JPH02270805A - 鱗翅類害虫に活性な、Ｂ．ｔ．ＰＳ８１Ｆと命名される新規なバシラス・スリンギエンシス分離体、及び鱗翅類に対し活性の毒素をコードした遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は鱗翅目害虫に対して活性のある１３．ｔ、ｐｓ
８１Ｆと指定される新規なバシラス・スリンギエンシス
分離体、及び鱗翅目活性毒素をコードした遺伝子に関す
る。

〔従来の技術〕

最も広く使用される微生物殺虫剤は細菌ハシラス争スリ
ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｌ＋ｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ＞に由来している。この細菌薬剤は、葉を食へ
る広範囲のいも虫や蚊の防除に使用される。バシラス・
スリンギエンシスは、感受性のある昆虫ホストに摂取さ
れると有毒なタンパク性パラ胞子や結晶をつくる。例え
は、バシラス・スリンギエンシス・バラエテ４”カース
タキ（Ｂ、ｔｌｌｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ。

ｋｕｒｓｔａｋｉ）　Ｎｏ−１は、デルタ毒素と呼はれ
る結晶をつくるが、これは幾つかの鱗翅目昆虫の幼虫に
有毒である。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるこのＢ
、ｔ。

結晶タンパク遺伝子のクローニング及び発現は、公表文
献［シュネフ・エッチ・イー（Ｓｃｈｎｅｐｆ、　１１
．Ｅ、）及びホワイトリー・エソチー・アール（Ｗｈｉ
ｔｅｌｙ、　Ｈ。

Ｒ，）（１９８１年）＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７８巻２８９３−２８
９７頁］中に記述されている。合衆国特許第４．４４８
，８８５号と第４，４６７．０３６号は、大腸菌でのＢ
、ｔ。

結晶タンパクの発現を明らかにしている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、試験されたすべての鱗翅目害虫に対して活性
のあるＢ、↑、、ＰＳ８１Ｆと指定される新規なバシラ
ス・スリンギエンシス分離体に間する。

また、鱗翅目昆虫に有毒な新規な毒素遺伝子が明らかに
され、特許請求されている。この毒素遺伝子はプラスミ
ドベクターを経由して、適当なホストへ移すことができ
る。

特定的には、本発明はＢ、ｔ、ＰＳ８１Ｆと指定される
新規なり　、　ｔ、　、分離体、その変異種、及び鱗翅
目害虫に、対して活性のある１３３，２６６ダルトンの
タンパクをコードした新規なデルタ内毒素遺伝子を含め
てなる。

第１表は新規な毒素をコードしたＤＮＡを明らかにして
いる。第２表は新規な毒素のアミノ酸配列を一１〕− 明らかにしている。第３表は第１．２表を合成したもの
である。第４表は８１Ｆの推定アミノ酸配列を他の既知
の五つのＢ、ｔ、内毒素と比較している。

〔課題を解決する手段〕

本発明の新規な毒素遺伝子は、鱗翅目に対して活性のあ
るＰＳ８１Ｆと指定される新規なり．スリンギエンシス
（Ｂ、ｔ、）分離体から得られた。

［Ｂ、ｔ、ＰＳ８１Ｆの特性］ 集落形態−Ｂ、ｔ、に典型的な大集落で、表面はくすん
でいる。

増殖期の細胞形態−Ｂ、ｔ、、に典型的。

鞭毛の血清型−４ａ４ｃ、ケニャ。

細胞内含有物−胞子形成細胞は両錘型結晶をつくる。　
　　　・ プラスミド製剤−プラスミド製剤の７カロースゲル電気
泳動は、ｓ、ｊ、ｐｓｓ＋ｒをＢ　、　ｔ、　、　＋１
　［＋　−１及び他のＢ、ｔ、分離体から区別している
。

アルカリ可溶性タンパク−Ｂ、ｔ、ＰＳ８］Ｆは＋３０
，０００ダルトンのタンパクと（３０，０００ダルトン
のタンパクをもっている。

活性−〇、ｔ、ＰＳ８１Ｆは試験されたすべての鱗翅目
を殺虫する。

生物検定結果：　　　　　　　　　　　　ＬＣ５゜ビー
トアワヨトつ（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＢｉｇｕａ）　　
　　　　　　　　　　　　１０．４　μｇ／ｍｌニシハ
マキガ幼虫ぐＣｈｏｒ　ｉ　５ｔｏｎｅｕ　ｒａｏｃｃ
ｉ「Ｉｅｎｔａｌ　ｉｓ）　　　　　　　　　　　！　
、４　Ｉｉ　ｇ／ｍｌ検定手順： スボトブテラ・エクシクアーー胞子及び結晶ベレットの
希釈物をつくり、合衆国農務省の昆虫餌（技術ブレティ
ン１５２８、合衆国農務省）と混合し、小さなプラスチ
ックトレーに注いた。新生幼虫を餌混合物ｔに置き、２
５　”Ｃに１呆持する。死亡率を６日後に記録する。

コリストネウラ・オクシデンタリスーースボトブテラ・
エクシグア検定と同し方法で希釈物と餌をつくる。第４
齢幼虫を使用し、死亡率を８日後に記録する。

Ｂ．スリンギエンシスＰＳ８１Ｆ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８
４２４）とその変異種は、標準的な既′ｆＯ培地と発酵
手法を用いて培養できる。発ｅ−サイクルの終了時にま
ずＢ、１．。

胞子と結晶をこの技術で周知の手段によって発酵ブロス
から分離することによって、細菌を取り入れることがで
きる。回収されたＢ　、　ｊ、　、胞子及び結晶は、取
り扱いと特定目標害虫への施用を容易にするだめの表面
活性剤、分散剤、不活性担体、及び他の成分の添加によ
り、水和剤、濃厚液剤、粒剤又は他の処方剤に処方でざ
る。処方と施用手順はこの技術に周知であり、鱗翅目、
例えはいも土類に対して活性のある０．スリンギエンシ
ス（＋＋ｏ−１）の、市販菌株と一緒に使用される。Ｂ
、１４．Ｉ’５８１Ｆとその変異種は鱗翅目害虫の防除
に使用できる。

本発明のＢ、ｔ、ＰＳ８１Ｆと、毒素遺伝子を取り込ん
だ大腸菌ホストであるブラスミＩ”　ｐ　Ｍ　Ｖ　Ｃ３
８６含有の大腸菌ＤＨ５（α）の二欧培養基は、合衆国
イリノイ州ビオリア、合衆国農務省北部地域研究所の永
久保存施設に、１９８８年１０月７日に寄託された。呼
出し番号は次のとおりである。

Ｂ、ｔ、、ＰＳ８１Ｆ　　　　　　　　−ＮＲＲＬ、Ｂ
−１８４２４大腸菌（ＤＨ５ｚ　）（ｐＨｙＣ３８Ｇ）
　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４２３本培養基は、３７　Ｃ
ＦＲ］、＋４及び３５　ＵＳＣＩ２２の下で権限がある
と特許庁長官により決定された者は、本特許出願と対応
する米国出願の係属中に、培養基を人手できることが保
証される条件により寄託された。また、その米国出願又
はその子孫の対応特許出願が提出されている国ノ９の外
国特許法で要求されるとおりに、寄託物は利用できる。

しかし、寄託物か利用できるからといって、行政行為に
よって１４与された特許権を損わしめて本発明の実施す
る権利を構成するものではないことを理解すべきである
。

更に、本培養基寄託物は、ブタベスト微生物寄託条約の
規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされる
。すなわち、寄託物の試料提供に刻する品も最近の請求
（々少なくとも５年間、かつとんな場合も、寄託門口か
ら少なくとも３０年間か、又は培養基を開示して発行さ
れる特許の権利行使可能な曲間中、これらの寄託物は、
生育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあ
らゆる配置、ｆをも一〕で保存される。要求を受けた受
託施設−Ｉ：ｌ　　− が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合には
、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである。

本培養基寄託物の一般への人手可能性に関するすべての
制限は、これらを開示した特許の１１与に際して永久に
取り除かれる。

本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入で
きる。毒素遺１云子の発現は、直接又は間接に□止剤の
細胞内生産と保持をもたらす。適当なポスト、例えばシ
ュートモ→−スの場合、微生物は鱗翅目昆虫発生位置に
施用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その
結果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わりに、
毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素
の活性を持続させるような斎件下に処理てぎる。次に処
理細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はＢ
、１．毒素の毒性を保持している。

Ｂ、１．毒素遺伝子は適当なヘクターをぶＹて微生物ポ
ストへ導入されて、このホストか生きている状態で環境
へ施用される場合に、あるホスト微生物を使用すること
か必須である。微生物ホストは、−１４＝ 一つ以上の問題となる作物の「植物領域」（葉面、葉類
域、根領域、及び／叉は根表面）を占有することが蜘ら
れたものを選択する。これらの微生物は、特定環境（作
物及び他の昆虫生息地）中で野性型微生物と順調に競合
できるように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤を発現させる
遺伝子の安定な維持と発現を提供し、望ましくは殺虫剤
に対して環境的劣化と不活性化からの改良された保護・
を提供する。

広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領域
（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が知
られている。これらの微生物は細菌、藻類及びカビを包
含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（
Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、
クレブシェラ（ＫＩｐｌ＋５ｉｅｌ　ｌａ）、キサント
モナス（Ｘａｎｔ、ｈ　ｏ　ｍ　Ｏｎ　ａ　ｓ　）、ス
トレプトミセス（Ｓｔ、ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾ
ビウム（Ｒｈｉｚｏｌ＋ｉｕｍ）、ロードシュードモナ
ス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィ
リウス（Ｍｅｔ、ｈｙｌ。

ｐｈｉ　ｌ　１ｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂ
ａｃｔ、ｅｒ）、乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）、アースロバフタ−（Ａｒｆ、ｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔ、ｏｂａｃｔｅｒ）、
リューコノスト’７り（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）及び
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）属の細菌
；カビ類特に酵母、例えばサツカロミセス（Ｓａｃｃｌ
＋ａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコツカス（Ｃｒ　ｙｐ
ｔ、ｏ　ｃ　ｏ　ｃ　ｃ　ｕ　ｓ　）、クルイベロミセ
ス（ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロミセス
（Ｓｐｏｒｏｈｏｌｏｎ＋ｙｃｅｓ）、ロードトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びオーレオバシジウム（
Ａ　Ｌｌ　ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｌＷ）属のカビなどの
微生物である。特に重要なものは、シュードモナス・シ
リンカニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ
）、シュードモナス・フルオレッセンス、セラティア・
マルセスケンス（Ｓｅｒ＋・ａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）、アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）、アグロバクテリウム・ツ
メファシェンス（Ａｇｒｏｈａｃｔ、ｅｒｉ＋＋ｍ　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロートシュードモナス・スフ
ェロイデス（Ｒｌ＋　ｏ　ｄ　Ｏ１１Ｓ　ｅ　ｕ　ｄ。

ｍｏｎａｓ　ｓｐｌ＋ｅｒｏｉｄｅｓ）、キサントモナ
ス争カンペストリス（Ｘａｎｆ、ｌ＋ｏｍｏｎａＳｃａ
ｍｐｅｓｔ、ｒｉｓ）、リゾビウム０メリオチ（Ｒｈｉ
ｚｏｌ＋ｉｕｍ　ｍｅｌｉｏ量、１）、アルカリゲネス
０エントロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｎｔｒｏ
ｐｈｕｓ）及びアゾトバクター・ヴインランディ（Ａｚ
ｏｆ、ｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎＩａｎｄｉｉ）のような
植物領域の細菌種：及びロードトルラ・ルブラ（Ｒｈｏ
ｄｏｔ、ｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）、Ｒ，グルチニス（
Ｒ、ｇ　ｌ　ｕ　ｆ、　ｉ　ｎ　ｉ　ｓ　）、Ｒ，マリ
ーナ（Ｒ，ｍａｒｉｎａ）、Ｒ。

オーランティアカ（Ｒ，ａｕｒａｎｆ、１ａｃａ）、ク
リプトコツカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ，ジフルエンス（Ｃ，ｄ　ｉ
　ｆｆ　１ｕｅｎｓ）、Ｃ，ローレンティ（Ｃ０１ａｕ
ｒｅｎｔｉ　ｉ）、サツカロミセス・ロゼイ（Ｓ、　ｒ
ｏｓｅｉ）、Ｓ、プレトリエンシス（Ｓ、　ｐｒｅｔｏ
ｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）、スボａボロミセス−ロゼウス（Ｓｐｏｒｏ
ｂｏｌｏｎ＋ｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ、オドルス
（Ｓ、　。

ｄｏｒｕｓ）、クルイベロミセス・ヴエローナエ（にＩ
　ＩＪ　ｙｖｅｒｏ＊ｙｃｅｓ　ｖｅｒｏｎａｅ）及び
オーレオバシジウム・ポルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉ
ｄｉｕ＊　ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）のような植物領域の酵
母種である。特に重要なのは有色素微生物である。

遺伝子の安定な１呆持と発現を可能とするような条件下
に、毒素を発現させるＢ、ｔ、遺伝子を微生物ホストに
導入するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺伝
子発現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の毒素遺
伝子、及び糾込みを行なうためのホスト生物内の配列と
相同のＤ）ＩＡ配列、また絹込みや安定な保持が起こる
ための・、ホス！・内で機能的な複製系などを含んだＤ
ＮＡ構造体を用意することができる。

転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含し
よう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、毒
素の発Ｉｎが環境への放出後にのみ生ずるようにするの
が望ましいこともある。これはオペレータ、叉はアクチ
ヘータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき
、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によっ
て誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用する
と、生物は毒素を発現せずに実験室で生育てき、環境へ
放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒素
の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境
中ての栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用でき
る。転写開始には、リポソーム結合位置と開始コドンが
存在しよう。

メツセンジャーＲＮＡの安定性を強化する配列を使用す
ると共に、特シこ活性プロモータを使用してメツセンシ
ャーの発現を強化するために種々の操作を使用できる。

開始及び転写終結領域は停止コドン、終結領域、及び仔
章にポリアデニル化信号を包含しよう。

転写の方向、すなわちコープインクＶ！、はセンス配列
の５゛から３”への方向で、構造体は転写調節領域（こ
れがある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの
５′又は３′のいずれかにある）、リポソーム結合位置
、開始コ！・ン、開始コドンと同調する開放読取り枠を
もった構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配
列（使用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本
鎖としてのこの配列はそれ自体微生物ポストの形質転換
に使用できるが、普通はマーカーを含めたｌ＋　Ｎ　Ａ
配列を伴うようにし、この第二のＴＩＮＡ配列は、ポス
トへのＤ）ＩＡ導入中に毒素発現構造体に結合させるこ
とができる。

マーカーとは、変更×は形質転換されたボスｊ・の選定
を行なうための構造遺伝子のことである。

マーカーは通常、選択的利点を提供ずろもので、例えば
抗生物質や重金属への耐性なとの殺生物耐性や、栄養素
要求ホストに原栄両性を与える相補性を提供する。変更
されたホストが選定されるたけでなく、野外で競合的で
あるように、相補性を使用するのが好ましい。構造体の
開角に、またホストの変更に、一つ以−Ｆのマーカーを
使用できる。

野外で仙の野性型微生物に対する競合的利点を提供する
ことによって、生物を更に変更できる。例えは、金属キ
レート剤、例えはシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒
素発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。こ
の方法て、シブミツオアの強化された発現が毒素生産ポ
ストに競合的利点を提供するため、ホストは野性型微生
物と効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を占
めるようになる。

機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも５０塩基対（１月〕）、好ま
しくは約１００＋）ｐ、及び通常的１．０００１月〕ま
での配列を包含しよう。こうして合法的組換えの確率が
強化されろため、ｉｔ　Ｉ＝４子はホスＩ・へ組込まれ
、ポストによって安定に保持される。毒素遺伝子が相補
性を提供する遺伝子並ひに競合的利点を提（＋、する遺
伝子に近接しているのが望ましい。従って、毒素遺伝子
が失われる場合、生ずる生物は相補性遺１云子及び／×
は競合的利点を提供する遺伝子も失う可能性が強く、こ
のため無傷の構造体を保持している遺伝子と環境中で競
合できなくなる。

細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、
カビ等のような広範囲の微生物ポストから多数の転写調
節領域が人手できる。種々の転写調節領域はｔ、　ｒ　
１１遺伝子、ｌａｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及
Ｕ右プロモータ、Ｔａｃプロモータ、及びホスト中で機
能的な場合は毒素遺伝子と関連して天然に生ずるブ１コ
モータを包含する。例として合衆国特許第４．３３２．
１８号、第４，３４２，８３２号、及び第４．３５Ｇ、
２７０号を参照のこと。終結領域は、普通は転写開始領
域と関連Ｍる終結領域か、又は異なる転写開始領域（二
つの領域かホスト内て適合的て機能的であるト１りりに
おいて）でありうる。

安定なエピゾーム保持叉は刊込みを所望する場合は、ホ
スト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使用され
よう。複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常存
在するエビソーム要素、又はホスト内で安定なウィルス
の複製系から誘導される。１ｌＢＲ３２２、ρＡＣＹＣ
］８４、Ｒ５ＦＩＯＩＯ１１ｉＲＯＩ　Ｇ　ｌ　４等の
ような多数のプラスミドが人手できる。例として、オル
ソン（ＯＩｓＯｌｌ）ら、（１４１８２年）　ｊ、Ｂａ
ｃｔ、ｐｒｉｏｌ、　１５０巻６０６９頁、及びハクタ
サリアン（ｒｔａｇｄａｓａｒｉａｎ）ら、（＋９８］
年）　Ｇｅｒ＋ｅ　１６巻２３７頁、並ひｔこ合衆国特
許第４゜：３５ｆｉ、２７０号、第４，３６２．旧７号
、及び第４，３７１，６２５号を参照のこと。

Ｂ、ｔ、遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、
転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以１−を包
含でき、その場合−つの複製系はプラスミドの開発中に
クローニング用に使用され、第二の複製系は靜終ホスＩ
・ての機能発揮にノｇ・要である。更に、７１てに述へ
た一つ以」二のマーカーがイ１在てぎる。糾込みを望む
場合は、ブラー２２＝ スミトはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい
。

形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在する
時は、それらに対して所望生物を選定できるように、慣
用の方法に従って選定手法を使用して単離てきる。次に
形質転換体を殺虫活性のために試験できる。

殺虫剤含有細胞を処理して処理細胞を目標害虫環境に施
用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるのに適した
ホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通常
、は乳類のような高等生物に有毒な物質を生しない細胞
に限定される。しかし、毒素が・不安定か、哺乳類ホス
トへの毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準
である場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も
使用できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核
生物と、カビのような低級真核生物である。

ダラム陰性・陽性双方の１ｑ核生物の例は、エシェリキ
ア（Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒ
ｗｉｎｉａ）、シケラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リルモネ
ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びプロテウス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ）のような腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒ。

ｈａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　；バシラス科（Ｂａｃ　
ｉ　Ｉ　ｌ　ａｃｅａｅ）　；リソヒウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ）のようなりゾヒウム科（Ｒｈｉｚｏ−ｂｉａ
ｃｅａｅ）　；発光細菌、ジモモナス（ＺｙｍｏｌＩｌ
ｏｎａｓ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロ
モナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ
）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）のようならせん
菌科；乳酸かん菌科；シュードモナス（ｒ’ｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）及びアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ）のようなシュードモナス科；アゾトバクター科及
びニトロバクタ−科を包含する。真核生物には藻菌類（
Ｐ　ｈ　ｙ　ｃ　ｏ　ｍｙｃｅｆ、ｅｓ）と子のう菌Ｉ
ｌ（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）のようなカビがあり、こ
れはサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と
シゾサツカロミセス（Ｓｃｌ＋ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）のような酵母、ロートトルラ レオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポ
ロボロミセス（ＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅＳ）のよう
な担子菌類（Ｂａｓ　ｉｄ　ｉｎｍｙｃｅｔｅｓ）酵母
を包含する。

生産目的のためにホスト細胞を選定する上で特に重要な
特性は、Ｂ　、　ｔ．　、遺伝子のホストへの導入の容
易さ、発現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の
安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤
ミクロカプセルとして使用するのに重要な特性は厚い細
胞壁、色素形成、及び細胞内パッケージング又は封入体
の形成のような殺虫剤保護性二葉親和性；対哺乳類毒性
の欠如；害虫に摂取させるための誘引力；毒素に損害を
与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮とし
ては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等
がある。

特に重要なホスト生物は、ロートトルラ種、オーレオバ
シジウム種、サツカロミセス種、スポロボロミセス種の
ような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種、及び
フラボバクテリウム種のような葉面′ここ生息する生物
：叉はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等の他の
生物を包含する。

特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａＳａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュード
モナス・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ）、サツカロミセスｅセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バシラス・スリ
ンギエンシス、大腸菌、枯草菌（Ｂ。

ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を包含する。

細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実質
的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用できる。

微生物細胞、例えばＢ　、　ｔ．　、毒素遺伝子を含有
する微生物の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさない
か、又は毒素を保護する細胞能力を消滅させない限り、
化学的又は物理的手段によるか、又は化学的及び物理的
手段の鞘合わせによることができる。化学的試薬の例は
ハロゲン化剤、特に原子番号Ｉ７−８０のハロゲンであ
る。もっと特定的には、ヨウ素を温和な条件下に、所望
の結果を達成するのに十分な時間に使用できろ。他の適
当な手法は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの
ようなアルデヒｌー類：塩化ゼフィランと塩化セチルピ
リジニウムのような抗感染剤：イソプロピルアルコール
とエタノールのようなアルコール類；ブアン固定剤とヘ
リ−固定剤［フマソン（旧＋ｍａｓｏｎ）、グレッチェ
ン・エル（Ｇｒｅｆ．ｃｈｅｎ．　Ｌ．）　ｒ動物組織
手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、１９６７年
、を参照コのような種々の組織学的固定剤等での処理；
又はホスＩ・動物に細胞を投与する時に細胞中につくら
れる毒素の活性を保存し、持続させるような物理的処理
（加熱）と化学薬剤処理との繕合わせを包含する。物理
的手段の例は、カンマ放射線とＸ線のような短波長放射
線、凍結、Ｕｖ照射、凍結乾燥等である。

一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するような
、強化された構造安定性をもつであろう。

殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制しないように、不活
性化方法を選定すべきである。例えばホルムアルデヒド
はタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工
を抑制できる。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少な
くとも実質部分の生物学的利用率叉は生物活性を保持す
る。

Ｂ、ｔ、殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは、ＤＮＡ
構造体がそこで選択的利点を提供し、細胞の全部又は実
質的全部がＢ１１．遺伝子を保持するように選択培地を
与えるところの、任意の都合のよい栄養培地で生育てき
る。次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り入れる。

その代わりに、細胞を取り入れる前に処理することもて
きる。

Ｂ、ｔ、＠胞を種々の方法で処方できる。これらを無機
鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は
植物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等
〉のような種々の不活性材料と混合することにより、水
和剤、粒剤叉は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着
助剤、安定剤、その他殺虫助剤、又は表面活性剤を包含
できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので
、フオーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。

成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体
を包含できる。

殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使用
されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なくと
も１［１て存在し、ｌｏｏｍ　Ｉ　！でありうる。乾燥
処方剤は約１−９５ｕｌｉ！！の殺虫剤をもつが、液体
処方剤は一般に約＋−６０！！：％の固形分を液相中に
もってあろう。処方剤は概してｍｇ当たり約ｌＯ２ない
し約１０４個の細胞をもってあろう。これらの処方剤は
へクタール当たり約５０　ｍｇ（液体又は乾燥）ないし
Ｉ　ｋｇ以上の率で投与されよう。

処方剤は鱗翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水に
噴霧、散布、散水等によって施用できる。

ＰＳ８１Ｆの変異種は、この技術で周知の手順によって
つくることができる。例えば、非胞子形成性変異種は、
ｒ’５８１Ｆのエチルメタンスルホネー）（ＥＭＳ）変
異誘発によって得られる。変異種は、この技術で周知の
手順により、紫外光やニトロソグアニジンを使用してつ
くることができる。

以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示した
実施例である。これらの例は限定的に考えられてはなら
ない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶媒
混合物割合はすべて容量による。

実施例Ｉ　　Ｒ，ｔ、ＰＳ８１Ｆ（ＮＲＲＬ　Ｂ１８４
２４）の培養＋＋、ｔ、ＰＳ８１Ｆ（ＮＲＲＬロー１８
４２４）又はその変異種の二次培養基を使用して次の培
地、すなわちペプトン−２９＝ ・ブドウ糖・塩培地に接種した。

ハクト・ペプトン　　　　７．５　ｇ／ｌブトつ糖　　
　　　　　１．Ｏｇ／Ｉ ＫＭ２ＰＯ４：Ｌ４　ｇ／Ｉ Ｋ２ＨＰＩＩ４４．３５　ｇ／ｌ 塩溶液　　　　　　　　　５．０　ｍｌ／ｌＣａＣｌ２
ｆＷ液　　　　　　　５．Ｏｉｆ／ｌ塩溶液（１００ｍ
ｌ） ＭｇＳ０４−７１１２０　　　　　　　２．４６３Ｍｎ
５ｆ）４−８２０　　　　　　　０．０４　ｇＺｎＳＯ
４−７１１２００，２８ｇ ＦｅＳＯｎ−７）１２０　　　　　　　０．４０　ｇＣ
ａＣＩ２ＣａＣｌ２溶液ｌ） ＣａＣ１２−２８２０３，６６ｇ ｐｌ＋７．２ 塩溶液とＣａＣｌ２溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ
処理し調理したブロスに、接種時に添加する。

２０Ｏｒｐｍで操作される回転振どう機で、フラスコを
３０°Ｃ１６４時間培養する。

上の手順は、この技術で周知の手順により、大発酵Ｈ置
まで容易に規模拡大できる。

上の発酵で得られるＢ　、　１．　、胞子及びｌ又は結
晶は、この技術で周知の手順により単離てきる。しばし
ば用いられる手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例
えば遠心分離にかけることである。

実施例２　新規な毒素遺伝子のクローニングと大腸菌へ
の形質転換 Ｂ、スリンギエンシス＋１０−１と新規な８．ｔ、、Ｐ
Ｓ８１Ｆの細胞を低光学密度（θ０６ｏｏ１．０）に生
育させ、細胞を遠心分離によって回収し、全細胞ＯＮ、
Ａを調製した。２０％庶糖と５０ｆｆ１ｇ／ｍ　Ｉリソ
チームを含有するＴＥＳ緩衝液（３０ｍＭトリス−ＣＩ
、ＩＱ　ｍＭ　Ｅ［ｌＴＡ、　５０　ｍＭ　ＮａＣ１、
ｐＨ＝　８．０）中で細胞をプロトプラスト化させた。

プロトプラストを４ｚの最終濃度までＳＤＳ添加によっ
て溶菌化した。細胞材料を最終濃度１００ｍＭの中性塩
化カリウム中、４℃で一夜沈殿させた。

上澄み液をフェノール／クロロホルム（１：Ｉ）で２回
抽出した。ＤＮＡをエタノール中で沈殿させ、塩化セシ
ウム勾配上の等密度バンディングによって精製した。

各々（ＰＳ８１ＦとＨＤ−１）からの全細胞ＤＮＡをＥ
ｃｏＲｌで消化させ、０．８χアカロースゲル−ＴＡＥ
−緩衝化ゲル上の電気泳動によって分離した。ゲルのサ
ザンブロットを、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３３２のプラスミ
ド１１Ｍ３．＋３０−７中に含まれる毒素遺伝子のＮ５
ｉｌからＮ５ｉｌまでの断片、及び°’４．５ｋｂクラ
ス”の毒素遺伝子［クロンスタット（Ｋｒｏｎｓｔａｄ
）及びホワイトリー（Ｗｌ＋１ｔｅｌｙ）（１９８６年
）Ｇｅｎｅ　ＬノＳＡ　４３巻２９−４０頁］のＮ５ｉ
ｌからＮｓ　ｉｌまての断片でプローブした。これらの
二つの断片を一緒にし、プローブとして用いた。結果は
、ＰＳ８１Ｆのハイブリット化断片がｌＩＤ−１のそれ
と異なることを示している。特定的には、ＰＳ８１Ｆ中
の３．５ｋｂのハイブリット化バントが、Ｈ［ｌ−１中
に見られる３００　ｂｐ大きい３．８　ｋｂのハイブリ
ット化バントの代わりに検出された。

ＰＳ８１Ｆの全細胞ＤＮＡ　２００μｇをＥｃｏＲｌで
消化させ、分離用０．８χアガロース−ＴＡＥゲル上の
電気泳動によって分離した。ゲルの３．Ｏｋｂから４．
Ｏｋｂの領域を切り出し、そこからのＤＮＡを電気溶離
し、ＥＬＬＩＴＩＰ丁”−ｄ（シュライヒャー・エン］
・・シュニル社、ニューハンプシャー州キーン）イオン
交換カラムを用いて濃縮した。単離されたＥｃｏＲｌ断
片をしＡＭＢ［１ＡＺＡＰ丁”　ＥｃｏＲ１アーム（ス
トラタジーン・クローニング・システムズ社、カリフォ
ルニア州うホヤ）に再結合し、ＧＩＧＡＰＡＣＫ　ＧＯ
ＬＤＴ”抽出液を用いてパッケージした。パッケージに
した組換えファージを大腸菌菌株８Ｂ４（ストラドジー
ン）と−緒にプレートに撒くと、高プラーク密度が得ら
れた。プラークを放剖性標識付きプローブによる標準的
核酸ハイブリット化手順によって選定した。ハイブリッ
ト化されたプラークを精製し、低プラーク密度で再選定
した。生ずる精製ファージをＲ４０８旧３ヘルパーフア
ージ（ストラドジーン）と−緒に生育させ、却換えＢＬ
ＩノＥＳＣ８１Ｉ’Ｔ”　（ストラドジーン）プラスミ
ドを自動的に切り出し、パッケージ化した。

自動化切り出し法の一部として、「ファージミツト」を
ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（ストラドジーン）に再感
染させた。感染ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞をアンピシリン耐
性について選定し、所望のプラスミドを見つけるため、
生ずるコロニーを標準ミニブレツブ化手順によって分析
した。ｒ＋Ｍ５，３１＋と指定されるプラスミドは、約
３．５　ｋｈ　ＥｃｏＲ１挿入物を含有しており、スト
ラドジーン社のＴ７及びＴ３ブライマー、プラス−［の
既存Ｂ、ｔ、内毒素オリゴヌクレオチドブライマーを用
いて配列決定した。約１．７ｋｂの毒素遺伝子が配列決
定され、ＰＳ８１Ｆを他のクローン化Ｂ、１゜内毒素遺
伝子と比較したデータ分析は、ＰＳ８１Ｆ配列が特異な
ものであることを示した。他の既存のＲ，ｔ、内毒素遺
伝子に対して最も相同性の小さいＰＳ８１Ｆ配列中の領
域の一つに、合成オリゴヌクレオチド（Ｇ　ＣＴ　Ｇ　
Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　（ｌ　ＣＴ　Ａ　Ｔ　
Ｔ　ＣＧ　Ｔ　を達；ＴＧＧＴＧＡＧＣ）を構築した。

全細胞ｒｌＮＡを部分的に５ａｕ３Ａで消化させ、電気
泳動によって０．６エアカロースＴＡＥゲル上で９−２
３　ｋｂ断片の混合物へ分画し、これをＬＡＭＢＤＡ　
ＤＡＳＨ”　（ストラタジーン）へ再結合した。パッケ
ージ化したファージをＰ２３９２大腸菌細胞（ストラド
ジーン）と−緒に高滴定価でプレートに蒔ぎ、核酸ハイ
フリット化プローブとして前１８放射性標識付き合成オ
リゴヌクレオチド′を用いて選定した。ハイブリッＩ・
化プラークを低めのプラーク密度で再選定した。精製ハ
イブリット化プラークを用いてＤＮＡ単離用のファージ
調製のため、液体培養基中てＰ２３９２大Ｉｆ）菌細胞
に感染させた。ＤＮＡを標準手順によって単離した。分
＃量の紺換えファージＤ）ＩＡを５ａｌｌで消化させ（
挿入ｒｌＮＡをラムダアームから放出させるため）　、
０．（’ｉＹアカＩＪ−スーＴＡＥゲル上の電気泳動に
よって分路した。大断片（、ｌ：記のように電気溶離し
濃縮したもの）を、Ｘｈｏ　ｌて消化させホスファター
ゼ処理したＢＬＩＪＥＳＣ８１　ＰＴＴ″Ｔ１プラスミ
ド合させた。再結合体を大腸菌Ｄ　Ｈ５（α）コンピテ
ント細胞（ＢＲＬ）に形質転換し、アンピシリン、イソ
プロピル−（β）−Ｄ−チオカラクトシト（ＩＰＴＧ）
及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（βＩ
Ｄ−ガラクトシド（、ＸＧＡＬ）を含有するＬＢ寒天上
にプレートした。ｐ旧、４３−２４と指定されるプラス
ミドを単離するために、白色集落（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔの（β）−ガラクトシダーゼ遺伝子中に挿入物をも
つもの）を標準的なミニブレツブ手順にかけた。全長毒
素遺伝子は、”Ｉｌ、３ｋｈクラス゛°の毒素遺伝子に
対してつくられたオリコ′又りレオチトフ゛ライマーを
用いて、またＰＳ８１Ｆの配列に対してつくられたブラ
イマーとの“ウオーキング゛によって配列決定された。

推定されたＰＳ８１Ｆアミノ酸配列を他の五つの内毒素
の配列と比較したデータ分析は、ＰＳ）ＩＩＦが特異な
ものであることを示している（第４表）。

プラスミドル旧、４３−２４は、１３：（，２６６ダル
トンの内毒素をコードした３、５１８　ｋｔ＋を含め、
約１８ｋｂのＰＳ８ＩＦ　ＤＮＡを含有している。プラ
スミドは、約１３ｋｂの非コードＤＮＡを切り出して、
末端を再結合させ、ＤＩＩ５（α）を形質転換し、アン
ピシリンを含有するＬＢ寒天にプレートすることによっ
て大きさを減少させた。生ずる集落は、大きさの減した
プラスミドを単離するために、標準ミニブレツブ手順に
よって分析した。所望のプラスミドｐＭＹｃ３８６は、
ＰＳ８１Ｆ毒素遺伝子のコード配列を含有し、これを５
ａｅｌからＡｐａｌまての４．５　ｋｌ＋の断片として
切り出すことができる。

一ヒのクローニング手順は、他に注−σがなければ標準
手順を使用して行なった。

プラスミドの調製とポスト生物の形質転換に使用される
種々の方法はこの技術で周知である。また、クローニン
グ・ヒヒクルとしてのラムダバクテリオファージの使用
法、すなわちラムダＤＮＡの！ｌＩＩ製、生体外パッケ
ージング、及びＭ４換えＤＮＡのトランスフェクション
は、この技術で周知である。

これらの手用口はずへて、マニアチス・ティー（Ｍａｎ
ｉａｔ、ｉｓ、　Ｔ、）、フリッシｍｌ’イー・エフ（
ＦｒｉｔＳｃｆｉ。

Ｅ、Ｆ、）及びサムフロック・シエイ（Ｓａｍｈｒｏｏ
ｋ、　ｊ、）（１９８２年）、「分子クローニング：実
験マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ−研究
所、ニューヨーク州）に記述されている。このように、
微生物細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化を行
ない、ｆｌＮＡ断片をｔ気ン水動にかけ、プラスミドの
チーリンクとアニーリングを行ない、ＤＮＡを挿入、再
結合し、細１１ａをＩＦモ質転換し、プラスミドＤＮＡ
を調製し、タンパクを電気泳動にかけ、Ｄ　Ｎ　Ａの配
列を決定するのは、１宜伝子工学の当業者の技術範囲に
ある。

本明細書で明らかにされている制限酵素は、ヘ−３７＝ セスダ研究所（メリーラント州ゲイサーズハーク）及び
ニューイングランド・バイオラフ（マサチューセッツ州
ヒハリー）から購入できる。酵素は、供給側から提供さ
れる指示に従って使用される。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含有するブラスミＦ’　ｐ　Ｍ　
Ｖ　＋〕３８　Ｇは、形質転換されたホスト微生物から
周知の標準手順を用いて除去できる。例えは大腸菌ＮＲ
ＲＬ　Ｒ−１８４２３を透明溶菌液の等密度勾配手順等
にかけて、ｐＭＹｃ３８６を回収することができる。

標準的昆虫試験からのデータは、新規なｎ、ｔ、ｐｓ８
１Ｆがコナカ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｒｋ　＋ｉｏｔ、ｈ
）、スボトブテラ・エクシグア、ニシハマキ力幼虫、及
びトリコブルシア・二に対して活性があることを示して
いる。

実施例３　毒素遺伝子の植物への挿入 不明″ａ臀で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコ
ー）・シた新規な遺伝子は、アゲＩコバクター〇ツメフ
ァシェンス（Ａｇｒｏｈａｃｔ、ｅ＋　↑ｕｍｅｆａＣ
ｉｅｎｓ）からのＴ１プラスミドを使用して、植物細胞
へ挿入できる。次に植物細胞を植物へ再生させる［ザン
ブリスキ・ピー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、　Ｐ、）、ショ
ーフ・エフＩＲ− チ（Ｊｏｏｓ、　Ｌ）、ジエンテロ畢シー（Ｇｅｎｔｅ
ｌｌｏ、　Ｃ，）、リーマシス、ジエイ（Ｌｅｅｍａｎ
ｓ、、１．）、パン・モンタギュー・エム（Ｖａｎ　Ｍ
ｏｎｔａｇｕｅ、　Ｍ、）、及びシェル・ジエイ（Ｓｃ
ｈｅｌｌ、　　、１．）（１９８３年）Ｃｅｌｌ　３２
巻＋０３３−１０４３頁］。この点て、特に有用なｌ＼
クターはρＥＮＤＩＩＫであ゛る［クリ−・エッチ・ジ
エイ（Ｋｌｅｅ、　、Ｈ，Ｊ、）、ヤノフスキー・エム
・エフ（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　Ｍ、Ｆ、）及びネスター
・イー・ダブリ−ｔ　−（Ｎｅｓｔｅｒ、　Ｅ、Ｗ、）
（１９８５年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３巻６
３７−６４２頁］。このブラースミドは、植物細胞と細
菌中で複製でき、パラセンジャー遺伝子に対して複数の
クローニング位置をもっている。例えば毒素遺伝子はｐ
ＥＮＤ４にのＢａｍＨｌへ挿入され、大腸菌中て増殖し
、適当な植物細胞へ形質転換される。

実施例４　新規なり．スリンギエンシス遺伝子のバクロ
ウィルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフオル
ニカ（Ａｕｔ、ｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）核ポリへトロシスウィルス（ＡｃＮＰν）のような
バクロウィルスへクローン化できろ。ｐ　１．１　ＣＢ
のような市販のクローニングｌ＼クターにクローン化さ
れたＡ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖゲノムを含有するプラスミドを
構築できる。ＡｃＮＰＶケノムを変更し、ポリｌ＼トリ
ン遺伝子のコード領域が除かれて、バラセンシャー遺伝
子の特異なりローニング位置がポリヘトリンプロモータ
の真後ろに置かれるようにする。このようなベクターの
例はベノックら［ペノック・ジー・デイ−（Ｐｅｎｎｏ
ｃｋ。

Ｇ、Ｄ、）、シューメーカー令シー（Ｓｈｏｅｍａｋｅ
ｒ、　Ｃ０）及びミラー・エル・ケイ（Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｌ、に、）（１９８４年）Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、４巻３９９−４０６頁］に記述さ
れたｐＧＰ−８６８７４、及びスミスら［スミス・ジー
・イー（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｅ、）、サマーズ・エムφデ
イ−（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、Ｄ、）及びフレーザー虐
エム・ジエイ（１９８３年）Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂ、
ｉｏｌ。

３巻２１５６−２１６５頁］に記述されたρＡ＋’、　
３８０である。本発明の新規なタンパク毒素をコーｉ・
した遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適当な領
域で、Ｂａｍ旧リンカ−によって変更でき、ＡｃＮＰＶ
ヘクター類の一つのもののパラセンジャー位置に挿入で
きる。

すでに明らかにされたように、Ｂ、ｆ４．毒素遺伝子を
コードしたヌクレオチド配列を第１表に示す。

推定されたアミノ酸配列を′＠２表に示す。

この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配クリは
、１）ＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。遺
伝暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに
使用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号
化ヌクレオチドトリプレット（コドン）を使用できるた
め、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配
列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描
くことができる。

フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴＫロイシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　ＸＴＶイソロイシン（ｌｌｅ）　
　　　　ＡＴＭメチオニン（Ｍｅｆ、）　　　　　　Ａ
ＴＧバリン（Ｖａｌ）　　　　　　　　ＧＴＬセリン（
Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＱＲＳプロリン（Ｐｒｏ）
　　　　　　　　ＣＣＬスレオニン（Ｔｈｒ）　　　　
　　ＡＣＬアラニン（Ａｌａ）　　　　　　　ＧＣＬチ
ロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　ＴＡＫヒスチジン（ｌ
ｌｉｓ）　　　　　　Ｃｌグルタミン（Ｇｌ　ｎ　）　
　　　　　　ＣＡ　、ｌアスパラギン（ＡＳｎ）　　　
　　ＡＡＫリジン（Ｌ！／Ｓ）　　　　　　　　　ＡＡ
、１アスパラギン酸（Ａｓｐ）　　　　Ｇｌグルタミン
酸（Ｇｌｕ）　　　　　ＧＡｊシスティン（Ｃｙｓ）　
　　　　　ＴＧＫトリプトファン（Ｔｒｐ）　　　　　
ＴＧＧアルキニン（Ａｒｇ）　　　　　　　ＷＧＺグリ
シン（Ｇｌｙ）　　　　　　　　ＧＧＬ終結信号　　　
　　　　　　ＴＡ、１ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ絹は、
左側に駅末端、右側に３′末端をもつ伝令ＲＮＡのトリ
ヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡはす
べて、ウラシルにはチミンを置き趨えた、ｍＲＮＡの配
列に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである。文字はデオ
キシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン
塩基を示す。

Ａ＝アデニン Ｇ＝ニブアニ ン４２− Ｃニシトシン Ｔ−チミン ｙがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ叉はＣ９ＶがＣまたは
Ｔの場合は、×＝Ｃ１ ×がＣの場合は、Ｖ＝Ａ、　＋１；、　Ｃ叉はＴ。

×がＴの場合は、Ｖ＝Ａ叉はＧ。

ＺがＡ又はＧの場合は、−＝（−叉はＡ。

ＺがＣ又はＴの場合は、Ｗ：Ｃ。

ＷがＣの場合は、Ｚ：Ａ、　に、　Ｃ又はＴ。

−がＡの場合は、Ｚ＝Ａ叉はＣ９ ＳかＡ、ｌ’ｌ、し又はＴの場合は、（Ｉ　Ｒ＝　Ｔ　
Ｃ、又はその代わりに５がＴ又はＣの場合は、０Ｒ＝Ａ
Ｇ。

、ｌ　＝　Ａ　Ｓ／、は（ｊ １〈＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、　　Ｔ、　　ＣＭ　ｉ；ｔら。

Ｍ＝Ａ、　　Ｃ，”；ｌ：はＴ。

ｈ記は、Ｒ，＋、９毒素の新規なアミノ酸配列が、この
タンパクの同しアミノ酸配列なコーＩ・した同等なヌク
レオチド配列によって調製できることを示す。従って、
本発明はこのような同等なヌクレオ箋工茎、遺伝子をコ
ードして（ チト配列を包含する。史に、アミノ酩酊クリの変更がタ
ンパクの二次構造を変更しないならば、Ｉ＋＋（認され
た構造及び機能のタンパクが、このような変更によって
構築できることが示された［カイザー・イー・ティー（
にａｉｓｅｒ、　Ｅ、Ｔ、）及びノ１スディ・エフ・シ
エイ（Ｋｅｚｄｙ、　Ｆ、、１．）（１９Ｆ１４年）Ｓ
ｃ　ｉ　ｅｎｔ：ｅ　２２３巻２４９−２５５頁］。こ
のように、本発明はタンパクの二次構造を変更しないよ
うな本明細書に記載のアミノ酸配列の変異体、叉は構造
か変更される場合、生物活性がある程度保持されろよう
な変異体を包含する。

ハる新規な毒素のヌクレオチｊ−配列 １２０、Ｉ　ＡＧＴＡＧＧＧＧＧＡ　ＣＡＧＴＡＧＡＴ
ＴＣＴＣＴＴＡＡＴＧＡ１１２６１　　ＧＧＡＴＡＴＡ
ＧＴＣＡ丁ＣＧＡＴＴＭＧ　　ＴＣＡＴＧＴＴＡＣ。

１３２１　ＡＣＴＡＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴ
　ＴＴＧＧＡＣＡＣＡ１５０１　　ＴＴＴＧＴＧ丁ＣＴ
Ｔ　　ＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡ　　ＴＡＴＴＭＣ丁Ｃ１５
６１ＣＧＴＴＡＴＧＣＴＴ　　ＣＣＡＧ丁ＡＧＧＧＡ　
　ＴＧＣＡＣＧＡＡＴ１６２１　ＧＡＴＡＴＧＡＣＣＣ
ＴＴＧＡＪＬＡＡＡＡＣＣＡＴにＧＡＡＡＴ１６８１　
　ＴＡＴＡＣＣＭＴ丁　ＴＴＡＧＴＭ丁ＣＣＴＴＴＴＴ
ＣＡ丁Ｔ１７４１　ＧＭＧＡＡＣＴＴＣＣＴＡＴＴＣに
ＴＧＧ　ＴＧＧＴＧＡＧＣＴ１８１（１１Ｂ２０　　　
　１８３ １８０１　ＧＡＴＧＣＭＣＡＴ　ＴＴＧＭＧＭＧＡ　Ａ
ＴＡＴＧＡＴＴＴ１８６１　ＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡ　Ｃ
ＡＡＡＴＣＭＣＴ　ＡＧＧＧＣＴＡＡｊ１１９２１　　
Ｇ丁ＴＴＣＣＭＴＴ　　ＴＡＧＴＴＧＡＧＴＧ　　Ｔ丁
ＴＡ丁ＣＧＧＡ１９８１　丁ＣＣＧＡＧＡＡＡＧ　　Ｔ
ＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＡＡＧＣＧＡＣＴ２０４１　　Ｍ
Ｃ丁ＴｃＡＧＡＧ　　ＧＧＡＴＣＡＡＴＡＧ　　ＧＣＡ
ＡＣｃＡ（Ｊ２１０１　　ＡＴＣＣＡＡＧＧ丁Ｇ　　Ｇ
ＡＧＡＴＧＡＣＧＴ　　Ａ丁ＴＣＡＡＡＧＪ２１６１　
　ＧＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴ丁　Ａ丁Ａ
ＴＣＡＡＡ／２２２１　　ＣＧＣＴＡＴＧＡＡ丁　丁Ａ
ＡＧＡＧＧＧＴＡ　　ＴＡＴＣＧＡＧＣＪ：ｌ　　　　
１２４０　　　１２５０　　　１２６０■ ■ 、Ｔ 、Ｃ 、Ｇ Ｔ ＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴ　ＧＣＧＣＧＣＣＡＣＡ　ＣＣＴ
ＴＣＡＡＴＧＧ２４０１　ＭＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＣＡ
ＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＩ２４６１　　ＴＴＣ丁Ｃ
ＣＴ丁ＧＧ　　ＡＣＡＴＴＧＡＴＧ丁　ＴＧＧＡＴＧＴ
１２５２１　ＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡ　ＴＴＡＡＧＡＣＡ
ＣＡ　ＡＧＡＴＧＧＣ’２７１０　　　　２７２０　　
　　２；２７０１　　ＧＴＡＧＡＴＧＣＴＴ　　ＴＡ丁
ＴＴＧＴＡＡＡ　　Ｃ丁ＣＴＣＭ’２７６１　　Ａ丁Ｇ
ＡＴＴＣＡＴＧ　　ＣＧＧＣＡＧＡ丁Ｍ　　ＡＣＧＣＧ
ＴＴＩ’１ｏ０１　ＣＴＴＧＴＴＣ；ＴＴＣＣＡＣＡＡ
ＴＧＧ弘ＡＧＣＡＣＡＡ３０６１　ＧＧＣＴＡＴＡＴＣ
ＣＴＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＣＧＴＡＣ３１２１ＣＡＴ
ＧＡＧＡＴＣＧんＬ（ＪＣＡＡＴＡＣＡＧＡＣＧＡＡ３
１８１　ＴＡＴＣＣＡＡＡＣＡ　ＡＣＡＣＧＧＴＡＡＣ
ＧＴＧＴＭＴ３２４１　　ＡＣＧ丁ＡＣＡＣＴＴ　　Ｃ
ｃＣｃＴＡＡＴＣＧ　　ＡＧＧＡＴＡＴ３４２１　　Ｔ
ＡＣＴＴＣＣＣＡＧ　　ＡＡＡＣＣＧＡＴＭ　　ＧＧＴ
ＡＴＧＧ３４８１　ＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧ　ＴＧＧＡＡ
ＴＴＡＣＴ　ＴＣＴＴＡＴＧ−４ワ 櫂Ｃ ＣＡ ｒＡＴ　・ υ０　　　　２７４０　　　　２７５０　　　　２７６
０ＡＴ　１ ：ＡＴ； ＴＧ ＡＡＩ ＣＴＧ　； Ｍτ　・ ＧＡＣ［ ＡＴＴ　［’ ＣＡＧ　ＣＡＡＴＡＡＴＡ 第２表、新規 １　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　ｒｌｅ　ＶｓＥ　Ａｓｎ　Ａｓｎ
　Ｃ１６，Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　
Ａｓｎ　（３ｉ　　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　ＡＬａ　
Ｔｈｒ　Ａｓｎ　１４６　ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　ＩＬｅ　Ｇ６ｉ　ＡＬａ　ＩＬｅ　Ｔｒ
ｐ　Ｇｔｙ　Ｓｅｒ　Ｉｔｅ　Ｃ７６ＧＬｕ　ＧＬｎ　
ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　？９１　Ａｒｇ　Ａ
ｓｎ　ＧＬｎ　ＡＬａ　ｔｉｅ　Ｓｅｒ　Ａ１０６　Ｇ
Ｌｙ　ｒｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ　Ａｔａ　Ｐ１
２１　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＧＬ
ｕ　Ｇ１３６　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ｒＬｅ　Ｌｅｕ　Ｖａ
Ｌ　Ｔｈｒ　Ａ１５１　Ｔｙｒ　ＧＬｎ　ＶａＬ　Ｐｒ
ｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　５１６６　Ｈｆｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅ
ｒ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ＾１８１　Ｇｔｙ　Ｐｈｅ
　Ａｓｐ　ＩＬｅ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　１１９６　Ａｒｇ
　Ｌｅｕ　Ｉｔｅ　Ｐｒｏ　ＩＬｅ　Ｔｙｒ　Ｔ２１１
Ｔｈｒ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐ
２２６　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＧＬｎ　Ｐ
ｈｅ　Ａ２４ｉ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　ＩＬｅ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｈｅ　Ａ２５６　ＩＬｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　ＧＬｎ　Ｌ２７１　ＶａＬ　ＩＬｅ　Ａ
ｓｎ　ｆｅｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔ２８６　１Ｌｅ　Ｇ
Ｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　ｒｔｅ　Ａ３０１　Ａ
ｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　Ｔ３
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　　　＋　　　＋　　　区　　−〉！ （Ｄ （Ｏ 。：′：″：　ｍ　Ｃｏ　（Ｏｘ ＜＜＜＜ 骨・−〉 ＋１１）＋ Ｌｌ　ｔ５Ｌｌ　） ｔＡψ（１）ト ：ｃ：ｅωｃａｍ工 １１Ｄ１はバシラス・スリンギエンシス亜種カースタキ
Ｈｒｌｌ　［ブリサート及びホワイトリー、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｆｉ巻（Ｈ１８
８年）２７２３頁］からのｃｒｙＡＩ毒素遺伝子である
。

＋１０７３はＨＤ　７３からのｃ　ｒ　ｙ　Ａ　３遺伝
子である。

ＢＴＢはＢＴ菌株Ｂｅｒｌｉｎｅ＋からのｃｒｙＡ２遺
伝子である。

８１Ｆはマイコ）ｆンのＢＴ菌株ＰＳＢ　１　Ｆからの
デルタ内毒素遺伝子である。

ＢＴＥは、ＢＴＩＴｆ！種エントモシダス［ホニー、サ
ーム、及びヴイツサー、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６巻（＋９）１８年）Ｇ２４０頁
］からのデルタ内毒素遺伝子である。

＋１Ｄ２は、ＢＴ苗株１１Ｄ２［ブリサート及びボワイ
トリー、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ３ｅａｒＣ
ｈ　　Ｉｆ’ｉ巻（１９８８年）２７２３頁コからのデ
ルタ内毒素遺伝子である。

・・は同一アミノ酸相同性を示す。

：＝＝：は配置１１．を１１旧と整合させるのに要する
キャップを示す。

才は配列Ｉｔ　Ｔ　Ｅと１１０２を１１１１と整合させ
るのに要する挿入物を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｆｌ、ｆ、、Ｐｓ８１ＦとＢ　、　ｉ、　、
　Ｉｔ　Ｄ　−１ｈ）らのプラスミド製剤のアカ【コー
スケル電気泳動を示す。 ａ）未切断ｎ、ｔ、、ｐｓ８＋Ｆ １１）　Ｈｉｎｄｍで切断されたＩｌ、ｊ、Ｉ’Ｓ８］
Ｆ。 Ｃ）未切断Ｂ、１．旧）−１゜ ｄ）　ＨｉｎｒｌｌＴＩで切断されたＢ、１．．１ｌｒ
ｉｌ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＲＲＬＢ−１８４２４の確認特性をもったＢ．ス
   リンギエンシスＰＳ８１Ｆ、又はその変異種の昆虫防除
   有効量に鱗翅類昆虫の害虫を接触させることからなる、
   鱗翅類害虫の防除法。 ２、該害虫が鱗翅目に属している、特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ３、該害虫がニシハマキガ科の幼虫（Ｗｅｓｔｅｒｎｓ
   ｐｒｕｃｅ　ｂｕｄｗｏｒｍ）である、特許請求の範囲
   第２項に記載の方法。 ４、植物昆虫害虫が食べることがわかっている植物を播
   種する時に、Ｂ．スリンギエンシスＰＳ８１Ｆを粒状餌
   に混入して、土上に置くか又は土中に入れることにより
   、Ｂ．スリンギエンシスＰＳ８１Ｆの昆虫防除有効量に
   該害虫を接触させる、特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ５、（１）Ｂ．スリンギエンシスＰＳ８１Ｆ又はその変
   異種の胞子又は結晶を含めてなる粒状餌をつくり；かつ （２）粒状餌を土上に置くか又は土中に入れる；ことを
   含めてなる、土壌に生息する鱗翅目害虫の防除法。 ６、該粒状餌がトウモロコシ種子を土中に蒔くのと同時
   期に施用される、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、実質的に無傷のＢ．ｔ．ＰＳ８１Ｆ細胞又はその変
   異種が、目標害虫環境に施用される時に、殺虫活性を長
   くするために処理される、特許請求の範囲第１項又は第
   ５項に記載の方法。 ８、殺虫剤担体と組み合わせたＢ．スリンギエンシスＰ
   Ｓ８１Ｆ、又はその変異種の胞子又は結晶を含めてなる
   物質の組成物。 ９、該担体が食欲刺激剤又は誘引剤を含めてなる、特許
   請求の範囲第８項に記載の物質の組成物。 １０、種子被覆剤として使用される処方剤成分と組み合
   わせたＢ．スリンギエンシスＰＳ８１Ｆ又はその変異種
   を含めてなる、物質の組成物。 １１、鱗翅目害虫に対して活性のあるＮＲＲＬＢ−１８
   ４２４の確認特性をもったＢ．スリンギエンシスＰＳ８
   １Ｆ又はその変異種。 １２、ＮＲＲＬＢ−１８４２４の確認特性をもったＢ．
   スリンギエンシスＰＳ８１Ｆ又はその変異種の昆虫防除
   有効量に鱗翅目害虫を接触させることを含めてなる、鱗
   翅目害虫の防除法。 １３、第２表に示すアミノ酸配列のバシラス・スリンギ
   エンシス（Ｂ．ｔ．）毒素をコードしたＤＮＡ。 １４、第１表に示すヌクレオチド配列をもった、特許請
   求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ。 １５、第２表に示すアミノ酸配列をもち、かつ鱗翅類昆
   虫に対して活性のある毒素、及びタンパクの二次構造を
   変更しないか、又は構造が変更されていても、生物活性
   がある程度保持されるようなその変異種。 １６、第２表に示すアミノ酸配列をコードしたヌクレオ
   チド配列の全部又は一部をもったＤＮＡを含めてなる組
   換えＤＮＡ運搬ベクター。 １７、原核生物又は真核生物ホストへ運搬され、その中
   で複製される、特許請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡ
   運搬ベクター。 １８、第２表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素
   を発現させるために形質転換される細菌ホスト。 １９、第２表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素
   がコードされている場合のＢ．ｔ．毒素遺伝子を含有す
   るプラスミドベクターで形質転換させた、特許請求の範
   囲第１８項に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。 ２０、特許請求の範囲第１８項に記載のホストであり、
   ＮＲＲＬＢ−１８４２３の確認特性をもった大腸菌ＤＨ
   ５（α）（ｐＭＹＣ３８６）。 ２１、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ア
   ゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニ
   ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
   ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、リゾビウ
   ム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（Ｒ
   ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウス
   （Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウ
   ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（
   Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又はアルカリゲネス（Ａｌｃ
   ａｌｉｇｅｎｅｓ）の種である、特許請求の範囲第１８
   項に記載の微生物。 ２２、該微生物が有色素で葉面接着性である、特許請求
   の範囲第２１項に記載の微生物。 ２３、特許請求の範囲第２１項に記載の微生物を鱗翅類
   昆虫に、又は該昆虫の環境に投与することを含めてなる
   、鱗翅類昆虫の防除法。 ２４、投与が根の周辺に対してである、特許請求の範囲
   第２３項に記載の方法。 ２５、投与が葉面に対してである、特許請求の範囲第２
   ４項に記載の方法。 ２６、投与が水に対してである、特許請求の範囲第２３
   項に記載の方法。 ２７、目標害虫環境に施用されたときに持続的な殺虫活
   性をもった実質的に無傷の処理細胞を含有する殺虫剤を
   含めてなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤が鱗翅類昆
   虫に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、第２表に示
   すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素を発現できる形質
   転換された微生物の発現の結果としてつくられる場合の
   殺虫剤組成物。 ２８、環境中で殺虫活性を長くするために処理細胞が化
   学的又は物理的手段によって処理される、特許請求の範
   囲第２７項に記載の殺虫剤組成物。 ２９、該細胞が原核生物又は低級真核生物である、特許
   請求の範囲第２８項に記載の殺虫剤組成物。 ３０、該原核生物細胞が腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
   ｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａ
   ｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ
   ）、らせん科（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、乳酸杆菌
   科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、シュードモ
   ナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾト
   バクター科（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）及び
   ニトロバクター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ
   ）からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２９項に
   記載の殺虫剤組成物。 ３１、該低級真核生物細胞が藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃ
   ｅ−ｔｅｓ）、子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）
   、及び担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）から
   なる群から選ばれる、特許請求の範囲第２９項に記載の
   殺虫剤組成物。 ３２、細胞が有色素細菌、酵母又はカビ（菌類）である
   、特許請求の範囲第２７項に記載の殺虫剤組成物。 ３３、第２表に示すアミノ酸配列のポリペプチド毒素を
   コードした、鱗翅類昆虫に有毒なバシラス・スリンギエ
   ンシス毒素遺伝子の発現結果である細胞内毒素を含有す
   る処理された実質的に無傷の単細胞微生物であって、細
   胞を目標昆虫環境に施用する時に殺虫活性を長くするよ
   うな条件下に該細胞が処理される場合の微生物。 ３４、環境中で殺虫活性を長くするために細胞が化学的
   又は物理的手段によって処理される、特許請求の範囲第
   ３３項に記載の細胞。 ３５、該微生物がシュードモナスであり、該毒素が第２
   表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素である、特
   許請求の範囲３３項に記載の細胞。 ３６、該細胞がヨウ素で処理される、特許請求の範囲第
   ３５項に記載のシュードモナス細胞。 ３７、シュードモナス・フルオレッセンスである、特許
   請求の範囲第３３項に記載の細胞。 ３８、ｐＭＹＣ３８６と指定されるプラスミド。