の挿入体の配列に対して構築された42
−merオリゴヌクレオチドは、GGATACCGGTGACCCATTAACAT
TCCAATCTTTTAGTTACGCであり、これを81 I Aと呼ばれる
毒素遺伝子配列の単離に使用した。pM2,31−１中の挿入
体の配列に対して構築された40−merオリゴヌクレオチ
ドは、GAAGTTTATGGCCTCTTTCTGTAGAAAATCAAATTGGACCであ
り、これを81 I Bと呼ばれる毒素遺伝子配列の単離に使
用した。
両方の完全毒素遺伝子をクローン化するために、Sau3
A部分ライブラリーを構築した。PS81 I全細胞DNAを部分
的にSau3Aで消化させ、電気泳動によって0.6％アガロー
スTAEゲル上で９−23kb断片の混合物へ分画し、既述の
とおりに精製し、LambdaGEM−11TM（プロメガ）へ再結
合した。パッケージ化したファージをP2392大腸菌細胞
（ストラタジーン）と一緒に高い力価でプレートに蒔
き、核酸ハイブリッド化プローブとして前掲放射性標識
付き合成オリゴヌクレオチドを用いて選定した。各プロ
ーブを用いて、ハイブリッド化プラークを低めのプラー
ク密度で再選定した。各プローブとハイブリッド化させ
る精製プラークを用いてDNA単離用のファージ調製のた
め、液体培養基中でP2392大腸菌細胞に感染させた。DNA
を標準手順によって単離した。分離量のDNAをSal Iで消
化させ（挿入DNAをラムダアームから放出させるた
め）、0.6％アガロース−TAEゲル上の電気泳動によって
分離した。上記のように電気溶離し濃縮した大断片を、
Sal Iで消化させ脱ホスホリル化処理したpUC19（NEB）
に再結合させた。再結合体を大腸菌DH5（α）コンピテ
ント細胞（BRL）に形質転換し、アンピシリン、イソプ
ロピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）及び５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ−
ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上にプレートし
た。所望のプラスミド類を単離するために、pUC19の
（β）−ガラクトシダーゼ遺伝子中に所望挿入体をもつ
白色集落を標準的なプラスミド精製手順にかけた。プラ
スミドpM3,122−１は、81 I Aオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて単離された15Kb Sau3A断片を含有する。プ
ラスミドpM4,59−１は、81 I Bオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて単離された18Kb Sau3A断片を含有する。
プラスミドpM3,122−１を幾つかの制限酵素で消化さ
せ、サザンブロット分析にかけた。ブロットを［32P］
放射性標識付き81 I Aの特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブ、並びに既知のB.t.k.毒素遺伝子に対してつくられ
た標識付きオリゴヌクレオチド配列決定用プライマーで
プローブした。生ずるオートラジオグラムは、このクロ
ーン化Sau3A断片上に二つの毒素遺伝子が縦に並んで存
在することを示した。プラスミドpM3,122−１は、既知
のB.t.k.遺伝子に対してつくられたオリゴヌクレオチド
プローブとハイブリッド化された4.0Kb Ndel I断片をも
っていた。しかし、この断片は81 I A又は81 I Bに対す
る特異的オリゴヌクレオチド類とはハイブリッド化しな
かった。新しい毒素遺伝子が発見され、引き続き81 I A
2と命名された。4.0Kb Nde I断片を単離し、pUC19中で
クローン化すると、プラスミドpMYC392を生じた。81 I
A毒素遺伝子は、pM3,122−１をHind IIIで消化させるこ
とによって単離すると、81 I A2毒素遺伝子のほとんど
が削除された。この断片を再環化するとpMYC1603を生じ
た。81 I A毒素遺伝子はその制限地図に基づいて特異な
ものがあり、現在配列決定中である。
プラスミドpM4,59−１を幾つかの制限酵素で消化さ
せ、サザンブロット分析にかけた。ブロットを［32P］
放射性標識付き81 I Bの特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブ、並びに既知のB.t.k.毒素遺伝子に対してつくられ
た標識付きオリゴヌクレオチド配列決定用プライマーで
プローブした。プラスミドpM4,59−１を地図化し、部分
的な81 I B毒素遺伝子のみを含有することがわかった。
第二毒素遺伝子の完全開放読取り枠（ORF）は18Kb断片
上に発見され、81 I B2と命名された。81 I B2毒素遺伝
子は、pM4,59−１をNde I及びSma Iで消化させ、Nde I
のオーバーハングを補充し、線状断片を一緒に再結合さ
せることによって、81 I B毒素遺伝子とは別個にクロー
ン化された。生ずるプラスミドはpMYC394と命名され
た。81 I B毒素遺伝子の完全開放読取り枠を別のSau3A
断片から単離し、pBluescript（ストラタジーン）中の
7.3Kb Hind III断片ヘラムダライブラリーからクローン
化した。生ずるプラスミドはpMYC393である。
毒素遺伝子は、“4.5kbクラス”の毒素遺伝子に対し
てつくられたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた標
準的なサンガージデオキシ連鎖終結法によって、また新
しい毒素遺伝子の配列に対してつくられたプライマーと
の“ウォーキング”によって配列決定された。４毒素遺
伝子の配列分析は、特異な開放読取り枠を明らかにし、
独特の内毒素蛋白質を推論づけた（第１−12表）。次の
表は塩基対の各開放読取り枠（ORF）の大きさと、ダル
トンで表わされた推定内毒素分子量をまとめたものであ
る。
内毒素蛋白質は、毒素遺伝子からシュードモナス及び
／又はバシラスにおいて発現された。"6.6Kb"クラスの
毒素に対して向けられたポリクローナル抗体を使用する
SDS−PAGE/ウエスタンブロット分析は、各遺伝子が約13
0,000ダルトンの免疫反応性蛋白質をコードしているこ
とを確証した。バシラス又はシュードモナスで発現され
る本発明の遺伝子でコードされた毒素蛋白質は、試験さ
れた全鱗翅類昆虫、すなわちキャベツシャクトリムシ
（Trichoplusia ni）、ビートアワヨトウ（Spodoptera
exigua）、コナガ（Plutella xylo−stella）及び西部
ハマキガ幼虫（Choristoneura oc−cidentalis）に対し
て活性をもっている。
上のクローニング手順は、他に注意がなければ標準手
順を使用して行なわれた。
プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用され
る種々の方法はこの技術で周知である。また、クローニ
ング・ビヒクルとしてのラムダバクテリオファージの使
用法、すなわちラムダDNAの調製、生体外パッケージン
グ、及び組換えDNAのトランスフェクションは、この技
術で周知である。これらの手順はすべて、マニアチス・
ティー（Maniatis,T.）、フリッシュ・イー・エフ（Fri
tsch,E.F.）及びサムブロック・ジェイ（Sambrook,J.）
（1982年）、「分子クローニング：実験マニュアル」
（コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨー
ク州）に記述されている。このように、微生物細胞から
DNAを抽出し、制限酵素での消化を行ない、DNA断片を電
気泳動にかけ、プラスミドのテーリングとアニーリング
を行ない、DNAを挿入、再結合し、細胞を形質転換し、
プラスミドDNAを調製し、蛋白質を電気泳動にかけ、DNA
の配列を決定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範囲
にある。
本明細書で明らかにされている制限酵素は、ベセスダ
研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）、ニューイ
ングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリ
ー）、及びベーリンガー・マンハイム（インディアナ州
インディアナポリス）から購入できる。酵素は、供給側
から提供される指示に従って使用される。
B.t.毒素遺伝子を含有するプラスミド類は、形質転換
されたホスト微生物から周知の標準手順を用いて除去で
きる。例えばホスト微生物を透明溶菌液の等密度勾配手
順等にかけて、所望のプラスミドを回収することができ
る。
実施例３ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコ
ードした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシ
エンス（Agrobacter tumefaciens）からのTiプラスミド
を使用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植
物へ再生させる［ザンブリスキ・ピー（Zambryski,
P.）、ジョース・エッチ（Joos,H.）、ジェンテロ・シ
ー（Gentello,C.）、リーマンス、ジェイ（Leemans,
J.）、バン・モンタギュー・エム（Van Montague,
M.）、及びシェル・ジェイ（Schell,J.）（1983年）Cel
l 32巻1033−1043頁］。この点で、特に有用なベクター
はpEND4Kである［クリー・エッチ・ジェイ（Klee,H.
J.）、ヤノフスキー・エム・エフ（Yanofsky,M.F.）及
びネスター・イー・ダブリュー（Nester,E.W.）（1985
年）Bio/Technology 3巻637−642頁］。このプラスミド
は、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセンジャー遺伝
子に対して複数のクローニング位置をもっている。例え
ば毒素遺伝子はpEND4KのBamH I位置へ挿入され、大腸菌
中で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換される。
実施例４ 新規なB.スリンギエンシス遺伝子のバクロウ
イルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォ
ルニカ（Autographa californica）核ポリヘドロシスウ
イルス（AcNPV）のようなバクロウイルスへクローン化
できる。pUC8のような市販のクローニングベクターにク
ローン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを構
築できる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝子
のコード領域が除かれて、パッセンジャー遺伝子の特異
なクローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後ろ
に置かれるようにする。このようなベクターの例はペノ
ックら［ペノック・ジー・ディー（Pennock,G.D.）、シ
ューメーカー・シー（Shoemaker,C.）及びミラー・エル
・ケイ（Miller,L.K.）（1984年）Mol.Cell Biol.4巻39
9−406頁］に記述されたpGP−B6874、及びスミスら［ス
ミス・ジー・イー（Smith,G.E.）、サマーズ・エム・デ
ィー（Summers,M.D.）及びフレーザー・エム・ジェイ
（1983年）Mol.Cell Biol.3巻2156−2165頁］に記述さ
れたpAC380である。本発明の新規な蛋白質毒素をコード
した遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適当な領
域で、BamH Iリンカーによって変更でき、AcNPVベクタ
ー類の一つのもののパッセンジャー位置に挿入できる。
すでに明らかにされたように、B.t.毒素遺伝子をコー
ドしたヌクレオチド配列を第１、４、７、及び10表に示
す。推定されたアミノ酸配列を第２、５、８、及び11表
に示す。
この技術で周知のように、蛋白質のアミノ酸配列は、
DNAのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝暗号
の重剰性のため、すなわち蛋白質をつくるのに使用され
るアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化ヌクレ
オチドトリプレット（コドン）を使用できるため、一つ
の特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列がコー
ドできる。このため、遺伝暗号を次のように描くことが
できる。
フェニルアラニン（Phe） TTK ロイシン（Leu） XTY イソロイシン（Ile） ATM メチオニン（Met） ATG バリン（Val） GTL セリン（Ser） QRS プロリン（Pro） CCL スレオニン（Thr） ACL アラニン（Ala） GCL チロシン（Tyr） TAK ヒスチジン（His） CAK グルタミン（Gln） CAJ アスパラギン（Asn） AAK リジン（Lys） AAJ アスパラギン酸（Asp） GAK グルタミン酸（Glu） GAJ システイン（Cys） TGK トリプトファン（Trp） TGG アルギニン（Arg） WGZ グリシン（Gly） GGL 終結信号 TAJ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組
は、左側に5'末端、右側に3'末端をもつ伝令RNAのトリ
ヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のDNAはすべ
て、ウラシルにはチミンを置き換えた、mRNAの配列に対
応する配列のDNA鎖のものである。文字はデオキシヌク
レオチド配列を形成するブリン又はピリミジン塩基を示
す。
Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はC. ＹがＣまたはＴの場合は、Ｘ＝C. ＸがＣの場合は、Ｙ＝A,G,C又はT. ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はG. ＺがＡ又はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はA. ＺがＣ又はＴの場合は、Ｗ＝C. ＷがＣの場合は、Ｚ＝A,G,C又はT. ＷがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はG. ＳがA,G,C又はＴの場合は、QR＝TC.又はその代わりにＳ
がＴ又はＣの場合は、QR＝AG. Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はG. Ｍ＝A,C又はT. 上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列が、この蛋白
質の同じアミノ酸配列をコードした均等なヌクレオチド
配列によって調製できることを示す。従って、本発明は
このような均等なヌクレオチド配列を包含する。更に、
アミノ酸配列の変更が蛋白質の二次構造を変更しないな
らば、確認された構造及び機能の蛋白質が、このような
変更によって構築できることが示された［カイザー・イ
ー・ティー（Kaiser,E.T.）及びケズディ・エフ・ジェ
イ（Kezdy,F.J.）（1984年）Science 223巻249−255
頁］。このように、本発明は蛋白質の二次構造を変更し
ないような本明細書に記載のアミノ酸配列の変異体、又
はその構造が変更されているとしても、生物活性がある
程度保持されるような変異体を包含する。
図面の簡単な説明 第１図は、B.t.HD−１及びB.t.PS81 Iからのプラスミ
ド製剤のアガロースゲル電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８４９９ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８５００ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８５１７ (72)発明者 ジユエル ペイン アメリカ合衆国 92126 カリフォルニ ア州 サンディエゴ ハンプヒルドライ ブ 7984 (72)発明者 オーガスト ジエイ．シック アメリカ合衆国 92056 カリフォルニ ア州 オーシャンサイド サンヘレナ ドライブ 3188 (56)参考文献 特開 昭63−160577（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．53（１），1987, Ｐ．113−119 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．52（２−３）, 1987，Ｐ．285−290 Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, Ｖｏｌ．133，1987，Ｐ．2921−2931 Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏ ｌ．２（１），1988，Ｐ．153−157 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．328，1987, Ｐ．33−37 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏ ｌ．85，1987，Ｐ．33−37 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．５，1987，Ｐ．807−813

Claims (33)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】NRRL B−18484の確認特性をもったバシラ
    ス・スリンギエンシスPS81 I、又はそれの毒素の昆虫防
    除有効量に鱗翅類害虫を接触させることを含めてなる、
    鱗翅類害虫の防除法。
  2. 【請求項２】上記バシラス・スリンギエンシスPS81 Iを
    粒状餌に混入し、植物害虫が食することの知られた植物
    の種子を蒔く時に、この粒剤を土上に置くか又は土中に
    入れることにより、バシラス・スリンギエンシスPS81 I
    又はそれの毒素の昆虫防除有効量に上記害虫を接触せし
    める、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】（１）バシラス・スリンギエンシスPS81 I
    又はそれの毒素、胞子、又は結晶を含む粒状餌を調製
    し、そして （２）上記粒状餌を土上に置くか又は土中に入れること
    からなる、 鱗翅類の土壌生息害虫の防除法。
  4. 【請求項４】上記粒状餌が、トウモロコシ種子を土中に
    蒔くのと同じ時期に施用される、請求項３に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】実質的に無傷の細胞が目標害虫環境に施用
    される時に殺虫活性を持続させるために、実質的に無傷
    のバシラス・スリンギエンシスPS81 I細胞が処理され
    る、請求項１又は３に記載の方法。
  6. 【請求項６】殺虫剤担体と組み合わせたバシラス・スリ
    ンギエンシスPS81 I又はそれの胞子、又は結晶を含めて
    なる殺虫組成物。
  7. 【請求項７】上記担体が食欲刺激剤又は誘引剤を含めて
    なる、請求項６に記載の組成物。
  8. 【請求項８】種子被覆剤として使用される処方剤成分と
    組み合わせたB.スリンギエンシスPS81 Iを含めてなる殺
    虫組成物。
  9. 【請求項９】鱗翅目害虫に対して活性のあるNRRL B−18
    484の確認特性をもったB.スリンギエンシスPS81 I。
  10. 【請求項１０】バシラス・スリンギエンシスPS81 Iの無
    胞子性及び／又はファージ耐性突然変異体。
  11. 【請求項１１】第２表、第５表、第８表、及び第11表に
    示すアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列
    及び鱗翅類に対する毒素活性を保有しているその断片を
    もったバシラス・スリンギエンシス（B.t.）毒素をコー
    ドしたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】第１表、第４表、第７表、及び第10表に
    示す配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列及び
    鱗翅類に対する毒素活性を保有しているその断片をもっ
    た、バシラス・スリンギエンシス（B.t.）毒素をコード
    したポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】第２表、第５表、第８表、及び第11表に
    示す配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列をもっ
    た、鱗翅類害虫に活性のある毒素、及び鱗翅類に対する
    毒素活性を保持しているその断片。
  14. 【請求項１４】第２、５、８、及び11表に示す配列から
    なる群から選ばれるアミノ酸配列及び鱗翅類に対する毒
    素活性を保持しているその断片をコードしたヌクレオチ
    ド配列をもったポリヌクレオチドを含めてなる組換え運
    搬ベクター。
  15. 【請求項１５】原核生物又は真核生物ホストへ運搬さ
    れ、その中で複製される、請求項15に記載のDNA運搬ベ
    クター。
  16. 【請求項１６】第２、５、８、及び11表に示す配列から
    なる群から選ばれるアミノ酸配列及び鱗翅類に対する毒
    素活性を保有しているその断片をもったバシラス・スリ
    ンギエンシス（B.t.）毒素を発現させるために形質転換
    された細菌ホスト。
  17. 【請求項１７】第２、５、８、及び11表に示す配列から
    なる群から選ばれるアミノ酸配列及び鱗翅類に対する毒
    素活性を保有しているその断片をもったB.t.毒素がコー
    ドされている場合のB.t.毒素遺伝子を含有するプラスミ
    ドベクターで形質転換させた大腸菌（E.coli）。
  18. 【請求項１８】NRRL B−18498の確認特性をもった大腸
    菌（NM522）（pMYC392）、NRRL B−18499の確認特性を
    もった大腸菌（NM522）（pMYC393）、NRRL B−18500の
    確認特性をもった大腸菌（NM522）（pMYC394）、及びNR
    RL B−18517の確認特性をもった大腸菌（NM522）（pMYC
    1603）からなる群から選ばれる形質転換されたホスト。
  19. 【請求項１９】シュードモナス（Pseudomonas）、アグ
    ロバクテリウム（Agrobacterium）、バシラス（Bacillu
    s）又はストレプトミセス（Streptomyces）の種であ
    る、請求項16に記載の細菌ホスト。
  20. 【請求項２０】上記微生物が有色素で葉面接着性であ
    る、請求項19に記載の細菌ホスト。
  21. 【請求項２１】請求項13に記載の毒素を鱗翅類昆虫に、
    又は上記昆虫の環境に投与することを含めてなる、鱗翅
    類昆虫の防除法。
  22. 【請求項２２】上記の投与が根の周辺に対してである、
    請求項21に記載の方法。
  23. 【請求項２３】上記の投与が葉面に対してである、請求
    項21に記載の方法。
  24. 【請求項２４】上記の投与が水に対してである、請求項
    21に記載の方法。
  25. 【請求項２５】目標害虫環境に施用されると持続的な殺
    虫活性をもった実質的に無傷の処理細胞を含有する殺虫
    剤を含めてなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤が鱗翅
    類昆虫に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、第２、
    ５、８、及び11表に示す配列からなる群から選ばれるア
    ミノ酸配列をもったバシラス・スリンギエンシス（B.
    t.）毒素を発現できる形質転換された微生物の発現の結
    果としてつくられる場合の殺虫剤組成物。
  26. 【請求項２６】環境中で殺虫活性を持続させるために処
    理細胞が化学的又は物理的手段によって処理される、請
    求項25に記載の殺虫剤組成物。
  27. 【請求項２７】該処理細胞が、シュードモナス（Pseudo
    monas）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、バシ
    ラス（Bacillus）又はストレプトミセス（Streptomyce
    s）の種からの処理細胞である、請求項25に記載の殺虫
    剤組成物。
  28. 【請求項２８】第２、５、８、及び11表に示す配列から
    なる群から選ばれるアミノ酸配列又は鱗翅類に対する毒
    素活性を保有しているそれらの断片のポリペプチド毒素
    をコードした、鱗翅類昆虫に有毒なバシラス・スリンギ
    エンシス毒素遺伝子の発現結果である細胞内毒素を含有
    する処理された実質的に無傷の単細胞微生物であって、
    上記細胞を目標昆虫環境に施用する時に殺虫活性を持続
    させるような条件下に上記細胞が処理される場合の微生
    物。
  29. 【請求項２９】環境中で殺虫活性を持続させるために細
    胞が化学的又は物理的手段によって処理されている、請
    求項28に記載の微生物。
  30. 【請求項３０】上記微生物がシュードモナスであり、上
    記毒素が第２、５、８、及び11表に示す配列からなる群
    から選ばれるアミノ酸配列又は鱗翅類に対する毒素活性
    を保有しているそれらの断片をもったB.t.毒素である、
    特許請求の範囲28に記載の微生物。
  31. 【請求項３１】上記細胞がヨウ素で処理される、請求項
    28に記載のシュードモナス微生物。
  32. 【請求項３２】シュードモナス・フルオレッセンスであ
    る、請求項28に記載の微生物。
  33. 【請求項３３】請求項12に記載のポリヌクレオチドを含
    むプラスミド。
JP16585090A 1989-06-27 1990-06-26 鱗翅類害虫に対して活性のある新規なバランス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に活性のある新規な毒素をコートした遺伝子 Expired - Lifetime JP3531872B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US371,955 1989-06-27
US07/371,955 US5126133A (en) 1989-06-27 1989-06-27 Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US07/451,261 US5188960A (en) 1989-06-27 1989-12-14 Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US451,261 1989-12-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03224487A JPH03224487A (ja) 1991-10-03
JP3531872B2 true JP3531872B2 (ja) 2004-05-31

Family

ID=27005594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP16585090A Expired - Lifetime JP3531872B2 (ja) 1989-06-27 1990-06-26 鱗翅類害虫に対して活性のある新規なバランス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に活性のある新規な毒素をコートした遺伝子

Country Status (10)

Country Link
US (7) US5188960A (ja)
EP (1) EP0405810B1 (ja)
JP (1) JP3531872B2 (ja)
KR (1) KR910001059A (ja)
AT (1) ATE135406T1 (ja)
AU (1) AU625294B2 (ja)
CA (1) CA2017186C (ja)
DE (1) DE69025808T2 (ja)
ES (1) ES2084659T3 (ja)
GR (1) GR3019582T3 (ja)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2616444B1 (fr) 1987-06-10 1990-03-02 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques codant pour des polypeptides dotes d'une activite larvicide vis-a-vis de lepidopteres
ATE120801T1 (de) * 1988-09-06 1995-04-15 Plant Genetic Systems Nv Pflanzen, die mit einer lepidopteralen dns- sequenz aus bazillus thuringiensis transformiert werden.
EP0400246A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
AU649984B2 (en) * 1989-12-18 1994-06-09 Sandoz Ltd. Transformation of bacillus thuringiensis and production of a mutant B.t. endotoxin
US5686069A (en) * 1990-10-15 1997-11-11 Mycogen Corporation Protein toxins active against lepidopteran pests
US5268172A (en) * 1991-09-13 1993-12-07 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t.PS158C2, active against lepidopteran pests, and genes encoding lepidopteran-active toxins
DK0670900T3 (da) * 1992-11-24 1999-11-22 Abbott Lab Isolater af Bacillus thuringiensis, som er aktive imod Lepidoptera-skadedyr
US5356623A (en) * 1993-03-17 1994-10-18 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryET1 toxin gene and protein toxic to lepidopteran insects
US5843744A (en) * 1993-07-08 1998-12-01 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis Tn5401 proteins
US5322687A (en) * 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
US6150589A (en) * 1995-05-23 2000-11-21 Mycogen Corporation Genes encoding lepidopteran-active toxins from Bacillus thuringiensis isolate PS158C2
US6110668A (en) * 1996-10-07 2000-08-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Gene synthesis method
US5965428A (en) * 1996-10-08 1999-10-12 Ecogen, Inc. Chimeric lepidopteran-toxic crystal proteins
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
ES2195738B1 (es) * 2001-07-31 2005-01-01 Universitat De Valencia. Estudi General Nueva cepa de bacilus thuringlensis para el control de orugas de lepidopteros y en especial de la gardama, spodoptera exigua.
PL1620571T3 (pl) 2003-05-02 2015-10-30 Dow Agrosciences Llc Zdarzenie kukurydzy TC1507 i sposoby jego wykrywania
AU2004318788B2 (en) 2004-03-26 2011-12-22 Corteva Agriscience Llc Cry1F and Cry1Ac transgenic cotton lines and event-specific identification thereof
US7777102B2 (en) * 2007-02-08 2010-08-17 University Of Tennessee Research Foundation Soybean varieties
US20110079544A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for sorting resistant seed from a mixture with susceptible seed
JP5762953B2 (ja) 2008-05-29 2015-08-12 レスメド・リミテッドＲｅｓＭｅｄＬｉｍｉｔｅｄ 医療ヘッドギア
WO2010096613A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production
MX2011013224A (es) 2009-06-09 2012-06-01 Pioneer Hi Bred Int Promotor de endospermo temprano y metodos de uso.
EP2494056A1 (en) 2009-10-26 2012-09-05 Pioneer Hi-Bred International Inc. Somatic ovule specific promoter and methods of use
RU2593961C2 (ru) 2009-12-16 2016-08-10 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Fa ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ У НАСЕКОМЫХ
NZ601101A (en) * 2009-12-16 2014-10-31 Dow Agrosciences Llc Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects
MX350002B (es) 2009-12-16 2017-08-22 Dow Agrosciences Llc Uso de cry1da en combinacion con cry1be para el manejo de insectos resistentes.
AU2010330919B2 (en) 2009-12-16 2016-05-12 Dow Agrosciences Llc Insecticidal protein combination comprising Cry1Ab and Cry2Aa for controlling European corn borer, and methods for insect resistance management
CN103269577B (zh) * 2010-07-29 2017-12-26 陶氏益农公司 经修饰以增加植物转化频率的土壤杆菌属的菌株
US9220245B2 (en) 2010-12-12 2015-12-29 Pioneer Hi Bred International Inc Methods of using field-derived colonies of insects selected for decreased susceptibility to plants expressing insecticidal toxins
US20130167262A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11268
WO2013096810A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11482
CA2860783A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ovule specific promoter and methods of use
US9006515B2 (en) 2012-01-06 2015-04-14 Pioneer Hi Bred International Inc Pollen preferred promoters and methods of use
CN108192901A (zh) 2012-02-01 2018-06-22 陶氏益农公司 人造叶绿体转运肽
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
US9567381B2 (en) 2012-03-09 2017-02-14 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
AU2012208997B1 (en) 2012-07-30 2013-09-19 Dlf Usa Inc. An alfalfa variety named magnum salt
CA2887571A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guard cell promoters and uses thereof
CA2887575A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions to enhance activity of cry endotoxins
US10968446B2 (en) 2012-11-01 2021-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
WO2014159306A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
UA121847C2 (uk) 2013-03-14 2020-08-10 Піонір Хай-Бред Інтернешнл Інк. Полінуклеотид, що кодує елемент сайленсингу з інсектицидною активністю проти шкідника рослин із ряду coleoptera, та спосіб його застосування
EP2971000A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Pioneer Hi Bred Int PHI-4 POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR USE
MD4304C1 (ro) * 2013-08-13 2015-04-30 Институт Зоологии Академии Наук Молдовы Tulpină de bacterii Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki - bioinsecticid pentru combaterea lepidopterelor din genul Lymantria
EA030896B1 (ru) 2013-08-16 2018-10-31 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
EP4159028A1 (en) 2013-09-13 2023-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
RU2016116914A (ru) 2013-10-04 2017-11-13 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Регуляторные элементы гена металлотионеин-подобного белка из zea mays и их применение
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
CN103739683B (zh) * 2014-01-17 2015-06-17 北京大北农科技集团股份有限公司 杀虫蛋白质、其编码基因及用途
EP3705489A1 (en) 2014-02-07 2020-09-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
BR112016018103B1 (pt) 2014-02-07 2024-01-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto
AR099800A1 (es) 2014-03-21 2016-08-17 Agrigenetics Inc Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
US9686931B2 (en) 2014-07-07 2017-06-27 Alforex Seeds LLC Hybrid alfalfa variety named HybriForce-3400
CA2955828A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ubiquitin promoters and introns and methods of use
CA2961733A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US9648826B2 (en) 2014-09-29 2017-05-16 Alforex Seeds LLC Low lignin non-transgenic alfalfa varieties and methods for producing the same
US10059959B2 (en) 2014-10-16 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active Cry1Da1 amino acid sequence variant proteins
RU2733898C2 (ru) 2014-10-16 2020-10-09 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
MX369364B (es) * 2014-10-16 2019-11-06 Pioneer Hi Bred Int Polipeptidos insecticidas con actividad de espectro amplio y usos de estos.
WO2016099916A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
EP3267796B1 (en) 2015-03-11 2023-08-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of pip-72 and methods of use
BR112017024948A2 (pt) 2015-05-19 2018-07-31 Pioneer Hi Bred Int proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
US10647995B2 (en) 2015-06-16 2020-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP3322679A4 (en) 2015-07-13 2019-07-10 Pivot Bio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING THE CHARACTERISTICS OF A PLANT
CA2994676A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant derived insecticidal proteins and methods for their use
WO2017040343A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
WO2017062412A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored nif clusters
CN108575091A (zh) 2015-12-18 2018-09-25 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
US11104911B2 (en) 2015-12-22 2021-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Embryo-preferred Zea mays promoters and methods of use
MX2018012025A (es) 2016-04-14 2019-02-07 Pioneer Hi Bred Int Polipeptidos insecticidas que tienen un espectro de actividad mejorado y sus usos.
CA3021391A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
EP3451837B1 (en) 2016-05-04 2021-08-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3022858A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
RU2019101793A (ru) 2016-06-24 2020-07-24 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Регуляторные элементы растений и способы их применения
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US11535653B2 (en) 2016-10-21 2022-12-27 Vestaron Corporation Cleavable peptides and insecticidal and nematicidal proteins comprising same
CA3038806A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
BR112019012339A2 (pt) 2016-12-14 2019-11-26 Pioneer Hi Bred Int polipeptídeo inseticida recombinante, composição, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, método para inibir o crescimento ou extermínio de uma praga de inseto ou população de praga, polipeptídeo ipd093 quimérico e proteína de fusão
MX2019007491A (es) 2016-12-22 2019-09-06 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
BR112019014378A2 (pt) 2017-01-12 2020-02-11 Pivot Bio, Inc. Métodos e composições para o aprimoramento de traços de plantas
WO2018140214A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nematicidal protein from pseudomonas
BR112019016394A2 (pt) 2017-02-08 2020-04-07 Pioneer Hi Bred Int construto de dna, pilha molecular, pilha de melhoramento, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de praga de inseto
US11555203B2 (en) 2017-05-11 2023-01-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3630982A1 (en) 2017-05-26 2020-04-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
AU2018337756A1 (en) 2017-09-25 2020-04-02 Pioneer Hi-Bred, International, Inc. Tissue-preferred promoters and methods of use
WO2019074598A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. VIRUS-INDUCED GENETIC SILENCING TECHNOLOGY FOR THE CONTROL OF INSECTS IN MAIZE
BR112020008035A2 (pt) 2017-10-25 2020-10-27 Pivot Bio, Inc. métodos e composições para aprimorar micróbios geneticamente modificados que fixam nitrogênio
CN111630061A (zh) 2017-12-19 2020-09-04 先锋国际良种公司 杀昆虫多肽及其用途
EP3755797A1 (en) 2018-02-22 2020-12-30 Zymergen, Inc. Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins
CN111770995A (zh) 2018-03-02 2020-10-13 齐默尔根公司 杀昆虫蛋白发现平台和自其发现的杀昆虫蛋白
WO2019169150A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant health assay
US11525144B2 (en) 2018-03-14 2022-12-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
WO2019178038A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
BR112020023800A2 (pt) 2018-05-22 2021-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos
AU2019291824A1 (en) 2018-06-27 2021-01-14 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
US20210277409A1 (en) 2018-06-28 2021-09-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for selecting transformed plants
US11878999B2 (en) 2018-08-29 2024-01-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3111090A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation
WO2021076346A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack
WO2021221690A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
TW202142114A (zh) 2020-02-04 2021-11-16 美商陶氏農業科學公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法
WO2021222567A2 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
BR112022027035A2 (pt) 2020-07-14 2023-04-11 Pioneer Hi Bred Int Proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
BR112023002603A2 (pt) 2020-08-10 2023-04-04 Pioneer Hi Bred Int Elementos reguladores de plantas e métodos de uso dos mesmos
WO2023278804A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Pivot Bio, Inc. Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen
TW202345696A (zh) 2022-05-18 2023-12-01 美商科迪華農業科技有限責任公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法
WO2024020360A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Pairwise Plants Services, Inc. Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc'

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4448885A (en) * 1981-04-27 1984-05-15 Board Of The Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
US4467036A (en) * 1981-11-12 1984-08-21 The Board Of Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
GB8425487D0 (en) * 1984-10-09 1984-11-14 Agricultural Genetics Co Strain of bacillus thuringiensis
US4695455A (en) * 1985-01-22 1987-09-22 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes
ZA878674B (en) * 1986-11-20 1988-08-31 Monsanto Co Insect-resistant tomato plants
FR2616444B1 (fr) * 1987-06-10 1990-03-02 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques codant pour des polypeptides dotes d'une activite larvicide vis-a-vis de lepidopteres
DE68914477T2 (de) * 1988-01-22 1994-11-24 Mycogen Corp Bacillus-thuringiensis-Hybridgen, Plasmid und transformiertes Pseudomonas fluorescens.
ATE120801T1 (de) * 1988-09-06 1995-04-15 Plant Genetic Systems Nv Pflanzen, die mit einer lepidopteralen dns- sequenz aus bazillus thuringiensis transformiert werden.
US5206166A (en) * 1989-05-18 1993-04-27 Mycogen Corporation Genes encoding lepidopteran-active toxins and transformed hosts
US5164180A (en) 1989-05-18 1992-11-17 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests
EP0400246A1 (en) 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
US5126133A (en) * 1989-06-27 1992-06-30 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5246852A (en) 1989-06-27 1993-09-21 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
AU632335B2 (en) 1990-06-05 1992-12-24 Mycogen Corporation Novel bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests, and genes encoding lepidopteran-active toxins
US5273746A (en) * 1992-01-29 1993-12-28 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against phthiraptera pests

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，１９８７，Ｐ．８０７−８１３
Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５２（２−３），１９８７，Ｐ．２８５−２９０
Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５３（１），１９８７，Ｐ．１１３−１１９
Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３３，１９８７，Ｐ．２９２１−２９３１
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２（１），１９８８，Ｐ．１５３−１５７
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２８，１９８７，Ｐ．３３−３７
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８５，１９８７，Ｐ．３３−３７

Also Published As

Publication number Publication date
AU5790090A (en) 1991-02-28
US6096708A (en) 2000-08-01
US7511129B2 (en) 2009-03-31
GR3019582T3 (en) 1996-07-31
US6737273B2 (en) 2004-05-18
CA2017186C (en) 2009-03-24
ES2084659T3 (es) 1996-05-16
US5691308A (en) 1997-11-25
JPH03224487A (ja) 1991-10-03
AU625294B2 (en) 1992-07-09
DE69025808D1 (de) 1996-04-18
US7138568B2 (en) 2006-11-21
EP0405810B1 (en) 1996-03-13
DE69025808T2 (de) 1996-07-25
US6573240B1 (en) 2003-06-03
US20040058860A1 (en) 2004-03-25
CA2017186A1 (en) 1990-12-27
ATE135406T1 (de) 1996-03-15
EP0405810A2 (en) 1991-01-02
EP0405810A3 (en) 1991-03-13
US20040194165A1 (en) 2004-09-30
US20070118924A1 (en) 2007-05-24
US5188960A (en) 1993-02-23
KR910001059A (ko) 1991-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3531872B2 (ja) 鱗翅類害虫に対して活性のある新規なバランス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に活性のある新規な毒素をコートした遺伝子
JP2576912B2 (ja) 鱗翅類害虫活性の新規バシラス・スリンギエンシス分離体と、新規な鱗翅類活性毒素をコードした遺伝子
JP3054158B2 (ja) 鱗翅類害虫活性のＢ．ｔ．ＰＳ８１ＧＧと命々される新規バシラス・スリンギエンシス分離体と、鱗翅類活性毒素をコードした遺伝子
US5039523A (en) Novel Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. PS81F, active against lepidopteran pests, and a gene encoding a lepidopteran-active toxin
US5126133A (en) Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
JP3298103B2 (ja) 新規なハイブリッドバシラス・スリンギエンシス遺伝子、プラスミド、及び形質転換されたシユードモナス・フルオレッセンス
KR100241117B1 (ko) 신규한 미생물 및 살충제
US4996155A (en) Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin
US5164180A (en) Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests
US5208017A (en) Biologically active Bacillus thuringiensis isolates
JP3220697B2 (ja) 鱗翅類害虫に活性な、Ｂ．ｔ．ＰＳ８１Ｆと命名される新規なバシラス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に対し活性の毒素をコードした遺伝子
US5262158A (en) Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarida
JPH0558833A (ja) 新規な双翅類害虫に活性の新規なバシラス・チユーリンゲンシス単離体
US5135867A (en) Gene encoding a lepidopteran-active toxin from Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. .PS81GG active against lepidopteran pests
US5206166A (en) Genes encoding lepidopteran-active toxins and transformed hosts
US5306494A (en) Coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolates and genes encoding coleopteran-active toxins
JP3388543B2 (ja) ダニを抑制するための新規なバシルスチューリンゲンシス単離体
US5211946A (en) Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides
US5246852A (en) Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
JPH0829100B2 (ja) 新規なハリブリッド バシルス チューリンゲンシス遺伝子プラスミド及び形質転換されたシュードモナス フルオレスセンス
JPH05103676A (ja) 新規な鞘翅目活性タンパク毒素をコードしたバチルス・チユーリンゲンシス遺伝子
JPH07170871A (ja) 生物学的に活性なバチルス・チューリンゲンシス分離体、及び鞘翅目活性毒素をコードした遺伝子
US5296368A (en) Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. PS81F, active against lepidopteran pests, and a gene encoding a lepidopteran-active toxin
US5133962A (en) Method of controlling coleopteran insects with Bacillus thuringiensis
JPH0591883A (ja) 新規な双翅類に活性の毒素をコードした新規なバシラス・チユーリンゲンシス遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20031106

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040301

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080312

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100312

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110312

Year of fee payment: 7

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110312

Year of fee payment: 7