JP2576912B2 - 鱗翅類害虫活性の新規バシラス・スリンギエンシス分離体と、新規な鱗翅類活性毒素をコードした遺伝子 - Google Patents
鱗翅類害虫活性の新規バシラス・スリンギエンシス分離体と、新規な鱗翅類活性毒素をコードした遺伝子Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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-
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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- A01N63/23—B. thuringiensis
-
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、鱗翅類の害虫に活性な新規なバシラス・ス
リンギエンシス分離体と、鱗翅目に活性な毒素をコード
した遺伝子に関する。
リンギエンシス分離体と、鱗翅目に活性な毒素をコード
した遺伝子に関する。
最も広く使用される微生物殺虫剤は細菌バシラス・ス
リンギエンシス（Bacillus thringiensis）に由来して
いる。この細菌薬剤は、葉を食べる広範囲のいも虫や甲
虫並びに蚊の防除に使用される。バシラス・スリンギエ
ンシスは、感受性のある昆虫ホストに採取されると有毒
な、タンパク性パラ胞子体や結晶をつくる。例えば、バ
シラス・スリンギエンシスsubsp.カースタキ（B.thring
iensissubsp.kurstaki）HD−１は、デルタトキシンと呼
ばれる生物毒素からなる結晶封入物をつくるが、これは
幾つかの鱗翅目昆虫の幼虫に有毒である。大腸菌（E.co
li）におけるこのB.t.結晶タンパク遺伝子のクローニン
グ、配列決定及び発現は、刊行文献［シェネフ・エッチ
・イー（Schnepf,H.E.）及びホワイトリー・エッチ・ア
ール（Whitely,H.R.）（1981年）,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 78巻2893−2897頁］中に記述されている。合衆国
特許第4,448,885号と第4,467,036号は、両方とも大腸菌
でのB.t.結晶タンパクの発現を明らかにしている。
リンギエンシス（Bacillus thringiensis）に由来して
いる。この細菌薬剤は、葉を食べる広範囲のいも虫や甲
虫並びに蚊の防除に使用される。バシラス・スリンギエ
ンシスは、感受性のある昆虫ホストに採取されると有毒
な、タンパク性パラ胞子体や結晶をつくる。例えば、バ
シラス・スリンギエンシスsubsp.カースタキ（B.thring
iensissubsp.kurstaki）HD−１は、デルタトキシンと呼
ばれる生物毒素からなる結晶封入物をつくるが、これは
幾つかの鱗翅目昆虫の幼虫に有毒である。大腸菌（E.co
li）におけるこのB.t.結晶タンパク遺伝子のクローニン
グ、配列決定及び発現は、刊行文献［シェネフ・エッチ
・イー（Schnepf,H.E.）及びホワイトリー・エッチ・ア
ール（Whitely,H.R.）（1981年）,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 78巻2893−2897頁］中に記述されている。合衆国
特許第4,448,885号と第4,467,036号は、両方とも大腸菌
でのB.t.結晶タンパクの発現を明らかにしている。
本発明は、試験した全ての鱗翅類害虫に対して活性の
ある、B.t.PS81A2及びPS81RR1と命名される新規なバシ
ラス・スリンエンシス分離体に関する。
ある、B.t.PS81A2及びPS81RR1と命名される新規なバシ
ラス・スリンエンシス分離体に関する。
また、本発明は、鱗翅類害虫に毒性のある毒素を表現
する新規な毒素遺伝子を開示し特許請求している。これ
らの毒素遺伝子をプラスミドベクターを経由して適当な
宿主にうつすことが出来る。
する新規な毒素遺伝子を開示し特許請求している。これ
らの毒素遺伝子をプラスミドベクターを経由して適当な
宿主にうつすことが出来る。
特定的には、本発明はB.t.PS81A2及びPS81RR1と呼ば
れる新規なB.t.分離体、その突然変異、及び鱗翅目害虫
に対して活性のある蛋白質に対してコードしている、こ
れらのB.t.分離体に由来する新規なδエンドトキシン遺
伝子からなる。より詳しくは、B.t.PS81A2中の遺伝子は
133,601ダルトンのエンドトキシンをコードしているの
に対して、B.t.PS81RR1は133,367ダルトンのエンドトキ
シンをコードしている。
れる新規なB.t.分離体、その突然変異、及び鱗翅目害虫
に対して活性のある蛋白質に対してコードしている、こ
れらのB.t.分離体に由来する新規なδエンドトキシン遺
伝子からなる。より詳しくは、B.t.PS81A2中の遺伝子は
133,601ダルトンのエンドトキシンをコードしているの
に対して、B.t.PS81RR1は133,367ダルトンのエンドトキ
シンをコードしている。
第１表は、PS81A2によって表現された新規な毒素をコ
ードしたDNAを明らかにしている。第２表はPS81A2によ
って表現された新規な毒素のアミノ酸配列を明らかにし
ている。第３表は第１、２表を合成したものである。第
４表はPS81RR1によって表現された新規な毒素をコード
したDNAを明らかにしている。第５表はPS81RR1によって
表現された新規な毒素のアミノ酸配列を明らかにしてい
る。第６表は第４、５表を合成したものである。
ードしたDNAを明らかにしている。第２表はPS81A2によ
って表現された新規な毒素のアミノ酸配列を明らかにし
ている。第３表は第１、２表を合成したものである。第
４表はPS81RR1によって表現された新規な毒素をコード
したDNAを明らかにしている。第５表はPS81RR1によって
表現された新規な毒素のアミノ酸配列を明らかにしてい
る。第６表は第４、５表を合成したものである。
本発明の新規な毒素遺伝子は、PS81A2及びPS81RR1と
命名される新規な鱗翅類に活性のB.スリンギエンシス
（B.t.）分離体から得られた。
命名される新規な鱗翅類に活性のB.スリンギエンシス
（B.t.）分離体から得られた。
［B.t.PS81A2とPS81RR1の特性］ 集落形態−−B.t.に典型的な大集落で、表面はくすんで
いる。
いる。
増殖期の細胞形態−−B.t.に典型的。
鞭毛の血清型−−7,アイザワイ。
細胞内含有物−−胞子形成細胞は両錘型結晶をつくる。
プラスミド調製物−−プラスミド調製物のアガロースゲ
ル電気泳動は、B.t.PS81A2及びPS81RR1を、B.t.HD−１
及び他のB.t.分離体から区別している。
ル電気泳動は、B.t.PS81A2及びPS81RR1を、B.t.HD−１
及び他のB.t.分離体から区別している。
アルカリ可溶性タンパク−−B.t.PS81A2とPS81RR1は13
3,601及び133,367ダルトンのタンパクを夫々製造する。
3,601及び133,367ダルトンのタンパクを夫々製造する。
特異な毒素−−133,601及び133,367ダルトンの毒素は既
に確認されたどの毒素とも違っている。
に確認されたどの毒素とも違っている。
活性−−B.t.PS81A2及びPS81RR1は両方とも試験された
すべての鱗翅類を殺す（Trichoplusia ni,Spodoptera e
xigua及びPlutella xylostella）。
すべての鱗翅類を殺す（Trichoplusia ni,Spodoptera e
xigua及びPlutella xylostella）。
生物検定手順： スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）−−
胞子及び結晶ペレットの希釈物が準備され、USDA昆虫餌
（テクニカルブレティン1528、合衆国農務省）と混合
し、小さなプラスチックトレーに注いだ。新生スポドプ
テラ・エクシグア幼虫に餌混合物上に置き、25℃に保持
する。死亡率を６日後に記録する。
胞子及び結晶ペレットの希釈物が準備され、USDA昆虫餌
（テクニカルブレティン1528、合衆国農務省）と混合
し、小さなプラスチックトレーに注いだ。新生スポドプ
テラ・エクシグア幼虫に餌混合物上に置き、25℃に保持
する。死亡率を６日後に記録する。
他の昆虫−−スポドプテラ・エクシグアの生物特定と同
様に希釈物と餌が準備される。第４期幼虫が使用され、
８日後に死亡率が記録される。
様に希釈物と餌が準備される。第４期幼虫が使用され、
８日後に死亡率が記録される。
B.スリンギエンシスPS81A2、NRRL B−18457及びB.ス
リンギエンシスPS81RR1、NRRL B−18458とその変異種
は、標準的な既知培地と発酵手法を用いて培養できる。
発酵サイクルの終了時に、まずB.t.胞子と結晶をこの技
術で周知の手段によって発酵ブロスから分離することに
よって、細菌を取り入れることができる。回収されたB.
t.胞子及び結晶は、取り扱いと特定目標害虫への施用を
容易にするための表面活性剤、分割剤、不活性担体、及
び他の成分の添加により、水和剤、濃厚液剤、粒剤又は
他の処方剤に処方剤できる。処方と施用手順はこの技術
に周知であり、鱗翅類、例えばいも虫類に対して活性の
あるB.スリンギエンシス（HD−１）の市販菌株と一緒に
使用される。B.t.PS81A2及びPS81RR1とその変異種は鱗
翅類害虫の防除に使用できる。
リンギエンシスPS81RR1、NRRL B−18458とその変異種
は、標準的な既知培地と発酵手法を用いて培養できる。
発酵サイクルの終了時に、まずB.t.胞子と結晶をこの技
術で周知の手段によって発酵ブロスから分離することに
よって、細菌を取り入れることができる。回収されたB.
t.胞子及び結晶は、取り扱いと特定目標害虫への施用を
容易にするための表面活性剤、分割剤、不活性担体、及
び他の成分の添加により、水和剤、濃厚液剤、粒剤又は
他の処方剤に処方剤できる。処方と施用手順はこの技術
に周知であり、鱗翅類、例えばいも虫類に対して活性の
あるB.スリンギエンシス（HD−１）の市販菌株と一緒に
使用される。B.t.PS81A2及びPS81RR1とその変異種は鱗
翅類害虫の防除に使用できる。
本発明のB.t.PS81A2及びPS81RR1と、本発明の毒素遺
伝子を取り込んだ大腸菌ホストの二次培養基は、合衆国
イリノイ州ピオリア、アメリカ合衆国農務省北部地域研
究所の永久保存施設に寄託された。寄託番号と寄託日は
次のとおりである。
伝子を取り込んだ大腸菌ホストの二次培養基は、合衆国
イリノイ州ピオリア、アメリカ合衆国農務省北部地域研
究所の永久保存施設に寄託された。寄託番号と寄託日は
次のとおりである。
本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下で米国特
許商標庁長官に権原があると認められた者は、本特許出
願に対応する米国出願の係属中に、培養基を入手できる
ことを保証されているという条件により寄託された。ま
た、該米国出願又はその子孫の対応特許出願が提出され
ている米国以外の国々の特許法で要求されるとおりに、
寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入手できるから
といって、行政行為によって付与された特許権を損わし
めて本発明の実施する権利を構成するものではないこと
を理解すべきである。
許商標庁長官に権原があると認められた者は、本特許出
願に対応する米国出願の係属中に、培養基を入手できる
ことを保証されているという条件により寄託された。ま
た、該米国出願又はその子孫の対応特許出願が提出され
ている米国以外の国々の特許法で要求されるとおりに、
寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入手できるから
といって、行政行為によって付与された特許権を損わし
めて本発明の実施する権利を構成するものではないこと
を理解すべきである。
更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約
の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされ
る。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつ、どんな場合も、寄託期日
から少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発行さ
れる特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、
生育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあ
らゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養寄託物の一般への入手可能性に関するすべて
の制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久に
取り除かれる。
の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされ
る。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつ、どんな場合も、寄託期日
から少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発行さ
れる特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、
生育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあ
らゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養寄託物の一般への入手可能性に関するすべて
の制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久に
取り除かれる。
本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入
できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の
細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト、例えばシ
ュードモナスの場合、微生物は鱗翅目昆虫発生位置に施
用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結
果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わりに、毒
素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の
活性を長くするような条件下に処理できる。次に処理細
胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.毒
素の毒性を保持している。
できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の
細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト、例えばシ
ュードモナスの場合、微生物は鱗翅目昆虫発生位置に施
用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結
果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わりに、毒
素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の
活性を長くするような条件下に処理できる。次に処理細
胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.毒
素の毒性を保持している。
B.t.毒素遺伝子は適当なベクターを経て微生物ホスト
へ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ施
用される場合に、あるホスト微生物を使用することが必
須である。微生物ホストは一以上の重要作物の「植物領
域」（葉面（phylloplane）、葉領域（phyllospher
e）、根領域（rizosphere）、及び／又は根表面（rizop
lane）を占有することが知られたものを選択する。これ
らの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生成地）中
で野生型微生物とうまく競合できるよう選ばれ、ポリペ
プチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を
提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境による分解と不
活性化に対する改良された保護を提供する。
へ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ施
用される場合に、あるホスト微生物を使用することが必
須である。微生物ホストは一以上の重要作物の「植物領
域」（葉面（phylloplane）、葉領域（phyllospher
e）、根領域（rizosphere）、及び／又は根表面（rizop
lane）を占有することが知られたものを選択する。これ
らの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生成地）中
で野生型微生物とうまく競合できるよう選ばれ、ポリペ
プチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を
提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境による分解と不
活性化に対する改良された保護を提供する。
広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領
域（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及びカビを
包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばバシ
ルス（Bacillus）シュードモナス（Pseudomonas）、エ
ルウィニア（Erwinia）、セラティア（Serratia）、ク
レブシェラ（klebsiella）、キサントモナス（Xanthomn
as）、ストレプトミセス（Streptomyces）、リゾビウム
（Rhizobium）、ロードシュードモナス（Rhodopseudoma
nas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Ace
tobacter）、乳酸杆菌（Lactohacillus）、アースロバ
クター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacte
r）、リューコノストック（Leuconostoc）及びアルカリ
ゲネス（Alcaligenes）属の細菌；菌類、特に酵母、例
えばサッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッ
カス（Cryptococus）、クルイベロミセス（kluyveromyc
es）、スポロポロミセス（Sporobolomyces）、ロードト
ルラ（Rhodotorula）、及びオーレオバシジウム（Aureo
basidium）属の微生物である。特に重要なものは、シュ
ードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シ
ュードモナス・フルオレッセンス、セラティア・マルセ
スケンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・
キシリヌム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrohacterium tumefacien
s）、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Rhodops
eudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペスト
リス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオ
チ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロ
フス（Alcaligenes entrophus）及びアゾトバクター・
ヴィンランティ（Azotobacter vinlandii）のような植
物領域の細菌種；及びロードトルラ・ルブラ（Rhodotor
ula rubra）、R.グルチニス（R.glutinis）、R.マリー
ナ（R.marina）、R.オーランティアカ（R.aurantiac
a）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus ai
bidus）、C.ジフルエンス（C.diffluens）、C.ローレン
ティ（C.laurentil）、サッカロミセス・ロゼイ（S.ros
ei）、S.プレトリエンシス（S.pretoriensis）、S.セレ
ビシエ（S.cerevisiae），スポロポロミセス・ロゼウス
（Sporobolomyces roseus）、S.オドルス（S.odoru
s）、クルイベロミセス・ヴェローナエ（kluyveromyces
veronae）及びオーレオバシジウム・ポルランス（Aure
obasidium pollulans）のような植物領域の酵母種であ
る。特に重要なのは有色素微生物である。
域（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及びカビを
包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばバシ
ルス（Bacillus）シュードモナス（Pseudomonas）、エ
ルウィニア（Erwinia）、セラティア（Serratia）、ク
レブシェラ（klebsiella）、キサントモナス（Xanthomn
as）、ストレプトミセス（Streptomyces）、リゾビウム
（Rhizobium）、ロードシュードモナス（Rhodopseudoma
nas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Ace
tobacter）、乳酸杆菌（Lactohacillus）、アースロバ
クター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacte
r）、リューコノストック（Leuconostoc）及びアルカリ
ゲネス（Alcaligenes）属の細菌；菌類、特に酵母、例
えばサッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッ
カス（Cryptococus）、クルイベロミセス（kluyveromyc
es）、スポロポロミセス（Sporobolomyces）、ロードト
ルラ（Rhodotorula）、及びオーレオバシジウム（Aureo
basidium）属の微生物である。特に重要なものは、シュ
ードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シ
ュードモナス・フルオレッセンス、セラティア・マルセ
スケンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・
キシリヌム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrohacterium tumefacien
s）、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Rhodops
eudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペスト
リス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオ
チ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロ
フス（Alcaligenes entrophus）及びアゾトバクター・
ヴィンランティ（Azotobacter vinlandii）のような植
物領域の細菌種；及びロードトルラ・ルブラ（Rhodotor
ula rubra）、R.グルチニス（R.glutinis）、R.マリー
ナ（R.marina）、R.オーランティアカ（R.aurantiac
a）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus ai
bidus）、C.ジフルエンス（C.diffluens）、C.ローレン
ティ（C.laurentil）、サッカロミセス・ロゼイ（S.ros
ei）、S.プレトリエンシス（S.pretoriensis）、S.セレ
ビシエ（S.cerevisiae），スポロポロミセス・ロゼウス
（Sporobolomyces roseus）、S.オドルス（S.odoru
s）、クルイベロミセス・ヴェローナエ（kluyveromyces
veronae）及びオーレオバシジウム・ポルランス（Aure
obasidium pollulans）のような植物領域の酵母種であ
る。特に重要なのは有色素微生物である。
遺伝子の安定な保持と発現を可能とするような条件下
に、毒素を発現させるB.t.遺伝子を微生物ホストに導入
するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺伝子発
現用の転写翻訳調節信号、その調節制御下の毒素遺伝子
及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列と相同の
DNA配列、及び／又は組込みや安定な保持が起こるため
の、ホスト内で機能的な働きをする複製系などを含んど
DNA構造体を用意することができる。
に、毒素を発現させるB.t.遺伝子を微生物ホストに導入
するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺伝子発
現用の転写翻訳調節信号、その調節制御下の毒素遺伝子
及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列と相同の
DNA配列、及び／又は組込みや安定な保持が起こるため
の、ホスト内で機能的な働きをする複製系などを含んど
DNA構造体を用意することができる。
転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含
しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、
毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするの
が望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチ
ベータやヘンハンサに結合する領域、によって達成で
き、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によ
って誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用す
ると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境
へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒
素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環
境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在しよう。
しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、
毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするの
が望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチ
ベータやヘンハンサに結合する領域、によって達成で
き、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によ
って誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用す
ると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境
へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒
素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環
境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在しよう。
特に活性プロモータを使用し、並びに、メッセンジャ
ーRNAの安定性を強化する配列を使用することによっ
て、メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作
を使用できる。転写及び翻訳終結領域は停止コドン、終
結領域、及び任意付加的にポリアデニル化信号を包含し
よう。内側の膜を通じて蛋白質の分泌を促進する為に、
翻訳されたポリペプチド配列のアミノ末端に於いて、疎
水性の「リーダー」配列が使用され得る。
ーRNAの安定性を強化する配列を使用することによっ
て、メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作
を使用できる。転写及び翻訳終結領域は停止コドン、終
結領域、及び任意付加的にポリアデニル化信号を包含し
よう。内側の膜を通じて蛋白質の分泌を促進する為に、
翻訳されたポリペプチド配列のアミノ末端に於いて、疎
水性の「リーダー」配列が使用され得る。
転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の
５′から３′への方向で、構造体は転写調節領域（これ
がある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの
５′又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位
置、開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠を
もった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配
列（使用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本
鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換
に使用できるが、普通はマーカーを含めたDNA配列を伴
うようにし、この第二のDNA配列は、ホストへのDNA導入
中に毒素発現構造体に結合させることができる。
５′から３′への方向で、構造体は転写調節領域（これ
がある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの
５′又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位
置、開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠を
もった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配
列（使用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本
鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換
に使用できるが、普通はマーカーを含めたDNA配列を伴
うようにし、この第二のDNA配列は、ホストへのDNA導入
中に毒素発現構造体に結合させることができる。
マーカーとは、変更又は形質転換されたホストの選定
を行なうための構造遺伝子のことである。マーカーは通
常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重
金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養要素ホストに原
栄養性を与える相補性を提供する。変更されたホストが
選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、相
補性を使用するのが好ましい。構造体に開発に、またホ
ストの変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野外
で他の野生型微生物に対する競合的利点を提供すること
によって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレー
ト剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素発
現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。この方
法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産ホスト
に競合的利点を提供するため、ホストは野生型微生物と
効果的に競合し、環境中で安定した生態地位を占めるよ
うになる。
を行なうための構造遺伝子のことである。マーカーは通
常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重
金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養要素ホストに原
栄養性を与える相補性を提供する。変更されたホストが
選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、相
補性を使用するのが好ましい。構造体に開発に、またホ
ストの変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野外
で他の野生型微生物に対する競合的利点を提供すること
によって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレー
ト剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素発
現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。この方
法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産ホスト
に競合的利点を提供するため、ホストは野生型微生物と
効果的に競合し、環境中で安定した生態地位を占めるよ
うになる。
機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内
の配列と相同な、少なくとも50塩基対（bp）、好ましく
は約100ph、及び通常約1,000bpまでの配列を包含しよ
う。こうして合法的組換えの確率が強化されるため、遺
伝子はホストへ組込まれ、ホストによって安定に保持さ
れる。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合
的利点を提供する遺伝子に接近しているのが望ましい。
従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。
の配列と相同な、少なくとも50塩基対（bp）、好ましく
は約100ph、及び通常約1,000bpまでの配列を包含しよ
う。こうして合法的組換えの確率が強化されるため、遺
伝子はホストへ組込まれ、ホストによって安定に保持さ
れる。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合
的利点を提供する遺伝子に接近しているのが望ましい。
従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。
細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻
類、カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域はtrp遺
伝子、iac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモー
タ、Tacプロモータ、及びホスト中で機能的な場合は毒
素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータを包含す
る。例として合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832
号、及び第4,356,270号を参照のこと。二つの領域がホ
スト内で適合的で機能的である限り、終結領域は、普通
は転写開始領域と関連する終結領域か、又は異なる転写
開始領域でありうる。
類、カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域はtrp遺
伝子、iac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモー
タ、Tacプロモータ、及びホスト中で機能的な場合は毒
素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータを包含す
る。例として合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832
号、及び第4,356,270号を参照のこと。二つの領域がホ
スト内で適合的で機能的である限り、終結領域は、普通
は転写開始領域と関連する終結領域か、又は異なる転写
開始領域でありうる。
安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、
ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使用さ
れよう。複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常
存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安定なウイル
スの複製系から誘導される。pBR322、pACYC184、RSF101
0、pR01614等のような多数のプラスミドが入手できる。
例として、オルソン（Olson）ら、（1982年）J.Bacteri
ol.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasarian）
ら、（1981年）Gene16巻237頁、並びに、米国特許第4,3
56,270号、第4,362,817号及び第4,371,625号を参照のこ
と。
ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使用さ
れよう。複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常
存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安定なウイル
スの複製系から誘導される。pBR322、pACYC184、RSF101
0、pR01614等のような多数のプラスミドが入手できる。
例として、オルソン（Olson）ら、（1982年）J.Bacteri
ol.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasarian）
ら、（1981年）Gene16巻237頁、並びに、米国特許第4,3
56,270号、第4,362,817号及び第4,371,625号を参照のこ
と。
B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、転
写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を含有するが、一つ以上を包含
でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開発中にク
ローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストで
の機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上
のマーカーが存在できる。組込みを望む場合は、プラス
ミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。
写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を含有するが、一つ以上を包含
でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開発中にク
ローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストで
の機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上
のマーカーが存在できる。組込みを望む場合は、プラス
ミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。
形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在す
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
殺虫剤含有細胞を処理して処理細胞を目標害虫環境に
施用する時に、細胞内毒素の活性を長くするのに適した
ホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通
常、哺乳類のような高等生物に有毒な物質を生じない細
胞に限定される。しかし、毒素が不安定な、哺乳類ホス
トへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準
である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も
使用できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核
生物と、菌類のような低級真核生物である。グラム陰性
・陽性双方の原核生物の例は、エシエリキア（Escheric
hia）、エルフィニア（Erwinia）、シゲラ（Shigell
a）、サルモネラ（Salmonella）及びプロテウス（Prote
us）のような腸内細菌科（Enterobacteriaceae）；バシ
ラス科（Bacillaceae）；リゾビウム（Rhizobium）のよ
うなリゾビウム科（Rhizo−biaceae）；発光細菌、ジモ
モナス（Zymomonoas），セラティア（Serratia）、アエ
ロモナス（Aeromonas）、ビブリオ（Vibrio）、デスル
ホビブリオ（Desulfovibrio）、スピリルム（Spirillu
m）のようならせん菌科；乳酸かん菌科（Lactobacillac
eae）；シュードモナス（Pseudomonas）及びアセトバク
ター（Acetobacter）のようなシュードモナス科；アゾ
トバクター科、放線菌目（Actinomycetales）及びニト
ロバクター科を包含する。真核生物には藻菌類（Phycom
ycetes）と子のうち菌類（Ascomycetes）のような菌類
があり、これはサッカロミセス（Saccharomyces）とシ
ゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）のような酵
母、ロードトルラ（Rhodotorula）、オーレオバシジウ
ム（Aureohasidium）、スポロボロミセス（Sporobromyc
es）のような担子菌類（Basidiomycetes）酵母を包含す
る。
施用する時に、細胞内毒素の活性を長くするのに適した
ホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通
常、哺乳類のような高等生物に有毒な物質を生じない細
胞に限定される。しかし、毒素が不安定な、哺乳類ホス
トへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準
である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も
使用できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核
生物と、菌類のような低級真核生物である。グラム陰性
・陽性双方の原核生物の例は、エシエリキア（Escheric
hia）、エルフィニア（Erwinia）、シゲラ（Shigell
a）、サルモネラ（Salmonella）及びプロテウス（Prote
us）のような腸内細菌科（Enterobacteriaceae）；バシ
ラス科（Bacillaceae）；リゾビウム（Rhizobium）のよ
うなリゾビウム科（Rhizo−biaceae）；発光細菌、ジモ
モナス（Zymomonoas），セラティア（Serratia）、アエ
ロモナス（Aeromonas）、ビブリオ（Vibrio）、デスル
ホビブリオ（Desulfovibrio）、スピリルム（Spirillu
m）のようならせん菌科；乳酸かん菌科（Lactobacillac
eae）；シュードモナス（Pseudomonas）及びアセトバク
ター（Acetobacter）のようなシュードモナス科；アゾ
トバクター科、放線菌目（Actinomycetales）及びニト
ロバクター科を包含する。真核生物には藻菌類（Phycom
ycetes）と子のうち菌類（Ascomycetes）のような菌類
があり、これはサッカロミセス（Saccharomyces）とシ
ゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）のような酵
母、ロードトルラ（Rhodotorula）、オーレオバシジウ
ム（Aureohasidium）、スポロボロミセス（Sporobromyc
es）のような担子菌類（Basidiomycetes）酵母を包含す
る。
生産目的のためにホスト細胞を選定する上で特に重要
な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容易さ、発現
系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セルとして使用するのに重要な特性は厚い細胞壁、色素
形成、及び細胞内パッケージング又は封入体の形成のよ
うな殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害
虫に摂取させるたむの誘引力；毒素に損害を与えない殺
菌固定の容易さ等を含有する。他の考慮としては、処方
と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。
な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容易さ、発現
系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セルとして使用するのに重要な特性は厚い細胞壁、色素
形成、及び細胞内パッケージング又は封入体の形成のよ
うな殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害
虫に摂取させるたむの誘引力；毒素に損害を与えない殺
菌固定の容易さ等を含有する。他の考慮としては、処方
と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。
特に重要なホスト生物は、ロードトルラの種、オーレ
オバシジウムの種、サッカロミセスの種、スポロボロミ
セスの種のような酵母；シュードモナスの種、エルウィ
ニアの種、及びフラボバクテリウムの種のような葉面に
生息する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌の種、バシ
ラスの種、ストレプトミセスの種等の他の生物を包含す
る。特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ
（Pseldomonas aerginosa）、シュードモナス・フルオ
レッセンス（P.fluorescens）、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バシラス・スリ
ンギエンシス、大腸菌、枯草菌（B.subtilis）、ストレ
プトミセスリビダス（Streptomyces lividas）等を包含
する。
オバシジウムの種、サッカロミセスの種、スポロボロミ
セスの種のような酵母；シュードモナスの種、エルウィ
ニアの種、及びフラボバクテリウムの種のような葉面に
生息する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌の種、バシ
ラスの種、ストレプトミセスの種等の他の生物を包含す
る。特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ
（Pseldomonas aerginosa）、シュードモナス・フルオ
レッセンス（P.fluorescens）、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バシラス・スリ
ンギエンシス、大腸菌、枯草菌（B.subtilis）、ストレ
プトミセスリビダス（Streptomyces lividas）等を包含
する。
細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実
質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。
質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。
微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物
の処理は、毒素の状態に悪影響を及ぼさないか、又は毒
素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は
物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合
わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子
番号17−80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ
素を温和条件下に、所望の結果を達成するのに十分な時
間に使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒド
とグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼフ
ィランと塩化セチルピリジウムのような抗感染剤；イソ
プロピルアルコールとエタノールのようなアルコール
類；ルゴールヨウ素、ブアン固定剤とヘリー固定剤［フ
マソン（Humason）、グレッチェン・エル（Gretchen,
L.）「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン
社、1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等
での処理；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞中
につくられる毒素の活性を保存し、持続させるような物
理的処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含す
る。物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短
波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。
の処理は、毒素の状態に悪影響を及ぼさないか、又は毒
素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は
物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合
わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子
番号17−80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ
素を温和条件下に、所望の結果を達成するのに十分な時
間に使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒド
とグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼフ
ィランと塩化セチルピリジウムのような抗感染剤；イソ
プロピルアルコールとエタノールのようなアルコール
類；ルゴールヨウ素、ブアン固定剤とヘリー固定剤［フ
マソン（Humason）、グレッチェン・エル（Gretchen,
L.）「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン
社、1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等
での処理；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞中
につくられる毒素の活性を保存し、持続させるような物
理的処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含す
る。物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短
波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。
一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するよう
な、強化された構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプ
ロ型の、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟
型への加工を抑制しないように、不活性化方法を選定す
べきである。例えばホルムアルデヒドはタンパクを架橋
し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制できる。不
活性化ないし殺菌方法は、毒素の少なくとも実質部分の
生物学的利用率又は生物活性を保持する。
な、強化された構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプ
ロ型の、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟
型への加工を抑制しないように、不活性化方法を選定す
べきである。例えばホルムアルデヒドはタンパクを架橋
し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制できる。不
活性化ないし殺菌方法は、毒素の少なくとも実質部分の
生物学的利用率又は生物活性を保持する。
B.t.殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは任意慣用の
栄養培地で生育できるが、DNA構造体は選択的利点を提
供するため、細胞の全量又は実質的全量がB.t.遺伝子を
保持するように選択培地となる。次にこれらの細胞を慣
用方法に従って取り入れる。その代わりに、細胞を取り
入れる前に処理することもできる。
栄養培地で生育できるが、DNA構造体は選択的利点を提
供するため、細胞の全量又は実質的全量がB.t.遺伝子を
保持するように選択培地となる。次にこれらの細胞を慣
用方法に従って取り入れる。その代わりに、細胞を取り
入れる前に処理することもできる。
B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これらを無機鉱
物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植
物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等）
のような種々の不活性材料と混合することにより、水和
剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助
剤、安定剤、その他殺虫剤、又は表面活性剤を包含でき
る。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フ
ォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成分
は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包
含できる。
物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植
物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等）
のような種々の不活性材料と混合することにより、水和
剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助
剤、安定剤、その他殺虫剤、又は表面活性剤を包含でき
る。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フ
ォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成分
は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包
含できる。
殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使
用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なく
とも１重量％で存在し、100重量％でありうる。乾燥処
方剤は約１−95重量％の殺虫剤をもつが、液体処方剤は
一般に約１−60重量％の固形分を液相中にもつであろ
う。処方剤は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞
をもつであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約
50mg（液体又は乾燥）ないし1kg以上の率で投与されよ
う。
用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なく
とも１重量％で存在し、100重量％でありうる。乾燥処
方剤は約１−95重量％の殺虫剤をもつが、液体処方剤は
一般に約１−60重量％の固形分を液相中にもつであろ
う。処方剤は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞
をもつであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約
50mg（液体又は乾燥）ないし1kg以上の率で投与されよ
う。
処方剤は鱗翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水
に噴霧、散布、散水等によって施用できる。
に噴霧、散布、散水等によって施用できる。
PS81A2及びPS81RR1の変異種は、この技術で周知の手
順によってつくることができる。例えば、非胞子形成性
変異種は、PS81A2及びPS81RR1のエチルメタンスルホネ
ート（EMS）変異誘発によって得られる。変異種は、こ
の技術で周知の手順により、紫外光やニトロソグアニジ
ンを使用してつくることができる。
順によってつくることができる。例えば、非胞子形成性
変異種は、PS81A2及びPS81RR1のエチルメタンスルホネ
ート（EMS）変異誘発によって得られる。変異種は、こ
の技術で周知の手順により、紫外光やニトロソグアニジ
ンを使用してつくることができる。
低いパーセントの非胞子形成突然変異が無傷のままで
残り、長い醗酵期間にわたって溶菌されない。これらの
系統は溶菌マイナス（−）と命名される。溶菌ナイナス
系統は振盪フラスコ媒体中で非胞子形成性の突然変異を
スクリーニングし、醗酵の終わりにまだ無傷でかつ毒素
結晶を含有している突然変異を選択することによって同
定できる。溶菌マイナス系統は保護されたカプセル封入
された毒素蛋白質を生じる細胞固定方法に適している。
残り、長い醗酵期間にわたって溶菌されない。これらの
系統は溶菌マイナス（−）と命名される。溶菌ナイナス
系統は振盪フラスコ媒体中で非胞子形成性の突然変異を
スクリーニングし、醗酵の終わりにまだ無傷でかつ毒素
結晶を含有している突然変異を選択することによって同
定できる。溶菌マイナス系統は保護されたカプセル封入
された毒素蛋白質を生じる細胞固定方法に適している。
この非胞子形成性突然変異のファージ抵抗性の変種を
造る為に、ファージ溶菌物のアリコートを栄養寒天上に
広げ、乾燥させた。ファージ感受性の細菌系統のアリコ
ートは次に乾燥溶菌物上でプレートにされ、乾燥され
る。このプレートを30℃で培養する。プレートを２日間
培養し、その時点で寒天上に生育する数多くのコロニー
が見られる。これらのコロニーの幾つかを拾い上げ、栄
養寒天プレート上でサブカルチャーにした。これらの見
掛け上抵抗性の培養基をファージ溶菌物とのクロススト
リーキングによって抵抗性を試験した。ファージ溶菌物
の線をプレートにひき、乾燥させる。抵抗性と仮定した
培養基を次にファージの線と交差させてストリークす
る。抵抗性の細菌培養基は30℃での一夜培養の後、ファ
ージの線と交差するストリーキングのどこにも溶菌を示
さない。次に、抵抗性の培養基のローン（綿布）を、栄
養寒天プレート上にプレートにすることによって、ファ
ージに対する抵抗性を再確認した。感受性の系統もまた
ポジティブ対照として役立てるために同様にプレートに
した。乾燥後、ファージ溶菌物の一滴をそのプレートの
中心にプレートし、乾燥させた。抵抗性の培養基は30℃
で24時間後、ファージ溶菌物が置かれた区域で溶菌を示
さなかった。
造る為に、ファージ溶菌物のアリコートを栄養寒天上に
広げ、乾燥させた。ファージ感受性の細菌系統のアリコ
ートは次に乾燥溶菌物上でプレートにされ、乾燥され
る。このプレートを30℃で培養する。プレートを２日間
培養し、その時点で寒天上に生育する数多くのコロニー
が見られる。これらのコロニーの幾つかを拾い上げ、栄
養寒天プレート上でサブカルチャーにした。これらの見
掛け上抵抗性の培養基をファージ溶菌物とのクロススト
リーキングによって抵抗性を試験した。ファージ溶菌物
の線をプレートにひき、乾燥させる。抵抗性と仮定した
培養基を次にファージの線と交差させてストリークす
る。抵抗性の細菌培養基は30℃での一夜培養の後、ファ
ージの線と交差するストリーキングのどこにも溶菌を示
さない。次に、抵抗性の培養基のローン（綿布）を、栄
養寒天プレート上にプレートにすることによって、ファ
ージに対する抵抗性を再確認した。感受性の系統もまた
ポジティブ対照として役立てるために同様にプレートに
した。乾燥後、ファージ溶菌物の一滴をそのプレートの
中心にプレートし、乾燥させた。抵抗性の培養基は30℃
で24時間後、ファージ溶菌物が置かれた区域で溶菌を示
さなかった。
以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示し
た実地例である。これらの例は限定的に考えられてはな
らない。他に注意がなければ、百分率はすべて容量によ
る。
た実地例である。これらの例は限定的に考えられてはな
らない。他に注意がなければ、百分率はすべて容量によ
る。
実施例１ B.t.PS81A2及びPS81RR1の培養 B.t.PS81A2及びPS81RR1又はその突然変異の二次培養
基を使用して次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・
塩培地に接種できる。
基を使用して次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・
塩培地に接種できる。
バクト・ペプトン 7.5 g/ ブドウ糖 1.0 g/ KH2PO4 3.4 g/ K2HPO4 7.35g/ 塩溶液 5.0 ml/ CaCl2溶液 5.0 ml/ 塩溶液（100ml） MgCO4−7H2O 2.46g MnSO4−H2O 0.04g ZnSO4−7H2O 0.28g FeSO4−7H2O 0.40g CaCl2溶液（100ml） CaCl2・2H2O 3.66g pH7.2 塩溶液とCaCl2溶液を濾過減菌し、オートクレープ処
理し調理したブロスに、接種時に添加する。200rpmで操
作される回転振盪機で、フラスコを30℃、64時間培養す
る。
理し調理したブロスに、接種時に添加する。200rpmで操
作される回転振盪機で、フラスコを30℃、64時間培養す
る。
上の手順は、この技術で周知の手順により、大発酵装
置まで容易に規模拡大できる。
置まで容易に規模拡大できる。
上の発酵で得られるB.t.胞子及び／又は結晶は、この
技術で周知の手順により単離できる。しばしば用いられ
る手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例えば遠心分
離にかけることである。
技術で周知の手順により単離できる。しばしば用いられ
る手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例えば遠心分
離にかけることである。
実施例２ 分離体PS81A2からの新規な毒素遺伝子のクロ
ーニングと大腸菌への形質転換 低光学密度（0D600＝1.0）に生育させたB.t.細胞から
全細胞性DNAを調製した。20％庶糖と50mg/mlリゾチーム
を含有するTES緩衝液（30mMトリス−Cl、10mMエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）、50mM NaCl、pH＝8.0）中で遠
心分離しプロトプラスト化させることによって細胞の回
収した。プロトプラストを４％の最終濃度までドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）添加によって溶菌した。細胞材
料を（最終濃度）100mMの中性塩化カリウム中、４℃で
一夜沈殿させた。上澄み液をフェノール／クロロホルム
（1:1）で２回抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、
セシウム勾配上の等密度バンディングによって精製し
た。
ーニングと大腸菌への形質転換 低光学密度（0D600＝1.0）に生育させたB.t.細胞から
全細胞性DNAを調製した。20％庶糖と50mg/mlリゾチーム
を含有するTES緩衝液（30mMトリス−Cl、10mMエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）、50mM NaCl、pH＝8.0）中で遠
心分離しプロトプラスト化させることによって細胞の回
収した。プロトプラストを４％の最終濃度までドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）添加によって溶菌した。細胞材
料を（最終濃度）100mMの中性塩化カリウム中、４℃で
一夜沈殿させた。上澄み液をフェノール／クロロホルム
（1:1）で２回抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、
セシウム勾配上の等密度バンディングによって精製し
た。
PS81A2とB.t.k.HD−１からの全細胞DNAをEcoR Iで消
化させ、0.8％アガロースゲル−TAE−緩衝化ゲル上の電
気泳動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、NR
RL B−18332のプラスミドpM3,130−７中に含まれる毒素
遺伝子のNsi IからNsi Iまでの断片、及び“4.5kbクラ
ス”の毒素遺伝子［クロンスタッド（Kronstad）及びホ
ワイトリー（Whitely）（1986年）Gene USA 43巻29−40
頁］のNsi Iからkpn Iまでの断片でプローブした。これ
らの二つの断片を一緒にし、プローブとして用いた。結
果は、PS81A2のハイブリッド化断片がHD−１のそれと異
なることを示している。特定的には、PS81A2中の3.0kb
のハイブリッド化バンドが、HD−１中に見られる3.8kb
及び1.8kbのハイブリッド化バンドの代わりに検出され
た。
化させ、0.8％アガロースゲル−TAE−緩衝化ゲル上の電
気泳動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、NR
RL B−18332のプラスミドpM3,130−７中に含まれる毒素
遺伝子のNsi IからNsi Iまでの断片、及び“4.5kbクラ
ス”の毒素遺伝子［クロンスタッド（Kronstad）及びホ
ワイトリー（Whitely）（1986年）Gene USA 43巻29−40
頁］のNsi Iからkpn Iまでの断片でプローブした。これ
らの二つの断片を一緒にし、プローブとして用いた。結
果は、PS81A2のハイブリッド化断片がHD−１のそれと異
なることを示している。特定的には、PS81A2中の3.0kb
のハイブリッド化バンドが、HD−１中に見られる3.8kb
及び1.8kbのハイブリッド化バンドの代わりに検出され
た。
PSR1A2の全細胞DNA 200μｇをEcoR Iで消化させ、分
離用0.8％アガロース−TAEゲル上に電気泳動によって分
離した。ゲルの2.5kbから3.5kbの領域を切り出し、そこ
からのDNAを電気溶離し、ELUTRIPTM−ｄ（シュライヒャ
ー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー州キー
ン）イオン交換カラムを用いて濃縮した。単離されたEc
oR I断片をLAMBDA ZAPTMEcoR Iアーム（ストラタジーン
・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州ラホ
ヤ）に再結合し、Gigapak GOLDTM（ストラテジーン）エ
キストラクトを用いてパッケージ処理した。パッケージ
化した組換えフィージを大腸菌菌株BB4（ストラトジー
ン）と一緒にフレートに撒くと、高プラーク密度から得
られた。プラークを放射性標識付きプローブにより標準
的核酸ハイブリッド化手順によって選定した。ハイブリ
ッド化されたプラークを精製し、低プラーク密度で再選
定した。生ずる精製ファージを、R408 M13ヘルパーファ
ージ（ストラトジーン）と一緒に生育させ、組換えBlue
ScriptTM（ストラタジーン）プラスミドを自動的に切り
出し、パッケージ化した。自動化切り出し法の一部とし
て、「ファージミッド」をXL1−Blue大腸菌細胞（スト
ラトジーン）に再感染させた。感染XL1−Blue細胞をア
ンピシリン耐性について選定し、所望のプラスミドを見
つけるため、生ずるコロニーを標準ミニプレップ化手順
によって分析した。プラスミドpM6,31−１は、約3.0kb
EcoR I挿入物を含有しており、ストラタジーン社のT7及
びT3プライマー、プラス一組の既存B.t.エンドトキシ遺
伝子ンオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定
した。約1.8kbの毒素遺伝子の配列を決定し、PS81A2を
他のクローン化されたB.t.エンドトキシン遺伝子と比較
するデータ分析はPS81A2の配列が独特のものであること
を示した。合成オリゴヌクレオチド（CAGATCCACGAGGCTT
ATCTTCCAGAACTAC）を、他の存在するB.t.エンドトキシ
ン遺伝子と較べて最も相同でないPS81A2配列の一つの領
域に構築した。
離用0.8％アガロース−TAEゲル上に電気泳動によって分
離した。ゲルの2.5kbから3.5kbの領域を切り出し、そこ
からのDNAを電気溶離し、ELUTRIPTM−ｄ（シュライヒャ
ー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー州キー
ン）イオン交換カラムを用いて濃縮した。単離されたEc
oR I断片をLAMBDA ZAPTMEcoR Iアーム（ストラタジーン
・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州ラホ
ヤ）に再結合し、Gigapak GOLDTM（ストラテジーン）エ
キストラクトを用いてパッケージ処理した。パッケージ
化した組換えフィージを大腸菌菌株BB4（ストラトジー
ン）と一緒にフレートに撒くと、高プラーク密度から得
られた。プラークを放射性標識付きプローブにより標準
的核酸ハイブリッド化手順によって選定した。ハイブリ
ッド化されたプラークを精製し、低プラーク密度で再選
定した。生ずる精製ファージを、R408 M13ヘルパーファ
ージ（ストラトジーン）と一緒に生育させ、組換えBlue
ScriptTM（ストラタジーン）プラスミドを自動的に切り
出し、パッケージ化した。自動化切り出し法の一部とし
て、「ファージミッド」をXL1−Blue大腸菌細胞（スト
ラトジーン）に再感染させた。感染XL1−Blue細胞をア
ンピシリン耐性について選定し、所望のプラスミドを見
つけるため、生ずるコロニーを標準ミニプレップ化手順
によって分析した。プラスミドpM6,31−１は、約3.0kb
EcoR I挿入物を含有しており、ストラタジーン社のT7及
びT3プライマー、プラス一組の既存B.t.エンドトキシ遺
伝子ンオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定
した。約1.8kbの毒素遺伝子の配列を決定し、PS81A2を
他のクローン化されたB.t.エンドトキシン遺伝子と比較
するデータ分析はPS81A2の配列が独特のものであること
を示した。合成オリゴヌクレオチド（CAGATCCACGAGGCTT
ATCTTCCAGAACTAC）を、他の存在するB.t.エンドトキシ
ン遺伝子と較べて最も相同でないPS81A2配列の一つの領
域に構築した。
Sau3Aで部分的に消化し、0.6％アガロース−TAEゲル
上の９〜23kbの断片の混合物として電気泳動で分画し
た、PS81A2の全細胞DNAを、ラムダDASHTM（ストラテジ
ーン製）に連結した。高力価パッケージ化されたファー
ジをP2392大腸菌細胞（ストラテジーン製）上でプレー
トにし、核酸ハイブリッド化プローブとして放射標識さ
れた合成のオリゴヌクレオチド（前記のもの）を用いて
スクリーニングした。ハイブリッド化プラークをより低
いプラーク密度で再スクリーニングした。DNA単離の為
のフアージの製造の為に液体培養基中でP2392大腸菌細
胞を感染させる為に、単一の精製をしたハイブリッド化
プラークを使用した。DNAは標準手順で単離した。組替
えファージDNAの製造の為の量はSal Iで消化し（挿入さ
れたDNAをラムダアームから開放する為）、そして0.6％
アガロース−TAEゲル上で電気泳動させることによって
分離した。上記のように電気溶離しそして濃縮した大き
な断片を、Sal I消化脱ホスホリル化pUC19（NEB）に連
結した。連結した混合物を大腸菌DH5（アルファ）コン
ピテント細胞（BRL）に形質転換し、そしてアンピシリ
ン、イソプロピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（lP
TG）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
（β）−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上
にプレートにした。白いコロニー（pUC19のβ−ガラク
トシド遺伝子中に挿入物を有する）を標準のミニプレッ
プ（minipurep）手順にかけ、pM4,122−３と命名される
プラスミドを単離した。「4.5kbクラス」の毒素遺伝子
に対して造ったオリゴヌクレオチドプライマーを用い、
そしてPS81A2の配列に対して造ったプライマーと「ウォ
ーキング」させることによって、完全な長さの毒素遺伝
子の配列を決定した。
上の９〜23kbの断片の混合物として電気泳動で分画し
た、PS81A2の全細胞DNAを、ラムダDASHTM（ストラテジ
ーン製）に連結した。高力価パッケージ化されたファー
ジをP2392大腸菌細胞（ストラテジーン製）上でプレー
トにし、核酸ハイブリッド化プローブとして放射標識さ
れた合成のオリゴヌクレオチド（前記のもの）を用いて
スクリーニングした。ハイブリッド化プラークをより低
いプラーク密度で再スクリーニングした。DNA単離の為
のフアージの製造の為に液体培養基中でP2392大腸菌細
胞を感染させる為に、単一の精製をしたハイブリッド化
プラークを使用した。DNAは標準手順で単離した。組替
えファージDNAの製造の為の量はSal Iで消化し（挿入さ
れたDNAをラムダアームから開放する為）、そして0.6％
アガロース−TAEゲル上で電気泳動させることによって
分離した。上記のように電気溶離しそして濃縮した大き
な断片を、Sal I消化脱ホスホリル化pUC19（NEB）に連
結した。連結した混合物を大腸菌DH5（アルファ）コン
ピテント細胞（BRL）に形質転換し、そしてアンピシリ
ン、イソプロピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（lP
TG）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
（β）−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上
にプレートにした。白いコロニー（pUC19のβ−ガラク
トシド遺伝子中に挿入物を有する）を標準のミニプレッ
プ（minipurep）手順にかけ、pM4,122−３と命名される
プラスミドを単離した。「4.5kbクラス」の毒素遺伝子
に対して造ったオリゴヌクレオチドプライマーを用い、
そしてPS81A2の配列に対して造ったプライマーと「ウォ
ーキング」させることによって、完全な長さの毒素遺伝
子の配列を決定した。
プラスミドpM4,122−２は、約133,601ダルトンのエン
ドトキンをコードしている3.522kbを含めた、約15kbのP
481A2 DNAを含有する。PS81A2毒素遺伝子のORFはpM4,12
2−３から単離され、そして、5.5kbのプラント末端のDr
a III断片としてパシルスシャトルベクトルpBC1ac中に
サブクローン化された。大腸菌NM522細胞を形質転換
し、アンピシリンを補充したLB寒天上でプレートにし
た。生じるコロニーを標準のミニプレップ（minipep）
手順によって分析し、挿入物を含有しているプラスミド
を単離した。所望のプラスミドpMYC389はPS81A2毒素遺
伝子のコード配列を含有している。
ドトキンをコードしている3.522kbを含めた、約15kbのP
481A2 DNAを含有する。PS81A2毒素遺伝子のORFはpM4,12
2−３から単離され、そして、5.5kbのプラント末端のDr
a III断片としてパシルスシャトルベクトルpBC1ac中に
サブクローン化された。大腸菌NM522細胞を形質転換
し、アンピシリンを補充したLB寒天上でプレートにし
た。生じるコロニーを標準のミニプレップ（minipep）
手順によって分析し、挿入物を含有しているプラスミド
を単離した。所望のプラスミドpMYC389はPS81A2毒素遺
伝子のコード配列を含有している。
実施例３ 分離体PS81RR1からの新規な毒素遺伝子のク
ローニングと大腸菌への形質転換 低光学密度（OD600＝1.0）に生育させたB.t.細胞から
全細胞性DNAを調製した。20％庶糖と50mg/mlリゾチーム
を含有するTES緩衝液（30mMトリス−Cl、10mMエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）、50mM NaCl、pH＝8.0）中で遠
心分離しプロトプラスト化させることによって細胞の回
収した。プロトプラストを４％の最終濃度までドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）添加によって溶菌した。細胞材
料を（最終濃度）100mMの中性塩化カリウム中、４℃で
一夜沈殿させた。上澄み液をフェノール／クロロホルム
（1:1）で２回抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、
塩化セシウム勾配上の等密度バンディングによって精製
した。
ローニングと大腸菌への形質転換 低光学密度（OD600＝1.0）に生育させたB.t.細胞から
全細胞性DNAを調製した。20％庶糖と50mg/mlリゾチーム
を含有するTES緩衝液（30mMトリス−Cl、10mMエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）、50mM NaCl、pH＝8.0）中で遠
心分離しプロトプラスト化させることによって細胞の回
収した。プロトプラストを４％の最終濃度までドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）添加によって溶菌した。細胞材
料を（最終濃度）100mMの中性塩化カリウム中、４℃で
一夜沈殿させた。上澄み液をフェノール／クロロホルム
（1:1）で２回抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、
塩化セシウム勾配上の等密度バンディングによって精製
した。
PS81RR1とB.t.k.HD−１からの全細胞DNAをEcoR Iで消
化させ、0.8％アガロースゲル−TAE−緩衝化ゲル上の電
気泳動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、NR
RL B−18332のプラスミドpM3,130−７中に含まれる毒素
遺伝子のNsi IからNsi Iまでの断片、及び“4.5kbクラ
ス”の毒素遺伝子［クロンスタッド（Kronstad）及びホ
ワイトリー（Whitely）（1986年）Gene USA 43巻29−40
頁］のNsi Iからkpn Iまでの断片でプローブした。これ
らの二つの断片を一緒にし、プローブとして用いた。結
果は、PS81RR1のハイブリッド化断片がHD−１のそれと
異なることを示している。特定的には、PS81RR1中の2.3
kbのハイブリッド化バンドが、HD−１中に見られる3.8k
b及び1.8kbのハイブリッド化バンドの代わりに検出され
た。
化させ、0.8％アガロースゲル−TAE−緩衝化ゲル上の電
気泳動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、NR
RL B−18332のプラスミドpM3,130−７中に含まれる毒素
遺伝子のNsi IからNsi Iまでの断片、及び“4.5kbクラ
ス”の毒素遺伝子［クロンスタッド（Kronstad）及びホ
ワイトリー（Whitely）（1986年）Gene USA 43巻29−40
頁］のNsi Iからkpn Iまでの断片でプローブした。これ
らの二つの断片を一緒にし、プローブとして用いた。結
果は、PS81RR1のハイブリッド化断片がHD−１のそれと
異なることを示している。特定的には、PS81RR1中の2.3
kbのハイブリッド化バンドが、HD−１中に見られる3.8k
b及び1.8kbのハイブリッド化バンドの代わりに検出され
た。
PS81RR1の全細胞DNA 200μｇをEcoR Iで消化させ、分
離用0.8％アガロース−TAEゲル上の電気泳動によって分
離した。ゲルの2.2kbから2.5kbの領域を切り出し、そこ
からのDNAを電気溶離し、ELUTRIPTM−ｄ（シュライヒャ
ー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー州キー
ン）イオン交換カラムを用いて濃縮した。単離されたEc
oR I断片をLAMBDA ZAPTMEcoR Iアーム（ストラタジーン
・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州ラホ
ヤ）に再結合し、Gigapak GOLDTM（ストラテジーン）エ
キストラクトを用いてパッケージ処理した。パッケージ
化した組換えフィージを大腸菌菌株BB4（ストラトジー
ン）と一緒にフレートに撒くと、高プラーク密度から得
られた。プラークを放射性標識付きプローブによる標準
的核酸ハイブリッド化手順によって選定した。ハイブリ
ッド化されたプラークを精製し、低プラーク密度で再選
定した。生ずる精製ファージを、R408 M13ヘルパーファ
ージ（ストラトジーン）と一緒に生育させ、組換えBlue
ScriptTM（ストラタジーン）プラスミドを自動的に切り
出し、パッケージ化した。自動化切り出し法の一部とし
て、「ファージミッド」をXL1−Blue大腸菌細胞（スト
ラトジーン）に再感染させた。感染XL1−Blue細胞をア
ンピシリン耐性について選定し、所望のプラスミドを見
つけるため、生ずるコロニーを標準ミニプレップ化手順
によって分析した。プラスミドpM3,31−３は、約2.3kb
EcoR I挿入物を含有しており、ストラタジーン社のT7及
びT3プライマー、プラス一組の既存B.t.エンドトキシン
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。
約600bpの毒素遺伝子の配列を決定し、PS81RR1を他のク
ローン化されたB.t.エンドトキシン遺伝子と皮下するデ
ータ分析はPS81RR1の配列が独特のものであることを示
した。合成オリゴヌクレオチド（CGTGGATATGGTGAATCTTA
TG）を、他の存在するB.t.エンドトキシン遺伝子と較べ
て最も相同でないPS81RR1配列の一つの領域に構築し
た。
離用0.8％アガロース−TAEゲル上の電気泳動によって分
離した。ゲルの2.2kbから2.5kbの領域を切り出し、そこ
からのDNAを電気溶離し、ELUTRIPTM−ｄ（シュライヒャ
ー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー州キー
ン）イオン交換カラムを用いて濃縮した。単離されたEc
oR I断片をLAMBDA ZAPTMEcoR Iアーム（ストラタジーン
・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州ラホ
ヤ）に再結合し、Gigapak GOLDTM（ストラテジーン）エ
キストラクトを用いてパッケージ処理した。パッケージ
化した組換えフィージを大腸菌菌株BB4（ストラトジー
ン）と一緒にフレートに撒くと、高プラーク密度から得
られた。プラークを放射性標識付きプローブによる標準
的核酸ハイブリッド化手順によって選定した。ハイブリ
ッド化されたプラークを精製し、低プラーク密度で再選
定した。生ずる精製ファージを、R408 M13ヘルパーファ
ージ（ストラトジーン）と一緒に生育させ、組換えBlue
ScriptTM（ストラタジーン）プラスミドを自動的に切り
出し、パッケージ化した。自動化切り出し法の一部とし
て、「ファージミッド」をXL1−Blue大腸菌細胞（スト
ラトジーン）に再感染させた。感染XL1−Blue細胞をア
ンピシリン耐性について選定し、所望のプラスミドを見
つけるため、生ずるコロニーを標準ミニプレップ化手順
によって分析した。プラスミドpM3,31−３は、約2.3kb
EcoR I挿入物を含有しており、ストラタジーン社のT7及
びT3プライマー、プラス一組の既存B.t.エンドトキシン
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。
約600bpの毒素遺伝子の配列を決定し、PS81RR1を他のク
ローン化されたB.t.エンドトキシン遺伝子と皮下するデ
ータ分析はPS81RR1の配列が独特のものであることを示
した。合成オリゴヌクレオチド（CGTGGATATGGTGAATCTTA
TG）を、他の存在するB.t.エンドトキシン遺伝子と較べ
て最も相同でないPS81RR1配列の一つの領域に構築し
た。
Sau3Aで部分的に消化し、0.6％アガロース−TAEゲル
上の９〜23kbの断片の混合物として電気泳動で分画し
た、PS81RR1の全細胞DNAを、ラムダ（Lambda）GEMTM−1
1（ストラテジーン製）に連結した。高力価パッケージ
化されたファージをP2392大腸菌細胞（ストラテジーン
製）上でプレートにし、核酸ハイブリッド化プローブと
して放射標識された合成のオリゴヌクレオチド（前記の
もの）を用いてスクリーニングした。ハイブリッド化プ
ラークをより低いプラーク密度で再スクリーニングし
た。DNA単離の為のフアージの製造の為に液体培養基中
でP2392大腸菌細胞を感染させる為に、単一の精製をし
たハイブリッド化プラークを使用した。DNAは標準手順
で単離した。組替えファージDNAの製造の為の量は、挿
入されたDNAをラムダアームから開放する為にSal Iで消
化し、そして0.6％アガロース−TAEゲル上で電気泳動さ
せることによって分離した。上記のように電気溶離し、
そして濃縮した大きな断片を、Sal I消化脱ホスホリル
化pUC19（NEB）に連結した。連結した混合物を大腸菌DH
5（アルファ）コンピテント細胞（BRL）に形質転換し、
そしてアンピシリン、イソプロピル−（β）−Ｄ−チオ
ガラクトシド（lPTG）及び５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−（β）−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含
有するLB寒天上にプレートにした。白いコロニー（pUC1
9のβ−ガラクトシド遺伝子中に挿入物を有する）を標
準のミニプレップ（minipurep）手順にかけ、pM4,122−
３と命名されるプラスミドを単離した。完全な長さの毒
素遺伝子を「4.5kbクラス」の毒素遺伝子に対して造っ
たオリゴヌクレオチドプライマーを用い、そしてPS81RR
1の配列に対して造ったプライマーと「ウォーキング」
させることによって配列を決定した。
上の９〜23kbの断片の混合物として電気泳動で分画し
た、PS81RR1の全細胞DNAを、ラムダ（Lambda）GEMTM−1
1（ストラテジーン製）に連結した。高力価パッケージ
化されたファージをP2392大腸菌細胞（ストラテジーン
製）上でプレートにし、核酸ハイブリッド化プローブと
して放射標識された合成のオリゴヌクレオチド（前記の
もの）を用いてスクリーニングした。ハイブリッド化プ
ラークをより低いプラーク密度で再スクリーニングし
た。DNA単離の為のフアージの製造の為に液体培養基中
でP2392大腸菌細胞を感染させる為に、単一の精製をし
たハイブリッド化プラークを使用した。DNAは標準手順
で単離した。組替えファージDNAの製造の為の量は、挿
入されたDNAをラムダアームから開放する為にSal Iで消
化し、そして0.6％アガロース−TAEゲル上で電気泳動さ
せることによって分離した。上記のように電気溶離し、
そして濃縮した大きな断片を、Sal I消化脱ホスホリル
化pUC19（NEB）に連結した。連結した混合物を大腸菌DH
5（アルファ）コンピテント細胞（BRL）に形質転換し、
そしてアンピシリン、イソプロピル−（β）−Ｄ−チオ
ガラクトシド（lPTG）及び５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−（β）−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含
有するLB寒天上にプレートにした。白いコロニー（pUC1
9のβ−ガラクトシド遺伝子中に挿入物を有する）を標
準のミニプレップ（minipurep）手順にかけ、pM4,122−
３と命名されるプラスミドを単離した。完全な長さの毒
素遺伝子を「4.5kbクラス」の毒素遺伝子に対して造っ
たオリゴヌクレオチドプライマーを用い、そしてPS81RR
1の配列に対して造ったプライマーと「ウォーキング」
させることによって配列を決定した。
プラスミドpM,RR1−Ａは、133,367ダルトンのエンド
トキンをコードしている3.540kbを含めた、約13kbのPS8
1RR1 DNAを含有する。PS81RR1毒素遺伝子のORFは3.8kb
のNde I断片上でpM1,RR1−Ａから単離され、そして、バ
シルスシャトルベクトルpBClacに連結された。大腸菌NM
522細胞を形質転換し、生じるコロニーを標準のミニプ
レップ（miniprep）手順によって分析し、正しい挿入物
を含有しているプラスミドを単離した。所望のプラスミ
ドpMYC390はPS81RR1毒素遺伝子のコード配列を含有して
いる。
トキンをコードしている3.540kbを含めた、約13kbのPS8
1RR1 DNAを含有する。PS81RR1毒素遺伝子のORFは3.8kb
のNde I断片上でpM1,RR1−Ａから単離され、そして、バ
シルスシャトルベクトルpBClacに連結された。大腸菌NM
522細胞を形質転換し、生じるコロニーを標準のミニプ
レップ（miniprep）手順によって分析し、正しい挿入物
を含有しているプラスミドを単離した。所望のプラスミ
ドpMYC390はPS81RR1毒素遺伝子のコード配列を含有して
いる。
上のクローニング手順は、他に注意がなければ標準手
順を使用して行なった。
順を使用して行なった。
プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用され
る種々の方法はこの技術で周知である。また、クローニ
ング・ビヒクルとしてのラムダバクテリオファージの使
用法、すなわちラムダDNAの調製、生体外パッケージン
グ、及び組換えDNAのトランスフェクションは、この技
術で周知である。これの手順はすべて、マニアチス・テ
ィー（Maniatis,T.）、フリッシュ・イー・エフ（Frits
ch,E.F.）及びサムブロック・ジェイ（Sambrook,J.）
（1982年）、「分子クローニング：実験マニュアル」
（コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨー
ク州）に記述されている。このように、微生物細胞から
DNAを抽出し、制限酵素での消化を行ない、DNA断片を電
気泳動にかけ、プラスミドのテーリングとアニーリング
を行ない、DNAを挿入、再結合し、細胞を形質転換し、
プラスミドDNAを調製し、タンパクを電気泳動にかけ、D
NAの配列を決定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範
囲にある。
る種々の方法はこの技術で周知である。また、クローニ
ング・ビヒクルとしてのラムダバクテリオファージの使
用法、すなわちラムダDNAの調製、生体外パッケージン
グ、及び組換えDNAのトランスフェクションは、この技
術で周知である。これの手順はすべて、マニアチス・テ
ィー（Maniatis,T.）、フリッシュ・イー・エフ（Frits
ch,E.F.）及びサムブロック・ジェイ（Sambrook,J.）
（1982年）、「分子クローニング：実験マニュアル」
（コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨー
ク州）に記述されている。このように、微生物細胞から
DNAを抽出し、制限酵素での消化を行ない、DNA断片を電
気泳動にかけ、プラスミドのテーリングとアニーリング
を行ない、DNAを挿入、再結合し、細胞を形質転換し、
プラスミドDNAを調製し、タンパクを電気泳動にかけ、D
NAの配列を決定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範
囲にある。
本明細書で明らかにされている制限酵素は、ベセスダ
研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）及びニュー
イングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリ
ー）から購入できる。酵素は、供給側から提供される指
示に従って使用される。
研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）及びニュー
イングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリ
ー）から購入できる。酵素は、供給側から提供される指
示に従って使用される。
B.t.毒素遺伝子を含有するプラスミドpMYC386は、形
質転換されたホスト微生物から周知の標準手順を用いて
除去できる。例えば大腸菌NRRL B−18449を透明溶菌液
の等密度勾配手順等にかけて、pMYC386を回収すること
ができる。
質転換されたホスト微生物から周知の標準手順を用いて
除去できる。例えば大腸菌NRRL B−18449を透明溶菌液
の等密度勾配手順等にかけて、pMYC386を回収すること
ができる。
実施例４ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコ
ードした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシ
エンス（Agrobacter tumefaciens）からのTiプラスミド
を使用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植
物へ再生させる［ザンブリスキ・ピー（Zambryski,
P.）、ジョース・エッチ（Joos,H.）ジェンテロ・シー
（Gentello,C.）、リーマンス・ジェイ（Leemans,J.）
バン・モンタギュー・エム（Van Montague,M.）、及び
シェル・ジェイ（Schell,J.）（1983年）Cell 32巻1033
−1043頁］。この点で、特に有用なベクターはpEND4kで
ある［クリー・エッチ・ジェイ（klee,H.J.）、ヤノフ
スキー・エム・エフ（Yanofsky,M.F.）及びネスター・
イー・ダフリュー（Nester,E.W.）（1985年）Bio./Tech
nology 3巻637−642頁］。このプラスミドは、植物細胞
でも細菌中でも複製でき、パッセンジャー遺伝子に対し
て複数のクローニング位置をもっている。例えば、毒素
遺伝子はpEND4KのBamH I位置へ相され、大腸菌で増幅
し、適当な植物細胞へ形質転換される。
ードした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシ
エンス（Agrobacter tumefaciens）からのTiプラスミド
を使用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植
物へ再生させる［ザンブリスキ・ピー（Zambryski,
P.）、ジョース・エッチ（Joos,H.）ジェンテロ・シー
（Gentello,C.）、リーマンス・ジェイ（Leemans,J.）
バン・モンタギュー・エム（Van Montague,M.）、及び
シェル・ジェイ（Schell,J.）（1983年）Cell 32巻1033
−1043頁］。この点で、特に有用なベクターはpEND4kで
ある［クリー・エッチ・ジェイ（klee,H.J.）、ヤノフ
スキー・エム・エフ（Yanofsky,M.F.）及びネスター・
イー・ダフリュー（Nester,E.W.）（1985年）Bio./Tech
nology 3巻637−642頁］。このプラスミドは、植物細胞
でも細菌中でも複製でき、パッセンジャー遺伝子に対し
て複数のクローニング位置をもっている。例えば、毒素
遺伝子はpEND4KのBamH I位置へ相され、大腸菌で増幅
し、適当な植物細胞へ形質転換される。
実施例５ 新規なB.スリンギエンシス遺伝子のバクロウ
イルスのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォ
ルニカ（Autographa californica）核ポリヘドロシスウ
イルス（AcNPV）のようなバクロフイルスへスクローン
化できる。pCU8のような市販のクローニングベクターに
クローン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを
構築できる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝
子のコード領域が除かれて、ハッセンジャー遺伝子の特
異なクローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後
ろに置かれるようにする。このようなベクターの例はペ
ノックら［ペノック・ジー・ディー（Pennock,G.D.）、
シューメーカー・シー（Shoemaker,C.）及びミラー・エ
ル・ケイ（Miller,L.K.）（1984年）Mol.Cell Biol.4巻
339−406頁］に記述されたpGP−B6874、及びスミスら
［スマス・ジー・イー・（Smith,G.E.）、サマーズ・エ
ム・ディー（Summers,M.D.）及びフレーザー・エム・ジ
ェイ（1983年）Mol.Cell Biol.3巻2156−2165頁］に記
述されたpAC380である。本発明の新規なタンパク毒素を
コードした遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適
当な領域で、BamH Iリンカーによって変更でき、AcNPV
ベクター類の一つのもののパッセンジャー位置に挿入で
きる。
イルスのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォ
ルニカ（Autographa californica）核ポリヘドロシスウ
イルス（AcNPV）のようなバクロフイルスへスクローン
化できる。pCU8のような市販のクローニングベクターに
クローン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを
構築できる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝
子のコード領域が除かれて、ハッセンジャー遺伝子の特
異なクローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後
ろに置かれるようにする。このようなベクターの例はペ
ノックら［ペノック・ジー・ディー（Pennock,G.D.）、
シューメーカー・シー（Shoemaker,C.）及びミラー・エ
ル・ケイ（Miller,L.K.）（1984年）Mol.Cell Biol.4巻
339−406頁］に記述されたpGP−B6874、及びスミスら
［スマス・ジー・イー・（Smith,G.E.）、サマーズ・エ
ム・ディー（Summers,M.D.）及びフレーザー・エム・ジ
ェイ（1983年）Mol.Cell Biol.3巻2156−2165頁］に記
述されたpAC380である。本発明の新規なタンパク毒素を
コードした遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適
当な領域で、BamH Iリンカーによって変更でき、AcNPV
ベクター類の一つのもののパッセンジャー位置に挿入で
きる。
すでに明らかにされたように、B.t.毒素遺伝子をコー
ドしたヌクレオチド配列を第１及び４表に示す。推定さ
れたアミノ酸配列を第２及び５表に示す。
ドしたヌクレオチド配列を第１及び４表に示す。推定さ
れたアミノ酸配列を第２及び５表に示す。
この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列
は、DNAのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝
暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使
用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化
ヌクレオチドトリプレット（コドン）を使用できるた
め、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配
列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描
くことができる。
は、DNAのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝
暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使
用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化
ヌクレオチドトリプレット（コドン）を使用できるた
め、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配
列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描
くことができる。
フェニルアラニン（Phe） TTK ロイシン（Leu） XTY イソロイシン（lie） ATM メチオニン（Met） ATG バリン（Val） GTL セリン（Ser） QRS プロリン（Pro） CCL スレオニン（Thr） ACL アラニン（Ala） GCL チロシン（Tyr） TAK ヒスチジン（His） CAK グルタミン（Gln） CAJ アスパラギン（Asn） AAK リジン（Lys） AAJ アスパラギン酸（Asp） GAK グルタミン酸（Glu） GAJ システィン（Cys） TGK トリプトファン（Trp） TGG アルギニン（Arg） WGZ グリシン（Gly） GGL 終結信号 TAJ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に５′末端、右側に３′末端をもつ伝令RNAのトリ
ヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のDNAはすべ
て、ウラシルにはチミンを置き換えた。mRNAの配列に対
応する配列のDNA鎖のものである。文字はデオキシヌク
レオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を示
す。
左側に５′末端、右側に３′末端をもつ伝令RNAのトリ
ヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のDNAはすべ
て、ウラシルにはチミンを置き換えた。mRNAの配列に対
応する配列のDNA鎖のものである。文字はデオキシヌク
レオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を示
す。
Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトニン Ｔ＝チミン ＹがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はC. ＹがＣまたはＴの場合は、Ｘ＝C. ＹがＣの場合は、Ｙ＝A,G,C又はT. ＹがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はG. ＺがＡまたはＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はA. ＺがＣ又はＴの場合は、Ｗ＝C. ＷがＣの場合は、Ｚ＝A,G,C又はT. ＷがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はG. ＳがA,G,C又はＴの場合は、QR＝TC.又はその代わりにＳ
がＴ又はＣの場合は、QR＝AG. Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はG. Ｍ＝A,C又はT. 上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列が、このタン
パクの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオチ
ド配列によって調製できることを示す。従って、本発明
はこのような同等なヌクレオチド配列を包含する。更
に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更し
ないならば、確認された構造及び機能のタンパクが、こ
のようの変更によって構築できることが示された［カイ
ザー・イー・ティー（Kaiser,E.T.）及びケズディ・エ
フ・ジェイ（Kezdy,F.J）（1984年）Science 223巻249
−255頁］。このように、本発明はタンパクの二次構造
を変更しないような本発明細書に記載のアミノ酸配列の
変異体、又は構造が変更される場合、生物活性がある程
度保持されるような変異体を包含する。
がＴ又はＣの場合は、QR＝AG. Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はG. Ｍ＝A,C又はT. 上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列が、このタン
パクの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオチ
ド配列によって調製できることを示す。従って、本発明
はこのような同等なヌクレオチド配列を包含する。更
に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更し
ないならば、確認された構造及び機能のタンパクが、こ
のようの変更によって構築できることが示された［カイ
ザー・イー・ティー（Kaiser,E.T.）及びケズディ・エ
フ・ジェイ（Kezdy,F.J）（1984年）Science 223巻249
−255頁］。このように、本発明はタンパクの二次構造
を変更しないような本発明細書に記載のアミノ酸配列の
変異体、又は構造が変更される場合、生物活性がある程
度保持されるような変異体を包含する。
第１図は、B.t.PS81A2,B.t.PS81RR,及びB.t.HD−１から
のプラスミド調製物のアガロースゲル電気泳動の写真を
示す。
のプラスミド調製物のアガロースゲル電気泳動の写真を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 ＺＮＡ 9162−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (36)
- 【請求項１】バシルス スリンギエンシスPS81A2（NRRL
B−18457）、又はバシルス スリンギエンシスPS81RR1
（NRRL B−18458）の昆虫防除有効量に、鱗翅類害虫を
接触させることからなる、鱗翅類害虫の防除法。 - 【請求項２】バシルス スリンギエンシスPS81A2又はバ
シルス スリンギエンシスPS81RR1を害虫が食べること
がわかっている植物を播種する時に、餌の顆粒中に混入
しそしてその顆粒を土上に置くか又は土中に入れること
により、B.スリンギエンシスPS81A2又はPS81RR1の害虫
防除有効量に該害虫を接触させる、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】（１）B.スリンギエンシスPS81A2、又はPS
81RR1又はその胞子又は結晶を含む粒状餌をつくり、そ
して （２）粒状餌を土上に置くか又は土中に入れることから
なる、土壌に生息する鱗翅類害虫の防除法。 - 【請求項４】該粒状餌がトウモロコシ種子を土中に蒔く
のと同時期に施用される、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】実質的に無傷のバシルス スリンギエンシ
スPS81A2又はPS81RR1の細胞が、標的害虫の環境に施用
される時に、殺虫活性を長くするために処理される、請
求項１又は３に記載の方法。 - 【請求項６】殺虫剤担体と組み合わせたバシルス スリ
ンギエンシスPS81A2、又はPS81RR1、又はその胞子又は
結晶を含む組成物。 - 【請求項７】該担体が食欲刺激剤又は誘引剤を含む、請
求項６に記載の組成物。 - 【請求項８】種子被覆剤として適用された処方剤成分と
組み合わせたバシルス スリンギエンシスPS81A2又はPS
81RR1を含む。 - 【請求項９】鱗翅目害虫に対して活性のある毒素を生産
することにより特徴付けられる、バシルス スリンギエ
ンシスPS81A2（NRRL B−18457）。 - 【請求項１０】鱗翅目害虫に対して活性のある毒素を生
産することにより特徴付けられる、バシルス スリンギ
エンシスPS81RR1（NRRL B−18458）。 - 【請求項１１】次に示すアミノ酸配列（配列２） 又は 次に示すアミノ酸配列（配列５） を持つ、鱗翅目昆虫に対して活性のある毒素、及び DNA配列が次の配列 CAGATCCACGAGGCTTATCTTCCAGAACTAC とハイブリダイゼーションを生じ、上記配列２の突然変
異体をコードするものである、上記鱗翅目昆虫に対して
活性のある毒素の変異体毒素、及び DNA配列が次の配列 CGTGGATATGGTGAATCTTATG とハイブリダイゼーションを生じ、上記配列５の突然変
異体をコードするものである、上記鱗翅目昆虫に対して
活性のある毒素の変異体毒素。 - 【請求項１２】請求項11のバシルス スリンギエンシス
毒素をコードしたDNA。 - 【請求項１３】次に示すヌクレオチド配列（配列１） 又は次に示すヌクレオチド配列（配列４） をもった、請求項12に記載のDNA。
- 【請求項１４】請求項11に記載された配列２又は配列５
に示すアミノ酸配列をコードしたヌクレオチド配列をも
ったDNAを含む組換えDNA運搬ベクター。 - 【請求項１５】原核生物又は真核生物ホストへ運搬され
その中で複製される、請求項14に記載のDNA運搬ベクタ
ー。 - 【請求項１６】pMYC389又はpMYC390と命名されるプラス
ミドである請求項15に記載のDNA運搬ベクター。 - 【請求項１７】請求項11に記載された配列２又は配列５
に示すアミノ酸配列をもったバシルススリンギエンシス
毒素を発現するよう形質転換された細菌ホスト。 - 【請求項１８】請求項11に記載された配列２又は配列５
に示すアミノ酸配列をもったバシルス スリンギエンシ
ス毒素がコードされているバシルス スリンギエンシス
毒素遺伝子を含有するブラスミドベクターで形質転換さ
せた大腸菌（E.coli）である請求項17に記載の細菌ホス
ト。 - 【請求項１９】大腸菌（NM522）（pMYC389）（NRRL B−
18448）、又は大腸菌（NM522）（pMYC390）（NRRL B−1
8449）である請求項17に記載の細菌ホスト。 - 【請求項２０】シュードモナス（Pseudomonas）、アゾ
トバクター（Azotobacter）、エルウィニア（Erwini
a）、セラティア（Serratia）、クレブシェラ（Klebsie
lla）、リゾビウム（Rhizobium）、ロードシュードモナ
ス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylop
hilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、ア
セトバクター（Acetobacter）、アルカリゲネス（Alcal
igenes）、バシラス（Bacillus）及びストレブトマイセ
ス（Streptomyces）の種である微生物である、請求項17
に記載の細菌ホスト。 - 【請求項２１】微生物が有色素で葉面接着性である、請
求項20に記載の細菌ホスト。 - 【請求項２２】請求項20に記載の微生物を鱗翅類昆虫
に、又は該昆虫の環境に投与することからなる、鱗翅類
昆虫類の防除法。 - 【請求項２３】投与が根の周辺に対してである、請求項
22に記載の防除法。 - 【請求項２４】投与が葉面に対してである、請求項22に
記載の防除法。 - 【請求項２５】投与が水に対してである、請求項22に記
載の防除法。 - 【請求項２６】目標害虫環境に施用されると持続的な殺
虫活性をもった無傷の処理細胞を含有する殺虫剤を含め
てなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤が鱗翅類昆虫に
有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、請求項11に記載
された配列２又は配列５に示すアミノ酸配列をもったバ
シルス スリンギエンシス毒素を発現できる形質転換さ
れた微生物の発現の結果としてつくられる場合の殺虫剤
組成物。 - 【請求項２７】環境中で殺虫活性を長くするために処理
細胞が化学的又は物理的手段によって処理される、請求
項26に記載の殺虫組成物。 - 【請求項２８】細胞が原核生物又は低級真核生物であ
る、請求項27に記載の殺虫組成物。 - 【請求項２９】原核生物細胞が、腸内細菌科（Enteroba
cteriaceae）、バシラス科（Bacillaceae）、リゾビウ
ム科（Rhizobiaceae）、らせん科（Spirillaceae）、乳
酸杆菌科（Lactobacillaceae）、シュードモナス科（Ps
eudomonadaceae）、アゾトバクター科（Azotobacterace
ae）、ニトロバクター科（Nitrobacteraceae）及び放線
菌目（Actinomuycetales）からなる群から選ばれる請求
項28に記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項３０】低級真核生物細胞が藻菌類（Phycomycet
es）、予のう菌類（Ascomycetes）、及び担子菌類（Bas
idiomycetes）からなる群から選ばれる、請求項28に記
載の殺虫剤組成物。 - 【請求項３１】細胞が有色素細菌、酵母、又はカビ（菌
類fungi）である、請求項26に記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項３２】請求項11に記載された配列２又は配列５
に示すアミノ酸配列のポリペプチド毒素をコードした、
鱗翅類昆虫に有毒なバシラス・スリンギエンシス毒素遺
伝子の発現結果である細胞内毒素を含有する処理された
実質的に無傷の単細胞微細物であって、細胞を目標昆虫
環境に施用する時に殺虫活性を長くするような条件下に
該細胞が処理される場合の微生物細胞。 - 【請求項３３】環境中で殺虫活性を長くするために細胞
が化学的又は物理的手段によって処理される、請求項32
に記載の微生物細胞。 - 【請求項３４】該微生物がシュードモナスであり、該毒
素が請求項11に記載された配列２又は配列５に示すアミ
ノ酸配列をもったバシルス スリンギエンシス毒素であ
る、特許請求の範囲33に記載の微生物細胞。 - 【請求項３５】該細胞がヨウ素で処理されるシュードモ
ナス細胞である、請求項34に記載の微生物細胞。 - 【請求項３６】シュードモナス フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluorescens）細胞である、請求項32に記載
の微生物細胞。
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