DE68914477T2

DE68914477T2 - Bacillus-thuringiensis-Hybridgen, Plasmid und transformiertes Pseudomonas fluorescens.

Info

Publication number: DE68914477T2
Application number: DE68914477T
Authority: DE
Inventors: Thomas E Gilroy; Edward R Wilcox
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1989-01-17
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2009-01-18
Also published as: ES2063118T3; EP0325400A1; EP0325400B1; JPH02138977A; ATE104350T1; JPH0829100B2; DE68914477D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die am häufigsten verwendeten mikrobiellen Pestizide sind von dem Bakterium Bacillus thuringiensis abgeleitet. Dieses bakterielle Agens wird dazu verwendet, um ein breites Spektrum von blattfressenden Raupen, Japankäfern und Moskitos zu kontrollieren. Bacillus thuringiensis erzeugt eine proteinhaltige Paraspore oder einen Kristall, der nach Aufnahme durch einen empfänglichen Insektenwirt toxisch ist. Beispielsweise erzeugt B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 einen Kristall, Delta-Toxin genannt, der fuhr die Larven einer Anzahl von Lepidoptera-Insekten toxisch ist. Die Klonierung und Expression dieses B.t.-Kristallprotein-Gens in Escherichia coli ist in der publizierten Literatur beschrieben worden (Schnepf, H.E. und Whitely, H.R. [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2893-2897). Das US- Patent 4,448,885 und das US-Patent 4,467,036 offenbaren beide die Expression des B.t.-Kristallproteins in E. coli. US 4,467,036 offenbart B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 als erhältlich von der bekannten NRRL-Hinterlegungsstelle in Peoria, Illinois. Seine dortige Hinterlegungsnummer ist NRRL B-3792. B. thuringiensis var. kurstaki HD-73 ist ebenfalls von NRRL erhältlich. Seine Hinterlegungsnummer ist NRRL B-4488.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Offenhart und beansprucht ist ein neues Hybrid-Toxingen, das für Lepidoptera-Insekten toxisch ist. Dieses Toxingen ist mittels eines Plasmidvektors in einen Pseudomonas fluorescens-Wirt überführt worden.
Speziell umfaßt die Erfindung ein neues Hybrid-Delta-Endotoxingen, welches einen Teil des Toxingens von B. thuringiensis var. kurstaki HD-73 und einen Teil des Toxingens aus dem Stamm B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 umfaßt. Dieses Hybrid-Gen wurde in einen geeigneten Transfervektor inseriert, welcher dann dazu verwendet wurde, einen Pseudomonas fluorescens-Wirt zu transformieren. Der P. fluorescens-Wirt kann als gegen Lepidoptera-Insekten aktives Insektizid eingesetzt werden.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Hybrid-Toxingen (DNA), welches für ein neues Protein mit Aktivität gegen Lepidoptera-Insekten kodiert.

Detaillierte Offenbarung der Erfindung

Das neue Hybrid-Toxingen der vorliegenden Erfindung umfaßt einen Teil des Toxingens von B. thuringiensis var. kurstaki HD-73 und einen Teil des Toxingens des Stammes B. thuringiensis var. kurstaki HD-1. Im allgemeinen wurde der B.t.k.
HD-73-Genanteil zunächst mit DNA-Segmenten kombiniert, die abgeleitet waren von (1) dem bekannten E. coli Plasmid pBR322, (2) einem DNA-Segment, welches die Fähigkeit in Pseudomonas zu replizieren aus dem bekannten Plasmid pRO1614 überträgt und (3) einem DNA-Segment, welches den hybriden Tac-Promotor repräsentiert.
Das resultierende Hybrid-Gen war in einem Plasmid mit der Bezeichnung pM2,16-11 enthalten. Dieses Plasmid wurde dazu verwendet, um einen Pseudomonas fluorescens-Mikroorganismus zu transformieren, um den transformierten Stamm mit der Bezeichnung MR436 zu ergeben.
Das Toxin-Gen der vorliegenden Erfindung kann in eine große Vielfalt von mikrobiellen Wirten eingeführt werden. Die Expression des Toxin-Gens resultiert direkt oder indirekt in der intrazellulären Produktion und Aufrechterhaltung des Pestizids. Bei geeigneten Wirten, z. B. Pseudomonas, können die Mikroorganismen auf den Aufenthaltsort von Lepidoptera-Insekten aufgebracht werden, wo sie sich vermehren und von den Insekten aufgenommen werden. Das Ergebnis ist eine Kontrolle der unerwünschten Insekten. Als Alternative kann der Mikroorganismus, der das Toxin-Gen beherbergt, unter Bedingungen behandelt werden, die die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins verlängern. Die behandelte Zelle kann dann in der Umwelt eines Zielschädlings oder Zielschädlingen ausgebracht werden. Das resultierende Produkt behält die Toxizität des B.t.-Toxins.
Wenn das B.t.-Toxin-Gen mittels eines geeigneten Vektors in einen mikrobiellen Wirt eingeführt wird und der Wirt in der Umwelt in lebendem Zustand ausgebracht wird, ist es essentiell, daß bestimmte Wirtsmikroorganismen verwendet werden. Es werden Mikroorganismen-Wirte ausgewählt, von denen bekannt ist, daß sie die "Phytosphäre" (Phyllooberfläche, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizooberfläche) einer oder mehrerer interessierenden(r) Erntepflanze(n) bewohnen. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, daß sie imstande sind, in der besonderen Umwelt (Erntepflanze und anderen Insekten-Habitaten) erfolgreich mit den Wildtyp-Mikroorganismen im Wettbewerb zu stehen, für stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens sorgen, welches das Polypeptid-Pestizid exprimiert, und wünschenswerterweise für verbesserten Schutz des Pestizids vor umweltbedingtem Abbau und Inaktivierung zu sorgen.
Von einer großen Anzahl von Mikroorganismen ist bekannt, daß sie die Phyllooberfläche (die Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder die Rhizosphäre (den Boden in der Umgebung von Pflanzenwurzeln) einer großen Vielfalt von wichtigen Erntepflanzen bewohnen. Diese Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Pilze ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z. B. der Gattungen Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Aqrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefe, z. B. der Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche Bakterienspezies der Phytosphäre wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus und Azotobacter vinlandii; und Hefespezies der Phytosphäre wie Rhodotorula rubra, R. qlutinis, R. marina R aurantiaca, Cryotococcus albidus, c. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
Eine große Vielfalt von Wegen sind zur Einführung des B.t.-Gens, welches das Toxin exprimiert, in den Mikroorganismus-Wirt unter Bedingungen verfügbar, die die stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens erlauben. Es ist möglich DNA-Konstrukte bereitzustellen, welche einschließen die transkriptionalen und translationalen Regulationssignale zur Expression des Toxin-Gens, das Toxin-Gen unter deren regulatorischer Kontrolle und eine DNA-Sequenz, die mit einer Sequenz im Wirtsorganismus homolog ist, wodurch Integration eintreten wird, und/oder ein Replikationssystem, das in dem Wirt funktionell ist, wodurch Integration oder stabile Aufrechterhaltung eintreten wird.
Die transkriptionalen Initiationssignale werden einen Promotor und eine transkriptionale Initiationsstartstelle einschließen. In einigen Fällen mag es wünschenswert sein, für eine regulative Expression des Toxins zu sorgen, wodurch die Expression des Toxins nur nach der Freisetzung in die Umwelt eintreten wird. Dies kann mit Operatoren erreicht werden oder einem Bereich, der an einen Aktivator oder an "Enhancer" bindet, die nach einer Änderung in der physikalischen oder chemischen Umwelt der Mikroorganismen zur Induktion imstande sind. Beispielsweise kann ein temperaturempfindlicher regulatorischer Bereich eingesetzt werden, wobei die Organismen im Labor ohne Expression eines Toxins gezüchtet werden können, aber die Expression nach Freisetzung in die Umwelt beginnen würde. Andere Techniken können ein spezielles Nährmedium im Labor verwenden, welches die Expression des Toxins verhindert, während das Nährmedium in der Umwelt die Expression des Toxins erlauben würde. Zur translationalen Initiation wird eine ribosomale Bindungsstelle und ein Initiationscodon vorhanden sein.
Zur Erhöhung der Expression des "Messengers" können verschiedene Manipulationen durchgeführt werden, insbesondere die Verwendung eines aktiven Promotors ebenso wie der Einsatz von Sequenzen, welche die Stabilität der "Messenger"-RNA erhöhen. Der Initiations- und Translations-Terminationsbereich wird einen Stopcodon oder Stopcodons einschließen, einen Terminationsbereich und gegebenenfalls ein Polyadenylierungssignal.
In Transkriptionsrichtung, nämlich in 5'- zu 3'-Richtung der kodierenden oder "Sense"-Sequenz, wird das Konstrukt den transkriptionalen regulatorischen Bereich, falls vorhanden, und den Promotor, wobei der regulatorische Bereich entweder 5' oder 3' vom Promotor gelegen sein kann, die ribosomale Bindungsstelle, das Initiationscodon, das Strukturgen mit einem offenen Leserahmen in Phase mit dem Initiationscodon, das oder die Stopcodons, die Polyadenylierungs- Signalsequenz, falls vorhanden, und den Terminationsbereich einschließen. Diese Sequenz kann als Doppelstrang für sich allein zur Transformation eines Mikroorganismen-Wirts verwendet werden, wird aber üblicherweise mit einer DNA-Sequenz, die einen Marker beinhaltet, eingeschlossen sein, wobei während der Einführung der DNA in den Wirt die zweite DNA-Sequenz mit dem Toxin-Expressionskonstrukt verknüpft sein kann.
Durch einen Marker ist ein Strukturgen beabsichtigt, das die Selektion derjenigen Wirte, die modifiziert oder transformiert worden sind, ermöglicht. Der Marker wird normalerweise einen Selektionsvorteil bieten, beispielsweise Resistenz gegen ein Biozid, z. B. Resistenz gegenüber Antibiotika oder Schwermetallen; Komplementierung, z. B. um einem auxotrophen Wirt Prototrophie zu verleihen, oder dgl. Vorzugsweise wird Komplementierung eingesetzt, so daß der modifizierte Wirt nicht nur selektioniert werden kann, sondern auch im Freiland wettbewerbsfähig ist. Es können einer oder mehrere Marker bei der Entwicklung der Konstrukte ebenso wie zur Modifizierung des Wirts eingesetzt werden. Die Organismen können weiter modifiziert sein, indem für einen Wettbewerbsvorteil gegenüber anderen Wildtyp-Mikroorganismen im Freiland gesorgt wird. Beispielsweise können Gene, die Metall-chelierende Agentien, z. B. Siderophore, exprimieren, zusammen mit dem Strukturgen, welches das Toxin exprimiert, in den Wirt eingeführt werden. Auf diese Weise kann die erhöhte Expression eines Siderophors dem Toxin-erzeugenden Wirt einen Wettbewerbsvorteil bieten, so daß er effektiv mit den Wildtyp-Mikroorganismen in Wettbewerb stehen und stabil eine Nische in der Umwelt besetzen kann.
Wenn kein funktionales Replikationssystem vorhanden ist, wird das Konstrukt auch eine Sequenz von mindestens 50 Basenpaaren (bp), vorzugsweise mindestens etwa 100 bp, und üblicherweise nicht mehr als etwa 1000 bp einer Sequenz, die mit einer Sequenz im Wirt homolog ist, einschließen. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit legitimer Rekombination erhöht, so daß das Gen in den Wirt integriert und durch den Wirt stabil aufrechterhalten werden wird. Wünschenswerterweise wird sich das Toxin-Gen in enger Nachbarschaft zu dem Gen befinden, das für die Komplementierung sorgt, ebenso wie das Gen, das den Wettbewerbsvorteil bietet. Deshalb wird, falls das Toxin-Gen verlorengeht, der resultierende Organismus wahrscheinlich auch das komplementierende Gen und/oder das Gen, das den Wettbewerbsvorteil bietet, verlieren, so daß er nicht mehr in der Lage sein wird, in der Umwelt mit dem Gen, welches das intakte Konstrukt enthält, in Wettbewerb zu stehen.
Eine große Anzahl von transkriptionalen regulatorischen Bereichen sind aus einer großen Vielfalt von Mikroorganismen-Wirten wie Bakterien, Bakteriophagen, Cyanobakterien, Algen, Pilzen und dgl. verfügbar. Verschiedene transkriptionale regulatorische Bereiche schließen die Bereiche ein, die mit dem trp-Gen, lac- Gen, gal-Gen, den linken und rechten Lambda-Promotoren, dem Tac-Promotor, den in der Natur mit dem Toxin-Gen assoziierten Promotoren, wenn diese im Wirt funktionell sind, assoziiert sind. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4,332,898, 4,342,832 und 4,356,270. Der Terminationsbereich kann derjenige Terminationsbereich sein, der normalerweise mit dem transkriptionalen Initiationsbereich assoziiert ist, oder ein anderer transkriptionaler Initiationsbereich, solange die beiden Bereiche kompatibel und im Wirt funktionell sind.
Wenn eine stabile episomale Aufrechterhaltung oder Integration gewünscht ist, wird ein Plasmid eingesetzt werden, welches ein im Wirt funktionelles Replikationssystem aufweist. Das Replikationssystem kann von dem Chromosom, einem episomalen Element, das normalerweise in diesem Wirt oder einem anderen Wirt vorhanden ist, oder einem Replikationssystem eines Virus, der im Wirt stabil ist, abgeleitet sein. Es sind eine große Anzahl von Plasmiden verfügbar, z. B. pBR322, pACYC184, RSF1010, pRO1614 und dgl. Siehe beispielsweise Olson et al. (1982) J. Bacteriol. 150 : 6069, und Bagdasarian et al. (1981) Gene 16 : 237, und die US- Patente Nr. 4,356,270, 4,362,817 und 4,371,625.
Das B.t.-Gen kann zwischen dem transkriptionalen und translationalen Initiationsbereich und dem transkriptionalen und translationalen Terminationsbereich eingeführt werden, um so unter der regulatorischen Kontrolle des Initiationsbereichs zu stehen. Dieses Konstrukt wird in einem Plasmid enthalten sein, das mindestens ein Replikationssystem beinhalten wird, aber mehr als eines beinhalten kann, wenn ein Replikationssystem zur Klonierung während der Entwicklung des Plasmids eingesetzt wird und das zweite Replikationssystem zur Funktion im endgültigen Wirt nötig ist. Zusätzlich können ein oder mehrere Marker vorhanden sein, die oben beschrieben worden sind. Wenn Integration gewünscht ist, wird das Plasmid wünschenswerterweise eine Sequenz einschließen, die mit dem Wirts-Genom homolog ist.
Die Transformanten können nach bekannten Verfahren isoliert werden, üblicherweise unter Verwendung einer Selektionstechnik, die die Selektion des gewünschten Organismus gegenüber unmodifizierten Organismen oder übertragenden Organismen, falls diese anwesend sind, ermöglicht. Die Transformanten können dann auf Pestizid-Aktivität getestet werden.
Geeignete Wirtszellen, wobei die Pestizid-enthaltenden Zellen behandelt werden, um die Aktivität des Toxins in der Zelle zu verlängern, wenn die dann behandelte Zelle in der Umwelt des Zielschädlings oder der Zielschädlinge ausgebracht wird, können Prokaryoten oder Eukaryoten einschließen und sind normalerweise auf solche Zellen beschränkt, die keine Substanzen erzeugen, die für höhere Organismen wie Säugetiere toxisch sind. Es könnten jedoch Organismen, die Substanzen erzeugen, welche für höhere Organismen toxisch sind, eingesetzt werden, bei denen das Toxin instabil ist oder das Niveau der Anwendung ausreichend niedrig, um jede Möglichkeit der Toxizität für einen Säugerwirt zu vermeiden. Als Wirte werden von besonderem Interesse die Prokaryoten und die niederen Eukaryoten, z. B. Pilze, sein. Beispielhafte Prokaryoten, sowohl Gramnegative als auch positive, schließen Enterobacteriaceae, wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, wie Rhizobium; Spirillaceae, wie Photobakterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, wie Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae ein. Unter den Eukaryoten sind Pilze wie Phycomycetes und Ascomycetes, die Hefe z. B. Saccharomyces und Schizosaccharomyces einschließen; und Basidiomycetes-Hefe, wie Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dgl.
Eigenschaften, die für die Auswahl einer Wirtszelle für Produktionszwecke von besonderem Interesse sind, schließen die Leichtigkeit, mit der das B.t.- Gen in den Wirt eingeführt werden kann, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Effizienz der Expression, die Stabilität des Pestizids im Wirt und das Vorhandensein unterstützender genetischer Fähigkeiten ein. Eigenschaften, die für die Verwendung als Pestizid-Mikrokapsel von Interesse sind, schließen Schutzeigenschaften für das Pestizid wie dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Packung oder Bildung von Einschlußkörpern; Blattaffinität; mangelnde Toxizität gegenüber Säugern, Attraktivität für die Schädlinge zur Aufnahme; Leichtigkeit des Abtötens und Fixierens ohne Beschädigung des Toxins und dgl. ein. Andere Gesichtspunkte beinhalten die Leichtigkeit der Formulierung und der Handhabung, wirtschaftliche Gesichtspunkte, Lagerungsstabilität und dgl.
Wirtsorganismen von besonderem Interesse schließen Hefe, z. B. Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp., und Sporobolomyces sp.; phylloplane Organismen wie Pseudomonas sp., Erwinia sp. und Flavobacterium sp.; oder andere Organismen wie Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp., und dgl. ein. Spezielle Organismen schließen Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, und dgl. ein.
Die Zelle wird üblicherweise intakt sein und im wesentlichen in der Vermehrungsform vorliegen, wenn sie behandelt ist, eher als in der Sporenform, obwohl in einigen Fällen Sporen eingesetzt werden können.
Die Behandlung der mikrobiellen Zelle, z. B. einem Mikroorganismus, der das B.t.-Toxin-Gen enthält, kann auf chemische oder physikalische Weise oder durch eine Kombination von chemischen und/oder physikalischen Mitteln erfolgen, solange sich die Methode nicht schädlich auf die Eigenschaften des Toxins auswirkt oder die zelluläre Fähigkeit zum Schutz des Toxins nicht verringert. Beispiele chemischer Reagenzien sind Halogenierungsmittel, insbesondere Halogene der Atomzahl Nr. 17-80. Spezieller kann Iod unter milden Bedingungen und für eine ausreichende Zeit, um die gewünschten Resultate zu erreichen, eingesetzt werden. Andere geeignete Techniken beinhalten die Behandlung mit Aldehyden, z. B. Formaldehyd und Glutaraldehyd; Anti-Infektionsmitteln, z. B. Zephiranchlorid und Cetylpyridiniumchlorid; Alkoholen wie Isopropanol und Ethanol; verschiedenen histologischen Fixativen, z. B. Bouin's Fixativ und Helly's Fixativ (siehe: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); oder eine Kombination von physikalischen (Wärme) und chemischen Agenzien, die die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins erhalten und verlängern, wenn die Zelle dem Wirtstier verabreicht wird. Beispiele physikalischer Mittel sind Strahlung kurzer Wellenlänge, z. B. Gamma-Strahlung und Röntgenstrahlung, Einfrieren, UV-Bestrahlung, Lyophilisierung und dgl.
Die Zellen werden im allgemeinen erhöhte Strukturstabilität aufweisen, welche die Resistenz gegenüber Umweltbedingungen erhöht. Wenn das Pestizid in einer Proform vorliegt, sollte das Verfahren zur Inaktivierung so gewählt werden, daß das Processing der Proform zur reifen Form des Pestizids durch das Zielschädlingspathogen nicht behindert wird. Beispielsweise wird Formaldehyd Proteine vernetzen und könnte das Processing der Proform eines Polypeptid-Pestizids verhindern. Das Verfahren zur Inaktivierung oder Abtötung hält mindestens einen wesentlichen Teil der Bioverfügbarkeit oder Bioaktivität des Toxins aufrecht.
Der zelluläre Wirt, der das insektizide B.t.-Gen enthält, kann in jedem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, worin das DNA-Konstrukt einen Selektionsvorteil bietet, vorausgesetzt, es ist ein selektives Medium, so daß im wesentlichen alle oder alle Zellen das B.t.-Gen enthalten. Diese Zellen können dann nach üblichen Verfahren geerntet werden. Alternativ können die Zellen vor der Ernte behandelt werden.
Die B.t.-Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulate oder Staub, durch Mischen mit verschiedenen Inerten Materialien, z. B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (gepulverten Maiskolben, Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können Streu-Haft-Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder oberflächenaktive Mittel beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische Agenzien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere beinhalten.
Die Pestizid-Konzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Pestizid wird in mindestens 1 Gew.-% vorhanden sein und kann 100 Gew.-% betragen. Die trockenen Formulierungen werden 1-95 Gew.-% des Pestizids enthalten, während die flüssigen Formulierungen im allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Festkörper in der flüssigen Phase enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis 10&sup4; Zellen/mg enthalten. Diese Formulierungen werden bei etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
Die Formulierungen können in der Umwelt des oder der Lepidoptera-Schädlinges(e), z. B. Pflanzen, Boden oder Wasser durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder dgl. ausgebracht werden.
Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als beschränkend anzusehen. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1 - Konstruktion des neuen Hybrid-Toxingens und Transformation in Pseudomonas fluorescens

Ein Teil des B. thuringiensis var. kurstaki HD-73-Gens, der die gesamte Toxinkodierende DNA vom Start-ATG (d. h. Start-Methionin) bis zur HindIII-Stelle enthielt, wurde in das Tac-Promotor-Plasmid pKK223-3 (Pharmacia) eingebaut. Dies wurde durch eine glattendige Fusion dieses Gens gerade stromabwärts von der ribosomalen Bindungsstelle in pKK223-3 ausgeführt. Dies erzeugte das Plasmid pKK2. Als nächstes wurde der 3'-Anteil eines Toxingens aus dem B.t. -Stamm Berliner (DNA 5 : 305-314 [1986]) als SacI- bis PstI-Fragment in pKK2/SacI + PstI kloniert, um so ein rekombinantes Toxingen in einem neuen Plasmid mit der Bezeichnung pKK73BB-9 zu erzeugen. Dieses Gen stammt aus Berliner (DNA 5 : 305- 314, 1986) bezüglich aller Sequenzen jenseits (3' zu) der SacI-Stelle.
Als nächstes wurde pKK73BB-9 mit NsiI gespalten, um den internen Teil der Toxin- DNA freizusetzen, mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, Gelgereinigt und eingesetzt, um ein partielles HD73-ähnliches Toxingen-Fragment mit Nsil-Enden zu zu subklonieren. Das resultierende Plasmid wird als pKK1-73 bezeichnet. Das HD73-ähnliche Fragment repräsentiert alle DNA-Sequenzen zwischen den zwei NsiI-Stellen, die üblicherweise in B.t. -Toxinen gefunden werden. Als nächstes wurde pKK1-73 mit Tth111I gespalten, durch Behandlung mit Klenow- Fragment plus dNTPs glattendig gemacht, mit BamHI-Linkern versehen, mit BamHI verdaut, ligiert, transformiert und gescreent, um ein Plasmid zu finden, welches das partielle Tetracyclin-Gen (abgeleitet von pKK223-3) deletiert hatte. Dies ergab das Plasmid p1,123-1. Das Plasmid p1,123-1 wurde mit PvuI gespalten, kurz mit Bal 31 behandelt, mittels Klenow glattendig gemacht und dazu verwendet, um das auf ähnliche Weise mit glatten Enden versehene Gen für Tetracyclin-Resistenz aus pBR322 (Kartierungspositionen EcoRI bis AvaI) zu klonieren. Das Screenen von Tetracyclin-resistenten Kolonien ergab das gewünschte Plasmid p1,130-6. Dieses Plasmid wurde durch partielle Verdauung mit BamHI linearisiert, Gel-gereinigt und dazu verwendet, um den Pseudomonas-Replikationsursprung mit BamHI-Enden aus pRO1614 aufzunehmen. Das Endergebnis ist das Plasmid pM2,16-11.
Das Plasmid pM2,16-11 wurde dazu verwendet, um Pseudomonas fluorescens unter Verwendung von Standard-Transformationsverfahren zu transformieren.
Das oben erläuterte HD73-ähnliche NsiI-Fragment wurde wie folgt konstruiert. Zum 3'-Ende des partiellen HD73-Gens mit HindIII-Enden wurde eine HindIII bis NdeI Berliner-ähnliche Toxin-Sequenz hinzugefügt, die aus B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 kloniert worden war.
Die obigen Klonierungsverfahren wurden, wenn nicht anders angegeben, nach Standardverfahren ausgeführt.
Die verschiedenen Methoden, die bei der Herstellung der Plasmide und der Transformation von Wirtsorganismen eingesetzt wurden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Diese Verfahren sind alle in Maniatis et al. (1982) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, beschrieben. Es liegt im Rahmen der Fähigkeiten von Fachleuten auf dem Gebiet des "Genetic Engineering", DNA aus mikrobiellen Zellen zu extrahieren, Verdauungen mit Restriktionsenzymen durchzuführen, DNA-Fragmente zu elektrophoresieren, Plasmid und Insert-DNA mit Enden zu versehen und zu verschmelzen, DNA zu ligieren, Zellen zu transformieren, Plasmid-DNA herzustellen, Proteine zu elektrophoresieren und DNA zu sequenzieren.
Die hier offenbarten Restriktionsenzyme können von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA, oder New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA, bezogen werden. Die Enzyme werden nach den vom Hersteller gegebenen Anweisungen verwendet.
Das Plasmid pM2,16-11, welches das B.t.-Toxin-Gen enthält, kann aus dem transformierten Wirts-Mikroorganismus nach bekannten Standardverfahren entfernt werden. Beispielsweise kann P. fluorescens (pM2,16-11) isopyknischen "cleared iysate" Dichtegradientenverfahren unterworfen werden, um pM2,16-11 zu gewinnen. Eine Subkultur von P. fluorescens (pM2,16-11) wurde in der permanenten Sammlung der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, am 15.01.88 hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18292.

BEISPIEL 2 - Insertion des Toxingens in Pflanzen

Das neue Gen kann in Pflanzenzellen unter Verwendung des Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens eingeführt werden. Die Pflanzenzellen können dann dazu veranlaßt werden, zu Pflanzen zu regenerieren; siehe Zambryski et al. (1983) Cell 32 : 1033-1043). Ein besonders nützlicher Vektor in dieser Beziehung ist pEND4K; siehe Klee et al. (1985) Biotechnology 3 : 637-642). Dieses Plasmid kann sowohl in Pflanzenzellen als auch in Bakterien replizieren und weist mehrfache Klonierungsstellen für "Passenger"-Gene auf. Das Toxin-Gen kann beispielsweise in die BamHI-Stelle von pEND4K inseriert werden, in E. coli vermehrt und in geeignete Pflanzenzellen transformiert werden.

BEISPIEL 3 - Klonierung neuer B. thuringiensis Hybrid-Gene in Baculoviren

Das neue Hybrid-Gen kann in Baculoviren wie Autographa californica Kern- Polyhedrosis-Virus (AcNPV) kloniert werden. Es können Plasmide konstruiert werden, die das AcNPV-Genom in einen im Handel erhältlichen Klonierungsvektor wie pUC8 kloniert enthalten. Das AcNPV-Genom ist so modifiziert, daß der kodierende Bereich des Polyhedrin-Gens entfernt ist und eine nur einmal vorkommende Klonierungsstelle für ein "Passenger"-Gen direkt hinter dem Polyhedrin-Promotor plaziert ist. Beispiele solcher Vektoren sind pGP-B6874, beschrieben von Pennock et al. Mol Cell. Biol. 4 : 399-406, und pAC380, beschrieben von Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3 : 2156-2165. Das Gen, welches für das erfindungsgemäße neue Proteintoxin kodiert, kann mit BamHI-"Linkern" an geeigneten Bereichen sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts des codierenden Bereichs modifiziert werden und in die "Passenger"-Stelle eines der AcNPV-Vektoren eingebaut werden.
Die besondere Nukleotid-Sequenz, die für das neue B.t.-Toxingen codiert und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Anspruch 1 gezeigt.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß die Aminosäuresequenz eines Proteins durch die Nukleotidsequenz der DNA bestimmt wird. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, d. h. mehr als ein kodierendes Nukleotidtriplett (Codon) kann für die meisten der zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren eingesetzt werden, können verschiedene Nukleotidsequenzen für eine spezielle Aminosäure codieren.
Das neue B.t.-Toxin kann mittels jeder Nukleotidsequenz (äquivalent zu der gezeigten) hergestellt werden, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert; die vorliegende Erfindung schließt solche äquivalenten Nukleotidsequenzen ein. TABELLE

Claims

1. DNA, die für ein Bacillus thuringiensis-Toxin mit der in der TABELLE gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

2. DNA nach Anspruch 1, mit der in der TABELLE gezeigten Nukleotidsequenz.

3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Nukleotidsequenz am Stopcodon endet.

4. Gegen Lepidoptera-Insekten aktives Toxin mit der in der TABELLE gezeigten Aminosäuresequenz.

5. Rekombinanter DNA-Transfervektor, der DNA nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.

6. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, in den ein DNA-Transfervektor nach Anspruch 5 transferiert und repliziert worden ist.

7. Mikroorganismus, der imstande ist, ein Bacillus thuringiensis-Toxin mit der in der TABELLE gezeigten Aminosäuresequenz zu exprimieren.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, der eine Spezies ist von Pseudomonas, Azobacter, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter oder Alcaligenes; ein Prokaryot ausgewählt aus Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Rhizobiaceae, Spirillaceae, Lactobacillaceae, Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae; oder ein niederer Eukaryot, ausgewählt aus Phycomycetes, Ascomycetes und Basidiomycetes.

9. Mikroorganismus nach Anspruch 7, der Pseudomonas fluorescens ist.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, der Pseudomonas fluorescens (pM2,16-11) mit den kennzeichnenden Merkmalen von NRRL B-18292 ist.

11. Mikroorganismus nach Anspruch 7, der ein pigmentiertes Bakterium, Hefe oder ein Pilz ist.

12. Mikroorganismus nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 11, der pigmentiert ist und Phyllooberflächen-adhärent.

13. Im wesentlichen intakte Zellen eines einzelligen Mikroorganismus nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12, der das Toxin enthält.

14. Zellen nach Anspruch 13, wie erhalten durch Behandlung mit Iod oder anderen chemischen oder physikalischen Mitteln, um die insektizide Aktivität in der Umwelt zu verlängern.

15. Verfahren zur Kontrolle eines Lepidoptera-Insektenschädlings, welches das Ausbringen eines Mikroorganismus oder Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 14 an die Insekten oder in deren Umwelt umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Ausbringung in der Rhizosphäre, der Phyllooberfläche oder einem Wasserkörper erfolgt.

17. Plasmid pM2,16-11, wie erhältlich in Pseudomonas fluorescens (pM2,16-11) mit den kennzeichnenden Merkmalen von NRRL B-18292).