JP3220697B2 - 鱗翅類害虫に活性な、Ｂ．ｔ．ＰＳ８１Ｆと命名される新規なバシラス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に対し活性の毒素をコードした遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は鱗翅目害虫に対して活性のあるB.t.PS81Fと
指定される新規なバシラス・スリンギエンシス分離体、
及び鱗翅目活性毒素をコードした遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

最も広く使用される微生物殺虫剤は細菌バシラス・ス
リンギエンシス（Bacillus thringiensis）に由来して
いる。この細菌薬剤は、葉を食べる広範囲のいも虫や蚊
の防除に使用される。バシラス・スリンギエンシスは、
感受性のある昆虫ホストに摂取されると有毒なタンパク
性パラ胞子や結晶をつくる。例えば、バシラス・スリン
ギエンシス・バラエティ・カースタキ（B.thringiensis
var.kurstaki）HD−１は、デルタ毒素と呼ばれる結晶
をつくるが、これは幾つかの鱗翅目昆虫の幼虫に有毒で
ある。大腸菌（E.coli）におけるこのB.t.結晶タンパク
遺伝子のクローニング及び発現は、公表文献［シュネフ
・エッチ・イー（Schnepf,H.E.）及びホワイトリー・エ
ッチ・アール（Whitely,H.R.）（1981年）,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 78巻2893−2897頁］中に記述されている。
合衆国特許第4,448,885号と第4,467,036号は、大腸菌で
のB.t.結晶タンパクの発現を明らかにしている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、試験されたすべての鱗翅目害虫に対して活
性のあるB.t.PS81Fと指定される新規なバシラス・スリ
ンギエンシス分離体に関する。

また、鱗翅目昆虫に有毒な新規な毒素遺伝子が明らか
にされ、特許請求されている。この毒素遺伝子はプラス
ミドベクターを経由して、適当なホストへ移すことがで
きる。

特定的には、本発明はB.t.PS81Fと指定される新規な
B.t.分離体、その変異体、及び鱗翅目害虫に対して活性
のある133,266ダルトンのタンパクをコードした新規な
デルタ内毒素遺伝子を含めてなる。

第１表は新規な毒素をコードしたDNAを明らかにして
いる。第２表は新規な毒素のアミノ酸配列を明らかにし
ている。第３表は第１、２表を合成したものである。第
４表は81Fの推定アミノ酸配列を他の既知の五つのB.t.
内毒素と比較している。

〔課題を解決する手段〕

本発明の新規な毒素遺伝子は、鱗翅目に対して活性の
あるPS81Fと指定される新規なB.スリンギエンシス（B.
t.）分離体から得られた。

［B.t.PS81Fの特性］ 集落形態−−B.t.に典型的な大集落で、表面はくすんで
いる。

増殖期の細胞形態−−B.t.に典型的。

鞭毛の血清型−−4a4c,ケニヤ。

細胞内含有物−−胞子形成細胞は両錘型結晶をつくる。

プラスミド製剤−−プラスミド製剤のアガロースゲル電
気泳動は、B.t.PS81FをB.t.HD−１及び他のB.t.分離体
から区別している。

アルカリ可溶性タンパク−−B.t.PS81Fは130,000ダルト
ンのタンパクと60,000ダルトンのタンパクをもってい
る。

活性−−B.t.PS81Fは試験されたすべての鱗翅目を殺虫
する。

生物検定結果： LC₅₀ ビートアワヨトウ（Spodoptera exigua） 10.4μg/ml ニシハマキガ幼虫（Choristoneura occidentalis）1.
4μg/ml 検定手順： スポドプテラ・エクシグア−−胞子及び結晶ペレット
の希釈物をつくり、合衆国農務省の昆虫餌（技術ブレテ
ィン1528、合衆国農務省）と混合し、小さなプラスチッ
クトレーに注いだ。新生幼虫を餌混合物上に置き、25℃
に保持する。死亡率を６日後に記録する。

コリストネウラ・オクシデンタリス−−スポドプテラ
・エクシグア検定と同じ方法で希釈物と餌をつくる。第
４齢幼虫を使用し、死亡率を８日後に記録する。

B.スリンギエンシスPS81F（NRRL B−18424）とその変
異体は、標準的な既知培地と発酵手法を用いて培養でき
る。発酵サイクルの終了時にまずB.t.胞子と結晶をこの
技術で周知の手段によって発酵ブロスから分離すること
によって、細菌を取り入れることができる。回収された
B.t.胞子及び結晶は、取り扱いと特定目標害虫への施用
を容易にするための表面活性剤、分散剤、不活性担体、
及び他の成分の添加により、水和剤、濃厚液剤、粒剤又
は他の処方剤に処方できる。処方と施用手順はこの技術
に周知であり、鱗翅目、例えばいも虫類に対して活性の
あるB.スリンギエンシス（HD−１）の市販菌株と一緒に
使用される。B.t.PS81Fとその変異体は鱗翅目害虫の防
除に使用できる。

本発明のB.t.PS81Fと、毒素遺伝子を取り込んだ大腸
菌ホストであるプラスミドpMYC386含有の大腸菌DH5
（α）の二次培養基は、合衆国イリノイ州ピオリア、合
衆国農務省北部地域研究所の永久保存施設に、1988年10
月７日に寄託された。呼出し番号は次のとおりである。

B.t.PS81F − NRRL B−18424 大腸菌（DH5α）（pMYC386） − NRRL B−18423 本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下で権限が
あると特許庁長官により決定された者は、本特許出願と
対応する米国出願の係属中に、培養基を入手できること
が保証される条件により寄託された。また、その米国出
願又はその子孫の対応特許出願が提出されている国々の
外国特許法で要求されるとおりに、寄託物は利用でき
る。しかし、寄託物が利用できるからといって、行政行
為によって付与された特許権を損わしめて本発明の実施
する権利を構成するものではないことを理解すべきであ
る。

更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約
の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされ
る。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日か
ら少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発行され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関するすべ
ての制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久
に取り除かれる。

本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入
できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の
細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト、例えばシ
ュードモナスの場合、微生物は鱗翅目昆虫発生位置に施
用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結
果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わりに、毒
素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の
活性を持続させるような条件下に処理できる。次に処理
細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.
毒素の毒性を保持している。

B.t.毒素遺伝子は適当なベクターを経て微生物ホスト
へ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ施
用される場合に、あるホスト微生物を使用することが必
須である。微生物ホストは、一つ以上の問題となる作物
の「植物領域」（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根
表面）を占有することが知られたものを選択する。これ
らの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中
で野性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリ
ペプチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現
を提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と不活
性化からの改良された保護を提供する。

広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領
域（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及びカビを
包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュ
ードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwini
a）、セラティア（Serratia）、クレブシェラ（Klebsie
lla）、キサントモナス（Xanthomonas）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、ロ
ードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィ
リウス（Methylophilius）、アクロバクテリウム（Agro
bacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、乳酸杆
菌（Lactobacillus）、アースロバクター（Arthrobacte
r）、アゾトバクター（Azotobacter）、リューコノスト
ック（Leuconostoc）及びアルカリゲネス（Alcaligene
s）属の細菌；カビ類特に酵母、例えばサッカロミセス
（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcu
s）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、スボロポロ
ミセス（Sporobolomyces）、ロードトルラ（Rhodotorul
a）、及びオーレオバシジウム（Aureobasidium）属のカ
ビなどの微生物である。特に重要なものは、シュードモ
ナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュード
モナス・フルオレッセンス、セラティア・マルセスケン
ス（Serratia murcescens）、アセトバクター・キシリ
ヌム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロ
ードシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomon
as spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（X
anthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhi
zobium melioti）、アルカリゲネス・エントロフス（Al
caligenes entrophus）及びアゾトバクター・ヴィンラ
ンディ（Azotobacter vinlandii）のような植物領域の
細菌種；及びロードトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubr
a）、R.グルチニス（R.glutinis）、R.マリーナ（R.mar
ina）、R.オーランティアカ（R.aurantiaca）、クリプ
トコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.
ジフルエンス（C.diffluens）、C.ローレンティ（C.lau
rentii），サッカロミセス・ロゼイ（S.rosei）、S.プ
レトリエンシス（S.pretoriensis）、S.セレビシエ（S.
cerevisiae）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobol
omyces roseus）、S.オドルス（S.odorus）、クルイベ
ロミセス・ヴェローナエ（Kluyveromyces veronae）及
びオーレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium po
llulans）のような植物領域の酵母種である。特に重要
なのは有色素微生物である。

遺伝子の安定な保持と発現を可能とするような条件下
に、毒素を発現させるB.t.遺伝子を微生物ホストに導入
するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺伝子発
現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の毒素遺伝
子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列と相
同のDNA配列、また組込みや安定な保持が起こるため
の、ホスト内で機能的な複製系などを含んだDNA構造体
を用意することができる。

転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含
しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、
毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするの
が望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチ
ベータやエンハンサに結合する領域、によって達成で
き、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によ
って誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用す
ると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境
へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒
素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環
境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在しよう。

メッセンジャーRNAの安定性を強化する配列を使用す
ると共に、特に活性プロモータを使用してメッセンジャ
ーの発現を強化するために種々の操作を使用できる。開
始及び転写終結領域は停止コドン、終結領域、及び任意
にポリアデニル化信号を包含しよう。

転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の
５′から３′への方向で、構造体は転写調節領域（これ
がある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの
５′又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位
置、開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠を
もった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配
列（使用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本
鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換
に使用できるが、普通はマーカーを含めたDNA配列を伴
うようにし、この第二のDNA配列は、ホストへのDNA導入
中に毒素発現構造体に結合させることができる。

マーカーとは、変更又は形質転換されたホストの選定
を行なうための構造遺伝子のことである。マーカーは通
常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重
金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要求ホストに
原栄養性を与える相補性を提供する。変更されたホスト
が選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、
相補性を使用するのが好ましい。構造体の開発に、また
ホストの変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野
外で他の野性型微生物に対する競合的利点を提供するこ
とによって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレ
ート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素
発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。この
方法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産ホス
トに競合的利点を提供するため、ホストは野性型微生物
と効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を占め
るようになる。

機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内
の配列と相同な、少なくとも50塩基対（bp）、好ましく
は約100bp、及び通常約1,000bpまでの配列を包含しよ
う。こうして合法的組換えの確率が強化されるため、遺
伝子はホストへ組込まれ、ホストによって安定に保持さ
れる。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合
的利点を提供する遺伝子に近接しているのが望ましい。
従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。

細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻
類、カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域はtrp遺
伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモー
タ、Tacプロモータ、及びホスト中で機能的な場合は毒
素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータを包含す
る。例として合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832
号、及び第4,356,270号を参照のこと。終結領域は、普
通は転写開始領域と関連する終結領域か、又は異なる転
写開始領域（二つの領域がホスト内で適合的で機能的で
ある限りにおいて）でありうる。

安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、
ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使用さ
れよう。複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常
存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安定なウイル
スの複製系から誘導される。pBR322、pACYC184、RSF101
0、pRO1614等のような多数のプラスミドが入手できる。
例として、オルソン（Olson）ら、（1982年）J.Bacteri
ol.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasarian）
ら、（1981年）Gene 16巻237頁、並びに合衆国特許第4,
356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を参照
のこと。

B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、転
写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を包含
でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開発中にク
ローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストで
の機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上
のマーカーが存在できる。組込みを望む場合は、プラス
ミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。

形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在す
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。

殺虫剤含有細胞を処理して処理細胞を目標害虫環境に
施用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるのに適し
たホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通
常、ほ乳類のような高等生物に有毒な物質を生じない細
胞に限定される。しかし、毒素が不安定か、哺乳類ホス
トへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準
である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も
使用できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核
生物と、カビのような低級真核生物である。グラム陰性
・陽性双方の原核生物の例は、エシェリキア（Escheric
hia）、エルウィニア（Erwinia）、シゲラ（Shigell
a）、サルモネラ（Salmonella）及びプロテウス（Prote
us）のような腸内細菌科（Entero bacteriaceae）；バ
シラス科（Bacillaceae）；リゾビウム（Rhizobium）の
ようなリゾビウム科（Rhizobiaceae）；発光細菌、ジモ
モナス（Zymomonas），セラティア（Serratia）、アエ
ロモナス（Aeromonas）、ビブリオ（Vibrio）、デスル
ホビブリオ（Desulfovibrio）、スピリルム（Spirillu
m）のようならせん菌科；乳酸かん菌科；シュードモナ
ス（Pseudomonas）及びアセトバクター（Acetobacter）
のようなシュードモナス科；アゾトバクター科及びニト
ロバクター科を包含する。真核生物には藻菌類（Phycom
ycetes）と子のう菌類（Ascomycetes）のようなカビが
あり、これはサッカロミセス（Saccharomyces）とシゾ
サッカロミセス（Schizosaccharomyces）のような酵
母、ロードトルラ（Rhodotorula）、オーレオバシジウ
ム（Aureobasidium）、スポロボロミセス（Sporobolomy
ces）のような担子菌類（Basidiomycetes）酵母を包含
する。

生産目的のためにホスト細胞を選定する上で特に重要
な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容易さ、発現
系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セルとして使用するのに重要な特性は厚い細胞壁、色素
形成、及び細胞内パッケージング又は封入体の形成のよ
うな殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害
虫に摂取させるための誘引力；毒素に損害を与えない殺
菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処方
と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。

特に重要なホスト生物は、ロードトルラ種、オーレオ
バシジウム種、サッカロミセス種、スポロボロミセス種
のような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種、及
びフラボバクテリウム種のような葉面に生息する生物；
又はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等の他の生
物を包含する。特定的な生物は、シュードモナス・アエ
ルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス
・フルオレッセンス（P.fluorescens）、サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バシラ
ス・スリンギエンシス、大腸菌、枯草菌（B.subtilis）
等を包含する。

細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実
質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。

微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物
の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒
素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は
物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合
わせによることができる。化学的試薬の例はハロゲン化
剤、特に原子番号17−80のハロゲンである。もっと特定
的には、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を達成す
るのに十分な時間に使用できる。他の適当な手法は、ホ
ルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒ
ド類；塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのよう
な抗感染剤；イソプロピルアルコールとエタノールのよ
うなアルコール類；ブアン固定剤とヘリー固定剤［フマ
ソン（Humason）、グレッチェン・エル（Gretchen,L.）
「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、
1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での
処理；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞中につ
くられる毒素の活性を保存し、持続させるような物理的
処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。
物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長
放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。

一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するよう
な、強化された構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプ
ロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型か
ら成熟型への加工を抑制しないように、不活性化方法を
選定すべきである。例えばホルムアルデヒドはタンパク
を架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制でき
る。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少なくとも実質
部分の生物学的利用率又は生物活性を保持する。

B.t.殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは、DNA構造
体がそこで選択的利点を提供し、細胞の全部又は実質的
全部がB.t.遺伝子を保持するように選択培地を与えると
ころの、任意の都合のよい栄養培地で生育できる。次に
これらの細胞を慣用方法に従って取り入れる。その代わ
りに、細胞を取り入れる前に処理することもできる。

B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これらを無機鉱
物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植
物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等）
のような種々の不活性材料と混合することにより、水和
剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助
剤、安定剤、その他殺虫助剤、又は表面活性剤を包含で
きる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、
フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成
分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を
包含できる。

殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使
用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なく
とも１重量％で存在し、100重量％でありうる。乾燥処
方剤は約１−95重量％の殺虫剤をもつが、液体処方剤は
一般に約１−60重量％の固形分を液相中にもつであろ
う。処方剤は概してmg当たり約10²ないし約10⁴個の細胞
をもつであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約
50mg（液体又は乾燥）ないし1kg以上の率で投与されよ
う。

処方剤は鱗翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水
に噴霧、散布、散水等によって施用できる。

PS81Fの変異体は、この技術で周知の手順によってつ
くることができる。例えば、非胞子形成性変異体は、PS
81Fのエチルメタンスルホネート（EMS）変異誘発によっ
て得られる。変異体は、この技術で周知の手順により、
紫外光やニトロソグアニジンを使用してつくることがで
きる。

以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示し
た実施例である。これらの例は限定的に考えられてはな
らない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶
媒混合物割合はすべて容量による。

実施例１ B.t.PS81F（NRRL B−18424）の培養 B.t.PS81F（NRRL B−18424）又はその変異体の二次培
養基を使用して次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖
・塩培地に接種した。

バクト・ペプトン 7.5g/ ブドウ糖 1.0g/ KH₂PO₄ 3.4g/ K₂HPO₄ 4.35g/ 塩溶液 5.0ml/ CaCl₂溶液 5.0ml/ 塩溶液（100ml） MgSO₄−7H₂O 2.46g MnSO₄−H₂O 0.04g ZnSO₄−7H₂O 0.28g FeSO₄−7H₂O 0.40g CaCl₂溶液（100ml） CaCl₂−2H₂O 3.66g pH7.2 塩溶液とCaCl₂溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処
理した調理しブロスに、接種時に添加する。200rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。

上の手順は、この技術で周知の手順により、大発酵装
置まで容易に規模拡大できる。

上の発酵で得られるB.t.胞子及び／又は結晶は、この
技術で周知の手順により単離できる。しばしば用いられ
る手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例えば遠心分
離にかけることである。

実施例２ 新規な毒素遺伝子のクローニングと大腸菌へ
の形質転換 B.スリンギエンシスHD−１と新規なB.t.PS81Fの細胞
を低光学密度（OD₆₀₀＝1.0）に生育させ、細胞を遠心分
離によって回収し、全細胞DNAを調製した。20％蔗糖と5
0mg/mlリゾチームを含有するTES緩衝液（30mMトリス−C
l、10mM EDTA、50mM NaCl、pH＝8.0）中で細胞をプロト
プラスト化させた。プロトプラストを４％の最終濃度ま
でSDS添加によって溶菌化した。細胞材料を最終濃度100
mMの中性塩化カリウム中、４℃で一夜沈殿させた。上澄
み液をフェノール／クロロホルム（1:1）で２回抽出し
た。DNAをエタノール中で沈殿させ、塩化セシウム勾配
上の等密度バンディングによって精製した。

各々（PS81FとHD−１）からの全細胞DNAをEcoR Iで消
化させ、0.8％アガロースゲル−TAE−緩衝化ゲル上の電
気泳動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、NR
RL B−18332のプラスミドpM3,130−７中に含まれる毒素
遺伝子のNsi IからNsi Iまでの断片、及び“4.5kbクラ
ス”の毒素遺伝子［クロンスタッド（Kronstad）及びホ
ワイトリー（Whitely）（1986年）Gene USA 43巻29−40
頁］のNsi IからNsi Iまでの断片でプローブした。これ
らの二つの断片を一緒にし、プローブとして用いた。結
果は、PS81Fのハイブリッド化断片がHD−１のそれと異
なることを示している。特定的には、PS81F中の3.5kbの
ハイブリッド化バンドが、HD−１中に見られる300bp大
きい3.8kbのハイブリッド化バンドの代わりに検出され
た。

PS81Fの全細胞DNA 200μｇをEcoR Iで消化させ、分離
用0.8％アガロース−TAEゲル上の電気泳動によって分離
した。ゲルの3.0kbから4.0kbの領域を切り出し、そこか
らのDNAを電気溶離し、ELUTIP^TM−ｄ（シュライヒャー
・エンド・シュエル社、ニューハンフシャー州キーン）
イオン交換カラムを用いて濃縮した。単離されたEcoR I
断片をLAMBDAZAP^TMEcoR Iアーム（ストラタジーン・ク
ローニング・システムズ社、カリフォルニア州ラホヤ）
に再結合し、GIGAPACK GOLD^TM抽出液を用いてパッケー
ジした。パッケージにした組換えファージを大腸菌菌株
BB4（ストラトジーン）と一緒にプレートに撒くと、高
プラーク密度が得られた。プラークを放射性標識付きプ
ローブによる標準的核酸ハイブリッド化手順によって選
定した。ハイブリッド化されたプラークを精製し、低プ
ラーク密度で再選定した。生ずる精製ファージをR408 M
13ヘルパーファージ（ストラトジーン）と一緒に生育さ
せ、組換えBLUESCRIPT^TM（ストラタジーン）プラスミド
を自動的に切り出し、パッケージ化した。自動化切り出
し法の一部として、「ファージミッド」をXL1−Blue大
腸菌細胞（ストラトジーン）に再感染させた。感染XL1
−Blue細胞をアンピシリン耐性について選定し、所望の
プラスミドを見つけるため、生ずるコロニーを標準ミニ
プレップ化手順によって分析した。pM5,31−１と指定さ
れるプラスミドは、約3.5kb EcoR I挿入物を含有してお
り、ストラタジーン社のT7及びT3プライマー、プラス一
組の既存B.t.内毒素オリゴヌクレオチドプライマーを用
いて配列決定した。約1.7kbの毒素遺伝子が配列決定さ
れ、PS81Fを他のクローン化B.t.内毒素遺伝子と比較し
たデータ分析は、PS81F配列が特異なものであることを
示した。他の既存のB.t.内毒素遺伝子に対して最も相同
性の小さいPS81F配列中の領域の一つに、合成オリゴヌ
クレオチド（GCTGAAGAACTTCCTATTCGTGGTGGTGAGC）を構
築した。

全細胞DNAを部分的にSau3Aで消化させ、電気泳動によ
って0.6％アガロースTAEゲル上で９−23kb断片の混合物
へ分画し、これをLAMBDA DASH^TM（ストラタジーン）へ
再結合した。パッケージ化したファージをP2392大腸菌
細胞（ストラタジーン）と一緒に高滴定価でプレートに
蒔き、核酸ハイブリッド化プローブとして前掲放射性標
識付き合成オリゴヌクレオチドを用いて選定した。ハイ
ブリッド化プラークを低めのプラーク密度で再選定し
た。精製ハイブリッド化プラークを用いてDNA単離用の
ファージ調製のため、液体培養基中でP2392大腸菌細胞
に感染させた。DNAを標準手順によって単離した。分離
量の組換えファージDNAをSal Iで消化させ（挿入DNAを
ラムダアームから放出させるため）、0.6％アガロース
−TAEゲル上の電気泳動によって分離した。大断片（上
記のように電気溶離し濃縮したもの）を、Xho Iで消化
させホスファターゼ処理したBLUESCRIPT^TMプラスミドに
再結合させた。再結合体を大腸菌DH5（α）コンピテン
ト細胞（BRL）に形質転換し、アンピシリン、イソプロ
ピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）及び５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ−ガ
ラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上にプレートし
た。pMI,43−24と指定されるプラスミドを単離するため
に、白色集落（pBluescriptの（β）−ガラクトシダー
ゼ遺伝子中に挿入物をもつもの）を標準的なミニプレッ
プ手順にかけた。全長毒素遺伝子は、“4.3kbクラス”
の毒素遺伝子に対してつくられたオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、またPS81Fの配列に対してつくられ
たプライマーとの“ウォーキング”によって配列決定さ
れた。推定されたPS81Fアミノ酸配列を他の五つの内毒
素の配列と比較したデータ分析は、PS81Fが特異なもの
であることを示している（第４表）。

プラスミドpM1,43−24は、133,266ダルトンの内毒素
をコードした3.518kbを含め、約18kbのPS81F DNAを含有
している。プラスミドは、約13kbの非コードDNAを切り
出して、末端を再結合させ、DH5（α）を形質転換し、
アンピシリンを含有するLB寒天にプレートすることによ
って大きさを減少させた。生ずる集落は、大きさの減じ
たプラスミドを単離するために、標準ミニプレップ手順
によって分析した。所望のプラスミドpMYC386は、PS81F
毒素遺伝子のコード配列を含有し、これをSae IからApa
Iまでの4.5kbの断片として切り出すことができる。

上のクローニング手順は、他に注意がなければ標準手
順を使用して行なった。

プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用され
る種々の方法はこの技術で周知である。また、クローニ
ング・ビヒクルとしてのラムダバクテリオファージの使
用法、すなわちラムダDNAの調製、生体外パッケージン
グ、及び組換えDNAのトランスフェクションは、この技
術で周知である。これらの手順はすべて、マニアチス・
ティー（Maniatis,T.）、フリッシュ・イー・エフ（Fri
tsch,E.F.）及びサムブロック・ジェイ（Sambrook,J.）
（1982年）、「分子クローニング：実験マニュアル」
（コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨー
ク州）に記述されている。このように、微生物細胞から
DNAを抽出し、制限酵素での消化を行ない、DNA断片を電
気泳動にかけ、プラスミドのテーリングとアニーリング
を行ない、DNAを挿入、再結合し、細胞を形質転換し、
プラスミドDNAを調製し、タンパクを電気泳動にかけ、D
NAの配列を決定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範
囲にある。

本明細書で明らかにされている制限酵素は、ベセスダ
研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）及びニュー
イングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリ
ー）から購入できる。酵素は、供給側から提供される指
示に従って使用される。

B.t.毒素遺伝子を含有するプラスミドpMYC386は、形
質転換されたホスト微生物から周知の標準手順を用いて
除去できる。例えば大腸菌NRRL B−18423を透明溶菌液
の等密度勾配手順等にかけて、pMYC386を回収すること
ができる。

標準的昆虫試験からのデータは、新規なB.t.PS81Fが
コナガ（diamondback moth）、スポドプテラ・エクシグ
ア、ニシハマキガ幼虫、及びトリコプルシア・ニに対し
て活性があることを示している。

実施例３ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコ
ードした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシ
エンス（Agrobacter tumefaciens）からのTiプラスミド
を使用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植
物へ再生させる［ザンブリスキ・ピー（Zambryski,
P.）、ジョース・エッチ（Joos,H.）、ジェンテロ・シ
ー（Gentello,C.）、リーマンス、ジェイ（Leemans,
J.）、バン・モンタギュー・エム（Van Montague,
M.）、及びシェル・ジェイ（Schell,J.）（1983年）Cel
l 32巻1033−1043頁］。この点で、特に有用なベクター
はpEND4Kである［クリー・エッチ・ジェイ（Klee,H.
J.）、ヤノフスキー・エム・エフ（Yanofsky,M.F.）及
びネスター・イー・ダブリュー（Nester,E.W.）（1985
年）Bio/Technology 3巻637−642頁］。このプラスミド
は、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセンジャー遺伝
子に対して複数のクローニング位置をもっている。例え
ば毒素遺伝子はpEND4KのBamH Iへ挿入され、大腸菌中で
増殖し、適当な植物細胞へ形質転換される。

実施例４ 新規なB.スリンギエンシス遺伝子のバクロウ
イルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォ
ルニカ（Autographa californica）核ポリヘドロシスウ
イルス（AcNPV）のようなバクロウイルスへクローン化
できる。pUC8のような市販のクローニングベクターにク
ローン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを構
築できる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝子
のコード領域が除かれて、パッセンジャー遺伝子の特異
なクローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後ろ
に置かれるようにする。このようなベクターの例はペノ
ックら［ペノック・ジー・ディー（Pennock,G.D.）、シ
ューメーカー・シー（Shoemaker,C.）及びミラー・エル
・ケイ（Miller,L.K.）（1984年）Mol.Cell Biol.4巻39
9−406頁］に記述されたpGP−B6874、及びスミスら［ス
ミス・ジー・イー（Smith,G.E.）、サマーズ・エム・デ
ィー（Summers,M.D.）及びフレーザー・エム・ジェイ
（1983年）Mol.Cell Biol.3巻2156−2165頁］に記述さ
れたpAC380である。本発明の新規なタンパク毒素をコー
ドした遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適当な
領域で、BamH Iリンカーによって変更でき、AcNPVベク
ター類の一つのもののパッセンジャー位置に挿入でき
る。

すでに明らかにされたように、B.t.毒素遺伝子をコー
ドしたヌクレオチド配列を第１表に示す。推定されたア
ミノ酸配列を第２表に示す。

この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列
は、DNAのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝
暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使
用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化
ヌクレオチドトリプレット（コドン）を使用できるた
め、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配
列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描
くことができる。

フェニルアラニン（Phe） TTK ロイシン（Leu） XTY イソロイシン（Ile） ATM メチオニン（Met） ATG バリン（Val） GTL セリン（Ser） QRS プロリン（Pro） CCL スレオニン（Thr） ACL アラニン（Ala） GCL チロシン（Tyr） TAK ヒスチジン（His） CAK グルタミン（Gln） CAJ アスパラギン（Asn） AAK リジン（Lys） AAJ アスパラギン酸（Asp） GAK グルタミン酸（Glu） GAJ システイン（Cys） TGK トリプトファン（Trp） TGG アルギニン（Arg） WGZ グリシン（Gly） GGL 終結信号 TAJ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組
は、左側に５′末端、右側に３′末端をもつ伝令RNAの
トリヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のDNAは
すべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、mRNAの配列
に対応する配列のDNA鎖のものである。文字はデオキシ
ヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基
を示す。

Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はC. ＹがＣまたはＴの場合は、Ｘ＝C. ＸがＣの場合は、Ｙ＝A,G,C又はT. ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はG. ＺがＡ又はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はA. ＺがＣ又はＴの場合は、Ｗ＝C. ＷがＣの場合は、Ｚ＝A,G,C又はT. ＷがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はG. ＳがA,G,C又はＴの場合は、QR＝TC.又はその代わりにＳ
がＴ又はＣの場合は、QR＝AG. Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はG. Ｍ＝A,C又はT. 上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列が、このタン
パクの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオチ
ド配列によって調製できることを示す。従って、本発明
はこのような同等なヌクレオチド配列を包含する。更
に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更し
ないならば、確認された構造及び機能のタンパクが、こ
のような変更によって構築できることが示された［カイ
ザー・イー・ティー（Kaiser,E.T.）及びケズディ・エ
フ・ジェイ（Kezdy,F.J.）（1984年）Science 223巻249
−255頁］。このように、本発明はタンパクの二次構造
を変更しないような本明細書に記載のアミノ酸配列の変
異体、又は構造が変更される場合、生物活性がある程度
保持されるような変異体を包含する。

HD1はバシラス・スリンギエンシス亜種カースタキHD1
［ブリザード及びホワイトリー、Nucleic Acids Resear
ch 16巻（1988年）2723頁］からのcryA1毒素遺伝子であ
る。

HD73はHD73からのcryA3遺伝子である。

BTBはBT菌株BerlinerからのcryA2遺伝子である。

81FはマイコゲンのBT菌株PS81Fからのデルタ内毒素遺
伝子である。

BTEは、BT亜種エントモシダス［ホニー、サーム、及
びヴィッサー、Nucleic Acids Research 16巻（1988
年）6240頁］からのデルタ内毒素遺伝子である。

HD2は、BT菌株HD2［ブリザード及びホワイトリー、Nu
cleic Acids Research 16巻（1988年）2723頁］からの
デルタ内毒素遺伝子である。

・・・・は同一アミノ酸相同性を示す。

は配列をHD1と整合させるのに要するギャップを示す。

＊は配列BTEとHD2をHD1と整合させるのに要する挿入
物を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、B.t.PS81FとB.t.HD−１からのプラスミド製
剤のアガロースゲル電気泳動を示す。 ａ）未切断B.t.PS81F ｂ）Hind IIIで切断されたB.t.PS81F。 ｃ）未切断B.t.HD−１。 ｄ）Hind IIIで切断されたB.t.HD−１。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/20 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (56)参考文献 特開 昭61−254187（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−146593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−139389（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A01N 63/00 C07K 14/32 - 14/325 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】表２の蛋白質の昆虫防除有効量に、鱗翅類
   昆虫の害虫を接触させることからなる、鱗翅類害虫の防
   除法。
2. 【請求項２】該害虫が鱗翅目に属している、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】該害虫がニシハマキガ科の幼虫（Western
   spruce budworm）である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】目標害虫環境に施用される時に、殺虫活性
   を長くするために処理される実質的に無傷のB.t.PS81F
   細胞又はその変異体中に該蛋白質が存在する、請求項１
   に記載の方法。
5. 【請求項５】殺虫剤担体と組み合わせたバシラス・スリ
   ンギエンシスPS81F、又はその変異体の胞子又は結晶を
   含めてなる殺虫剤組成物。
6. 【請求項６】該担体が食欲刺激剤又は誘引剤を含めてな
   る、請求項５に記載の殺虫剤組成物。
7. 【請求項７】鱗翅目害虫に対して毒素活性がある、NRRL
   B−18424の確認特性をもったバシラス・スリンギエン
   シスPS81F又はその変異体。
8. 【請求項８】第２表に示すアミノ酸配列のバシラス・ス
   リンギエンシス（B.t.）毒素をコードしたDNA。
9. 【請求項９】第１表に示すヌクレオチド配列をもった、
   請求項８に記載のDNA。
10. 【請求項１０】第２表に示すアミノ酸配列をもち、かつ
    鱗翅類昆虫に対して活性のある毒素、及びタンパクの二
    次構造を変更しないか、又は構造が変更されていても、
    生物活性がある程度保持されるようなその変異体毒素。
11. 【請求項１１】第２表に示すアミノ酸配列をコードした
    ヌクレオチド配列をもち、鱗翅類昆虫に対して活性のあ
    る毒素をコードしているDNAを含めてなる組換えDNA運搬
    ベクター。
12. 【請求項１２】第２表に示すアミノ酸配列をコードした
    ヌクレオチド配列をもち、鱗翅類昆虫に対して活性のあ
    る毒素をコードしているDNAを含む、pMYC386と命名され
    るプラスミド。
13. 【請求項１３】第２表に示すアミノ酸配列をもったB.t.
    毒素を発現させるように、第２表に示すアミノ酸配列を
    もったB.t.毒素がコードされているB.t.毒素遺伝子を含
    有するベクターで形質転換された、細菌ホスト。
14. 【請求項１４】第２表に示すアミノ酸配列をもったB.t.
    毒素がコードされているB.t.毒素遺伝子を含有するプラ
    スミドベクターで形質転換させた大腸菌（E.coli）。
15. 【請求項１５】請求項14に記載の大腸菌ホストであり、
    NRRL B−18423の確認特性をもった大腸菌DH5（α）（pM
    YC386）。