JPH0591883A - 新規な双翅類に活性の毒素をコードした新規なバシラス・チユーリンゲンシス遺伝子 - Google Patents
新規な双翅類に活性の毒素をコードした新規なバシラス・チユーリンゲンシス遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 双翅目昆虫類に対して有効な微生物又はこれ
を含む殺虫剤組成物の提供。 【構成】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓから双翅目昆虫類に対して活性のある毒素をコード
するＤＮＡの分離。これを含むプラスミドベクターによ
り形質転換した大腸菌その他の微生物。このようにして
得られた微生物自体またはこれを含む殺虫剤組成物。こ
の使用による上記昆虫類の防除法。
を含む殺虫剤組成物の提供。 【構成】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓから双翅目昆虫類に対して活性のある毒素をコード
するＤＮＡの分離。これを含むプラスミドベクターによ
り形質転換した大腸菌その他の微生物。このようにして
得られた微生物自体またはこれを含む殺虫剤組成物。こ
の使用による上記昆虫類の防除法。
Description
【産業上の利用分野】本発明は双翅目に対して活性のあ
る毒素をコードした新規なバシラス・チューリンゲンシ
ス(Bacillus thuringiensis)遺伝子に関する。
る毒素をコードした新規なバシラス・チューリンゲンシ
ス(Bacillus thuringiensis)遺伝子に関する。
【従来の技術】バシラス・チューリンゲンシス(B.t.)は
δ-エンドトキシンと命名される昆虫毒素を生産する。
これはB.t.胞子形成細胞によって合成される。この毒素
は感受性のある昆虫の幼虫によって結晶型で摂取される
と、昆虫の腸液プロテアーゼによって生物学的に活性の
部分に転換される。一次目標は昆虫の腸上皮細胞であ
り、これが急速に破壊される。B.t.の報告された活性ス
ペクトルは、鱗翅目（Lepidoptera）と鞘翅目（Coleo-p
tera）内の昆虫種を包含し、その多くは農林業の主要害
虫である。活性スペクトルはまた、蚊とブヨを含む双翅
目(Diptera)の昆虫を包含している。コウチ・ティー・
エル(Couch, T.L.)(1980年)「バシラス・チューリンゲン
シス・バラエティ・イスラエレンシス(B.thuringi-ensi
s var. israelensis)の蚊病原性」Developments in Ind
ustrial Microbiology (工業微生物学の発展)22巻61-76
頁；ビーグル・シー・シー(Beegle, C.C.)(1978年)「農
業生態系における昆虫体内細菌の使用」Developments i
n Industrial Microbiology (工業微生物学の発展)20巻
97-104頁を参照のこと。
δ-エンドトキシンと命名される昆虫毒素を生産する。
これはB.t.胞子形成細胞によって合成される。この毒素
は感受性のある昆虫の幼虫によって結晶型で摂取される
と、昆虫の腸液プロテアーゼによって生物学的に活性の
部分に転換される。一次目標は昆虫の腸上皮細胞であ
り、これが急速に破壊される。B.t.の報告された活性ス
ペクトルは、鱗翅目（Lepidoptera）と鞘翅目（Coleo-p
tera）内の昆虫種を包含し、その多くは農林業の主要害
虫である。活性スペクトルはまた、蚊とブヨを含む双翅
目(Diptera)の昆虫を包含している。コウチ・ティー・
エル(Couch, T.L.)(1980年)「バシラス・チューリンゲン
シス・バラエティ・イスラエレンシス(B.thuringi-ensi
s var. israelensis)の蚊病原性」Developments in Ind
ustrial Microbiology (工業微生物学の発展)22巻61-76
頁；ビーグル・シー・シー(Beegle, C.C.)(1978年)「農
業生態系における昆虫体内細菌の使用」Developments i
n Industrial Microbiology (工業微生物学の発展)20巻
97-104頁を参照のこと。
【課題を解決する手段】本発明は、双翅目に活性のある
毒素をコードした新規なバシラス・チューリンゲンシス
（B.t.）遺伝子に関する。本発明の新規な遺伝子は、バ
シラス・チューリンゲンシス・バラエティ・モリソニPS
71M3（B.t.PS71M3）として本明細書で知られる新規なB.
t.分離体から単離される。本発明の新規な遺伝子によっ
てコードされた毒素は、２４時間後、ネッタイシマカ
（Aedes aegypti）とイエカ（Culexpi-piens）の100％
致死率を示した。本発明の遺伝子は、以下の特性をもっ
たB.t.PS71M3から得られる。 B.t.PS71M3 集落形態 -- B.t.に典型的大集落、表面はくすんでいる。 増殖期の細胞形態 -- B.t.に典型的。 鞭毛の血清型 -- 8a8b, モリソニ。 細胞内封入体 -- 非晶質。 アルカリ可溶性蛋白質(SDS-PAGE) -- 144,999 ≒130,000 67,000 27,000 B.t.PS71M3は、実施例６に明らかにされたように、B.t.
PS71M3-69（NRRL B-18515）から得られた。本発明の遺
伝子によってコードされた毒素は、試験されたすべての
蚊を殺す。ヤブカ属のネッタイシマカ(Aedes aegypti)
とアエデス・ドルサリス(Aedes dor-salis)；ハマダラ
カ属のアノフェレス・アルボマニス(Anopheles alboman
is)；イエカ属のクレックス・ピピエンス・キンケファ
シアツス(Culex pipiens quin-quefasciatus)とクレッ
クス・タルサリス(Culex tarsalis)に対して生物検定を
行なった。 生物検定手順： 毒素希釈液を小さなカップ中の水に加
える。第四齢の幼虫を加える。致死率を４８時間後に読
み取る。 本発明の培養基は次のとおりである。培養基 寄託番号 寄託期日 大腸菌(MN522)(pMYC1625) NRRL B-18644 1990年4月6日 大腸菌(MN522)(pMYC1636) NRRL B-18693 1990年8月3日 バシラス・チューリンゲンシスPS71M3-69 NRRL B-18515 1989年6月29日 培養基は、61604合衆国イリノイ州ピオリア、ノース・
ユニバーシティ・ストリート1815番地、北部研究センタ
ー、農業研究サービス特許培養基保存施設(NRRL)に寄託
された。本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下に
権限があると特許庁長官に認められた者が本特許出願の
係属中に培養基を入手できることを保証されているとい
う条件の下に寄託された。また、本出願又はその子孫の
対応特許出願が提出されている国々の特許法で要求され
るなら、寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入手で
きるからといって、行政行為によって付与された特許権
を損わしめて本発明を実施する権利を構成するものでは
ないことを理解すべきである。更に、本培養基寄託物
は、ブタペスト微生物寄託条約の規定に従って保存さ
れ、一般の人々に入手可能とされる。すなわち、寄託物
の試料提供に対する最も最近の請求後少なくとも5年
間、かつどんな場合も、寄託期日から少なくとも30年間
か、又は培養基を開示して発行される特許の権利行使可
能な期間中、これらの寄託物は、生育可能で汚染されて
いない状態に保つために必要なあらゆる配慮をもって保
存される。要求を受けた受託施設が、寄託物の状態のた
めに試料を供給できない場合には、寄託者は寄託物を補
充する義務を認めるものである。本培養基寄託物の一般
への入手可能性に関するすべての制限は、これらを開示
した特許の付与に際して永久に取り除かれる。本発明の
毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入できる。毒
素遺伝子の表現は、直接又は間接に殺虫剤の細胞内生産
と保持をもたらす。適当なホスト、例えばシュードモナ
スの場合、微生物は双翅目昆虫発生位置に施用される
と、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結果、望ん
でいない昆虫を防除できる。その代わりに、毒素遺伝子
をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の活性を持
続させるような条件下に処理できる。次に処理細胞を目
標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.毒素の毒
性を保持している。B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを
経て微生物ホストへ導入されて、このホストが生きてい
る状態で環境へ施用される場合に、あるホスト微生物を
使用することが必須である。微生物ホストは、一つ以上
の重要作物の「植物領域」(葉面、葉領域、根領域、及び/
又は根表面)を占有することが知られたものを選択す
る。これらの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生
息地）中で野性型微生物とうまく競合できるように選ば
れ、ポリペプチド殺虫剤を表現させる遺伝子の安定な維
持と表現を提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的分
解と不活性化からの改良された保護を提供する。広範囲
の重要作物の葉面(植物の葉の表面)と根の領域(植物の
根の周囲の土壌)に生息する多数の微生物が知られてい
る。これらの微生物は細菌、藻類及び(真)菌類(fungi)
を包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばバ
シラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、エ
ルウィニア(Erwinia)、セラティア(Serratia)、クレブ
シェラ(Klebsiella)、キサントモナス(Xanthomonas)、
ストレプトミセス(Streptomyces)、リゾビウム(Rhizobi
um)、ロードシュードモナス(Rhodopseudomonas)、メチ
ロフィリウス(Methylophilius)、アグロバクテリウム(A
grobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)、乳酸杆
菌(Lactobacillus)、アースロバクター(Arthrobacte
r)、アゾトバクター(Azotobacter)、リューコノストッ
ク(Leuconostoc)、又はアルカリゲネス(Alcaligenes)属
の細菌；(真)菌類(fungi)、特に酵母、例えばサッカロ
ミセス(Saccharomyces)、クリプトコッカス(Cryptococc
us)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、スポロボロミ
セス(Sporobolomyces)、ロードトルラ(Rhodotorula)、
及びオーレオバシジウム(Aureobasidium)属などの微生
物である。特に重要なものは、シュードモナス・シリン
ガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フルオ
レッセンス、セラティア・マルセスケンス(Serratia ma
rcescens)、アセトバクター・キシリヌム(Acetobacter
xylinum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agr
obacterium tumefaciens)、ロードシュードモナス・ス
フェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサン
トモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestri
s)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium melioti)、アル
カリゲネス・エントロフス(Alcaligenes entrophus)、
及びアゾトバクター・ヴィンランディ(Azotobacter vin
landii)のような植物領域の細菌種；及びロードトルラ
・ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルチニス(R. gluti
nis)、R.マリーナ(R. marina)、R.オーランティアカ(R.
aurantiaca)、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptoco
ccus albidus)、C.ジフルエンス(C. diffluens)、C.ロ
ーレンティ(C. laurentii)、サッカロミセス・ロゼイ
(S. rosei)、S.プレトリエンシス(S. pretoriensis)、
S.セレビシエ(S. cerevisiae)、スポロボロミセス・ロ
ゼウス(Sporobolomyces roseus)、S.オドルス(S. odoru
s)、クルイベロミセス・ヴェローナエ(Kluyveromyces v
eronae)及びオーレオバシジウム・ポルランス(Aureobas
idium pollulans)のような植物領域の酵母種である。特
に重要なのは有色素微生物である。遺伝子の安定な保持
と表現を可能とするような条件下に、毒素を表現させる
B.t.遺伝子を微生物ホストに導入するには、さまざまな
方法を利用できる。毒素遺伝子表現用の転写翻訳調節信
号とその調節制御下の毒素遺伝子、及び組込みを行なう
ためのホスト生物内の配列と相同のDNA配列、また組込
みや安定な保持が起こるための、ホスト内で機能的な複
製系などを含んだDNA構造体を用意することができる。
転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含し
よう。ある場合には、毒素の調節的表現を提供して、毒
素の表現が環境への放出後にのみ生ずるようにするのが
望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチベ
ータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき、
これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によって
誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用する
と、生物は毒素を表現せずに実験室で生育でき、環境へ
放出されると表現が始まる。他の手法は、実験室で毒素
の表現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境
中での栄養培地は毒素表現を可能とするものを使用でき
る。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドンが
存在しよう。メッセンジャーRNAの安定性を強化する配
列を使用すると共に、特に活性プロモータを使用してメ
ッセンジャーＲＮＡの表現を強化するために種々の操作
を使用できる。転写及び翻訳終結領域は停止コドン、終
結領域、及び任意にポリアデニル化信号を包含しよう。
内膜を経由する蛋白の分泌を促進するために、翻訳され
たポリペプチド配列のアミノ末端に疎水性「リーダー」
配列を使用できる。転写の方向、すなわちコーディング
又はセンス配列の5'から3'への方向で、構造体は転写調
節領域(これがある場合)とプロモータ（制御領域はプロ
モータの5'又は3'のいずれかにある)、リボゾーム結合
位置、開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠
をもった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号
配列(使用する場合)、及び終結領域を包含しよう。二本
鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ホストの転写に使
用できるが、通常マーカーを含めたDNA配列を伴ってお
り、この第二のDNA配列はホストへのDNA導入中に毒素表
現構造体に結合させることができる。マーカーとは、変
更又は形質転換されたホストの選定を行なうための構造
遺伝子のことである。マーカーは通常、選択的利点を提
供するもので、例えば抗生物質や重金属への耐性などの
殺生物剤耐性や、栄養素要求ホストに原栄養性を与える
相補性を提供する。変更されたホストが選定されるだけ
でなく、野外で競合的であるように、相補性を使用する
のが好ましい。構造体の開発に、またホストの変更に、
一つ以上のマーカーを使用できる。野外で他の野性型微
生物に対する競合的利点を提供することによって、生物
を更に変更できる。例えば、金属キレート剤、例えばシ
デロフォア類の表現用遺伝子を、毒素表現用の構造遺伝
子と一緒にホストへ導入できる。この方法で、シデロフ
ォアの強化された表現が毒素生産ホストに競合的利点を
提供するため、ホストは野性型微生物と効果的に競合
し、環境中で安定した生態的地位を占めるようになる。
機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも50塩基対(bp)、好ましくは少
なくとも約100bp、及び通常約1,000 bpまでの配列を包
含しよう。こうして合法的な組換えの可能性が強化され
るため、遺伝子はホストへ組込まれ、ホストによって安
定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子
並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接しているのが
望ましい。従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる
生物は相補性遺伝子及び/又は競合的利点を提供する遺
伝子も失う可能性が強く、このため無傷の構造体を保持
している遺伝子と環境中で競合できなくなる。細菌、バ
クテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、カビ等の
ような広範囲の微生物ホストから多数の転写調節領域が
入手できる。種々の転写調節領域は、trp遺伝子、lac遺
伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモータ、Tacプロ
モータ、及びホスト中で機能的な場合は毒素遺伝子と関
連して天然に生ずるプロモータを包含する。例として合
衆国特許第4,332,898号、第4,342,832号及び第4,356,27
0号を参照のこと。終結領域は、普通は転写開始領域又
は別の転写開始領域(二つの領域がホスト内で適合的で
機能的である限りにおいて)と関連する終結領域であり
うる。安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合
は、ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使
用されよう。複製系は染色体、ホスト又は異なるホスト
内に通常存在するエピゾーム要素から、又はホスト内で
安定なウイルスの複製系から誘導される。pBR322、pACY
C184、RSF1010、pRO1614等のような多数のプラスミドが
入手できる。例として、オルソン(Olson)ら、(1982年)
J. Bacteriol.150巻6069頁、及びバグダサリアン(Bagda
sarian)ら、(1981年) Gene 16巻237頁、並びに合衆国特
許第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号
を参照のこと。B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にあ
るように、転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間
に導入できる。この構造体はプラスミドに含有され、プ
ラスミドは少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ
以上を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの
開発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最
終ホストでの機能発揮に必要である。更に、すでに述べ
た一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが
望ましい。形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物
が存在する時は、それらに対して所望生物を選定できる
ように、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離で
きる。次に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
処理細胞を目標害虫環境に施用する時に細胞内毒素の活
性を持続させるために、殺虫剤含有細胞を処理するのに
適したホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含する
が、通常、哺乳類のような高等動物に有毒な物質を生じ
ない細胞に限定される。しかし、毒素が不安定か、哺乳
類ホストへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施
用水準である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる
生物も使用できる。ホストとして特に興味あるものは、
原核生物と、カビのような低級真核生物である。グラム
陰性・陽性双方の原核生物の例はエシェリキア(Escheri
chia)、エルウィニア(Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サ
ルモネラ(Salmonella)及びプロテウス(Proteus)のよう
な腸内細菌科(Enterobacteriaceae)；バシラス科(Bacil
laceae)；リゾビウム(Rhizobium)のようなリゾビウム科
(Rhizobiaceae)；発光細菌、ジモモナス(Zymomonas)、
セラティア(Serratia)、アエロモナス(Aeromonas)、ビ
ブリオ(Vibrio)、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)、
スピリルム(Spirillum)のようならせん菌科；乳酸かん
菌科;シュードモナス(Pseudomonas)及びアセトバクター
(Acetobacter)のようなシュードモナス科；アゾトバク
ター科、放線菌科(Actinomycetales)及びニトロバクタ
ー科を包含する。真核生物には藻菌類(Phycomycetes)と
子のう菌類(Ascomycetes)のような菌類があり、これは
サッカロミセス(Saccharomyces)とシゾサッカロミセス
(Schizosaccharomyces)のような酵母、ロードトルラ(Rh
odotorula)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、ス
ポロボロミセス(Sporobolomyces)のような担子菌類(Bas
idiomycetes)酵母を包含する。 生産目的のためにホス
ト細胞を選択する上で特に重要な特性は、B.t.遺伝子の
ホストへの導入の容易さ、表現系の入手性、表現効率、
ホスト中の殺虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在
を包含する。殺虫剤ミクロカプセルとして使用するのに
重要な特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケ
ージング又は封入体の細胞内パッケージング又は形成の
ような殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；
害虫に摂取させるための誘引力；毒素に損害を与えない
殺菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処
方と取扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。特
に重要なホスト生物は、ロードトルラの種、オーレオバ
シジウムの種、サッカロミセスの種、スポロボロミセス
の種のような酵母；シュードモナスの種、エルウィニア
の種、及びフラボバクテリウムの種のような葉面に生息
する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌の種、バシラス
の種、ストレプトミセスの種等の他の生物を包含する。
特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ(Pseud
omonasaeruginosa)、シュードモナス・フルオレッセン
ス(P.fluorescens)、サッカロミセス・セレビシエ(Sacc
haromyces cerevisiae)、バシラス・チューリンゲンシ
ス、大腸菌、枯草菌(B.subtilis)、ストレプトミセス・
リビダンス(Streptomyces lividans)を包含する。細胞
は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実質的に
増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用できる。微生
物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物の処理
は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒素を保
護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は物理的
手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合わせに
よる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子番号17
-80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ素を温
和な条件下に、所望の結果を達成するのに十分な時間に
使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒドとグ
ルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼフィラ
ンと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤；イソプ
ロピルアルコールとエタノールのようなアルコール類；
ルゴールヨウ素、ブアン固定剤、及びヘリー固定剤［フ
マソン(Humason)、グレッチェン・エル(Gretch-en, L.)
「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、
1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での
処理；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞中につ
くられる毒素の活性を保存し、持続させるような物理的
処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。
物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長
放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。一般に細胞
は、環境条件に対する耐性を強化するような、強化され
た構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプロ型の場合
は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型へ
の加工を抑制しないように、不活性化方法を選定すべき
である。例えばホルムアルデヒドはタンパクを架橋し、
プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制しうる。不活性
化ないし殺虫方法は、毒素の少なくとも実質量の生物学
的利用率又は生物活性を保持する。B.t.殺虫剤遺伝子を
含有する細胞ホストは任意慣用の栄養培地で生育できる
が、ＤＮＡ構造体は選択的利点を提供するため、細胞の
全量又は実質的全量がB.t.遺伝子を保持するように選択
培地となる。次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り
入れる。その代わりに、細胞を取り入れる前に処理する
こともできる。B.t.細胞を種々の方法で処方できる。こ
れらを無機鉱物(フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸
塩等)又は植物材料(粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、ク
ルミ殻等)と混合することにより、水和剤、粒剤又は粉
剤として使用できる。処方剤は展粘着助剤、安定化剤、
その他殺虫添加物、又は表面活性剤を包含できる。液体
処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フォーム、
ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成分は流動
剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含でき
る。殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮液か直接
使用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少な
くとも1重量%で存在し、100重量%でありうる。乾燥処方
剤は約1-95重量%の殺虫剤をもつが、液体処方剤は一般
に約1-60重量%の固体を液相中にもつであろう。処方剤
は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞をもつであ
ろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約50 mg(液体
又は乾燥)ないし1 kg以上の率で投与されよう。処方剤
は双翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水に噴霧、
散布、散水等によって施用できる。B.t.PS71M3の突然変
異株は、この技術で周知の手順によってつくることがで
きる。例えば、非胞子形成変異株はB.t.PS71M3のエチル
メタンスルホネート（EMS）突然変異誘発によって得ら
れる。また、この技術で周知の手順により、紫外線及び
ニトロソグアニジンを用いて突然変異株をつくることが
できる。小さな割合の非胞子形成突然変異株は無傷にと
どまり、長期の発酵のあいだ溶菌しない。これらの菌株
は溶菌マイナス（-）と指定される。溶菌マイナス菌株
は振とうフラスコの培地中で非胞子形成変異株を検査
し、発酵の終りにまだ無傷で毒素結晶を含有する突然変
異株を選定することによって確認できる。溶菌マイナス
菌株は、保護されカプセル封入された毒素蛋白を生ずる
ような細胞固定化法に適している。上記の非胞子形成変
異株のファージ耐性変種をつくるには、ファージ溶菌液
のアリコートを栄養寒天上に広げ、乾燥させる。ファー
ジ感受性菌株のアリコートを乾燥した溶菌上に直接プレ
ートし、乾燥させる。プレートを30℃で培養する。プレ
ートを２日間培養し、この時点で多数の集落が寒天上に
生育しているのを観察できる。これらの集落の幾つかを
取り上げ、栄養寒天プレート上で二次培養する。これら
の明白な耐性培養基をファージ溶菌液との交差線条接種
によって耐性について試験する。ファージ溶菌液の１本
の線をプレート上に線条接種し、乾燥させる。次に、推
定上の耐性培養基をファージ線に交差するように線条接
種する。耐性菌の培養基は、30℃で一夜培養後、ファー
ジ線に交差する線条のどこでも溶菌を示さない。次に、
ファージ耐性は、栄養寒天プレート上に耐性培養基を一
面にプレートすることによって再確認される。陽性対照
として役立たせるため、感受性菌株も同様にプレートす
る。乾燥後、ファージ溶菌液の一滴をプレート中心部に
撒き、乾燥させる。耐性培養基は、30℃で24時間培養
後、ファージ溶菌液を置いた場所で溶菌を示さなかっ
た。
毒素をコードした新規なバシラス・チューリンゲンシス
（B.t.）遺伝子に関する。本発明の新規な遺伝子は、バ
シラス・チューリンゲンシス・バラエティ・モリソニPS
71M3（B.t.PS71M3）として本明細書で知られる新規なB.
t.分離体から単離される。本発明の新規な遺伝子によっ
てコードされた毒素は、２４時間後、ネッタイシマカ
（Aedes aegypti）とイエカ（Culexpi-piens）の100％
致死率を示した。本発明の遺伝子は、以下の特性をもっ
たB.t.PS71M3から得られる。 B.t.PS71M3 集落形態 -- B.t.に典型的大集落、表面はくすんでいる。 増殖期の細胞形態 -- B.t.に典型的。 鞭毛の血清型 -- 8a8b, モリソニ。 細胞内封入体 -- 非晶質。 アルカリ可溶性蛋白質(SDS-PAGE) -- 144,999 ≒130,000 67,000 27,000 B.t.PS71M3は、実施例６に明らかにされたように、B.t.
PS71M3-69（NRRL B-18515）から得られた。本発明の遺
伝子によってコードされた毒素は、試験されたすべての
蚊を殺す。ヤブカ属のネッタイシマカ(Aedes aegypti)
とアエデス・ドルサリス(Aedes dor-salis)；ハマダラ
カ属のアノフェレス・アルボマニス(Anopheles alboman
is)；イエカ属のクレックス・ピピエンス・キンケファ
シアツス(Culex pipiens quin-quefasciatus)とクレッ
クス・タルサリス(Culex tarsalis)に対して生物検定を
行なった。 生物検定手順： 毒素希釈液を小さなカップ中の水に加
える。第四齢の幼虫を加える。致死率を４８時間後に読
み取る。 本発明の培養基は次のとおりである。培養基 寄託番号 寄託期日 大腸菌(MN522)(pMYC1625) NRRL B-18644 1990年4月6日 大腸菌(MN522)(pMYC1636) NRRL B-18693 1990年8月3日 バシラス・チューリンゲンシスPS71M3-69 NRRL B-18515 1989年6月29日 培養基は、61604合衆国イリノイ州ピオリア、ノース・
ユニバーシティ・ストリート1815番地、北部研究センタ
ー、農業研究サービス特許培養基保存施設(NRRL)に寄託
された。本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下に
権限があると特許庁長官に認められた者が本特許出願の
係属中に培養基を入手できることを保証されているとい
う条件の下に寄託された。また、本出願又はその子孫の
対応特許出願が提出されている国々の特許法で要求され
るなら、寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入手で
きるからといって、行政行為によって付与された特許権
を損わしめて本発明を実施する権利を構成するものでは
ないことを理解すべきである。更に、本培養基寄託物
は、ブタペスト微生物寄託条約の規定に従って保存さ
れ、一般の人々に入手可能とされる。すなわち、寄託物
の試料提供に対する最も最近の請求後少なくとも5年
間、かつどんな場合も、寄託期日から少なくとも30年間
か、又は培養基を開示して発行される特許の権利行使可
能な期間中、これらの寄託物は、生育可能で汚染されて
いない状態に保つために必要なあらゆる配慮をもって保
存される。要求を受けた受託施設が、寄託物の状態のた
めに試料を供給できない場合には、寄託者は寄託物を補
充する義務を認めるものである。本培養基寄託物の一般
への入手可能性に関するすべての制限は、これらを開示
した特許の付与に際して永久に取り除かれる。本発明の
毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入できる。毒
素遺伝子の表現は、直接又は間接に殺虫剤の細胞内生産
と保持をもたらす。適当なホスト、例えばシュードモナ
スの場合、微生物は双翅目昆虫発生位置に施用される
と、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結果、望ん
でいない昆虫を防除できる。その代わりに、毒素遺伝子
をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の活性を持
続させるような条件下に処理できる。次に処理細胞を目
標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.毒素の毒
性を保持している。B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを
経て微生物ホストへ導入されて、このホストが生きてい
る状態で環境へ施用される場合に、あるホスト微生物を
使用することが必須である。微生物ホストは、一つ以上
の重要作物の「植物領域」(葉面、葉領域、根領域、及び/
又は根表面)を占有することが知られたものを選択す
る。これらの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生
息地）中で野性型微生物とうまく競合できるように選ば
れ、ポリペプチド殺虫剤を表現させる遺伝子の安定な維
持と表現を提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的分
解と不活性化からの改良された保護を提供する。広範囲
の重要作物の葉面(植物の葉の表面)と根の領域(植物の
根の周囲の土壌)に生息する多数の微生物が知られてい
る。これらの微生物は細菌、藻類及び(真)菌類(fungi)
を包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばバ
シラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、エ
ルウィニア(Erwinia)、セラティア(Serratia)、クレブ
シェラ(Klebsiella)、キサントモナス(Xanthomonas)、
ストレプトミセス(Streptomyces)、リゾビウム(Rhizobi
um)、ロードシュードモナス(Rhodopseudomonas)、メチ
ロフィリウス(Methylophilius)、アグロバクテリウム(A
grobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)、乳酸杆
菌(Lactobacillus)、アースロバクター(Arthrobacte
r)、アゾトバクター(Azotobacter)、リューコノストッ
ク(Leuconostoc)、又はアルカリゲネス(Alcaligenes)属
の細菌；(真)菌類(fungi)、特に酵母、例えばサッカロ
ミセス(Saccharomyces)、クリプトコッカス(Cryptococc
us)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、スポロボロミ
セス(Sporobolomyces)、ロードトルラ(Rhodotorula)、
及びオーレオバシジウム(Aureobasidium)属などの微生
物である。特に重要なものは、シュードモナス・シリン
ガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フルオ
レッセンス、セラティア・マルセスケンス(Serratia ma
rcescens)、アセトバクター・キシリヌム(Acetobacter
xylinum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agr
obacterium tumefaciens)、ロードシュードモナス・ス
フェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサン
トモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestri
s)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium melioti)、アル
カリゲネス・エントロフス(Alcaligenes entrophus)、
及びアゾトバクター・ヴィンランディ(Azotobacter vin
landii)のような植物領域の細菌種；及びロードトルラ
・ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルチニス(R. gluti
nis)、R.マリーナ(R. marina)、R.オーランティアカ(R.
aurantiaca)、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptoco
ccus albidus)、C.ジフルエンス(C. diffluens)、C.ロ
ーレンティ(C. laurentii)、サッカロミセス・ロゼイ
(S. rosei)、S.プレトリエンシス(S. pretoriensis)、
S.セレビシエ(S. cerevisiae)、スポロボロミセス・ロ
ゼウス(Sporobolomyces roseus)、S.オドルス(S. odoru
s)、クルイベロミセス・ヴェローナエ(Kluyveromyces v
eronae)及びオーレオバシジウム・ポルランス(Aureobas
idium pollulans)のような植物領域の酵母種である。特
に重要なのは有色素微生物である。遺伝子の安定な保持
と表現を可能とするような条件下に、毒素を表現させる
B.t.遺伝子を微生物ホストに導入するには、さまざまな
方法を利用できる。毒素遺伝子表現用の転写翻訳調節信
号とその調節制御下の毒素遺伝子、及び組込みを行なう
ためのホスト生物内の配列と相同のDNA配列、また組込
みや安定な保持が起こるための、ホスト内で機能的な複
製系などを含んだDNA構造体を用意することができる。
転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含し
よう。ある場合には、毒素の調節的表現を提供して、毒
素の表現が環境への放出後にのみ生ずるようにするのが
望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチベ
ータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき、
これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によって
誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用する
と、生物は毒素を表現せずに実験室で生育でき、環境へ
放出されると表現が始まる。他の手法は、実験室で毒素
の表現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境
中での栄養培地は毒素表現を可能とするものを使用でき
る。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドンが
存在しよう。メッセンジャーRNAの安定性を強化する配
列を使用すると共に、特に活性プロモータを使用してメ
ッセンジャーＲＮＡの表現を強化するために種々の操作
を使用できる。転写及び翻訳終結領域は停止コドン、終
結領域、及び任意にポリアデニル化信号を包含しよう。
内膜を経由する蛋白の分泌を促進するために、翻訳され
たポリペプチド配列のアミノ末端に疎水性「リーダー」
配列を使用できる。転写の方向、すなわちコーディング
又はセンス配列の5'から3'への方向で、構造体は転写調
節領域(これがある場合)とプロモータ（制御領域はプロ
モータの5'又は3'のいずれかにある)、リボゾーム結合
位置、開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠
をもった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号
配列(使用する場合)、及び終結領域を包含しよう。二本
鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ホストの転写に使
用できるが、通常マーカーを含めたDNA配列を伴ってお
り、この第二のDNA配列はホストへのDNA導入中に毒素表
現構造体に結合させることができる。マーカーとは、変
更又は形質転換されたホストの選定を行なうための構造
遺伝子のことである。マーカーは通常、選択的利点を提
供するもので、例えば抗生物質や重金属への耐性などの
殺生物剤耐性や、栄養素要求ホストに原栄養性を与える
相補性を提供する。変更されたホストが選定されるだけ
でなく、野外で競合的であるように、相補性を使用する
のが好ましい。構造体の開発に、またホストの変更に、
一つ以上のマーカーを使用できる。野外で他の野性型微
生物に対する競合的利点を提供することによって、生物
を更に変更できる。例えば、金属キレート剤、例えばシ
デロフォア類の表現用遺伝子を、毒素表現用の構造遺伝
子と一緒にホストへ導入できる。この方法で、シデロフ
ォアの強化された表現が毒素生産ホストに競合的利点を
提供するため、ホストは野性型微生物と効果的に競合
し、環境中で安定した生態的地位を占めるようになる。
機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも50塩基対(bp)、好ましくは少
なくとも約100bp、及び通常約1,000 bpまでの配列を包
含しよう。こうして合法的な組換えの可能性が強化され
るため、遺伝子はホストへ組込まれ、ホストによって安
定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子
並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接しているのが
望ましい。従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる
生物は相補性遺伝子及び/又は競合的利点を提供する遺
伝子も失う可能性が強く、このため無傷の構造体を保持
している遺伝子と環境中で競合できなくなる。細菌、バ
クテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、カビ等の
ような広範囲の微生物ホストから多数の転写調節領域が
入手できる。種々の転写調節領域は、trp遺伝子、lac遺
伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモータ、Tacプロ
モータ、及びホスト中で機能的な場合は毒素遺伝子と関
連して天然に生ずるプロモータを包含する。例として合
衆国特許第4,332,898号、第4,342,832号及び第4,356,27
0号を参照のこと。終結領域は、普通は転写開始領域又
は別の転写開始領域(二つの領域がホスト内で適合的で
機能的である限りにおいて)と関連する終結領域であり
うる。安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合
は、ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使
用されよう。複製系は染色体、ホスト又は異なるホスト
内に通常存在するエピゾーム要素から、又はホスト内で
安定なウイルスの複製系から誘導される。pBR322、pACY
C184、RSF1010、pRO1614等のような多数のプラスミドが
入手できる。例として、オルソン(Olson)ら、(1982年)
J. Bacteriol.150巻6069頁、及びバグダサリアン(Bagda
sarian)ら、(1981年) Gene 16巻237頁、並びに合衆国特
許第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号
を参照のこと。B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にあ
るように、転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間
に導入できる。この構造体はプラスミドに含有され、プ
ラスミドは少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ
以上を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの
開発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最
終ホストでの機能発揮に必要である。更に、すでに述べ
た一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが
望ましい。形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物
が存在する時は、それらに対して所望生物を選定できる
ように、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離で
きる。次に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
処理細胞を目標害虫環境に施用する時に細胞内毒素の活
性を持続させるために、殺虫剤含有細胞を処理するのに
適したホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含する
が、通常、哺乳類のような高等動物に有毒な物質を生じ
ない細胞に限定される。しかし、毒素が不安定か、哺乳
類ホストへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施
用水準である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる
生物も使用できる。ホストとして特に興味あるものは、
原核生物と、カビのような低級真核生物である。グラム
陰性・陽性双方の原核生物の例はエシェリキア(Escheri
chia)、エルウィニア(Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サ
ルモネラ(Salmonella)及びプロテウス(Proteus)のよう
な腸内細菌科(Enterobacteriaceae)；バシラス科(Bacil
laceae)；リゾビウム(Rhizobium)のようなリゾビウム科
(Rhizobiaceae)；発光細菌、ジモモナス(Zymomonas)、
セラティア(Serratia)、アエロモナス(Aeromonas)、ビ
ブリオ(Vibrio)、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)、
スピリルム(Spirillum)のようならせん菌科；乳酸かん
菌科;シュードモナス(Pseudomonas)及びアセトバクター
(Acetobacter)のようなシュードモナス科；アゾトバク
ター科、放線菌科(Actinomycetales)及びニトロバクタ
ー科を包含する。真核生物には藻菌類(Phycomycetes)と
子のう菌類(Ascomycetes)のような菌類があり、これは
サッカロミセス(Saccharomyces)とシゾサッカロミセス
(Schizosaccharomyces)のような酵母、ロードトルラ(Rh
odotorula)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、ス
ポロボロミセス(Sporobolomyces)のような担子菌類(Bas
idiomycetes)酵母を包含する。 生産目的のためにホス
ト細胞を選択する上で特に重要な特性は、B.t.遺伝子の
ホストへの導入の容易さ、表現系の入手性、表現効率、
ホスト中の殺虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在
を包含する。殺虫剤ミクロカプセルとして使用するのに
重要な特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケ
ージング又は封入体の細胞内パッケージング又は形成の
ような殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；
害虫に摂取させるための誘引力；毒素に損害を与えない
殺菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処
方と取扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。特
に重要なホスト生物は、ロードトルラの種、オーレオバ
シジウムの種、サッカロミセスの種、スポロボロミセス
の種のような酵母；シュードモナスの種、エルウィニア
の種、及びフラボバクテリウムの種のような葉面に生息
する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌の種、バシラス
の種、ストレプトミセスの種等の他の生物を包含する。
特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ(Pseud
omonasaeruginosa)、シュードモナス・フルオレッセン
ス(P.fluorescens)、サッカロミセス・セレビシエ(Sacc
haromyces cerevisiae)、バシラス・チューリンゲンシ
ス、大腸菌、枯草菌(B.subtilis)、ストレプトミセス・
リビダンス(Streptomyces lividans)を包含する。細胞
は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実質的に
増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用できる。微生
物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物の処理
は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒素を保
護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は物理的
手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合わせに
よる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子番号17
-80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ素を温
和な条件下に、所望の結果を達成するのに十分な時間に
使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒドとグ
ルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼフィラ
ンと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤；イソプ
ロピルアルコールとエタノールのようなアルコール類；
ルゴールヨウ素、ブアン固定剤、及びヘリー固定剤［フ
マソン(Humason)、グレッチェン・エル(Gretch-en, L.)
「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、
1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での
処理；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞中につ
くられる毒素の活性を保存し、持続させるような物理的
処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。
物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長
放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。一般に細胞
は、環境条件に対する耐性を強化するような、強化され
た構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプロ型の場合
は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型へ
の加工を抑制しないように、不活性化方法を選定すべき
である。例えばホルムアルデヒドはタンパクを架橋し、
プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制しうる。不活性
化ないし殺虫方法は、毒素の少なくとも実質量の生物学
的利用率又は生物活性を保持する。B.t.殺虫剤遺伝子を
含有する細胞ホストは任意慣用の栄養培地で生育できる
が、ＤＮＡ構造体は選択的利点を提供するため、細胞の
全量又は実質的全量がB.t.遺伝子を保持するように選択
培地となる。次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り
入れる。その代わりに、細胞を取り入れる前に処理する
こともできる。B.t.細胞を種々の方法で処方できる。こ
れらを無機鉱物(フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸
塩等)又は植物材料(粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、ク
ルミ殻等)と混合することにより、水和剤、粒剤又は粉
剤として使用できる。処方剤は展粘着助剤、安定化剤、
その他殺虫添加物、又は表面活性剤を包含できる。液体
処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フォーム、
ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成分は流動
剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含でき
る。殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮液か直接
使用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少な
くとも1重量%で存在し、100重量%でありうる。乾燥処方
剤は約1-95重量%の殺虫剤をもつが、液体処方剤は一般
に約1-60重量%の固体を液相中にもつであろう。処方剤
は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞をもつであ
ろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約50 mg(液体
又は乾燥)ないし1 kg以上の率で投与されよう。処方剤
は双翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水に噴霧、
散布、散水等によって施用できる。B.t.PS71M3の突然変
異株は、この技術で周知の手順によってつくることがで
きる。例えば、非胞子形成変異株はB.t.PS71M3のエチル
メタンスルホネート（EMS）突然変異誘発によって得ら
れる。また、この技術で周知の手順により、紫外線及び
ニトロソグアニジンを用いて突然変異株をつくることが
できる。小さな割合の非胞子形成突然変異株は無傷にと
どまり、長期の発酵のあいだ溶菌しない。これらの菌株
は溶菌マイナス（-）と指定される。溶菌マイナス菌株
は振とうフラスコの培地中で非胞子形成変異株を検査
し、発酵の終りにまだ無傷で毒素結晶を含有する突然変
異株を選定することによって確認できる。溶菌マイナス
菌株は、保護されカプセル封入された毒素蛋白を生ずる
ような細胞固定化法に適している。上記の非胞子形成変
異株のファージ耐性変種をつくるには、ファージ溶菌液
のアリコートを栄養寒天上に広げ、乾燥させる。ファー
ジ感受性菌株のアリコートを乾燥した溶菌上に直接プレ
ートし、乾燥させる。プレートを30℃で培養する。プレ
ートを２日間培養し、この時点で多数の集落が寒天上に
生育しているのを観察できる。これらの集落の幾つかを
取り上げ、栄養寒天プレート上で二次培養する。これら
の明白な耐性培養基をファージ溶菌液との交差線条接種
によって耐性について試験する。ファージ溶菌液の１本
の線をプレート上に線条接種し、乾燥させる。次に、推
定上の耐性培養基をファージ線に交差するように線条接
種する。耐性菌の培養基は、30℃で一夜培養後、ファー
ジ線に交差する線条のどこでも溶菌を示さない。次に、
ファージ耐性は、栄養寒天プレート上に耐性培養基を一
面にプレートすることによって再確認される。陽性対照
として役立たせるため、感受性菌株も同様にプレートす
る。乾燥後、ファージ溶菌液の一滴をプレート中心部に
撒き、乾燥させる。耐性培養基は、30℃で24時間培養
後、ファージ溶菌液を置いた場所で溶菌を示さなかっ
た。
【実施例】以下は、本発明を実施するために、最善の方
式を含めた手順を例示している実施例である。これらの
実施例は限定的に考えられてはならない。他に注意がな
ければ、百分率はすべて重量、溶媒混合物の割合はすべ
て容量による。 実施例１ B.t.PS71M3の培養 B.t.PS71M3又はその突然変異株の二次培養基を使用して
次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種
した。 バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH2PO4 3.4 g/l K2HPO4 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl2溶液 5.0 ml/l 塩溶液(100 ml) MgSO4・7H2O 2.46 g MnSO4・H2O 0.04 g ZnSO4・7H20 0.28 g FeSO4・7H2O 0.40 g CaCl2溶液(100 ml) CaCl2・2H2O 3.66 g pH 7.2 塩溶液とCaCl2溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処理
し調理ずみブロスに、接種時に添加する。200 rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。上の手順は、この技術で周知の手順により、大規
模発酵装置まで容易に規模拡大できる。上の発酵で得ら
れるB.t.胞子及び/又は結晶は、この技術で周知の手順
により単離できる。しばしば用いられる手順は、取り入
れた発酵液を分離手順、例えば遠心分離にかけることで
ある。 実施例２ B.t.PS71M3からの≒130 kDの新規な毒素遺伝
子のクローニング及び大腸菌への形質転換 低光学密度（OD600=1.0）に生育させたB.t.細胞から全
細胞ＤＮＡを調製した。細胞を遠心分離によって回収
し、20％庶糖と50 mg/mlリゾチームを含有するＴＥＳ緩
衝液（30 mMトリス-Cl、10 mMエチレンジアミン四酢酸
[EDTA]、50mM NaCl、pH=8.0）中で原形質化した。原形
質は、4％の最終濃度までドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）の添加によって溶菌化された。細胞材料を100 mM
（最終濃度）の中性塩化カリウム中で4℃で一夜沈殿さ
せた。上澄液をフェノール／クロロホルム（1:1）で2回
抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、セシウム勾
配物上の密度平衡バンディングで精製した。B.t.PS71M3
からの全細胞ＤＮＡをＥcoＲＶで消化させ、0.8％(w/v)
アガロース-ＴＡＥ（50 mMトリス-Cl、20 mM NaOAc、2.
5 mMEDTA、pH 8.0）緩衝ゲル上での電気泳動によって分
離した。ゲルのサザーンブロットを[32P]放射性標識つ
きプローブとハイブリッド形成させた。オリゴヌクレオ
チドの配列は（ＧＧＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＧＧＧ
ＧＴＡＡＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧ）である。結果は、
B.t.PS71M3のハイブリッド化断片が4.8 kb、4.0 kb、及
び3.8 kbの大きさであることを示した。Ｓau３Ａで部分
消化させ、電気泳動でサイズ分別したB.t.PS71M3全細胞
ＤＮＡから、ライブラリーを構築した。ゲルの9-23 kb
の領域を切出し、ＤＮＡを電気溶離し、次にエルチップ
TMイオン交換カラム（シュライヒャー・アン・シュエ
ル、ニューハンプシャー州キーン）を用いて濃縮した。
単離したＳau３Ａ断片をラムダＧＥＭ-11TM（PROMEGA）
へ連結させた。パッケージされたファージをＫＷ251大
腸菌細胞（PROMEGA）へ高力価でプレートにし、核酸ハ
イブリッド化プローブとして放射性標識つき合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて選別した。ハイブリッド形成プラ
ークを精製し、低プラーク密度で再選別した。プローブ
とのハイブリッドを形成した単一の単離精製プラークを
用いて、ＤＮＡ単離用のファージ調製のため、液体培養
基中のＫＷ251大腸菌細胞に感染させた。ＤＮＡを標準
手順によって単離した。ＤＮＡの調製量をＳalＩで消化
させ（ラムダアームから挿入ＤＮＡを放出させるた
め）、0.6％アガロース-ＴＡＥゲル上の電気泳動によっ
て分離した。上記のように電気溶離し濃縮された大断片
をＳalＩで消化させ脱ホスホリル化されたpBClacに連結
させた。連結混合物をNM522コンピテント大腸菌細胞へ
の形質転換によって導入し、アンピシリン、イソプロピ
ル-(ベータ)-D-チオガラクトシド(IPTG)及び5-ブロモ-4
-クロロ-3-インドリル-(ベータ)-D-ガラクトシド（XGA
L)を含有するLB寒天上にプレートした。pBClacの(ベー
タ)-ガラクトシダーゼ遺伝子への推定上の挿入体を伴っ
た白色集落を、標準的急速プラスミド精製手順にかける
と、所望のプラスミドが単離された。選択されたプラス
ミドはpMYC1625と名付けられ、8.0 kbのＳalＩ挿入体を
含有している。クローン化された挿入体の制限地図は、
毒素遺伝子が殺蚊タンパクをコードした他の毒素遺伝子
地図に新たに比較されることを示している。pMYC1625中
にクローン化された毒素遺伝子の制限地図は、cryIVA遺
伝子［ヘフテ・エッチ（Hoefte,H.）及びエッチ・アー
ル・ホイットリー（H.R. Whitely）[1989年] Microbiol
o-gical Reviews 53巻242-255頁］；140 kDエンドトキ
シン遺伝子［ウォード・エス（Ward,S.）及びディー・
エラー（D. Ellar）[1987年] Nucleic Acid Res. 15巻7
195頁］、及びバシラス・チューリンゲンシス・バラエ
ティ・イスラエレンシス（B.t.i.）から単離されたII型
遺伝子［セン（Sen）ら、[1988年] Agric. Biol. Chem.
52巻873-878頁］のファミリー内である。毒素遺伝子の
配列は、B.t.i. cryIVA遺伝子に対してつくったオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用する標準的なサンガー・
ジデオキシ連鎖終結法によって、及び新毒素遺伝子の配
列に対してつくったプライマーとの「ウォーキング」に
よって決定された。毒素遺伝子の配列分析は、これがＤ
ＮＡ配列から推定されると、134,934ダルトンのタンパ
クをコードしていることを明らかにした。アミノ酸配列
から推定されるヌクレオチド配列、及び組合せを図３〜
４、５〜６、７〜１２に見ることができる。上に引用さ
れたII型遺伝子と本タンパクとの間の６個の推定アミノ
酸の相違は、チョウ（Chou）及びファスマン（Fasman）
の方法（[1978年] Adv. in Enzymol. 47巻45-148頁）で
分析されているように、表現遺伝子生成物の二次構造に
関して有意の決定因子であると考えられる。二つのタン
パク遺伝子表現生成物のアミノ酸配列に生ずる変化は、
アミノ酸番号486、796、及び886において保守的な性質
のものと考えられるが、アミノ酸番号481、487及び987
で生ずる変化は異なる機能性を導入するものであって、
これがタンパクの予想される二次構造に著しい変化をも
たらしうる。これは図１と図２に例示されている。本遺
伝子生成物はアミノ酸470と500の間に１個の予想された
ターンをもつ一方、II型タンパクは同じ領域に三つのタ
ーンを含んでいる。プラスミドpMYC1625はエレクトロポ
レーションによって修復された結晶非生成（cry-）B.t.
ホストへ導入された。≒130 kDタンパクの表現は、SDS-
PAGEによって確証された。蚊幼虫への毒性の決定に胞子
及び結晶を使用した。溶液ml当たり10-4 mlの培養基
は、24時間後、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）とイ
エカ（Cu-lex pipiens）の100％致死率をもたらした。
プラスミド調製とホスト生物の形質転換に使用される種
々の方法は、この技術で周知である。マニアティス・テ
ィー（Maniatis, T.）、イー・エフ・フリッチ（E.F. F
ritsch）及びジェイ・サムブルック（J. Sambrook）(19
82年) 「分子クローニング：実験マニュアル」（コール
ド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク州）を
参照のこと。本明細書で明らかにされた制限酵素は、ベ
テスダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）、ニ
ューイングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビ
バリー）、又はベーリンジャー=マンハイム社（インデ
ィアナ州インディアナポリス）から購入できる。酵素
は、供給者から提供される指示に従って使用される。pB
Clacシャトルベクターは、プラスミドpBC16-1（バシラ
ス・ジェネティック・ストック・センター、オハイオ州
立大学、生化学教室、オハイオ州コロンバス）及びpUC1
9（ニューイングランド・バイオラブ）とを融合して構
築された。pBC16-1プラスミドをＥcoRIで消化させ、５'
オーバーハングにクレノウ酵素（ニューイングランド・
バイオラブ）によってデオキシヌクレオチド（dATP、dC
TP、dGTP、及びdTTP）を充填する。オリゴヌクレオチド
・リンカーの連結によってＳpeＩ制限部位を加えると、
pBC16-1SpeＩを生じた。上と同様に、Eco0109部位でＮh
eＩ制限部位をpUC19に加えると、pUC19NheＩを生じた。
pBC16-1SpeＩプラスミドをＳpeＩで消化させ、pUC19Nhe
ＩプラスミドをＮheＩで消化させると、相補性粘着(コ
ヒーシブ)末端を生じ、これらを一緒に連結するとpBCla
cシャトルベクターを生じた。B.t.毒素遺伝子を含有す
るプラスミドは、標準的な周知の手順を用いて、形質転
換ホスト微生物から除去できる。例えば、ホスト微生物
を透明溶菌液密度勾配平衡手順等にかけると、所望のプ
ラスミドが回収される。上の遺伝子は、同じ手順によっ
て、B.t.PS71M3-69からも単離できる。 実施例３ 分離体B.t.PS71M3からの≒77 kDの新規な毒
素遺伝子のクローニング、及び大腸菌への形質転換 実施例２に述べたとおりに全細胞ＤＮＡを調製した。B.
t.PS71M3からの全細胞ＤＮＡをＥcoRVで消化させ、0.8
％(w/v)アガロース-ＴＡＥ（50 mＭトリス-Cl、20 mＭ
NaOAc、2.5 mＭ EDTA、pH 8.0）緩衝ゲル上での電気泳
動によって分離した。ゲルのサザーンブロットを[32P]
放射性標識つきオリゴヌクレオチドプローブとのハイブ
リッドを形成させた。オリゴヌクレオチドの配列は（Ｃ
ＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＡＣ）である。結果は、B.t.PS71M3のハイ
ブリッド化断片が約14.0 kb、及び2.9 kbの大きさであ
ることを示した。実施例２に述べたようにライブラリー
を構築した。pBClacの(β)-ガラクトシダーゼ遺伝子へ
の推定上の挿入体を伴った白色集落を、標準的急速プラ
スミド精製手順にかけると、所望のプラスミドが単離さ
れた。選択されたプラスミドはpMYC1636と名付けられ、
およそ15 kbのＳalＩ挿入体を含有している。クローン
化された挿入体の制限地図は、毒素遺伝子が殺蚊タンパ
クをコードした他の毒素遺伝子地図と比較して新規であ
ることを示している。pMYC1636中にクローン化された毒
素遺伝子の制限地図は、B.t.バラエティ・イスラエレン
シス（B.t.i.）から単離されたcryIVC遺伝子［前掲ヘフ
テ及びホイットリー］に関連づけられる。毒素遺伝子の
配列は、B.t.i. cryIVC遺伝子に対してつくったオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用する標準的なジデオキシ
連鎖終結法によって、及び新毒素遺伝子の配列に対して
つくったプライマーとの「ウォーキング」によって決定
された。毒素遺伝子の配列分析は、ＤＮＡ配列から推定
すると二つの異なるアミノ酸をもった77,798ダルトンの
タンパクをコードした、cryIVC遺伝子に≒95％相同な開
放読取り枠を明らかにした。ヌクレオチド配列、推定さ
れるアミノ酸配列、及び組合せを図１３〜１４、１５〜
１６、１７〜２０に見ることができる。プラスミドpMYC
1636はエレクトロポレーションによって、修復された結
晶非生成（cry-）B.t.ホストへ導入された。約68 kDの
加工タンパクの表現は、SDS-PAGEによって確認された。
蚊幼虫への毒性の決定に胞子及び結晶を使用した。溶液
ml当たり10-4 mlの培養基は24時間後、ネッタイシマカ
（Aedes aegypti）の100％致死率をもたらした。上の遺
伝子は、同じ手順によって、B.t.PS71M3-69からも単離
できる。 実施例４ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコー
ドした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシエ
ンス(Agrobacter tumefaciens)からのTiプラスミドを使
用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植物へ
再生させる[ザンブリスキ・ピー(Zambryski, P.)、ジョ
ース・エッチ(Joos, H.)、ジェンテロ・シー(Gentello,
C.)、リーマンス・ジェイ(Leemans, J.)、バン・モン
タギュー・エム(Van Montague, M.)、及びシェル・ジェ
イ(Schell, J.)(1983年) Cell.32巻1033-1043頁]。この
点で、特に有用なベクターはpEND4Kである[クリー・エ
ッチ・ジェイ(Klee, H.J.)、ヤノフスキー・エム・エフ
(Yanofsky, M.F.)及びネスター・イー・ダブリュー(Nes
ter, E.W.)(1985年)Bio/Technology 3巻637-642頁]。こ
のプラスミドは、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセ
ンジャー遺伝子に対して複数のクローニング位置をもっ
ている。例えば毒素遺伝子はpEND4KのBamHI部位へ挿入
され、大腸菌中で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換さ
れる。 実施例５ 新規なB.チューリンゲンシス遺伝子のバクロ
ウイルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォル
ニカ(Autographa californica)核ポリヘドロシスウイル
ス(AcNPV)のようなバクロウイルスへクローン化でき
る。pUC8のような市販のクローニングベクターにクロー
ン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを構築で
きる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝子のコ
ード領域が除かれて、パッセンジャー遺伝子の特異なク
ローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後ろに置
かれるようにする。このようなベクターの例は、ペノッ
クら［ペノック・ジー・ディー(Pennock, G.D.)、シュ
ーメーカー・シー(Shoemaker, C.)及びミラー・エル・
ケイ(Miller, L. K.)(1984年)Mol. Cell.Biol. 4巻399-
406頁］に記述されたpGP-B6874、及びスミスら[スミス
・ジー・イー(Smith,G.E.)、サマーズ・エム・ディー(S
ummers, M.D.)及びフレーザー・エム・ジェイ(Fraser,
M.J.)(1983年)Mol.Cell.Biol. 3巻2156-2165頁]に記述
されたpAC380である。本発明の新規なタンパク毒素をコ
ードした遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適当
な領域で、BamHIリンカーによって変更でき、AcNPVベク
ター類の一つのもののパッセンジャー位置に挿入でき
る。既に明らかにされたように、≒130 kDの新規なB.t.
毒素遺伝子をコードしたヌクレオチド配列を図３〜４に
示す。推定アミノ酸配列を図５〜６に示す。図７〜１２
はヌクレオチド及びアミノ酸の配列を組合せたものであ
る。≒77 kDの新規なB.t.毒素をコードしたヌクレオチ
ド配列を図１３〜１４に示す。推定アミノ酸配列を図１
５〜１６に示す。図１７〜２０はヌクレオチドとアミノ
酸の配列を合成したものである。 実施例６ B.t.PS71M3-69からの親菌株B.t.PS71M3の調
製 親菌株は、殺菌のようなストレス条件下に得られる。下
記の条件下に次の復帰頻度が確定された。 PS71M3-69 1.63 x 10-11 統計的に、これは1 x 1011個の細胞のうちの１個が復帰
することを示す。殺菌後に見られる胞子形成体（復帰
体）の生育から生ずるタンパクのゲル走査分析は、両菌
株とも親と同一であった。手順は以下のとおりである。 １． 希釈培地(Ｌ-ブロス)１リットル中で突然変異株
培養基(B.t.PS71M3-69)を、回転振とう機上で24時間生
育させる。 ２． 細胞懸濁液を取り入れ、無菌遠心分離びんに移
し、8,000 rpmで10分回転させる。 ３． 上澄液を除き、容量を50 mlにするのに充分な量
の無菌脱イオン水中にペレットを再懸濁する。 ４． ペレットを再懸濁し、無菌フラスコに移す。この
未処理材料からプレートカウントを用意する。 ５． フラスコを80℃の水浴中に置き、200 rpmで15分
振とうする。 ６． フラスコを取り出し、懸濁液を栄養寒天へプレー
トする（50 mlずつ50プレートへ）。 ７． プレートを30℃で48時間培養し、出現する集落を
顕微鏡で検査する。 ８． 任意の胞子形成体を栄養寒天上に二次培養基接種
をし、72時間培養する。復帰頻度は、全処理細胞数によ
って胞子形成体数を割ることによって計算される。 例： (8.9 x 109 cfu/ml) x 50 ml ＝ 4.45 x 1011処
理細胞 ３胞子形成体が見つかったとすると、 3／4.45 x 1011 ＝ 6.74 x 10-12 ９． 胞子形成体の身元を決定するため、「復帰体」を
親菌株と平行して液体発酵培地中で生育させる。 １０．生ずるタンパクを分析し、親菌株で生じたものと
比較する。「復帰体」と親菌株は同一バンディングパタ
ーンをもつべきである。 この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列は、
DNAのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝暗号
の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使用さ
れるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化ヌク
レオチドトリプレット(コドン)を使用できるため、一つ
の特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列がコー
ドできる。このため、遺伝暗号を次のように描くことが
できる。 フェニルアラニン(Phe) TTK ロイシン(Leu) XTY イソロイシン(Ile) ATM メチオニン(Met) ATG バリン(Val) GTL セリン(Ser) QRS プロリン(Pro) CCL スレオニン(Thr) ACL アラニン(Ala) GCL チロシン(Tyr) TAK ヒスチジン(His) CAK グルタミン(Gln) CAJ アスパラギン(Asn) AAK リジン(Lys) AAJ アスパラギン酸(Asp) GAK グルタミン酸(Glu) GAJ システイン(Cys) TGK トリプトファン(Trp) TGG アルギニン(Arg) WGZ グリシン(Gly) GGL 終結信号 TAJ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に5'末端、右側に3'末端をもつ伝令RNAのトリヌク
レオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡはすべ
て、ウラシルにはチミンを置き換えた、mＲＮＡの配列
に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである。文字はデオキ
シヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩
基を示す。 A=アデニン G=グアニン C=シトシン T=チミン YがAまたはGの場合は、X=T又はC. YがCまたはTの場合は、X=C. XがCの場合は、Y=A, G, C又はT. XがTの場合は、Y=A又はG. ZがA又はGの場合は、W=C又はA. ZがC又はTの場合は、W=C. WがCの場合は、Z=A, G, C又はT. WがAの場合は、Z=A又はG. SがA, G, C又はTの場合はQR=TC.又はその代わりにSがT
又はCの場合はQR=AG. J=A又はG K=T又はC L=A, T, C又はG. M=A, C又はT. 上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列が、このタンパ
クの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオチド
配列によって調製できることを示す。従って、本発明は
このような同等なヌクレオチド配列を包含する。更に、
アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更しない
ならば、確認された構造及び機能のタンパクが、このよ
うな変更によって構築できることが示された［カイザー
・イー・ティー（Kaiser, E.T.）及びケズディ・エフ・
ジェイ（Kezdy, F.J.）（1984年）Science 223巻249-25
5頁]。このように、本発明はタンパクの二次構造を変更
しないような本明細書に記載のアミノ酸配列の突然変異
株、又は構造が変更される場合でも生物活性がある程度
保持されるような突然変異株を包含する。
式を含めた手順を例示している実施例である。これらの
実施例は限定的に考えられてはならない。他に注意がな
ければ、百分率はすべて重量、溶媒混合物の割合はすべ
て容量による。 実施例１ B.t.PS71M3の培養 B.t.PS71M3又はその突然変異株の二次培養基を使用して
次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種
した。 バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH2PO4 3.4 g/l K2HPO4 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl2溶液 5.0 ml/l 塩溶液(100 ml) MgSO4・7H2O 2.46 g MnSO4・H2O 0.04 g ZnSO4・7H20 0.28 g FeSO4・7H2O 0.40 g CaCl2溶液(100 ml) CaCl2・2H2O 3.66 g pH 7.2 塩溶液とCaCl2溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処理
し調理ずみブロスに、接種時に添加する。200 rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。上の手順は、この技術で周知の手順により、大規
模発酵装置まで容易に規模拡大できる。上の発酵で得ら
れるB.t.胞子及び/又は結晶は、この技術で周知の手順
により単離できる。しばしば用いられる手順は、取り入
れた発酵液を分離手順、例えば遠心分離にかけることで
ある。 実施例２ B.t.PS71M3からの≒130 kDの新規な毒素遺伝
子のクローニング及び大腸菌への形質転換 低光学密度（OD600=1.0）に生育させたB.t.細胞から全
細胞ＤＮＡを調製した。細胞を遠心分離によって回収
し、20％庶糖と50 mg/mlリゾチームを含有するＴＥＳ緩
衝液（30 mMトリス-Cl、10 mMエチレンジアミン四酢酸
[EDTA]、50mM NaCl、pH=8.0）中で原形質化した。原形
質は、4％の最終濃度までドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）の添加によって溶菌化された。細胞材料を100 mM
（最終濃度）の中性塩化カリウム中で4℃で一夜沈殿さ
せた。上澄液をフェノール／クロロホルム（1:1）で2回
抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、セシウム勾
配物上の密度平衡バンディングで精製した。B.t.PS71M3
からの全細胞ＤＮＡをＥcoＲＶで消化させ、0.8％(w/v)
アガロース-ＴＡＥ（50 mMトリス-Cl、20 mM NaOAc、2.
5 mMEDTA、pH 8.0）緩衝ゲル上での電気泳動によって分
離した。ゲルのサザーンブロットを[32P]放射性標識つ
きプローブとハイブリッド形成させた。オリゴヌクレオ
チドの配列は（ＧＧＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＧＧＧ
ＧＴＡＡＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧ）である。結果は、
B.t.PS71M3のハイブリッド化断片が4.8 kb、4.0 kb、及
び3.8 kbの大きさであることを示した。Ｓau３Ａで部分
消化させ、電気泳動でサイズ分別したB.t.PS71M3全細胞
ＤＮＡから、ライブラリーを構築した。ゲルの9-23 kb
の領域を切出し、ＤＮＡを電気溶離し、次にエルチップ
TMイオン交換カラム（シュライヒャー・アン・シュエ
ル、ニューハンプシャー州キーン）を用いて濃縮した。
単離したＳau３Ａ断片をラムダＧＥＭ-11TM（PROMEGA）
へ連結させた。パッケージされたファージをＫＷ251大
腸菌細胞（PROMEGA）へ高力価でプレートにし、核酸ハ
イブリッド化プローブとして放射性標識つき合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて選別した。ハイブリッド形成プラ
ークを精製し、低プラーク密度で再選別した。プローブ
とのハイブリッドを形成した単一の単離精製プラークを
用いて、ＤＮＡ単離用のファージ調製のため、液体培養
基中のＫＷ251大腸菌細胞に感染させた。ＤＮＡを標準
手順によって単離した。ＤＮＡの調製量をＳalＩで消化
させ（ラムダアームから挿入ＤＮＡを放出させるた
め）、0.6％アガロース-ＴＡＥゲル上の電気泳動によっ
て分離した。上記のように電気溶離し濃縮された大断片
をＳalＩで消化させ脱ホスホリル化されたpBClacに連結
させた。連結混合物をNM522コンピテント大腸菌細胞へ
の形質転換によって導入し、アンピシリン、イソプロピ
ル-(ベータ)-D-チオガラクトシド(IPTG)及び5-ブロモ-4
-クロロ-3-インドリル-(ベータ)-D-ガラクトシド（XGA
L)を含有するLB寒天上にプレートした。pBClacの(ベー
タ)-ガラクトシダーゼ遺伝子への推定上の挿入体を伴っ
た白色集落を、標準的急速プラスミド精製手順にかける
と、所望のプラスミドが単離された。選択されたプラス
ミドはpMYC1625と名付けられ、8.0 kbのＳalＩ挿入体を
含有している。クローン化された挿入体の制限地図は、
毒素遺伝子が殺蚊タンパクをコードした他の毒素遺伝子
地図に新たに比較されることを示している。pMYC1625中
にクローン化された毒素遺伝子の制限地図は、cryIVA遺
伝子［ヘフテ・エッチ（Hoefte,H.）及びエッチ・アー
ル・ホイットリー（H.R. Whitely）[1989年] Microbiol
o-gical Reviews 53巻242-255頁］；140 kDエンドトキ
シン遺伝子［ウォード・エス（Ward,S.）及びディー・
エラー（D. Ellar）[1987年] Nucleic Acid Res. 15巻7
195頁］、及びバシラス・チューリンゲンシス・バラエ
ティ・イスラエレンシス（B.t.i.）から単離されたII型
遺伝子［セン（Sen）ら、[1988年] Agric. Biol. Chem.
52巻873-878頁］のファミリー内である。毒素遺伝子の
配列は、B.t.i. cryIVA遺伝子に対してつくったオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用する標準的なサンガー・
ジデオキシ連鎖終結法によって、及び新毒素遺伝子の配
列に対してつくったプライマーとの「ウォーキング」に
よって決定された。毒素遺伝子の配列分析は、これがＤ
ＮＡ配列から推定されると、134,934ダルトンのタンパ
クをコードしていることを明らかにした。アミノ酸配列
から推定されるヌクレオチド配列、及び組合せを図３〜
４、５〜６、７〜１２に見ることができる。上に引用さ
れたII型遺伝子と本タンパクとの間の６個の推定アミノ
酸の相違は、チョウ（Chou）及びファスマン（Fasman）
の方法（[1978年] Adv. in Enzymol. 47巻45-148頁）で
分析されているように、表現遺伝子生成物の二次構造に
関して有意の決定因子であると考えられる。二つのタン
パク遺伝子表現生成物のアミノ酸配列に生ずる変化は、
アミノ酸番号486、796、及び886において保守的な性質
のものと考えられるが、アミノ酸番号481、487及び987
で生ずる変化は異なる機能性を導入するものであって、
これがタンパクの予想される二次構造に著しい変化をも
たらしうる。これは図１と図２に例示されている。本遺
伝子生成物はアミノ酸470と500の間に１個の予想された
ターンをもつ一方、II型タンパクは同じ領域に三つのタ
ーンを含んでいる。プラスミドpMYC1625はエレクトロポ
レーションによって修復された結晶非生成（cry-）B.t.
ホストへ導入された。≒130 kDタンパクの表現は、SDS-
PAGEによって確証された。蚊幼虫への毒性の決定に胞子
及び結晶を使用した。溶液ml当たり10-4 mlの培養基
は、24時間後、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）とイ
エカ（Cu-lex pipiens）の100％致死率をもたらした。
プラスミド調製とホスト生物の形質転換に使用される種
々の方法は、この技術で周知である。マニアティス・テ
ィー（Maniatis, T.）、イー・エフ・フリッチ（E.F. F
ritsch）及びジェイ・サムブルック（J. Sambrook）(19
82年) 「分子クローニング：実験マニュアル」（コール
ド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク州）を
参照のこと。本明細書で明らかにされた制限酵素は、ベ
テスダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）、ニ
ューイングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビ
バリー）、又はベーリンジャー=マンハイム社（インデ
ィアナ州インディアナポリス）から購入できる。酵素
は、供給者から提供される指示に従って使用される。pB
Clacシャトルベクターは、プラスミドpBC16-1（バシラ
ス・ジェネティック・ストック・センター、オハイオ州
立大学、生化学教室、オハイオ州コロンバス）及びpUC1
9（ニューイングランド・バイオラブ）とを融合して構
築された。pBC16-1プラスミドをＥcoRIで消化させ、５'
オーバーハングにクレノウ酵素（ニューイングランド・
バイオラブ）によってデオキシヌクレオチド（dATP、dC
TP、dGTP、及びdTTP）を充填する。オリゴヌクレオチド
・リンカーの連結によってＳpeＩ制限部位を加えると、
pBC16-1SpeＩを生じた。上と同様に、Eco0109部位でＮh
eＩ制限部位をpUC19に加えると、pUC19NheＩを生じた。
pBC16-1SpeＩプラスミドをＳpeＩで消化させ、pUC19Nhe
ＩプラスミドをＮheＩで消化させると、相補性粘着(コ
ヒーシブ)末端を生じ、これらを一緒に連結するとpBCla
cシャトルベクターを生じた。B.t.毒素遺伝子を含有す
るプラスミドは、標準的な周知の手順を用いて、形質転
換ホスト微生物から除去できる。例えば、ホスト微生物
を透明溶菌液密度勾配平衡手順等にかけると、所望のプ
ラスミドが回収される。上の遺伝子は、同じ手順によっ
て、B.t.PS71M3-69からも単離できる。 実施例３ 分離体B.t.PS71M3からの≒77 kDの新規な毒
素遺伝子のクローニング、及び大腸菌への形質転換 実施例２に述べたとおりに全細胞ＤＮＡを調製した。B.
t.PS71M3からの全細胞ＤＮＡをＥcoRVで消化させ、0.8
％(w/v)アガロース-ＴＡＥ（50 mＭトリス-Cl、20 mＭ
NaOAc、2.5 mＭ EDTA、pH 8.0）緩衝ゲル上での電気泳
動によって分離した。ゲルのサザーンブロットを[32P]
放射性標識つきオリゴヌクレオチドプローブとのハイブ
リッドを形成させた。オリゴヌクレオチドの配列は（Ｃ
ＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＡＣ）である。結果は、B.t.PS71M3のハイ
ブリッド化断片が約14.0 kb、及び2.9 kbの大きさであ
ることを示した。実施例２に述べたようにライブラリー
を構築した。pBClacの(β)-ガラクトシダーゼ遺伝子へ
の推定上の挿入体を伴った白色集落を、標準的急速プラ
スミド精製手順にかけると、所望のプラスミドが単離さ
れた。選択されたプラスミドはpMYC1636と名付けられ、
およそ15 kbのＳalＩ挿入体を含有している。クローン
化された挿入体の制限地図は、毒素遺伝子が殺蚊タンパ
クをコードした他の毒素遺伝子地図と比較して新規であ
ることを示している。pMYC1636中にクローン化された毒
素遺伝子の制限地図は、B.t.バラエティ・イスラエレン
シス（B.t.i.）から単離されたcryIVC遺伝子［前掲ヘフ
テ及びホイットリー］に関連づけられる。毒素遺伝子の
配列は、B.t.i. cryIVC遺伝子に対してつくったオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用する標準的なジデオキシ
連鎖終結法によって、及び新毒素遺伝子の配列に対して
つくったプライマーとの「ウォーキング」によって決定
された。毒素遺伝子の配列分析は、ＤＮＡ配列から推定
すると二つの異なるアミノ酸をもった77,798ダルトンの
タンパクをコードした、cryIVC遺伝子に≒95％相同な開
放読取り枠を明らかにした。ヌクレオチド配列、推定さ
れるアミノ酸配列、及び組合せを図１３〜１４、１５〜
１６、１７〜２０に見ることができる。プラスミドpMYC
1636はエレクトロポレーションによって、修復された結
晶非生成（cry-）B.t.ホストへ導入された。約68 kDの
加工タンパクの表現は、SDS-PAGEによって確認された。
蚊幼虫への毒性の決定に胞子及び結晶を使用した。溶液
ml当たり10-4 mlの培養基は24時間後、ネッタイシマカ
（Aedes aegypti）の100％致死率をもたらした。上の遺
伝子は、同じ手順によって、B.t.PS71M3-69からも単離
できる。 実施例４ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコー
ドした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシエ
ンス(Agrobacter tumefaciens)からのTiプラスミドを使
用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植物へ
再生させる[ザンブリスキ・ピー(Zambryski, P.)、ジョ
ース・エッチ(Joos, H.)、ジェンテロ・シー(Gentello,
C.)、リーマンス・ジェイ(Leemans, J.)、バン・モン
タギュー・エム(Van Montague, M.)、及びシェル・ジェ
イ(Schell, J.)(1983年) Cell.32巻1033-1043頁]。この
点で、特に有用なベクターはpEND4Kである[クリー・エ
ッチ・ジェイ(Klee, H.J.)、ヤノフスキー・エム・エフ
(Yanofsky, M.F.)及びネスター・イー・ダブリュー(Nes
ter, E.W.)(1985年)Bio/Technology 3巻637-642頁]。こ
のプラスミドは、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセ
ンジャー遺伝子に対して複数のクローニング位置をもっ
ている。例えば毒素遺伝子はpEND4KのBamHI部位へ挿入
され、大腸菌中で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換さ
れる。 実施例５ 新規なB.チューリンゲンシス遺伝子のバクロ
ウイルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォル
ニカ(Autographa californica)核ポリヘドロシスウイル
ス(AcNPV)のようなバクロウイルスへクローン化でき
る。pUC8のような市販のクローニングベクターにクロー
ン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを構築で
きる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝子のコ
ード領域が除かれて、パッセンジャー遺伝子の特異なク
ローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後ろに置
かれるようにする。このようなベクターの例は、ペノッ
クら［ペノック・ジー・ディー(Pennock, G.D.)、シュ
ーメーカー・シー(Shoemaker, C.)及びミラー・エル・
ケイ(Miller, L. K.)(1984年)Mol. Cell.Biol. 4巻399-
406頁］に記述されたpGP-B6874、及びスミスら[スミス
・ジー・イー(Smith,G.E.)、サマーズ・エム・ディー(S
ummers, M.D.)及びフレーザー・エム・ジェイ(Fraser,
M.J.)(1983年)Mol.Cell.Biol. 3巻2156-2165頁]に記述
されたpAC380である。本発明の新規なタンパク毒素をコ
ードした遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適当
な領域で、BamHIリンカーによって変更でき、AcNPVベク
ター類の一つのもののパッセンジャー位置に挿入でき
る。既に明らかにされたように、≒130 kDの新規なB.t.
毒素遺伝子をコードしたヌクレオチド配列を図３〜４に
示す。推定アミノ酸配列を図５〜６に示す。図７〜１２
はヌクレオチド及びアミノ酸の配列を組合せたものであ
る。≒77 kDの新規なB.t.毒素をコードしたヌクレオチ
ド配列を図１３〜１４に示す。推定アミノ酸配列を図１
５〜１６に示す。図１７〜２０はヌクレオチドとアミノ
酸の配列を合成したものである。 実施例６ B.t.PS71M3-69からの親菌株B.t.PS71M3の調
製 親菌株は、殺菌のようなストレス条件下に得られる。下
記の条件下に次の復帰頻度が確定された。 PS71M3-69 1.63 x 10-11 統計的に、これは1 x 1011個の細胞のうちの１個が復帰
することを示す。殺菌後に見られる胞子形成体（復帰
体）の生育から生ずるタンパクのゲル走査分析は、両菌
株とも親と同一であった。手順は以下のとおりである。 １． 希釈培地(Ｌ-ブロス)１リットル中で突然変異株
培養基(B.t.PS71M3-69)を、回転振とう機上で24時間生
育させる。 ２． 細胞懸濁液を取り入れ、無菌遠心分離びんに移
し、8,000 rpmで10分回転させる。 ３． 上澄液を除き、容量を50 mlにするのに充分な量
の無菌脱イオン水中にペレットを再懸濁する。 ４． ペレットを再懸濁し、無菌フラスコに移す。この
未処理材料からプレートカウントを用意する。 ５． フラスコを80℃の水浴中に置き、200 rpmで15分
振とうする。 ６． フラスコを取り出し、懸濁液を栄養寒天へプレー
トする（50 mlずつ50プレートへ）。 ７． プレートを30℃で48時間培養し、出現する集落を
顕微鏡で検査する。 ８． 任意の胞子形成体を栄養寒天上に二次培養基接種
をし、72時間培養する。復帰頻度は、全処理細胞数によ
って胞子形成体数を割ることによって計算される。 例： (8.9 x 109 cfu/ml) x 50 ml ＝ 4.45 x 1011処
理細胞 ３胞子形成体が見つかったとすると、 3／4.45 x 1011 ＝ 6.74 x 10-12 ９． 胞子形成体の身元を決定するため、「復帰体」を
親菌株と平行して液体発酵培地中で生育させる。 １０．生ずるタンパクを分析し、親菌株で生じたものと
比較する。「復帰体」と親菌株は同一バンディングパタ
ーンをもつべきである。 この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列は、
DNAのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝暗号
の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使用さ
れるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化ヌク
レオチドトリプレット(コドン)を使用できるため、一つ
の特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列がコー
ドできる。このため、遺伝暗号を次のように描くことが
できる。 フェニルアラニン(Phe) TTK ロイシン(Leu) XTY イソロイシン(Ile) ATM メチオニン(Met) ATG バリン(Val) GTL セリン(Ser) QRS プロリン(Pro) CCL スレオニン(Thr) ACL アラニン(Ala) GCL チロシン(Tyr) TAK ヒスチジン(His) CAK グルタミン(Gln) CAJ アスパラギン(Asn) AAK リジン(Lys) AAJ アスパラギン酸(Asp) GAK グルタミン酸(Glu) GAJ システイン(Cys) TGK トリプトファン(Trp) TGG アルギニン(Arg) WGZ グリシン(Gly) GGL 終結信号 TAJ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に5'末端、右側に3'末端をもつ伝令RNAのトリヌク
レオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡはすべ
て、ウラシルにはチミンを置き換えた、mＲＮＡの配列
に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである。文字はデオキ
シヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩
基を示す。 A=アデニン G=グアニン C=シトシン T=チミン YがAまたはGの場合は、X=T又はC. YがCまたはTの場合は、X=C. XがCの場合は、Y=A, G, C又はT. XがTの場合は、Y=A又はG. ZがA又はGの場合は、W=C又はA. ZがC又はTの場合は、W=C. WがCの場合は、Z=A, G, C又はT. WがAの場合は、Z=A又はG. SがA, G, C又はTの場合はQR=TC.又はその代わりにSがT
又はCの場合はQR=AG. J=A又はG K=T又はC L=A, T, C又はG. M=A, C又はT. 上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列が、このタンパ
クの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオチド
配列によって調製できることを示す。従って、本発明は
このような同等なヌクレオチド配列を包含する。更に、
アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更しない
ならば、確認された構造及び機能のタンパクが、このよ
うな変更によって構築できることが示された［カイザー
・イー・ティー（Kaiser, E.T.）及びケズディ・エフ・
ジェイ（Kezdy, F.J.）（1984年）Science 223巻249-25
5頁]。このように、本発明はタンパクの二次構造を変更
しないような本明細書に記載のアミノ酸配列の突然変異
株、又は構造が変更される場合でも生物活性がある程度
保持されるような突然変異株を包含する。
図１は≒130 kDの毒素の新規なアミノ酸配列のプロット
構造、図２はバシラス・チューリンゲンシス・バラエテ
ィ・イスラエレンシス（B.t.i.）によって表現されるア
ミノ酸配列のプロット構造、図３は≒130 kDの新規なB.
t.毒素をコードしたヌクレオチド配列の前半（図４へ続
く）、図４は≒130 kDの新規なB.t.毒素をコードしたヌ
クレオチド配列の図３から続く後半、図５は≒130 kDの
新規なB.t.毒素の推定アミノ酸配列の前半（図６へ続
く）、図６は≒130 kDの新規なB.t.毒素の推定アミノ酸
配列の図５から続く後半、図７は図３〜４及び図５〜６
のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成したもの、
その１、図８は図３〜４及び図５〜６のヌクレオチド配
列及びアミノ酸配列を合成したものその２、図９は図３
〜４及び図５〜６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
を合成したものその３、図１０は図３〜４及び図５〜６
のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成したものそ
の４、図１１は図３〜４及び図５〜６のヌクレオチド配
列及びアミノ酸配列を合成したものその５、図１２は図
３〜４及び図５〜６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列を合成したものその６、図１３は≒77kDの新規なB.t.
毒素をコードしたヌクレオチド配列の前半（図１４へ続
く）、図１４は≒77 kDの新規なB.t.毒素をコードした
ヌクレオチド配列の図１３から続く後半、図１５は≒77
kDの新規なB.t.毒素の推定アミノ酸配列の前半（図１
６へ続く）、図１６は≒77 kDの新規なB.t.毒素の推定
アミノ酸配列の図１５から続く後半、 図１７は図１３
〜１４及び図１５〜１６のヌクレオチド配列及びアミノ
酸配列を合成したものその１、図１８は図１３〜１４及
び図１５〜１６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を
合成したものその２、図１９は図１３〜１４及び図１５
〜１６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成した
ものその３、図２０は図１３〜１４及び図１５〜１６の
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成したものその
４、をそれぞれ表わす略図である。
構造、図２はバシラス・チューリンゲンシス・バラエテ
ィ・イスラエレンシス（B.t.i.）によって表現されるア
ミノ酸配列のプロット構造、図３は≒130 kDの新規なB.
t.毒素をコードしたヌクレオチド配列の前半（図４へ続
く）、図４は≒130 kDの新規なB.t.毒素をコードしたヌ
クレオチド配列の図３から続く後半、図５は≒130 kDの
新規なB.t.毒素の推定アミノ酸配列の前半（図６へ続
く）、図６は≒130 kDの新規なB.t.毒素の推定アミノ酸
配列の図５から続く後半、図７は図３〜４及び図５〜６
のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成したもの、
その１、図８は図３〜４及び図５〜６のヌクレオチド配
列及びアミノ酸配列を合成したものその２、図９は図３
〜４及び図５〜６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
を合成したものその３、図１０は図３〜４及び図５〜６
のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成したものそ
の４、図１１は図３〜４及び図５〜６のヌクレオチド配
列及びアミノ酸配列を合成したものその５、図１２は図
３〜４及び図５〜６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列を合成したものその６、図１３は≒77kDの新規なB.t.
毒素をコードしたヌクレオチド配列の前半（図１４へ続
く）、図１４は≒77 kDの新規なB.t.毒素をコードした
ヌクレオチド配列の図１３から続く後半、図１５は≒77
kDの新規なB.t.毒素の推定アミノ酸配列の前半（図１
６へ続く）、図１６は≒77 kDの新規なB.t.毒素の推定
アミノ酸配列の図１５から続く後半、 図１７は図１３
〜１４及び図１５〜１６のヌクレオチド配列及びアミノ
酸配列を合成したものその１、図１８は図１３〜１４及
び図１５〜１６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を
合成したものその２、図１９は図１３〜１４及び図１５
〜１６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成した
ものその３、図２０は図１３〜１４及び図１５〜１６の
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を合成したものその
４、をそれぞれ表わす略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ０１Ｎ 63/02 Ｅ 7106−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 13/00 ＺＮＡ 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/70 15/74 15/79 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:065） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (28)
- 【請求項１】 図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ
酸配列の全部又は一部を有し、バシラス・チューリンゲ
ンシス(Bacillus thuringiensis)毒素をコードしたＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 図３〜４又は図１３〜１４に示すヌクレ
オチド配列の全部又は一部を有し、バシラス・チューリ
ンゲンシス毒素をコードしたＤＮＡ。 - 【請求項３】 図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ
酸配列の全部又は一部を有し、双翅目昆虫に対して活性
な毒素。 - 【請求項４】 図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ
酸配列をコードしたヌクレオチド配列の全部又は一部を
持つＤＮＡを含む組替ＤＮＡ運搬ベクター。 - 【請求項５】 原核又は真核ホスト中に運搬されその中
で複製される、請求項４に記載のＤＮＡ運搬ベクター。 - 【請求項６】 図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ
酸配列の全部又は一部をもったバシラス・チューリンゲ
ンシス毒素を表現させるために形質転換される細菌ホス
ト。 - 【請求項７】 図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ
酸配列の全部又は一部をもったバシラス・チューリンゲ
ンシス毒素をコードしたバシラス・チューリンゲンシス
毒素遺伝子を含有するプラスミドベクターで形質転換さ
れた、請求項６に記載の大腸菌。 - 【請求項８】 NRRL B-18644の確認特性をもった、形質
転換されたホスト大腸菌(NM522)(pMYC1625)。 - 【請求項９】 NRRL B-18693の確認特性をもった、形質
転換されたホスト大腸菌(NM522)(pMYC1636)。 - 【請求項１０】 シュードモナス(Pseudomonas)、アゾ
トバクター(Azotobacter)、エルウィニア(Erwinia)、セ
ラティア(Serratia)、クレブシェラ(Klebsiella)、リゾ
ビウム(Rhizobium)、ロードシュードモナス(Rhodopseud
omonas)、メチロフィリウス(Methylophilius)、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium)、アセトバクター(Aceto
bacter)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、バシラス(Bac
illus)、又はストレプトミセス(Streptomyces)の種であ
る、請求項６に記載の微生物。 - 【請求項１１】 微生物が有色素で葉面(phylloplane)
接着性である、請求項１０に記載の微生物。 - 【請求項１２】 請求項１０に記載の微生物を双翅目昆
虫に、又は上記昆虫の環境に投与することからなる、双
翅目昆虫類の防除法。 - 【請求項１３】 投与が根の周辺(rhizosphere)に対し
てである、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 投与が葉面に対してである、請求項１
２に記載の方法。 - 【請求項１５】 投与が水に対してである、請求項１２
に記載の方法。 - 【請求項１６】 目標害虫環境に施用されたときに持続
的な殺虫活性を有する実質的に無傷の処理細胞を含有す
る殺虫剤を含めてなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤
が双翅目昆虫に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、
図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ酸配列の全部又
は一部をもったバシラス・チューリンゲンシス毒素を表
現できる形質転換された微生物の表現の結果としてつく
られる場合の殺虫剤組成物。 - 【請求項１７】 環境中で殺虫活性を持続させるために
処理細胞が化学的又は物理的手段によって処理される、
請求項１６に記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項１８】 細胞が原核生物又は低級真核生物であ
る、請求項１７に記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項１９】 上記の原核生物細胞が腸内細菌科（En
terobacteriaceae)、バシラス科(Bacillaceae)、リゾビ
ウム科(Rhizobiaceae)、らせん科(Spirillaceae)、乳酸
杆菌科(Lactobacillaceae)、シュードモナス科(Pseudom
onadaceae)、アゾトバクター科(Azotobacteraceae)、ニ
トロバクター科(Nitrobacteraceae)及び放線菌科(Actin
omycetales)からなる群から選ばれる、請求項１８に記
載の殺虫剤組成物。 - 【請求項２０】 低級真核生物細胞が藻菌類（Phycomyc
etes)、子のう菌類(Ascomycetes)、及び担子菌類(Basid
iomycetes)からなる群から選ばれる、請求項１８に記載
の殺虫剤組成物。 - 【請求項２１】 細胞が有色素細菌、酵母又はカビであ
る、請求項１６に記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項２２】 細胞内毒素を含有する処理された実質
的に無傷の単細胞微生物細胞であって、この毒素がバシ
ラス・チューリンゲンシス毒素遺伝子の表現結果であ
り、上記毒素が双翅目昆虫に対して有毒であり、この遺
伝子が図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ酸配列の
全部又は一部をもったポリペプチド毒素をコードしてお
り、上記細胞を目標昆虫環境に施用する時に殺虫活性を
持続させるような条件下に上記細胞が処理される場合の
微生物細胞。 - 【請求項２３】 環境中で殺虫活性を持続させるために
細胞が化学的又は物理的手段によって処理される、請求
項２２に記載の細胞。 - 【請求項２４】 上記微生物がシュードモナスであり、
上記毒素が図５〜６又は図１５〜１６に示すアミノ酸配
列をもったバシラス・チューリンゲンシス毒素である、
請求項２２に記載の細胞。 - 【請求項２５】 細胞がヨウ素で処理される、請求項２
４に記載のシュードモナス細胞。 - 【請求項２６】 シュードモナス・フルオレッセンスで
ある、請求項２２に記載の細胞。 - 【請求項２７】 プラスミドpMYC1625。
- 【請求項２８】 プラスミドpMYC1636。
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-
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