JPH0829100B2

JPH0829100B2 - 新規なハリブリッドバシルスチューリンゲンシス遺伝子プラスミド及び形質転換されたシュードモナスフルオレスセンス

Info

Publication number: JPH0829100B2
Application number: JP1013021A
Authority: JP
Inventors: イー．ギルロイトーマス; アール．ウィルコクスエドワード
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1989-01-20
Publication date: 1996-03-27
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: ES2063118T3; EP0325400B1; DE68914477D1; DE68914477T2; JPH02138977A; EP0325400A1; ATE104350T1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕最も広く使用されている微生物殺虫剤は細菌であるバ
シルスチューリンゲンシス（Bacillus thuringiensi
s）に由来するものである。この細菌剤は広範囲の葉を
食べる幼虫、マメコガネ（Japanese beetle）及び蚊を
抑制するのに使用される。バシルスチューリンゲンシ
スは感受性の昆虫宿主によって摂取されると毒性であ
る、蛋白質性のバラ胞子又は結晶を製造する。例えばバ
シルスチューリンゲンシスvar.クルスタキ（kurstak
i）HD-1（以下B.t.k.HD-1と書くこともある）は多くの
鱗翅類昆虫の幼虫に毒性であるデルタトキシンと呼ばれ
る結晶を製造する。このB.t.結晶蛋白遺伝子を大腸菌中
でクローニングし、そして表現することは刊行された文
献に記載されている（シュネッフエッチ．イー．及び
フィットレーエッチ．アール．［1981］Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.78:2893−2897）。英国特許4,448,885及
び米国特許4,467,036は両方とも大腸菌中でB.t.結晶蛋
白を表現することを開示している。米国特許4,467,036
中に於てB.チューリンゲンシスvar.クルスタキHD-1がイ
リノイ州ペオリアの良く知られたNRRL培養基寄託所から
入手できることが開示されている。その寄託番号はNRRL
B-3792である。またB.チューリンゲンシスvar.クルス
タキHD-73はNRRLから入手できる。その寄託番号はNRRL
B-4488である。

〔課題を解決する手段〕

ここに開示され特許されているのは鱗翅類昆虫に毒性
のある新規なハイブリッド毒素遺伝子である。この毒素
遺伝子はプラスミドベクターを経てシュードモナスフ
ルオレスセンス（Pseudomonas fluorescedns）宿主に移
されている。

特定的には本発明はB.チューリンゲンシスvar.クルス
タキHD-73毒素遺伝子の一部、B.チューリンゲンシスva
r.クルスタキ系統HD-1からの毒素遺伝子の一部を含んで
いる新規なハイブリッドデルタエンドトキシン遺伝子か
らなる。このハイブリッド遺伝子は、適当な運搬ベクタ
ーに挿入され、これが次にシュードモナスフルオレス
センス宿主を形質転換するのに用いられる。P.フルオレ
スセンス宿主は、鱗翅類昆虫に対し、活性のある殺虫剤
として使用することが出来る。

より詳しくは、本発明は鱗翅類昆虫に対し、活性を有
する新規な蛋白質をコードしている新規なハイブリッド
毒素遺伝子（DNA）に関するものである。表Ｉは新規な
毒素をコードするDNAを開示している。表IIは新規なハ
イブリッド毒素のアミノ酸配列を開示している。表III
は表Ｉ及び表IIの複合体である。

〔課題を解決する手段〕

本発明の新規なハイブリッド毒素遺伝子は、B.チュー
リンゲンシスvar.クルスタキHD-73毒素遺伝子の一部及
びB.チューリンゲンシスvar.クルスタキ系統HD-1毒素遺
伝子の一部を含んでいる。一般にB.t.k.HD-73遺伝子部
分は、最初に（１）既知の大腸菌プラスミドpBR322、
（２）既知のプラスミドpRO1614からのシュードモナス
中で複製する能力を有するDNAセグメント及び（３）ハ
イブリッドTacプロモーターを表わしているDNAセグメン
トから由来するDNA断片と結合された。

生じるハイブリッド遺伝子は、pM2,16-11と呼ばれる
プラスミド中に含まれる。このプラスミドはシュードモ
ナスフルオレスセンス微生物を形質転換するのに使用
され、MR436と命名される形質転換された系統を与え
る。

本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物宿主中に導入
することが出来る。毒素遺伝子の表現は直接又は間接に
細胞内生産を生じ、そして殺虫剤の保持を生じる。適当
な宿主、例えばシュードモナスで微生物は鱗翅類が増殖
する鱗翅類昆虫のいる場所に適用出来、昆虫によって摂
取される。その結果望まれない昆虫が抑制される。別の
方法として毒素遺伝子を宿している微生物は細胞内で生
産される毒素の活性が持続される条件下で処理される。
処理された細胞を次に標的害虫の環境に適用することが
出来る。生じる生成物はB.t.毒素の毒性を保持する。

B.t.毒素遺伝子が、適当なベクターを介して微生物宿
主に導入され、そしてその宿主が生きている状態で環境
に適用されたときは、ある種の宿主微生物が使用される
のが必須である。微生物宿主が１又はそれ以上の問題と
なる作物のフィトスフェア（phytosphere）（フィロプ
レイン（phylloplane）、フィロスフェア（phyllospher
e）、リゾスフェア（rhizosphere）、及び／又はリゾプ
レイン（rhizoplane）を占有することが知られている微
生物宿主が選択される。これらの微生物は野性型の微生
物と特定の環境（作物及び他の昆虫生息場所）でうまく
競争することが出来るように選択され、ポリペプチド殺
虫剤を表現する遺伝子の安定した保持及び表現を与え、
そして望ましくは環境に於ける分野及び不活性化から殺
虫剤を保護することを改良する。

多種多用の重要な作物のフィロプレイン（植物の葉の
表面）及び／又はリゾスフェア（植物の根のまわりの土
壌）に数多くの微生物が生息することが知られている。
これらの微生物には細菌、藻類、及び菌類が含まれる。
特に興味がもたれるのは、例えば細菌、例えばシュード
モナス、エルウィニア、セラチア、クレブシエラ、キサ
ントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Str
eptomyces）、リゾビウム、ロドシュードモナス、メチ
ロフィラス、アグロバクテリウム、アセトバクター、ラ
クトバシルス（Lactobacillus）、アルスロバクター（A
rthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイ
コノストク（Leuconostoc）、及びアルカリゲネス：菌
類、特に酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyce
s）、クロプトコッカス（Cryptococus）、クルイヴェロ
マイセス（Kluyveromyces）、スボロボロマイセス（Spo
robolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）、及びオー
レオバシディゥム（Aureobasidium）属の微生物であ
る。特に興味がもたれるのは、シュードモナスシリン
ガエ（syringae）、シュードモナスフルオレスセン
ス、セラチアマルセスセンス（marcescens）、アセト
バクタークシリウム（xylium）、アグロバクテリウム
テゥメファシエンス（tumefaciens）、ドロシュード
モナススフェロイデス（spheroides）、キサントモナ
スカンペストリス（campestris）、リゾビウムメリ
トティ（melioti）、アルカリゲネスエントロファス
（entrophus）、及びアゾトバクターヴィンランディ
ー（vinlandii）などのフィトスフェア細菌種：ロドト
ルラルプラ（rubra）、ロドトルラグルティニス
（ glutinis）、ロドトルラマリナ（marina）、ロド
トルラアウランティカ（aurantiaca）、クリプトコッ
カスアルビダス（albidus）、クリプトコッカスデ
ィフルエンス（diffluens）、クリプトコッカスロー
レンティー（laurentii）、サッカロミセスロゼイ（r
osei）、サッカロミセスプレトリエンシス（pretorie
nsis）、サッカロミセスセレヴィシアエ（cerevisia
e）、スポロボロマイセスロゼウス（roseus）、スポ
ロボロマイセスオドラス（odorus）、クルイヴェロマ
イセスヴェロナエ（veronae）、及びオーレオバシデ
ィゥムポルランス（Pollulans）などのフィトスフェ
ア酵母種である。特に興味がもたれるのは、染色される
微生物である。

毒素を表現するB.t.遺伝子を安定な保持及び遺伝子の
表現を可能とする条件下で微生物宿主に導入する多種多
様の方法が利用できる。毒素遺伝子の表現のための転写
及び翻訳制御シグナル、制御された下に於ける毒素遺伝
子、及びインテグレーションを生じさせる宿主生物の配
列と相同のDNA配列、及び／又はインテグレーション又
は安定な保持を生じさせる宿主中で機能できる複製系、
を含むDNA構築物を与えることが出来る。

転写開始信号は、プロモーター及び転写開始出発位置
を含んでいる。ある場合には毒素の調節的表現を与える
ことが望ましく、その場合毒素の表現は環境中に放出さ
れたときのみにおきる。これは微生物の物理的又は化学
的な環境の変化によって誘発を行なうことの出来るオペ
レーター、又はアクティベーター若しくはエンヘンサー
に対し結合している領域によって達成できる。例えば温
度感受性の制御領域を使用することが出来、ここでは生
物は毒素の表現なしに実験室中で生育されるが、環境に
放出されると表現が開始する。他の技術は実験室中に於
いて特定の毒性の表現を阻害する栄養培地を使用し、こ
こでは環境に於ける栄養培地は毒素の表現を可能にす
る。翻訳開始に対してはリボソーム結合位置及び開始コ
ドンが存在するであろう。

種々のマニピュレーションをメッセンジャーの表現を
強めるために使用することが出来、特に活性プロモータ
ーを使用すること並びにメッセンジャーRNAの安定性を
強める配列を用いることによって出来る。開始及び翻訳
停止領域は、ストップコドン、停止領域、及び任意付加
的にポリアデニル化信号を含むであろう。

翻訳方向に於いて、即ちコード又はセンス配列の５′
から３′への方向に於いて構築物は、もしあるならば転
写制御領域及び制御領域がプロモーターの５′又は３′
のいずれかであるプロモーター、リボソーム結合位置、
開始コドン、開始コドンと同調したオープンリーディ
ングフレーム（開始読み枠）を有する構造遺伝子、ス
トップコドン、もしあるならばポリアデニル化信号配
列、及びターミネーター領域を含むであろう。二重鎖と
してのこの配列はそれ自身微生物宿主の形質転換に使用
できるが、通常はマーカーを含んでいるDNA配列ととも
に含まれ、ここでは第二のDNA配列はDNAを宿主に導入す
る間に於いて毒素表現構築物と一緒になる。

マーカーというのは修飾又は形質転換された宿主の選
択を与える構造遺伝子という意図である。マーカーは通
常、選択的な利点、例えば殺生物抵抗、例えば抗生物質
に対する抵抗性又は重金属に対する抵抗性；無機栄養宿
主に対し、原栄養を与えるための相補性などの選択的な
利点を通常与える。好ましくは修飾された宿主が選択さ
れるのみならず、フィールドに於いて競争的でもあり得
るように相補性が用いられる。構築物の開発には並びに
宿主の修飾には、１又はそれ以上のマーカーを使用でき
る。生物は更にフィールド中の他の野性型の微生物に対
して競争的な利点を与えることによって修飾することが
出来る。例えば、金属キレート剤を表現する遺伝子、例
えばシデロフォア（siderophores）を毒素を表現する構
造遺伝子と共に宿主に導入できる。この方法ではシデロ
フォアの強められた表現が毒素生産宿主に対する競争的
な利点を与え、従ってこれは野性型の微生物と効果的に
競争出来、そして環境のニッチェを安定に占有すること
が出来る。

機能的な複製系が存在しない場合は、構築物は又少な
くとも50塩基対（bp）、好ましくは少なくとも100塩基
対、そして通常は約1000塩基対を越えない宿主の配列の
相同の配列を含む。この方法によって合法的な組み替え
の確立が強められ、従って遺伝子は宿主中に統合され、
安定に宿主によって保持される。望ましくは毒素遺伝子
は相補性を与える遺伝子並びに競争的な利点を与える遺
伝子に接近しているのが好ましい。従って毒素遺伝子が
失われた場合には生じる生物は、相補性の遺伝子及び／
又は競争的な利点を与える遺伝子を失う場合が多く、従
って無傷の構築物を保持している遺伝子と一緒には環境
中で競争するのに不安定である。

多数の翻訳制御領域が多様な微生物宿主から入手出
来、例えば細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリ
ア、藻類、菌類などから入手できる。種々の翻訳制御領
域は、trp遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及
び右プロモーター、Tacプロモーター、宿主中で機能的
である場合には毒素遺伝子と組み合わされている天然の
プロモーターを含んでいる。例えば、米国特許4,332,89
8、4,342,832及び4,356,270を参照。停止領域は二つの
領域が両立可能で宿主中で機能的である限りに於いて転
写開始領域又は異なる転写開始領域と通常関連すること
が出来る。

安定なエピゾームの保持又は統合化が望まれる場合に
は宿主中で機能する複製系を有しているプラスミドを用
いる。複製系はクロモソーム、宿主又は異なる宿主中に
通常存在するエピゾームエレメント又は宿主中で安定で
あるビールスからの複製系であり得る。pBR322、pACYC1
84、RSF1010、pRO1614などの多数のプラスミドが入手可
能である。例えばオルソン等、（1982）J.Bacteriol.15
0:6069、及びバグダサリアン等、（1981）Gene 16:23
7、及び米国特許4,356,270、4,362,817、及び4,371,625
を参照。

B.t.遺伝子は開始領域及び調節制御の下にあるように
転写及び翻訳開始領域と転写及び翻訳停止領域の間に導
入できる。この構築物はプラスミド中に含められ、この
プラスミドは少なくとも一つの複製系を含んでいるが、
１以上のものを含むことが出来、この場合一つの複製系
はプラスミドの開発の間クローニングに用いられ、第二
の複製系は最終的な宿主中で機能するのに必要である。
更に、１それ以上のマーカーが存在出来、これは前に述
べた。統合化が望まれるときにはプラスミドは宿主ゲノ
ムと相同の配列を含むのが望ましい。

形質転換体は慣用の方法に従って単離出来、通常は未
修飾の生物又は存在する場合には運搬する生物に対して
所望の生物が選択することが出来る選択技術を用いる。
形質転換体は、次に殺虫活性について試験される。

処理細胞が標的害虫の環境に適用されたときに細胞の
毒素活性を長引かせるように殺虫剤含有細胞が処理され
る場合には、適当な宿主細胞は原核生物又は真核生物の
いずれかを含むことが出来、通常は哺乳類などの高等生
物に毒性の物質を生産しない細胞に限定される。しかし
ながら高等生物に毒性の物質を生産する生物もその毒素
が不安定であるか、又は適用水準が哺乳類宿主への毒性
の可能性をすべて避け得るほど十分低い場合には使用す
ることが出来る。特に興味のある宿主としては原核細胞
及び低級真核細胞、例えば菌類である。原核細胞の例
は、グラム陰性菌及び陽性菌であり、エンテロバクテリ
アセアエ、例えばエセリキア、エルウィニア、シジェ
ラ、サルモネラ、及びプロテウス；バシラセアエ；リゾ
ビセアエ、例えばリゾビウム；スピリラセアエ、例えば
フォトバクテリウム、ジモモナス、セラチア、アエロモ
ナス、ヴィブリオ、デサルフォヴォブリオ、スピリリウ
ム；ラクトバシラセアエ；シュードモナセアエ、例えば
シュードモナス及びアセトバクター；アゾトバクテラセ
アエ及びニトロバクテラセアエが含まれる。真核生物の
中には菌類、例えば藻状菌及び子嚢菌があり、これには
酵母、例えばサッカロマイセス及びシゾサッカロマイセ
スが含まれ、担子菌酵母、例えばロドトルラ、オーレオ
バシディゥム、スポロボロマイセスなどがある。

生産の目的のための宿主細胞を選択するのに特に興味
のある特徴にはB.t.i.遺伝子を宿主に導入する容易さ、
表現系の入手しやすさ、表現の効率、宿主中の殺虫剤の
安定性、及び補助的な遺伝的能力の存在が含まれる。殺
虫剤ミクロカプセルとしての使用のための興味ある特徴
には、殺虫剤の保護的な性質、例えば厚い細胞壁、染色
性、及び細胞内パッケージ又は封入体の形成、葉への親
和性、哺乳類に対する毒性が無いこと、害虫が摂取する
魅力、毒素の破壊なしに殺虫及び固定の容易さなどが含
まれる。他の考慮点には処方の容易さ及び取り扱いの容
易さ、経済性、強い安定性などが含まれる。

特に興味のある宿主生物には酵母、例えばロドトルラ
の種、オーレオバシディゥムの種、サッカロマイセスの
種、及びスポロボロマイセスの種；フィロプレイン生
物、例えばシュードモナスの種、エルウィニアの種及び
フラヴォバクテリウムの種、又はエセリキア、ラクトバ
シルスの種、バシルスの種などの他の生物が含まれる。
特定生物にはシュードモナスアエルギノサ、シュード
モナスフルオレスセンス、サッカロマイセスセレヴ
ィシアエ、バシルスチューリンゲンシス、大腸菌、バ
シルススブティリスなどが含まれる。

細胞は通常無傷（細胞壁が破壊されていない）であ
り、場合によっては胞子も用いられるけれども処理され
るときは胞子形であるよりも実質的に増殖形である。

微生物細胞の処理、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する
微生物の処理は、化学的又は物理的手段によるものであ
ることが出来るか、又は化学的及び／又は物理的手段の
組み合わせであり得、この技術が毒素の性質に悪影響を
与えず、また毒素を保護する細胞の能力を消失させない
限り用いられ得る。化学剤の例は、ハロゲン化剤、特に
原子番号17〜80のハロゲンである。より詳しくは、所望
の結果を達成するために温和な条件下そして十分な時
間、ヨウ素を使用することが出来る。他の適当な技術に
はアルデヒド、例えばホルムアルデヒド及びグルタルア
ルデヒドでの処理、抗感染剤、例えばゼフィランクロ
ライド及びセチルピリジニウムクロライドでの処理、
アルコール、例えばイソプロピルアルコール及びエタノ
ールでの処理、種々の細胞固定剤、例えばボーイン固定
剤及びヘリー固定剤での処理（ヒューメイソン、グレッ
チェンエル．、アニマルティッシュテクニック、
ダブリュー．エッチ．フリーマンアンドカンパニ
ー、1967）、又は細胞が宿主動物に投与されるとき細胞
中で製造される毒素の活性を保持し、長期化する物理的
（熱）及び化学的薬剤の組み合わせが含まれる。物理的
手段の例は、短波長照射、例えばγ照射及びＸ線照射、
凍結、紫外線照射、凍結乾燥などである。

細胞は一般に強められた構造的安定性を有し、このこ
とは環境条件に対する抵抗を強める。殺虫剤がプロフォ
ーム（proform）である場合には、標的害虫病原体によ
るプロフォームから殺虫剤の成熟形態への過程を阻止し
ないように不活性方法は選ばれるべきである。例えばホ
ルムアルデヒドは蛋白質を架橋させ、ポリペプチド殺虫
剤のプロフォームの処理を阻害し得る。不活性化又は殺
菌方法は毒素の生物利用可能性又は生物活性の少なくと
も実質的な部分を保持する。

B.t.殺虫遺伝子を含有する細胞宿主は、DNA構築物が
選択的な利点を与え、実質的に全て、又は全ての細胞が
B.t.遺伝子を保持するように選択培地を与える任意の慣
用の栄養培地中で生育され得る。これらの細胞は次に慣
用の方法にしたがって収穫される。別の方法として細胞
は収穫前に処理できる。

B.t.細胞は種々の方法で処方できる。これらは水和粉
末、顆粒又は散剤として使用出来、種々の不活性物質、
例えば無機物質（フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩、
燐酸塩など）又は植物性物質（粉末化したトウモロコシ
の穂軸、籾殻、くるみの殻など）と混合することによっ
て使用することが出来る。処方物は展開粘着助剤、安定
化剤、他の殺虫添加物、又は表面活性剤を含み得る。液
体処方剤は水を基盤としたもの又は非水性のものであり
得、フォーム、ゲル、懸濁液、乳化可能な濃縮物などと
して使用できる。成分はレオロジー剤、表面活性剤、乳
化剤、分散剤、又は重合体を含有できる。

殺虫剤濃度は特定の処方剤の性質、特にそれが濃縮物
であるか又は直接使用されるかに依存して広く変化し得
る。殺虫剤は少なくとも１重量％で存在し、100重量％
であってもよい。乾燥処方剤は殺虫剤の約１〜95重量％
を有し得るが、一方液体処方剤は一般に液相中の約１〜
60重量％固体である。処方剤は一般に約10²〜約10⁴細胞
/mgを有する。これらの処方剤はヘクター当たり約50mg
（液体又は乾燥物）〜1kg又はそれ以上投与される。

処方剤は鱗翅類害虫の環境、例えば植物、土壌又は水
に対してスプレー、ダスト、ふりかけ、などにより適用
することが出来る。

以下は本発明の実施のため最良の態様を含む手順を例
示する実施例である。これらの実施例は限定するものと
解釈されるべきでない。全てのパーセントは他に記載さ
れていない限り重量であり、全ての溶媒混合物は容量割
合である。

〔実施例〕

実施例１−新規なハリブリッド毒素遺伝子の構築及びシ
ュードモナスフルオレスセンスへの形態転換出発ATG（即ち、出発メチオニン）ないしHindIII位置
までの全ての毒素をコードしたDNAを含んでいるバシル
スチューリンゲンシスvar.クルスタキHD−73遺伝子の
部分を、Tac−プロモートされたプラスミドpKK223-3
（ファルマシア）中に挿入した。これはpKK223-3中のリ
ボソーム結合位置から少し下流のこの遺伝子のブラント
融合を作ることによってなされた。これによってプラス
ミドpKK2が形成された。次に、B.t.のベルリナー（Berl
iner）系統からの毒素遺伝子の３′部分（DNA5:305-314
［1986］）をSacIからPstIへの断片としてpKK2/SacI＋P
stI中にクローン化し、このようにして新しいpKK73BB-9
と命名される新しいプラスミド中に組み替え毒素遺伝子
を作った。この遺伝子はSacI位置を越えた全ての配列
（３′から）に対しベルリナー（Berliner）起源のもの
であった（DNA5:305-314.1986）。

次に、pKK73BB-9をNsiIで開裂し、毒素DNAの内部部分
を開放し、細菌アルカリフォルファターゼで処理し、ゲ
ル精製し、NsiI末端と部分的HD73-様の毒素遺伝子断片
をサブクローン化するのに使用した。生じるプラスミド
はpKK1-73と呼ばれる。HD73-様の断片は、B.t.毒素に一
般的に見られる二つのNsiI位置の間の全てのDNA配列を
表わしている。次に、pKK1-73をTth111Iで開裂し、クレ
ノー（Klenow）断片プラスdNTPで処理してブラント末端
とし、BamH1に対しリンカーにし、BamH1で消化し、連結
し、形質転換し、スクリーニングし、部分的なテトラサ
イクリン遺伝子が欠失したプラスミドを見出した（pKK2
23-3に由来）。これによってプラスミドp1,123-1が生じ
た。プラスミドp1,123-1をPvuIで開裂し、手短にBa131
で処理し、クレノーでブラント末端にし、同様にブラン
ト末端化したテトラサイクリン抵抗性のpBR322からの遺
伝子をクローン化するのに使用した（地図部分はEcoR1
〜AvaI）。テトラサイクリン抵抗性のコロニーのスクリ
ーニングによって所望のプラスミドpl.130-6を生成し
た。このプラスミドをBamH1での部分的な消化によって
線形化し、ゲル精製し、pRO1614からの複製のBamH1末端
シュードモナス起源を受け入れるのに使用した。最終的
な結果はプラスミドpM2,16-11となった。

プラスミドpM2,16-11を標準の形質転換手順を用いて
シュードモナスフルオレスセンスを形質転換するのに
使用した。

上で議論したHD73-様のNsiI断片を次の様に構築し
た。HindIII-末端化部分的HD73遺伝子の３′末端にバシ
ルスチューリンゲンシスvar.クルスタキHD-1からクロ
ーン化されたHindIII〜NdeIベルリナー様毒素配列を加
えた。

上記のクローニング手順は、他に記載されていない限
り標準の手順を使用した。

プラスミドの製造及び宿主生物の形質転換に用いた種
々の方法は、この技術で良く知られている。これらの手
順は全てマニアティス，ティー．、フリッシュ．イー．
エフ．、及びサンブルック．ジェイ．（1982）Molecula
r Cloning:実験室手順，コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー，ニューヨークに記載されている。従
ってDNAを微生物細胞から抽出し、制限酵素消化を実施
し、DNA断片を電気泳動にかけ、テーリングしてプラス
ミド及び挿入DNAをアニーリングさせ、DNAを連結させ、
細胞を形質転換し、プラスミドDNAを製造し、蛋白質を
電気泳動にかけ、そしてDNAの配列を決定することは遺
伝子工学技術分野の当業者の成し得ることである。

本明細書に開示された制限酵素は、ベセスダリサーチ
ラボラトリーズ、ミッドランド州、ゲイサースバー
グ、又はニューイングランドバイオラブ、マサチュー
セッツ州、ベベリーから購入することが出来る。酵素は
供給者によって与えられた説明に従って使用した。

B.t.毒素遺伝子を含有しているプラスミドpM2,16-11
は、標準の良く知られた手順を用いることによって形質
転換された宿主微生物から除去できる。例えば、P.フル
オレスセンス（pM2,16-11）を透明化した溶菌物密度勾
配平衡手順にかけるなどしてpM2,16-11を回収する。

P.フルオレスセンス（pM2,16-11）のサブカルチャー
は1988年１月15日にアメリカ合衆国61604イリノイ州、
ペオリア、ノースユニバーシティストリート1815の
リージョナルリサーチセンター、アグリカルチュラ
ルリサーチサービスパテントカルチャーコレ
クション（NRRL）の永久寄託されている。この培養基に
は寄託所から寄託番号NRRL B-18292が与えられている。
この寄託物は開示している特許の付与に基づいて公衆に
入手可能となる。この寄託物はまた、この出願の対応物
又はその子孫出願が出願されている国に於いて外国特許
法に要求されるに従って入手可能である。しかしながら
寄託物が入手可能であることは、行政行為によって与え
られた特許権を損って本発明を実施する実施権を構成す
るものではない。

更にこの培養基寄託は微生物の寄託に対するブタペス
ト条約の条項に従って一般に保存されて入手可能とされ
る。即ち培養基はこれを生きた状態で汚染されないよう
に保つのに必要な全ての注意を払って寄託物の試料を提
供する要求の最も細菌のものから少なくとも５年間の期
間、そしてどんな場合にも培養基を開示して発行される
任意の特許の権利行使可能な寿命の間、又は寄託の後少
なくとも30年間の期間保存される。寄託者は寄託物の状
態のために寄託所が試料を要求されたときに提供するこ
とが出来ないことがあった場合に寄託物を取替える義務
を認めるものである。この培養基寄託の一般への入手可
能性の全ての制限は、寄託物を開示している特許が付与
されると永久に除かれる。

実施例２−毒素遺伝子を植物に挿入すること本明細書に開示されている新規な殺虫毒素のコードし
ている新規な遺伝子は、アクロバクタートゥメファシ
エンスからのTiプラスミドを用いて植物細胞に挿入する
ことが出来る。植物細胞を次に植物中に再生させる（ザ
ンブルスキー，ビー．、ジョーズ．エッチ．、ゲンテ
ロ，シー．、リーマン，ジェイ．、バンモンターグ，エ
ム．及びシェル，ジェイ．［1983］Cell 32:1033-104
3）。この点に関する特に有用なベクターはpEND4Kであ
る（クリー，エッチ．ジェイ．、ヤノフスキー，エム．
エフ．及びネスター，イー．ダブリュー．［1985］Bio/
Technology 3:637-642）。このプラスミドは、植物細胞
及び細菌中の両方で複製出来、パッセンジャー遺伝子に
対する複数のクローニング位置を有している。毒素遺伝
子は、例えばpEND4KのBamHIの位置に挿入出来、大腸菌
中で増殖され、適当な植物細胞に形質転換される。

実施例３−新規なハリブリッドバシルスチューリン
ゲンシス遺伝子のバキュロウィルス（Baculovirus）へ
のクローニング本発明の新規なハイブリッド遺伝子は、オートグラフ
ァーカルフォルニカ（Autographa californica）核ポ
リヘドロシスウィルス（AcNPV）などのバキュロウィ
ルスにクローン化出来る。pUC8などの市販のクローニン
グベクター中にクローン化されたAcNPVゲノムを含有し
ているプラスミドを構築できる。AcNPVゲノムはポリヘ
ドリン遺伝子のコーディング領域が除去され、そしてパ
ッセンジャー遺伝子に対する独特のクローニング位置が
ポリヘドリンプロモーターのすぐ後に位置されている
ように修飾される。そのようなベクターの例はペノック
等（ペノック，ジー，ディー．、シュエマーカー，シ
ー．及びミラー，エル．ケイ．［1984］Mol.Cell.Biol.
4:399-406）によって記載されたpGP-B6874及びスミス等
（スミス，ジー．イー，、サマーズ，エム．ディー．及
びフレーザー，エム．ジェイ．［1983］ Mol.Cell.Biol.3:2156-2165）により記載されたpAC380
である。本発明の新規な蛋白毒素に対し、コードしてい
る遺伝子はコーディング領域から上流及び下流の両方の
適当な領域に於いてBamHIリンカーで修飾することが出
来、AcNPVベクターの一つのパッセンジャー位置に挿入
される。

前に記載したように新規なB.t.毒素遺伝子をコードし
ているヌクレオチド配列は、表Ｉに示されている。推測
されたアミノ酸配列が表IIに示されている。

蛋白質のアミノ酸配列はDNAのヌクレオチド配列によ
り決定されることがこの技術でよく知られている。遺伝
子コードの冗長性のために、即ち１以上のコードしてい
るヌクレオチドトリプレット（コドン）が蛋白質を作
るアミノ酸のほとんどに使用できるので異なるヌクレオ
チド配列が一つの特定のアミノ酸に対し、コードし得
る。従って遺伝子コードは次の様に述べることが出来
る。

フェニルアラニン（Phe） TTK ロイシン（Leu） XTV イソロイシン（lle） ATM メチオニン（Met） ATG バリン（Val） GTL セリン（Ser） QRS プロリン（Pro） CCL スレオニン（Thr） ACL アラニン（Ala） GCL チロシン（Tyr） TAK 末端信号 TAJ ヒスチジン（His） CAK グルタミン（Gln） CAJ アスパラギン（Asn） AAK リジン（Lys） AAJ アスパラギン酸（Asp） GAK グルタミン酸（Glu） GAJ システイン（Cys） TGK トリプトファン（Trp） TGG アルギニン（Arg） WGZ グリシン（Gly） GGL キー：各々の３文字のデオキシヌクレオチドトリプレ
ットがmRNAのトリヌクレオチドであって、左に５′‐末
端を右に３′‐末端を有しているものに対応する。ここ
に与えられる全てのDNA配列は、その配列がmRNA配列に
対応する鎖のものであり、ウラシルがチミンに置き換え
られている。デオキシヌクレオチド配列を形成している
プリン又はピリミジンに対して次の文字で表わされる。

Ａ＝アデニンＧ＝グアニンＣ＝シトシンＴ＝チミンＸ＝ＹがＡ又はＧのときＴ又はＣＸ＝ＹがＣ又はＴであるならばＣＹ＝ＸがＣならばＡ、Ｇ、Ｃ又はＴＹ＝ＸがＴならばＡ又はＧＷ＝ＺがＡ又はＧならばＣ又はＡＷ＝ＺがＣ又はＴならばＣＺ＝ＷがＣならばＡ、Ｇ、Ｃ又はＴＺ＝ＷがＡならばＡ又はＧ QR＝ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴならばTC、又はQR＝ＳがＴ又はＣならばAG Ｊ＝Ａ又はＧＫ＝Ｔ又はＣＬ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧＭ＝Ａ、Ｃ又はＴ上記はB.t.毒素の新規なアミノ酸配列が蛋白質の同じ
アミノ酸配列をコードしている均等なヌクレオチド配列
によって製造できることを示している。従って本発明は
そのような均等なヌクレオチド配列も含む。更に同じ構
造のそして同じ機能の蛋白質は変化が蛋白質の二次構造
を変えないならば、アミノ酸配列を変更することによっ
て作ることが出来ることが示されている（カイザー，イ
ー．ティー．及びケズディー，エフ．ジェイ．［1984］
Science 223:249-255）。従って、本発明は蛋白質の二
次構造を変化しない本明細書に記載されてるアミノ酸配
列の突然変異体も又はもしも構造が変更されているなら
ば生物活性が或る程度保持されている突然変異体を含
む。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/15 8828−4Ｂ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:39）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下に示される式IIのアミノ酸配列を有するバシルスチューリンゲンシス（Bacillus thu
ringiensis＝B.t.）毒素をコードしたDNA。
【請求項２】以下に示される式Ｉのヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のDNA。
【請求項３】上記配列がストップコドンで停止している
請求項２の式Ｉに示されたヌクレオチド配列を有する請
求項１に記載のDNA。
【請求項４】請求項１の式IIに示されるアミノ酸配列を
有する、鱗翅類の昆虫に対して活性のある毒素。
【請求項５】請求項１の式IIに示されたアミノ酸配列に
対しコードするヌクレオチド配列を有するDNAを含んで
いる組み替えDNA運搬ベクター。
【請求項６】原核宿主又は真核宿主中に移され、そして
複製される請求項５に記載のDNA運搬ベクター。
【請求項７】請求項１の式IIに示されるアミノ酸配列を
有するB.t.毒素を発現するように形質転換された細菌宿
主。
【請求項８】請求項１の式IIに示されるアミノ酸配列を
有するB.t.毒素をコードするB.t.毒素遺伝子を含有する
プラスミドベクターで形質転換された請求項７に記載の
シュードモナスフルオレスセンス（Pseudomoas fluor
escens）。
【請求項９】請求項８に記載のシュードモナスフルオ
レスセンスであるNRRL B−18292の同定特性を有するシ
ュードモナスフルオレスセンス（pM2,16−11）。
【請求項１０】シュードモナス（Pseudomonas）、アゾ
トバクター（Azotobacter）、エルウィニア（Erwini
a）、セラチア（Serratia）、クレブシェラ（Klebsiell
a）、リゾビウム（Rhizobium）、ロドシュードモナス
（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophi
lius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセ
トバクター（Acetobacter）又はアルカリゲネス（Alcal
igenes）の種である請求項７に記載の微生物。
【請求項１１】上記微生物が色素を有し、そしてフィロ
プレイン（Phylloplane:葉の表面）に付着している請求
項10に記載の微生物。
【請求項１２】請求項10に記載の微生物を鱗翅類昆虫又
はその昆虫の環境に投与することからなる鱗翅類昆虫を
抑制する方法。
【請求項１３】上記投与がリゾスフェア（根のまわり）
になされる請求項12に記載の方法。
【請求項１４】上記投与がフィロプレイン（葉の表面）
になされる請求項13に記載の方法。
【請求項１５】投与が水の中になされる請求項12に記載
の方法。
【請求項１６】標的害虫の環境に適用されたときに長い
殺虫活性を有する実質的に無傷の処理された細胞を含ん
でいる殺虫剤を含み、上記殺虫剤が鱗翅類昆虫に毒性を
有するポリペプチドであり、細胞内部のものであって、
請求項Ｉの式IIに示されるアミノ酸配列を有するB.t.毒
素を発現する能力のある形質転換された微生物の発現の
結果生じるものである殺虫剤組成物。
【請求項１７】上記処理された細胞が、環境中で殺虫活
性を長期化させるために化学的又は物理的な手段で処理
されている請求項16に記載の殺虫組成物。
【請求項１８】上記細胞が、原子核細胞又は低級真核細
胞である請求項17に記載の殺虫組成物。
【請求項１９】上記原核細胞がエンテロバクテリアセア
エ（Enterobacteriaceae）、バシラセアエ（Bacillacea
e）、リゾビセアエ（Rhizobiaceae）、スピリラセアエ
（Spirillaceae）、ラクトバシラセアエ（Lactobacilla
ceae）、シュードモナダセアエ（Pseudomonadaceae）、
アゾトバクテラセアエ（Azotobacteraceae）及びニトロ
バクテラセアエ（Nitrobacteraceae）からなる群から選
ばれる請求項18に記載の殺虫組成物。
【請求項２０】上記低級真核細胞が双状菌類、子嚢菌
類、及び担子菌類からなる群から選ばれる請求項18に記
載の殺虫組成物。
【請求項２１】上記細胞が色素を有した細菌、酵母、又
は菌類（フンガス）である請求項16に記載の殺虫組成
物。
【請求項２２】請求項１の式IIに示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド毒素に対しコードする鱗翅類昆虫
に毒性を有するバシルスチューリンゲンシス毒素遺伝
子の発現の結果である細胞内の毒素を含有する処理され
た実質的に無傷の単細胞微生物細胞であって、この細胞
が標的昆虫の環境に適用されたときに長期化された殺虫
活性をもたらす条件下に処理されている細胞。
【請求項２３】細胞が環境中に於て殺虫活性を長期化さ
せるために化学的又は物理的手段で処理されている請求
項22に記載の細胞。
【請求項２４】上記微生物がシュードモナスであり、上
記毒素が請求項１の式IIに示されるアミノ酸配列を有す
るB.t.毒素である請求項22に記載の細胞。
【請求項２５】上記細胞がヨウ素で処理されたものであ
る請求項24に記載のシュードモナス細胞。
【請求項２６】シュードモナスフルオレスセンス（Ps
eudomonas fluorescedns）である請求項22に記載の細
胞。
【請求項２７】シュードモナスフルオレスセンス（Ps
eudomonas fluorescedns）（pM2,16−11）である、請求
項26に記載の細胞。