ES2306458T3 - Toxinas pesticidas. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS CLASES DE TOXINAS PESTICIDAS Y A SECUENCIAS DE POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN DICHAS TOXINAS. SE DESCRIBEN IGUALMENTE NUEVOS AISLADOS PESTICIDAS DEL BACILLUS THURINGIENSIS.
Description
Toxinas pesticidas.
El microbio del suelo Bacillus
thuringiensis (B.t.) es una bacteria
Gram-positiva, formadora de esporas, que se
caracteriza porque tiene inclusiones de proteínas cristalinas
paraespóricas. Estas inclusiones a menudo aparecen en el
microscopio como cristales con una forma diferenciada. Las proteínas
pueden ser muy tóxicas para las plagas y son específicas en su
actividad tóxica. Ciertos genes de toxinas de B.t. se han
aislado y secuenciado, y se han producido productos de B.t.
basados en ADN recombinante que se han aprobado para su uso.
Además, con el empleo de técnicas de ingeniería genética se están
desarrollando nuevas estrategias para distribuir estas endotoxinas
de B.t. a entornos agrícolas, incluyendo el uso de plantas
genéticamente modificadas con genes de endotoxinas para la
resistencia a insectos, y el uso de células microbianas intactas
estabilizadas como vehículos de transporte de endotoxinas de
B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim [1988], TIBTECH,
6:S4-S7).
\hbox{Por tanto, los genes de
endotoxinas de B.t. han adquirido un valor
comercial.}
En los últimos diez años, el uso comercial de
pesticidas de B.t. se restringido en gran medida a una
estrecha gama de plagas de lepidópteros (orugas). Las preparaciones
de las esporas y los cristales de B. thuringiensis subsp.
kurstaki se han empleado durante muchos años como
insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo,
B. thuringiensis var. kurstaki HD-1
produce una \delta-entotoxina cristalina que es
tóxica para las larvas de una serie de insectos lepidópteros.
Sin embargo, en estos últimos años los
investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con
especificidades para una gama mucho más amplia de plagas. Por
ejemplo, otras especies de B.t., a saber, israelensis
y tenebrionis (también conocidas como B.t.
M-7, y B.t. san diego), se han
utilizado en el mercado para controlar insectos de los órdenes de
los dípteros y los coleópteros, respectivamente (Gaertner, F.H.
[1989], "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins:
Living and Non-Living Microorganisms," en
Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed.,
Taylor and Francis, Nueva York y Londres, 1990, pp.
245-255). Véase también Couch, T.L. (1980),
"Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var.
israelensis," Developments in Industrial Microbiology,
22:61-76; Beegle, C.C. (1978), "Use of
Entomogenous Bacteria in Agroecosystems," Developments in
Industrial Microbiology, 20:97-104. En Krieg, A.,
A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Schnetter (1983), Z. ang. Ent.,
96:500-508, se describe Bacillus
thuringiensis var. tenebrionis, que, según se indica, es
activo contra dos escarabajos del orden de los coleópteros: el
escarabjo de la patata de Colorado, Leptinotarsa
decemlineata, y Agelastica alni.
En fechas recientes se han identificado nuevas
subespecie de B.t., y se han aislado los genes responsables
para proteínas de \delta-endotoxinas activas
(Höfte, H., H.R. Whiteley [1989], Microbiological Reviews,
52(2):242-255). Höfte y Whiteley han
clasificado los genes de las proteínas de los cristales de
B.t. en 4 clases principales. Las clases son CryI
(específicos de lepidópteros), CryII (específicos de lepidópteros y
dípteros), CryIII (específicos de coleópteros), y CryIV (específicos
de dípteros). También se ha indicado el descubrimiento de cepas
específicamente tóxicas contra otras plagas (Feitelson, J.S., J.
Payne, L. Kim, Bio/Technology, 10:271-275).
La clonación y expresión de un gen de una
proteína de un cristal de B.t. en Escherichia coli se
ha descrito en la bibliografía publicada (Schnepf, H.E., H.R.
Whiteley [1981], Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78:2893-2897). La patente de EEUU 4.448.885 y la
patente de EEUU 4.467.036 describen ambas la expresión de una
proteína de un cristal de B.t. en E. coli. Las
patentes de EEUU 4.797.276 y 4.853.331 describen B.
thuringiensis cepa tenebrionis (también conocida como
M-7, y B.t. san diego) que puede utilizarse
para controlar plagas de coleóptieros en diversos entornos. La
patente de EEUU nº 4.918.006 describe toxinas de B.t. que
tienen actividad contra dípteros. La patente de EEUU nº 4.849.217
describe aislados de B.t. que tienen actividad contra el
gorgojo de la alfalfa. La patente de EEUU nº 5.208.077 describe
aislados de Bacillus thuringiensis activos contra
coleópteros. La patente de EEUU nº 5.151.363 y la patente de EEUU nº
4.948.734 describen ciertos aislados de B.t. que tienen
actividad contra nematodos. Como resultado de investigaciones
profundas y de la inversión de recursos, otras patentes han otorgado
nuevos aislados de B.t. y nuevos usos de aislados de
B.t.. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de
B.t. y de nuevos usos de aislados de B.t. conocidos
sigue siendo una técnica empírica e impredecible.
Los coleópteros son un importante grupo de
plagas agrícolas que provocan muchos daños todos los años. Los
ejemplos de plagas de coleópteros incluyen los gorgojos de la
alfalfa y el crisomélido del maíz (Diabrotica).
El gorgojo de la alfalfa, Hypera postica,
y el gorgojo de la alfalfa egipcio, muy relacionado con él,
Hypera brunneipennis, son las plagas de insectos más
importantes de la alfalfa cultivada en EEUU, habiéndose infestado
2,9 millones de acres en 1984. Se gasta una suma anual de 20
millones de dólares para controlar estas plagas. El gorgojo de la
alfalfa egipcio es la especie predominante en el suroeste de EEUU,
en donde se produce su estivación (es decir, hibernación) durante
los calurosos meses de verano. En todos los demás aspectos, es
idéntico al gorgojo de la alfalfa, que predomina en el resto de
EEUU.
La etapa larvaria es la que produce más daños en
el ciclo vital del gorgojo. Se alimenta de las yemas en crecimiento
de la planta de la alfalfa y provoca la esqueletonización de las
hojas, la atrofia, una reducción en el crecimiento de la planta y,
en última instancia, reducciones en el rendimiento. Una plaga grave
puede arruinar toda la cosecha del heno. Los adultos, que también
se alimentan de hojas, pueden causar más daños pero menos
importantes.
Aproximadamente 9,3 millones de acres de maíz en
EEUU están infestados por complejos de especies de crisomélidos del
maíz cada año. El complejo de especies de crisomélidos del maíz
incluye el crisomélido del maíz del norte, Diabrotica
barberi, el crisomélido del maíz del sur, D. undecimpunctata
howardi, y el crisomélido del maíz del oeste, D. virgifera
virgifera. Las larvas de estas especies de Diabrotica,
que viven en el suelo, se alimentan de la raíz de la planta del
maíz, provocando su vuelco que, en última instancia, reduce el
rendimiento del maíz y a menudo provoca la muerte de la planta.
Cuando se alimentan de la barba del maíz, los escarabajos adultos
reducen la polinización y, por tanto, afectan perjudicialmente al
rendimiento del maíz por planta. Además, los adultos y las larvas
del género Diabrotica atacan cosechas de cucurbitáceas
(pepinos, melones, calabacines, etc.) y muchas cosechas de verduras
y de campo de producción comercial, así como las que se cultivan en
jardines particulares.
El control del crisomélido del maíz se ha
solucionado parcialmente mediante procedimientos de cultivo, tales
como la rotación de cultivos y la aplicación de altos niveles de
nitrógeno, para estimular el crecimiento de un sistema de raíces
adventicias. Sin embargo, lo que más se utiliza son los insecticidas
químicos, que garantizan el nivel deseado de control, mediante su
incorporación en el interior de la tierra, o en bandas sobre ella.
El principal problema asociado con el uso de insecticidas químicos
es el desarrollo de resistencia entre las poblaciones de
insectos
tratadas.
tratadas.
El documento WO 94/16079 describe una toxina de
PS80JJ1 activa contra las larvas del crisomélido del maíz,
obteniéndose la clonación de su gen mediante amplificación con PCR y
expresión del gen recombinante.
El documento
US-A-5204100 describe toxinas
activas contra coleópteros de 40-50 kDa.
La presente invención se refiere a nuevos
materiales y procedimientos para el control de plagas de
coleópteros. En realizaciones específicas, los materiales y
procedimientos descritos en la presente se emplean para controlar
el gorgojo de la alfalfa y/o el crisomélido del maíz.
La presente invención proporciona, de forma
ventajosa, secuencias polinucleotídicas que codifican toxinas que
tienen un peso molecular con longitud completa de aproximadamente
40-50 kDa. En una realización específica, estas
toxinas tienen un peso molecular de aproximadamente
43-47 kDa.
Según un aspecto de la presente invención, un
polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica una toxina activa contra una plaga de coleópteros, en el
que dicha secuencia de nucleótidos se hibrida bajo condiciones
rigurosas (como se define a continuación) con otra secuencia de
nucleótidos seleccionada de: ADN que codifica SEQ ID NO:2; ADN que
codifica SEQ ID NO:4; ADN que codifica SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8;
SEQ ID NO:10; ADN que codifica SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; ADN que
codifica SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14; ADN que codifica SEQ ID NO:15;
ADN que codifica SEQ ID NO:16; ADN que codifica SEQ ID NO:17; ADN
que codifica SEQ ID NO:18; ADN que codifica SEQ ID NO:19; SEQ ID
NO:20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ
ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; ADN que codifica una porción
pesticida de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:37; ADN que codifica SEQ ID
NO:38; SEQ ID NO:42; ADN que codifica SEQ ID NO:43; y SEQ ID
NO:45.
Un segundo aspecto de esta invención es un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una toxina activa contra una plaga de coleópteros, en
el que una porción de dicha secuencia de nucleótidos puede
amplificarse mediante PCR empleando una pareja de cebadores que
tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:20 y 24, para producir
un fragmento de aproximadamente 495 pb; SEQ ID NO:20 y 25, para
producir un fragmento de aproximadamente 594 pb; SEQ ID NO:21 y 24,
para producir un fragmento de aproximadamente 471 pb; y SEQ ID
NO:21 y 25, para producir un fragmento de aproximadamente 580
pb.
Un tercer aspecto de esta invención es un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una toxina activa contra una plaga de coleópteros, en
el que dicha toxina comprende una porción pesticida de
aproximadamente 40-50 kDa, mediante
SDS-PAGE, de una secuencia de aminoácidos
seleccionada de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:34 y SEQ ID NO:39.
Un cuarto aspecto de esta invención es un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una toxina activa contra una plaga de coleópteros, en
el que dicha toxina comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos 75% de coincidencia con una porción pesticida de una
secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:11, SEQ ID
NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:38 y SEQ ID NO:43.
Un quinto aspecto de esta invención es un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una toxina activa de aproximadamente
40-50 kDa de 80JJ1 contra una plaga de coleópteros,
en el que la secuencia de nucleótidos se ha optimizado para su
expresión en plantas.
Un sexto aspecto de esta invención es una toxina
activa purificada contra una plaga de coleópteros, en la que dicha
toxina es codificada por una secuencia de nucleótidos que se híbrida
con ADN bajo condiciones rigurosas como se definen a
continuación.
Los polinucleótidos de la invención pueden
codificar fragmentos pesticidas de las toxinas de longitud completa
o formas más largas de estas toxinas que incluyen, por ejemplo, una
región de protoxina. Estas toxinas, incluyendo sus fragmentos, son
activas contra plagas de coleópteros.
Las toxinas de B.t. específicas útiles
según la invención incluyen toxinas que pueden obtenerse a partir
de los aislados de B.t. denominados PS80JJ1, PS149B1 y
PS167H2. De éstos, PS149B1 y PS167H2 son aislados nuevos. La
presente invención también incluye el uso de variantes de las
toxinas y loas aislados de B.t. ejemplificados que tienen
sustancialmente las mismas propiedades activas contra coleópteros
que las toxinas y los aislados de B.t. específicamente
ejemplificados. Estos aislados variantes incluyen, por ejemplo,
mutantes. Los procedimientos para producir mutantes son muy
conocidos en la técnica microbiológica. Para este fin se emplean la
luz ultravioleta y los mutágenos químicos, tales como
nitrosoguanidina.
En una realización de la presente invención, las
secuencias polinucleotídicas de la presente invención se utilizan
para codificar toxinas de aproximadamente 43-47 kDa.
Estas toxinas entonces se emplean para controlar plagas de
coleópteros. En una realización particularmente preferida, las
plagas de coleópteros son los crisomélidos del maíz. Los genes que
codifican las toxinas de 43-47 kDa pueden obtenerse,
por ejemplo, de PS80JJ1, PS149B1 o PS167H2.
Las toxinas de aproximadamente
13-14 kDa, así como los genes que codifican estas
toxinas, también pueden obtenerse de PS80JJ1, PS149B1 y PS167H2. En
una realización particularmente preferida, la actividad de las
toxinas de 43-47 kDa pueda aumentarse y/o
facilitarse poniendo en contacto las plagas diana también con una
toxina de aproximadamente 13-14 kDa.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a células vegetales transformadas con al menos
una secuencia polinucleotídica de la presente invención, de forma
que las células vegetales transformadas expresen las toxinas
pesticidas en los tejidos consumidos por las plagas diana.
Como alternativa, los aislados de B.t. de
la presente invención, o los microbios recombinantes que expresan
las toxinas descritas en la presente, pueden emplearse para
controlar plagas. A este respecto, la invención incluye el
tratamiento de células de B.t. sustancialmente intactas y/o
células recombinantes que contengan las toxinas expresadas de la
invención, tratadas para prolongar la actividad pesticida cuando las
células sustancialmente intactas se aplican al entorno de una plaga
diana. La célula tratada actúa como un revestimiento protector para
la toxina pesticida. La toxina se hace activa tras su ingestión por
un insecto diana.
La figura 1 muestra tres toxinas pesticidas
específicas de 43-47 kDa de la presente invención,
así como una secuencia consenso para estas toxinas pesticidas.
La figura 2 muestra la relación de las
secuencias de 14 y 45 kDa de PS80JJ1 (SEQ ID NO:31 y 10).
La SEQ ID NO:1 es una secuencia
N-terminal de 5 aminoácidos de la toxina de
aproximadamente 45 kDa de 80JJ1.
La SEQ ID NO:2 es una secuencia
N-terminal de 25 aminoácidos de la toxina de
aproximadamente 45 kDa de 80JJ1.
La SEQ ID NO:3 es una secuencia
N-terminal de 24 aminoácidos de la toxina de
aproximadamente 14 kDa de 80JJ1.
La SEQ ID NO:4 es la secuencia
N-terminal de la toxina de aproximadamente 47 kDa de
149B1.
La SEQ ID NO:5 es una secuencia de aminoácidos
N-terminal de 50 aminoácidos para la proteína
purificada de aproximadamente 14 kDa de PS149B1.
La SEQ ID NO:6 es la secuencia
N-terminal de la toxina de aproximadamente 47 kDa de
167H2.
La SEQ ID NO:7 es una secuencia
N-terminal de 25 aminoácidos para la proteína
purificada de aproximadamente 14 kDa de PS167H2.
La SEQ ID NO:8 es una sonda oligonucleotídica
para el gen que codifica la toxina de 44,3 kDa de PS80JJ1 y es un
cebador directo para PS149B1 y PS167H2 que se utiliza según la
presente invención.
La SEQ ID NO:9 es un cebador inverso para
PS149B1 y PS167H2 que se utiliza según la presente invención.
La SEQ ID NO:10 es la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la toxina de aproximadamente 45 kDa de
PS80JJ1.
La SEQ ID NO:11 es la secuencia de aminoácidos
para la toxina de aproximadamente 45 kDa de PS80JJ1.
La SEQ ID NO:12 es la secuencia de nucleótidos
parcial del gen que codifica la toxina de aproximadamente 44 kDa de
PS149B1.
La SEQ ID NO:13 es la secuencia de aminoácidos
parcial para la toxina de aproximadamente 44 kDa de PS149B1.
La SEQ ID NO:14 es la secuencia de nucleótidos
parcial del gen que codifica la toxina de aproximadamente 44 kDa de
PS167H2.
La SEQ ID NO:15 es la secuencia de aminoácidos
parcial para la toxina de aproximadamente 44 kDa de PS167H2.
La SEQ ID NO:16 es una secuencia peptídica
utilizada en el diseño de cebadores según la presente invención.
La SEQ ID NO:17 es una secuencia peptídica
utilizada en el diseño de cebadores según la presente invención.
La SEQ ID NO:18 es una secuencia peptídica
utilizada en el diseño de cebadores según la presente invención.
La SEQ ID NO:19 es una secuencia peptídica
utilizada en el diseño de cebadores según la presente invención.
La SEQ ID NO:20 es una secuencia de nucleótidos
que corresponde al péptido de SEQ ID NO:16.
La SEQ ID NO:21 es una secuencia de nucleótidos
que corresponde al péptido de SEQ ID NO:17.
La SEQ ID NO:22 es una secuencia de nucleótidos
que corresponde al péptido de SEQ ID NO:18.
La SEQ ID NO:23 es una secuencia de nucleótidos
que corresponde al péptido de SEQ ID NO:19.
La SEQ ID NO:24 es un cebador inverso basado en
el complemento inverso de SEQ ID NO:22.
La SEQ ID NO:25 es un cebador inverso basado en
el complemento inverso de SEQ ID NO:23.
La SEQ ID NO:26 es un cebador directo basado en
la toxina de 44,3 kDa de PS80JJ1.
La SEQ ID NO:27 es un cebador inverso basado en
la toxina de 44,3 kDa de PS80JJ1.
La SEQ ID NO:28 es una secuencia genérica que
representa una nueva clase de toxinas según la presente
invención.
La SEQ ID NO:29 es una sonda oligonucleotídica
que se utiliza según la presente invención.
La SEQ ID NO:30 es la secuencia de nucleótidos
del locus genético entero que contiene marcos de lectura abiertos
de las toxinas de 14 y 45 kDa de PS80JJ1 y las secuencias de
nucleótidos flanqueantes.
La SEQ ID NO:31 es la secuencia de nucleótidos
del marco de lectura abierto de la toxina de 14 kDa de PS80JJ1.
La SEQ ID NO:32 es la secuencia de aminoácidos
deducida de la toxina de 14 kDa de PS80JJ1.
La SEQ ID NO:33 es un cebador oligonucleotídico
inverso según la presente invención.
La SEQ ID NO:34 es la secuencia de nucleótidos
del locus genético entero que contiene marcos de lectura abiertos
de las toxinas de 14 y 44 kDa de PS167H2 y las secuencias de
nucleótidos flanqueantes.
La SEQ ID NO:35 es la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la toxina de aproximadamente 14 kDa de
PS167H2.
La SEQ ID NO:36 es la secuencia de aminoácidos
para la toxina de aproximadamente 14 kDa de PS167H2.
La SEQ ID NO:37 es la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la toxina de aproximadamente 44 kDa de
PS167H2.
La SEQ ID NO:38 es la secuencia de aminoácidos
para la toxina de aproximadamente 44 kDa de PS167H2.
La SEQ ID NO:39 es la secuencia de nucleótidos
del locus genético entero que contiene marcos de lectura abiertos
de las toxinas de 14 y 44 kDa de PS149B1 y las secuencias de
nucleótidos flanqueantes.
La SEQ ID NO:40 es la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la toxina de aproximadamente 14 kDa de
PS149B1.
La SEQ ID NO:41 es la secuencia de aminoácidos
para la toxina de aproximadamente 14 kDa de PS149B1.
La SEQ ID NO:42 es la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la toxina de aproximadamente 44 kDa de
PS149B1.
La SEQ ID NO:43 es la secuencia de aminoácidos
para la toxina de aproximadamente 44 kDa de PS149B1.
La SEQ ID NO:44 es una secuencia génica
optimizada para el maíz que codifica la toxina de aproximadamente
14 kDa de 80JJ1.
La SEQ ID NO:45 es una secuencia génica
optimizada para el maíz que codifica la toxina de aproximadamente
44 kDa de 80JJ1.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a secuencias
polinucleotídicas que codifican nuevas toxinas pesticidas que
tienen un peso molecular con longitud completa de aproximadamente
40-50 kDa. En las realizaciones específicas
ejemplificadas en la presente, estas toxinas tienen un peso
molecular de aproximadamente 43-47 kDa. Ciertas
toxinas específicas se ejemplifican en la presente. Para las toxinas
que tienen una secuencia de aminoácidos conocida, el peso molecular
también es conocido. Los expertos en la técnica reconocerán que el
peso molecular aparente de una proteína, según se determina
mediante una electroforesis en gel, a veces será diferente del peso
molecular verdadero. Por tanto, cuando en la presente se haga
referencia, por ejemplo, a una proteína de 45 kDa o a una proteína
de 14 kDa, se entenderá que se hace referencia a proteínas de
aproximadamente este tamaño, aunque el peso molecular verdadero sea
algo diferente.
La presente invención se refiere no sólo a las
secuencias polinucleotídicas que codifican estas clases de toxinas,
sino también al uso de estas secuencias polinucleotídicas para
producir hospedantes recombinantes que expresen las toxinas. En
otro aspecto, la presente invención se refiere al uso combinado de
una toxina de aproximadamente 40-50 kDa de la
presente invención, junto con una toxina de aproximadamente
10-15 kDa de la presente invención, para lograr un
control muy eficaz de plagas, incluyendo coleópteros, tales como el
crisomélido del
maíz.
maíz.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a dos nuevos aislados y las toxinas y los genes que pueden
obtenerse de estos aislados. Los nuevos aislados de B.t. de
la presente invención se han denominado PS149B1 y PS167H2.
Las nuevas clases de toxinas y las secuencias
polinucleotídicas proporcionadas en la presente se definen según
varios parámetros. Una característica crítica de las toxinas
descritas en la presente es la actividad pesticida. En una
realización específica, estas toxinas tienen actividad contra plagas
de coleópteros. Las toxinas y los genes de la presente invención
también pueden definirse mediante sus secuencias de aminoácidos y de
nucleótidos. Las secuencias de las moléculas dentro de cada nueva
clase pueden definirse en la presente en términos de su homología
con ciertas secuencias ejemplificadas, así como en términos de su
capacidad para hibridarse con ciertas sondas y cebadores
ejemplificados en la presente, o ser amplificadas por éstos. Las
clases de toxinas proporcionadas en la presente también pueden
identificarse basándose en su inmunorreactividad con ciertos
anticuerpos y basándose en su adhesión a una fórmula genérica.
La secuencia de tres toxinas de aproximadamente
45 kDa de la presente invención se proporciona como SEQ ID NO:11,
43 y 38. En una realización preferida de la presente invención, las
toxinas en esta nueva clase tienen una secuencia que se ajusta a la
secuencia genérica presentada como SEQ ID NO:28. En una realización
específica, las toxinas de esta clase se ajustan a la secuencia
consenso que se muestra en la figura 1.
En una realización preferida, las toxinas de la
presente invención tienen al menos una de las siguientes
características:
(a) dicha toxina es codificada por una secuencia
de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: ADN
que codifica SEQ ID NO:2, ADN que codifica SEQ ID NO:4, ADN que
codifica SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, ADN que codifica
SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, ADN que codifica SEQ ID NO:13, SEQ ID
NO:14, ADN que codifica SEQ ID NO:15, ADN que codifica SEQ ID
NO:16, ADN que codifica SEQ ID NO:17, ADN que codifica SEQ ID NO:18,
ADN que codifica SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID
NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ
ID NO:27, ADN que codifica una porción pesticida de SEQ ID NO:28,
SEQ ID NO:37, ADN que codifica SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, y ADN
que codifica SEQ ID NO:43;
(b) dicha toxina inmunorreacciona con un
anticuerpo contra una toxina pesticida de aproximadamente
40-50 kDa, o su fragmento, procedente de un aislado
de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste
en PS80JJ1 que tiene las características identificativas de NRRL
B-18679, PS149B1 que tiene las características
identificativas de NRRL B-21553, y PS167H2 que tiene
las características identificativas de NRRL
B-21554;
(c) dicha toxina es codificada por una secuencia
de nucleótidos, en la que una porción de dicha secuencia de
nucleótidos puede amplificarse mediante PCR utilizando una pareja de
cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:20 y 24,
para producir un fragmento de aproximadamente 495 pb; SEQ ID NO:20 y
25, para producir un fragmento de aproximadamente 594 pb; SEQ ID
NO:21 y 24, para producir un fragmento de aproximadamente 471 pb; y
SEQ ID NO:21 y 25, para producir un fragmento de aproximadamente 580
pb;
(d) dicha toxina comprende una porción pesticida
de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:
28;
28;
(e) dicha toxina comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos 80% de homología con una porción
pesticida de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:38
y SEQ ID NO:43.
(f) dicha toxina es codificada por una secuencia
de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas con una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste ADN en
que codifica SEQ ID NO:3, ADN que codifica SEQ ID NO:5, ADN que
codifica SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, y ADN que codifica
SEQ ID
NO:41;
NO:41;
(g) dicha toxina inmunorreacciona con un
anticuerpo contra una toxina pesticida de aproximadamente
10-15 kDa, o su fragmento, procedente de un aislado
de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste
en PS80JJ1 que tiene las características identificativas de NRRL
B-18679, PS149B1 que tiene las características
identificativas de NRRL B-21553, y PS167H2 que tiene
las características identificativas de NRRL
B-21554;
(h) dicha toxina es codificada por una secuencia
de nucleótidos, en la que una porción de dicha secuencia de
nucleótidos puede amplificarse mediante PCR utilizando la pareja de
cebadores de SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:33; y
(i) dicha toxina comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de homología con
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, porciones pesticidas de SEQ
ID NO:32, porciones pesticidas de SEQ ID NO:36, y porciones
pesticidas de ADN que codifica SEQ ID NO:41.
Tal como se utiliza en la presente, las
condiciones "rigurosas" para la hibridación se refieren a
condiciones que logran el mismo grado, o aproximadamente el mismo
grado de especificidad de la hibridación que las condiciones
empleadas por los presentes solicitantes. De forma específica, la
hibridación de ADN inmovilizado sobre transferencias Southern con
sondas específicas de gen marcadas con ^{32}P se realizó mediante
procedimientos convencionales (Maniatis, T., E.F., Fritsch, J.
Sambrook [1982], Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En general, la
hibridación y los posteriores lavados se realizaron bajo
condiciones rigurosas que permitieron la detección de secuencias
diana con una homología con los genes de la toxina de PS80JJ1. Para
las sondas de genes de ADN bicatenario, la hibridación se realizó
durante la noche a 20-25ºC por debajo de la
temperatura de fusión (Tf) del ADN híbrido en 6x SSPE, 5x disolución
de Denhardt, SDS al 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La
temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula
(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, y F.C.
Kafatos [1983], Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K.
Moldave [eds.], Academic Press, Nueva York,
100:266-285):
Tf = 81,5ºC +
16,6 Log[Na+] + 0,41(% de G+C) - 0,61(% de formamida) -
600/longitud del dúplex en pares de
bases.
Los lavados se realizaron, de forma típica, como
sigue:
(1) dos veces a temperatura ambiente durante 15
minutos en 1x SSPE, SDS al 0,1% (lavado de baja rigurosidad).
(2) una vez a Tf-20ºC durante 15
minutos en 0,2x SSPE, SDS al 0,1% (lavado de rigurosidad
moderada).
Para las sondas oligonucleotídicas, la
hibridación se realizó durante la noche a 10-20ºC
por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido en 6x SSPE,
5x disolución de Denhardt, SDS al 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1
mg/ml. La Tf para las sondas oligonucleotídicas se determinó
mediante la siguiente fórmula:
Tf (ºC) =
2(número de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de bases
G/C)
(Suggs, S.V., T. Miyake, E.H.
Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura, y R.B. Wallace [1981],
ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes,
D.D. Brown [ed.], Academic Press, Nueva York,
23:683-693).
Los lavados se realizaron, de forma típica, como
sigue:
(1) dos veces a temperatura ambiente durante 15
minutos en 1x SSPE, SDS al 0,1% (lavado de baja rigurosidad).
(2) una vez a la temperatura de hibridación
durante 15 minutos en 1x SSPE, SDS al 0,1% (lavado de rigurosidad
moderada).
Con las indicaciones proporcionadas en la
presente, un experto en la técnica podría producir y emplear con
facilidad las diversas toxinas y secuencias polinucleotídicas de las
nuevas clases descritas en la presente.
Los microorganismos útiles según la presente
invención se han depositado en la colección permanente del
Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL),
Northern Regional Research Center, 1815 North University Street,
Peoria, Illinois, 61604, EEUU. Los números de depósito de cultivos
de las cepas depositadas son los
siguientes:
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes depósitos de cultivos se
conservarán y estarán disponibles para el público según las
disposiciones del Tratado de Budapest para el Depósito de
Microorganismos, es decir, se conservarán con todo el cuidado
necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante un
periodo de al menos cinco años después de la petición más reciente
del suministro de una muestra de un depósito y, en cualquier caso,
durante un periodo de al menos 30 (treinta) años después de la
fecha del depósito o durante la vida ejecutable de cualquier patente
que pueda otorgarse que describa los cultivos. El depositante
acepta la responsabilidad de sustituir el(los)
depósito(s) cuando el depositario sea incapaz de suministrar
una muestra cuando sea requerido, debido a la condición
del(de los) depósito(s). Todas las restricciones sobre
la disponibilidad al público de los presentes depósitos de cultivos
se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de una patente que
los describa.
A continuación se presenta una tabla que
proporciona las características de ciertos aislados de B.t.
útiles según la presente invención:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Genes y toxinas. Los genes y las toxinas
útiles según la presente invención incluyen no sólo las secuencias
de longitud completa descritas, sino también fragmentos de estas
secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que puedan
mantener las características de actividad pesticida de las toxinas
específicamente ejemplificadas en la presente. Tal como se utiliza
en la presente, los términos "variantes" o "variaciones"
de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las
mismas toxinas, o que codifican toxinas equivalentes que tienen
actividad pesticida. Tal como se utiliza en la presente, la
expresión "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que
tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra
las plagas diana que las toxinas reivindicadas.
Para un experto en la técnica será evidente que
los genes que codifican las toxinas activas pueden identificarse y
obtenerse a través de diversos medios. Los genes específicos
ejemplificados en la presente pueden obtenerse a partir de los
aislados depositados en un depósito de cultivos, como se describió
anteriormente. Estos genes, o sus porciones o variantes, también
pueden construirse de forma sintética, por ejemplo, mediante el uso
de un sintetizador de genes. Las variaciones de los genes pueden
construirse con facilidad utilizando técnicas convencionales para
realizar mutaciones puntuales. Además, pueden fabricarse fragmentos
de estos genes utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles
en el mercado según procedimientos convencionales. Por ejemplo,
pueden emplearse enzimas, tales como Bal31, o la mutagénesis
dirigida específica de sitio, para cortar sistemáticamente
nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, pueden obtenerse
genes que codifican fragmentos activos utilizando una diversidad de
enzimas de restricción. Pueden emplearse proteasas para obtener
directamente fragmentos activos de estas
toxinas.
toxinas.
Las toxinas equivalentes y/o los genes que
codifican estas toxinas equivalentes pueden derivarse de aislados
de B.t. y/o bancos de ADN utilizando las indicaciones
proporcionadas en la presente. Existe una serie de procedimientos
para obtener toxinas pesticidas de la presente invención. Por
ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos contra las toxinas
pesticidas descritas y reivindicadas en la presente para identificar
y aislar otras toxinas a partir de una mezcla de proteínas. De
forma especifica, pueden generarse anticuerpos contra las porciones
de las toxinas que son más constantes y que están más diferenciadas
de otras toxinas de B.t.. Estos anticuerpos entonces pueden
emplearse para identificar específicamente toxinas equivalentes con
la actividad característica mediante inmunoprecipitación, ensayo
inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA), o transferencias
Western. Los anticuerpos contra las toxinas, contra las toxinas
equivalentes o contra los fragmentos de estas toxinas descritos en
la presente pueden prepararse con facilidad utilizando
procedimientos convencionales de esta técnica. Los genes que
codifican estas toxinas entonces pueden obtenerse a partir del
microorganismo.
Los fragmentos y equivalentes que conserven la
actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas están dentro del
alcance de la presente invención. Además, debido a la redundancia
del código genético, una diversidad de secuencias de ADN diferentes
pueden codificar las secuencias de aminoácidos descritas en la
presente. Dentro de la técnica de un experto en la técnica está
crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas
o esencialmente las mismas toxinas. Estas secuencias de ADN
variantes están dentro del alcance de la presente invención. Tal
como se utiliza en la presente, la referencia a "esencialmente las
mismas" se refiere a secuencias que tienen sustituciones,
deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan
materialmente a la actividad pesticida. Los fragmentos que
conservan la actividad pesticida también se incluyen en esta
definición.
Otro procedimiento para identificar las toxinas
y los genes de la presente invención es mediante el uso de sondas
oligonucleotídicas. Estas sondas son secuencias de nucleótidos
detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de
un marcador apropiado, o pueden prepararse para que sean
inherentemente fluorescentes, como se describe en la solicitud
internacional nº WO 94/16094. Como se conoce en la técnica, si la
molécula sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando
un enlace fuerte entre las dos moléculas, puede asegurarse, de
forma razonable, que la sonda y la muestra tienen una homología
sustancial. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo bajo
condiciones rigurosas mediante técnicas muy conocidas en la técnica
como se describe, por ejemplo, en Keller, G.H., M.M. Manak (1987),
DNA Probes, Stockton Press, Nueva York, NY, pp.
169-170. La detección de la sonda proporciona un
medio para determinar, de una manera conocida, si la hibridación se
ha producido. Este análisis de la sonda proporciona un procedimiento
rápido para identificar genes que codifican toxinas de la presente
invención. Los segmentos de nucleótidos que se utilizan como sondas
según la invención pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de
ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de
nucleótidos también pueden utilizarse como cebadores de PCR para
amplificar genes de la presente invención.
Ciertas toxinas de la presente invención se han
ejemplificado específicamente en la presente. Puesto que estas
toxinas son sólo ejemplos de las toxinas de la presente invención,
será evidente que la presente invención comprende variantes o
toxinas equivalentes (y las secuencias de nucleótidos que codifican
las toxinas equivalentes) que tengan la misma actividad pesticida,
o similar, que la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes
tendrán homología de aminoácidos con una toxina ejemplificado. La
coincidencia de aminoácidos será, de forma típica, mayor que 60%,
preferiblemente mayor que 75%, más preferiblemente mayor que 80%,
más preferiblemente mayor que 90%, y puede ser mayor que 95%. La
homología de aminoácidos será mayor en las regiones críticas de la
toxina que son las responsables de la actividad biológica o que
estén implicados en la determinación de la configuración
tridimensional que es responsable, en último término, de la
actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones de
aminoácidos son aceptables y pueden esperarse, si estas
sustituciones se realizan en regiones que no son críticas para la
actividad o son sustituciones de aminoácidos conservadores que no
afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por
ejemplo, los aminoácidos pueden encuadrarse en las siguientes
clases: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las
sustituciones conservativas, en las que un aminoácido de una clase
se reemplaza por otro aminoácido del mismo tipo, se encuentran
dentro del alcance de la presente invención, con la condición de
que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica
del compuesto. La tabla 2 proporciona una lista de ejemplos de
aminoácidos que pertenecen a cada clase:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En algunos casos también pueden realizarse
sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas
sustituciones no deben desvirtuar significativamente la actividad
biológica de la toxina.
Las toxinas de la presente invención también
pueden caracterizarse en términos de la forma y localización de las
inclusiones de las toxinas, que se describieron anteriormente.
Hospedantes recombinantes. Los genes que
codifican las toxinas albergados por los aislados de la presente
invención pueden introducirse en una amplia variedad de hospedantes
microbianos o vegetales. La expresión del gen de la toxina da como
resultado, directa o indirectamente, la producción y mantenimiento
intracelular del pesticida. Con los hospedantes microbianos
adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden
aplicarse al emplazamiento de la plaga, en donde proliferarán y
serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Como
alternativa, el microbio que alberga el gen de la toxina puede
tratarse bajo condiciones que prolonguen la actividad de la toxina
y estabilicen la célula. La célula tratada, que conserva la
actividad tóxica, entonces puede aplicarse al entorno de la
plaga
diana.
diana.
Cuando el gen de la toxina de B.t. se
introduce mediante un vector adecuado en un hospedante microbiano,
y dicho hospedante se aplica al entorno es un estado vivo, resulta
esencial emplear ciertos microbios hospedantes. Los microorganismos
hospedantes se seleccionan porque ocupan la "fitosfera"
(filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más
cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan para que
sean capaces de competir con éxito en el entorno concreto (el
cultivo y otros hábitats de insectos) con los microorganismos de
tipo salvaje, para que proporcionen un mantenimiento y una expresión
estables del gen que expresa el pesticida polipeptídico y, de forma
deseable, para que proporcionen una mejor protección para el
pesticida frente a la inactivación y degración
ambiental.
ambiental.
Se conoce un gran número de microorganismo que
habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas)
y/o la rizosfera (la tierra que rodea las raíces de las plantas) de
una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos
incluyen bacterias, algas y hongos. De particular interés resultan
los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, los géneros
Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas,
Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius,
Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter,
Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; los hongos, en
particular las levaduras, por ejemplo, los géneros
Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces,
Rhodotorula y Aureobasidium. De particular interés son
las especies de bacterias de la fitosfera, tales como Pseudomonas
syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens,
Acetobacterxylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas
spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes
entrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de
levaduras de la fitosfera, tales como Rhodotorula rubra, R.
glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, G
diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S.
cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces
veronae y Aureobasidium pollulans. De particular interés
resultan los microorganismos pigmentados.
Se encuentran disponibles una amplia variedad de
formas para introducir un gen de B.t. que codifique una
toxina en un microorganismo hospedante bajo condiciones que permitan
el mantenimiento y la expresión estable del gen. Estos
procedimientos son muy conocidos por los expertos en la técnica y se
describen, por ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.135.867, que se
incorpora en la presente como referencia.
El control de coleópteros, incluyendo el
crisomélido del maíz, utilizando los aislados, las toxinas y los
genes de la presente invención puede lograrse mediante una
diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la
técnica. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, la aplicación
de aislados de B.t. a las plagas (o su emplazamiento), la
aplicación de microbios recombinantes a las plagas (o sus
emplazamientos), y la transformación de plantas con genes que
codifican las toxinas pesticidas de la presente invención. Los
microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, un B.t., E.
coli o Pseudomonas. Las transformaciones pueden ser
realizadas por los expertos en la técnica utilizando técnicas
convencionales. Los materiales necesarios para estas
transformaciones se describen en la presente, o pueden ser
adquiridos con facilidad de otra forma por los expertos en la
técnica.
Los genes sintéticos que sean funcionalmente
equivalentes a las toxinas de la presente invención también pueden
emplearse para transformar hospedantes. Los procedimientos para la
producción de genes sintéticos pueden encontrarse, por ejemplo, en
la patente de EEUU nº 5.380.831.
El control de otras plagas, tales como
lepidópteros y otros insectos, nematodos y ácaros también puede ser
lograda por los expertos en la técnica utilizando técnicas
convencionales combinadas con las indicaciones proporcionadas en la
presente.
Tratamiento de las células. Como se
mencionó anteriormente, B.t. o células recombinantes que
expresen una toxina de B.t. pueden tratarse para prolongar
la actividad de la toxina y para estabilizar la célula. La
microcápsula de pesticida que se forma comprende la toxina de
B.t. dentro de una estructura celular que se ha estabilizado
y que protege a la toxina cuando la microcápsula se aplica al
entorno de la plaga diana. Las células hospedantes adecuadas
incluyen procariotas o eucariotas, y normalmente se limitan a
aquellas células que no producen sustancias tóxicas para los
organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los
organismos que producen sustancias tóxicas para los organismos
superiores pueden utilizarse, en los que las sustancias tóxicas
sean inestables o su nivel de aplicación sea lo suficientemente bajo
como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un
hospedante mamífero. Como hospedantes, resultan de particular
interés los procariotas y los eucariotas inferiores, tales como
los
hongos.
hongos.
La célula normalmente estará intacta y estará
sustancialmente en forma proliferativa cuando se trate, en lugar de
estar en forma de esporas, aunque en algunos casos pueden emplearse
esporas.
El tratamiento de la célula microbiana, por
ejemplo, un microbio que contenga el gen de la toxina de
B.t., puede realizarse mediante medios químicos o físicos, o
mediante una combinación de medios químicos y/o físicos, con la
condición de que la técnica no afecte de modo perjudicial a las
propiedades de la toxina ni disminuya la capacidad celular de
proteger la toxina. Los ejemplos de reactivos químicos son agentes
halogenantes, en particular halógenos de número atómico
17-80. Más en concreto, puede emplearse yodo bajo
condiciones suaves y durante un tiempo suficiente para lograr los
resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el
tratamiento con aldehídos, tal como el glutaraldehído;
antiinfecciosos, tales como cloruro de zefirano y cloruro de
cetilpiridinio; alcoholes, tales como alcohol isopropílico y
etanol; diversos fijadores histológicos, tales como yoduro de
lugol, fijador de Bouin, diversos ácidos y fijador de Helly (véase
Humason, Gretchen, L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and
Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y
químicos que conserven y prolonguen la actividad de la toxina
producida en la célula cuando la célula se administre al entorno del
hospedante. Los ejemplos de medios físicos son la radiación de
longitud de onda corta, tal como la radiación gamma y la radiación
X, la congelación, la irradiación con UV, la liofilización y
similares. Los procedimientos para el tratamiento de células
microbianas se describen en las patentes de EEUU nº 4.695.455 y
4.695.462, que se incorporan en la presente como
referencia.
referencia.
Las células, en general, tendrán una estabilidad
estructural mejorada que potenciará la resistencia a las
condiciones ambientales. Cuando el pesticida se encuentra en
proforma, el procedimiento de tratamiento celular debe
seleccionarse para que no inhiba el procesamiento de la proforma
para producir la forma madura del pesticida por el patógeno plaga
diana. Por ejemplo, el formaldehído retícula las proteínas y puede
inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida
polipeptídico. El procedimiento de tratamiento debe mantener al
menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad
de la toxina.
Las características de particular interés para
seleccionar una célula hospedante para los fines de producción
incluyen la facilidad de introducir el gen de B.t. en el
hospedante, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficacia
de la expresión, la estabilidad del pesticida en el hospedante, y la
presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características
de interés para su uso como microcápsula de pesticida incluyen
cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes
celulares espesas, pigmentación, y encapsulación intracelular o
formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en entornos
acuosos; carencia de toxicidad para mamíferos; ser atractiva para
que las plagas la ingieran; facilidad para poder ser destruida y
fijada sin daños para la toxina; y similares. Otras consideraciones
incluyen la facilidad de formulación y manipulación, el coste
económico, la estabilidad durante la conservación y
similares.
similares.
Crecimiento de las células. El hospedante
celular que contiene el gen insecticida de B.t. puede
cultivarse en cualquier medio nutriente conveniente, en el que la
construcción de ADN proporcione una ventaja selectiva,
proporcionando un medio selectivo de forma que todas o
sustancialmente todas las células conserven el gen de B.t..
Estas células después pueden recolectarse según medios
convencionales. Como alternativa, las células pueden tratarse antes
de su recolección.
Las células de B.t. de la invención
pueden cultivarse utilizando medios y técnicas de fermentación
convencionales en la técnica. Tras finalizar el ciclo de
fermentación, las bacterias pueden recolectarse separando, en primer
lugar, las esporas y los cristales de B.t. del caldo de
fermentación mediante medios muy conocidos en la técnica. Las
esporas y los cristales de B.t. recuperados pueden formularse
en un polvo humectable, concentrado líquido, gránulos u otras
formulaciones mediante la adición de tensioactivos, dispersantes,
vehículos inertes y otros componentes para facilitar la
manipulación y la aplicación para plagas diana concretas. Estas
formulaciones y los procedimientos de aplicación son muy conocidos
en la técnica.
Formulaciones. Los gránulos cebo
formulados que contienen un atrayente y esporas y cristales de los
aislados de B.t., o los microbios recombinantes que
comprenden los genes obtenibles de los aislados de B.t.
descritos en la presente, pueden aplicarse a la tierra. El producto
formulado también puede aplicarse como un revestimiento de las
semillas o un tratamiento de las raíces o un tratamiento total de la
planta en etapas posteriores del ciclo del cultivo. Los
tratamientos de la planta y de la tierra con células de B.t.
pueden emplearse como polvos humectables, gránulos o polvos,
mediante su mezcla con diversos materiales inertes, tales como
minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos
y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo,
cáscaras de arroz, cáscaras de nuez y similares). Las formulaciones
pueden incluir adyuvantes pegajosos de dispersión, agentes
estabilizantes, otros aditivos pesticidas, o tensioactivos. Las
formulaciones líquidas pueden tener una base acuosa o no acuosa, y
pueden emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados
emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes
reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes, o
polímeros.
Como apreciarán los expertos en la técnica, la
concentración del pesticida variará ampliamente dependiendo de la
naturaleza de la formulación concreta, en particular si es un
concentrado o se va a emplear directamente. El pesticida estará
presente en al menos 1% en peso y puede estar al 100% en peso. Las
formulaciones secas tendrán aproximadamente 1-95%
en peso del pesticida, mientras que las formulaciones líquidas
tendrán, en general, aproximadamente 1-60% en peso
de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán, en
general, de aproximadamente 10^{2} a aproximadamente 10^{4}
células/mg. Estas formulaciones se administrarán de aproximadamente
50 mg (líquido o seco) a 1 kg o más por hectárea.
Las formulaciones pueden aplicarse al entorno de
la plaga, por ejemplo, la tierra y el follaje, mediante
pulverización, dispersión de polvos, rociado o similares.
Mutante. Pueden fabricarse mutantes de
los aislados de la invención mediante procedimientos muy conocidos
en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse un mutante asporógeno
mediante mutagénesis de sulfonato de etilmetano (EMS) de un
aislado. Los mutantes pueden fabricarse utilizando luz ultravioleta
y nitrosoguanidina mediante procedimientos muy conocidos en la
técnica.
Un porcentaje más pequeño de los mutantes
asporógenos permanecerán intactos y no se lisarán durante largos
periodos de fermentación; estas cepas se denominan de lisis negativa
(-). Las cepas de lisis negativa pueden identificarse seleccionando
mutantes asporógenos en medios en matraces de agitación y
seleccionando los mutantes que permanezcan intactos y que contengan
cristales de toxina al final de la fermentación. Las cepas de lisis
negativa resultan adecuadas para un proceso de tratamiento de
células que produzca una proteína de toxina encapsulada y
protegida.
protegida.
Para preparar un variante resistente a fagos de
dicho mutante asporógeno, una parte alícuota de un lisado de fagos
se extiende sobre agar de nutrientes y se deja secar. Una parte
alícuota de la cepa bacteriana sensible a fagos entonces se coloca
directamente sobre el lisado seco y se deja secar. Las placas se
incuban a 30ºC. Las placas se incuban durante 2 días y en este
momento pueden observarse numerosas colonias creciendo sobre el
agar. Algunas de estas colonias se recogen y se subcultivan sobre
placas de agar de nutrientes. Estos cultivos aparentemente
resistentes se ensayan para la resistencia mediante cultivo en línea
cruzado con el lisado de fagos. Una línea del lisado de fagos se
aplica sobre la placa y se deja secar. Los cultivos presuntamente
resistentes entonces se aplican en líneas sobre la línea de los
fagos. Los cultivos bacterianos resistentes no muestran lisis en
ninguna parte de la línea sobre la línea de fagos después de una
incubación durante la noche a 30ºC. La resistencia al fago entonces
se reconfirma cultivando en placa un césped del cultivo resistente
sobre una placa de agar de nutrientes. La cepa sensible también se
cultiva en placa de la misma manera para que sea el control
positivo. Después de secar, se coloca una gota del lisado de fagos
en el centro de la placa y se deja secar. Los cultivos resistentes
no muestran lisis en el área en la que se ha colocado el lisado de
fagos después de una incubación a 30ºC durante 24 horas.
A continuación se ofrecen ejemplos que ilustran
los procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no
deben considerarse limitantes. Todos los porcentajes son en peso y
todas las proporciones de mezcla de disolventes son en volumen, a
menos que se indique lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Puede utilizarse un subcultivo de los aislados
de B.t., o sus mutantes, para inocular el siguiente medio,
un medio de peptona, glucosa y sales.
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución de sales y la disolución de
CaCl_{2} se esterilizan mediante filtración y se añaden al caldo
tratado en un autoclave y cocido en el momento de la inoculación.
Los matraces se incuban a 30ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm
durante 64 horas.
El anterior procedimiento puede transformarse de
escala con facilidad para fermentadores grandes mediante
procedimientos muy conocidos en la técnica.
Las esporas y/o cristales de B.t.,
obtenidos en la anterior fermentación, pueden aislarse mediante
procedimientos muy conocidos en la técnica. Un procedimiento que se
emplea con frecuencia es someter el caldo de fermentación
recolectado a técnicas de separación, por ejemplo,
centrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Un gramo de polvo liofilizado de 80JJ1 se
suspendió en 40 ml de tampón que contenía Tris-Cl 80
mM, pH 7,8, EDTA 5 mM, PMSF 100 \muM, leupeptina 0,5 \mug/ml,
pepstatina 0,7 \mug/ml, y bestatina 40 \mug/ml. La suspensión
se centrifugó, y el sobrenadante resultante se rechazó. El sedimento
se lavó cinco veces utilizando 35-40 ml del tampón
anterior para cada lavado. El sedimento lavado se resuspendió en 10
ml de NaBr al 40%, EDTA 5 mM, PMSF 100 \muM, leupeptina 0,5
\mug/ml, pepstatina 0,7 \mug/ml, y bestatina 40 \mug/ml, y se
colocó en una plataforma de balanceo durante 75 minutos. La
suspensión de NaBr se centrifugó, se retiró el sobrenadante, y el
sedimento se trató por segunda vez con NaBr al 40%, EDTA 5 mM, PMSF
100 \muM, leupeptina 0,5 \mug/ml, pepstatina 0,7 \mug/ml, y
bestatina 40 \mug/ml, como se indicó anteriormente. Los
sobrenadantes (NaBr soluble al 40%) se reunieron y se dializaron
contra CAPS 10 mM, pH 10,0, EDTA 1 mM, a 4ºC. Los extractos
dializados se centrifugaron y el sobrenadante resultante se retiró.
El sedimento (NaBr de sedimento de diálisis al 40%) se suspendió en
5 ml de H_{2}O y se centrifugó. El sobrenadante resultante se
retiró y se eliminó. El sedimento lavado se lavó por segunda vez en
10 ml de H_{2}O y se centrifugó como se indicó anteriormente. El
sedimento lavado se suspendió en 1,5 ml de H_{2}O y contenía
principalmente tres péptidos con unos pesos moleculares de
aproximadamente 47 kDa, 45 kDa y 15 kDa cuando se analizó utilizando
SDS-PAGE. En esta etapa de purificación, el NaBr de
sedimento de diálisis al 40% suspendido contenía aproximadamente 21
mg/ml de proteína mediante un ensayo de Lowry.
Los péptidos en la suspensión del sedimento se
separaron utilizando SDS-PAGE (Laemlli, U.K. [1970],
Nature, 227:680) en geles de acrilamida al 15%. Las proteínas
separadas entonces se transfirieron electoforéticamente a una
membrana de PVDF (Millipore Corp.) en CAPS 10 mM, pH 11,0, MeOH al
10% a una constante de 100 V. Después de una hora las membranas de
PVDF se enjuagaron en agua brevemente y se colocaron durante 3
minutos en azul de Coomassie R-250 al 0,25%,
metanol al 50%, ácido acético al 5%. La membrana teñida se destiñó
en MeOH al 40%, ácido acético al 5%. La membrana desteñida se secó
al aire a temperatura ambiente (LeGendre et al. [1989], en A
Practical Guide to Protein Purification For Microsequencing, P.
Matsudaira, ed., Academic Press, Nueva York, NY). La membrana se
secuenció utilizando una degradación de Edman en fase gaseosa
automática (Hunkapillar, M.W., R.M. Hewick, W.L. Dreyer, L.E. Hood
[1983], Meth. Enzymol., 91:399).
El análisis de aminoácidos reveló que la
secuencia N-terminal de la banda de 45 kDa era la
siguiente:
Met-Leu-Asp-Thr-Asn
(SEQ ID NO:1).
La banda de 47 kDa también se analizó y se
determinó que la secuencia de aminoácidos N-terminal
era la misma secuencia de 5 aminoácidos de SEQ ID NO:1. Por tanto,
las secuencias de aminoácidos N-terminales del
péptido de 47 kDa y del péptido de 45 kDa eran idénticas.
Esta secuencia de aminoácidos también se
corresponde con una secuencia obtenida del péptido de 45 kDa
obtenido a partir de los polvos de cristal/esporas de PS80JJ1,
utilizando otro protocolo de purificación, siendo la secuencia
N-terminal la siguiente:
Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Leu-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Thr-Ser-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu
(SEQ ID NO:2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se disolvieron 0,8 ml de la suspensión de
diálisis blanca (aproximadamente 21 mg/ml) que contenía los péptidos
de 47 kDa, 45 kDa y 15 kDa, en 10 ml de NaBr al 40% y se añadieron
0,5 ml de EDTA 100 mM. Después de aproximadamente 18 horas (durante
la noche), se obtuvo una suspensión opaca blanca. Ésta se recogió
mediante centrifugación y se rechazó. El sobrenadante se concentró
en un Centricon-30 (Amicon Corporation) hasta un
volumen final de aproximadamente 15 ml. El volumen filtrado se lavó
con agua mediante diálisis de filtro y se incubó sobre hielo,
formando finalmente una suspensión blanca lechosa. La suspensión se
centrifugó, y el sedimento y el sobrenadante se separaron y se
guardaron. El sedimento entonces se suspendió en 1,0 ml de agua
(aproximadamente 6 mg/ml). El sedimento contenía la proteína de 15
kDa sustancialmente pura cuando se analizó mediante SDS-
PAGE.
PAGE.
Se determinó que la secuencia de aminoácidos
N-terminal era:
Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn-Thr-Arg-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ala-Lys-Thr-Lys-Leu
(SEQ ID NO:3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El sedimento P1 se resuspendió con dos volúmenes
de agua desionizada por unidad de peso húmedo, y a esto se le
añadieron nueve volúmenes de bromuro de sodio acuoso al 40% (p/p).
Ésta y todas las operaciones posteriores se realizaron sobre hielo
o a 4-6ºC. Después de 30 minutos, la suspensión se
diluyó con 36 volúmenes de agua enfriada y se centrifugó a 25.000 x
g durante 30 minutos para producir un sedimento y un
sobrenadante.
El sedimento resultante se resuspendió en
1-2 volúmenes de agua y se aplicó en una capa sobre
un gradiente de bromuro de sodio al 20-40% (p/p) y
se centrifugó a 8.000 x g durante 100 minutos. La capa que formó una
banda a bromuro de sodio aproximadamente al 32% (p/p) (las
"inclusiones" o INC) se recuperó y se dializó durante la noche
contra agua utilizando una membrana de diálisis con un límite de
exclusión de PM de 6-8 kDa. El material en
partículas se recuperó mediante centrifugación a 25.000 x g, se
resuspendió en agua, se separó en partes alícuotas y se ensayó para
las proteínas mediante el procedimiento de Lowry y mediante
SDS-PAGE.
El sobrenadante resultante se concentró de 3 a 4
veces utilizando concentradores Centricon-10,
después se dializó durante la noche contra agua utilizando una
membrana de diálisis con un límite de exclusión de PM de
6-8 kDa. El material en partículas se recuperó
mediante centrifugación a 25.000 x g, se resuspendió en agua, se
separó en partes alícuotas y se ensayó para las proteínas mediante
el procedimiento de Lowry y mediante SDS-PAGE. Esta
fracción se denominó P1.P2.
Los péptidos en la suspensión del sedimento se
separaron utilizando SDS-PAGE (Laemlli, U.K.,
supra) en geles de acrilamida al 15%. Las proteínas
separadas entonces se transfirieron electoforéticamente a una
membrana de PVDF (Millipore Corp.) en CAPS 10 mM, pH 11,0, MeOH al
10% a una constante de 100 V. Después de una hora las membranas de
PVDF se enjuagaron en agua brevemente y se colocaron durante 3
minutos en azul de Coomassie R-250 al 0,25%,
metanol al 50%, ácido acético al 5%. La membrana teñida se destiñó
en MeOH al 40%, ácido acético al 5%. La membrana desteñida se secó
al aire a temperatura ambiente (LeGendre et al.,
supra). La membrana se secuenció utilizando una degradación
de Edman en fase gaseosa automática (Hunkapillar et
al.,
supra).
supra).
El análisis de las proteínas indicó la presencia
de dos polipéptidos principales, con unos pesos moleculares de 47
kDa y 14 kDa. Los pesos moleculares se midieron frente a
polipéptidos patrón de peso molecular conocido. Este proceso sólo
proporciona una estimación del peso molecular verdadero. La banda de
47 kDa de PS149B1 migró en SDS-PAGE de una manera
indistinguible de la de la proteína de 47 kDa de PS80JJ1. De forma
similar, la banda de 14 kDa de PS149B1 migró en
SDS-PAGE de una manera indistinguible de las bandas
de 14 kDa de PS167H2 y PS80JJ1. Aparte de estos dos polipéptidos,
que se estimó que conformaban 25-35% (47 kDa) y
35-55% (15 kDa) del material teñido por Coomassie,
respectivamente, pueden existir bandas menos importantes, incluyendo
las que tienen un PM estimado de 46 kDa, 130 kDa y 70 kDa.
El análisis de las proteínas indicó que la
fracción de INC contenía un único polipéptido con un PM de 47 kDa,
y que la fracción P1.P2 contenía un único polipéptido con un PM de
14 kDa. Estos polipéptidos se recuperaron en rendimientos mayores
que 50% de P1.
La secuencia de aminoácidos
N-terminal para la proteína de 47 kDa purificada de
PS149B1 era:
Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-His-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu
(SEQ ID NO:4).
La secuencia de aminoácidos
N-terminal para la proteína de 14 kDa purificada de
PS149B1 era:
Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu-Asp-Gly-Gly-Arg-Trp-Arg-Thr-Ser-Pro-Xaa-Asn-Val-Ala-Asn-Asp-Gln-Ile-Lys-Thr-Phe-Val-Ala-Glu-Ser-Asn
(SEQ ID NO:5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La secuencia de aminoácidos
N-terminal para la proteína de 45 kDa purificada de
PS167H2 era:
Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Ile-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Tyr-Ala-Asn-Gly-Leu-His-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu
(SEQ ID NO:6).
La secuencia de aminoácidos
N-terminal para la proteína de 14 kDa purificada de
PS167H2 era:
Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu
(SEQ ID NO:7).
Estas secuencias de aminoácidos pueden
compararse con la secuencia obtenida para el péptido de 47 kDa
obtenido a partir de los polvos de cristales/esporas de 80JJ1 con
la secuencia N-terminal (SEQ ID NO:1), y con la
secuencia obtenida para el péptido de 14 kDa obtenido a partir de
los polvos de cristales/esporas de 80JJ1 con la secuencia
N-terminal (SEQ ID NO:3).
Evidentemente, las proteínas de
45-47 kDa están muy relacionadas y probablemente
representan una familia de genes, y las proteínas de 14 kDa están
muy relacionadas y probablemente representan otra familia de
genes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se preparó el ADN celular total a partir de
células de Bacillus thuringiensis (B.t.) cultivadas
hasta una densidad óptica, a 600 nm, de 1,0. Las células se
sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón
de protoplastos (lisozima 20 mg/ml en sacarosa 0,3 M,
Tris-Cl 25 mM [pH 8,0], EDTA 25 mM). Después de una
incubación a 37ºC durante 1 hora, los protoplastos se lisaron
mediante dos ciclos de congelación y descongelación. Se añadieron
nueve volúmenes de una disolución de NaCl 0,1 M, SDS al 0,1%,
Tris-Cl 0,1 M para completar la lisis. El lisado
aclarado se extrajo dos veces con fenol:cloroformo (1:1). Los ácidos
nucleicos se precipitaron con dos volúmenes de etanol y se
sedimentaron mediante centrifugación. El sedimento se resuspendió
en tampón TE y se añadió ARNasa hasta una concentración final de 50
\mug/ml. Después de un incubación a 37ºC durante 1 hora, la
disolución se extrajo una vez con fenol:cloroformo (1:1) y
cloroformo saturado con TE. El ADN precipitó de la fase acuosa
mediante la adición de un décimo de volumen de NaOAc 3 M y dos
volúmenes de etanol. El ADN se sedimentó mediante centrifugación,
se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en tampón
TE.
Se diseñó una sonda oligonucleotídica para el
gen que codifica la toxina de 45 kDa de PS80JJ1 a partir de los
datos de la secuencia peptídica N-terminal. La
secuencia de la sonda oligonucleotídica de 29 bases era:
5'-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA
AT-3' (SEQ ID NO:8).
Este oligonucleótido se mezcló en cuatro
posiciones, como se muestra. Esta sonda se radiomarcó con ^{32}P
y se empleó en la hibridación en condiciones convencionales de
transferencias Southern del ADN celular total de PS80JJ1 digerido
con diversas endonucleasas de restricción. En la tabla 3 se
presentan los datos autorradiográficos representativos de estos
experimentos que muestran los tamaños de los fragmentos de
restricción del ADN que contenían homología de secuencia con la
sonda oligonucleotídica de la toxina de 44,3 kDa de SEQ ID NO:8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos fragmentos de ADN identificados en estos
análisis contienen todo el gen de la toxina de 45 kDa de PS80JJ1 o
un segmento de éste. Los tamaños aproximados de los fragmentos de
ADN hibridrantes en la tabla 3 están de acuerdo, razonablemente,
con los tamaños de un subconjunto de los fragmentos de PS80JJ1 que
se hibridan con una sonda del subgen de la toxina de 45 kDa de
PS80JJ1 utilizada en otros experimentos, tal como se predice (véase
la tabla 4, a continuación).
Se construyó un banco de genes a partir del ADN
de PS80JJ1 parcialmente digerido con Sau3AI. Los digeridos
de restricción parciales se fraccionaron mediante una electroforesis
en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN con un tamaño de 9,3 a 23
kpb se cortaron y se retiraron del gel, se electroeluyeron desde el
corte del gel, se purificaron sobre una columna de intercambio
iónico Elutip-D (Schleicher and Schuell, Keene, NH)
y se recuperaron mediante precipitación en etanol. Los insertos de
Sau3AI se acoplaron a LambdaGem-11 digerido
con BamHI (Promega, Madison, WI). El fago recombinante se
encapsuló y se cultivó sobre células E. coli KW251. Las
placas se seleccionaron mediante hibridación con la sonda
oligonucleotídica descrita anteriormente. El fago hibridante se
purificó de la placa y se utilizó para infectar cultivos líquidos de
células E. coli KW251 para el aislamiento del ADN mediante
procedimientos convencionales (Maniatis et al.,
supra).
Los análisis de la transferencia Southern
revelaron que uno de los aislados de fagos recombinantes contenía
una banda de XbaI-SacI de aproximadamente 4,8 kpb que
se híbrida con la sonda del gen de la toxina PS80JJ1. El sitio
SacI que flanquea el gen de la toxina de PS80JJ1 es un sitio
de clonación del vector de fago, mientras que el sitio XbaI
flanqueante se localiza dentro del inserto de ADN de PS80JJ1. Este
fragmento de restricción de ADN se subclonó mediante procedimientos
convencionales en pBluescript S/K (Stratagene, San Diego, CA) para
el análisis de la secuencia. El plásmido resultante se denominó
pMYC2421. El inserto de ADN también se subclonó en pHTBlueII (un
vector lanzadera de E. coli/B. thuringiensis formado por
pBluescript S/K [Stratagene, La Jolla, CA] y el origen de la
replicación procedente de un plásmido de B.t. residente [D.
Lereclus et al. (1989), Microbiology Letters,
60:211-218]) para producir pMYC2420.
Se diseñó una sonda oligonucleotídica para el
gen que codifica la toxina de 14 kDa de PS80JJ1 a partir de los
datos de la secuencia peptídica N-terminal. La
secuencia de la sonda oligonucleotídica de 28 bases era:
5'-GW GAA GTW CAT ATW GAA ATW AAT AAT
AC-3' (SEQ ID NO:29). Este oligonucleótido se mezcló
en cuatro posiciones, como se muestra. La sonda se radiomarcó con
^{32}P y se empleó en hibridaciones en condiciones convencionales
de transferencias Southern del ADN celular total de PS80JJ1 y ADN de
pMYC2421 digerido con diversas endonucleasas de restricción. Los
experimentos de cartografiado RFLP demostraron que el gen que
codifica la toxina de 14 kDa está localizado en el mismo fragmento
EcoRI genómico que contiene la secuencia codificadora
N-terminal para la toxina de 44,3 kDa.
Para ensayar la expresión de los genes de la
toxina de PS80JJ1 en B.t., pMYC2420 se transformó en el
hospedante de B.t. acristalífero (Cry-), CryB (A. Aronson,
Purdue University, West Lafayette, IN), mediante electroporación.
La expresión de ambas toxinas de PS80JJ1 de aproximadamente 14 y
44,3 kDa codificadas por pMYC2420 fue demostrada mediante un
análisis SDS-PAGE. Las preparaciones de cristales de
las toxinas de la cepa recombinante CryB[pMYC2420], MR536,
se ensayaron y se demostró que eran activas contra el crisomélido
del maíz del
oeste.
oeste.
Los genes de la toxina de PS80JJ1 codificados
por pMYC2421 se secuenciaron utilizando el sistema de secuenciación
automática ABI373 y el programa informático asociado. La secuencia
del locus genético entero que contiene los marcos de lectura
abiertos y las secuencias de nucleótidos flanqueantes se muestra en
SEQ ID NO:30. El codón de terminación del gen de la toxina de 14
kDa está 121 pares de bases cadena arriba (5') del codón de inicio
del gen de la toxina de 44,3 kDa (figura 2). La secuencia de
nucleótidos del marco de lectura abierto de la toxina de 14 kDa de
PS80JJ1 (SEQ ID NO:31), la secuencia de nucleótidos del marco de
lectura abierto de la toxina de 44,3 kDa (SEQ ID NO:10), y las
respectivas secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO:32 y SEQ
ID NO:11) son nuevas comparadas con otros genes de toxinas que
codifican proteínas pesticidas.
Por tanto, la secuencia de nucleótidos que
codifica la toxina de 14 kDa de PS80JJ1 se muestra en SEQ ID NO:31.
La secuencia de aminoácidos deducida de la toxina de 14 kDa de
PS80JJ1 se muestra en SEQ ID NO:32. Las secuencias de nucleótidos
que codifican las toxinas de 14 y 45 kDa de PS80JJ1, así como las
secuencias flanqueantes, se muestran en SEQ ID NO:30. La relación
entre estas secuencias se muestra en la figura 2.
Un subcultivo de E. coli NM522 que
contiene el plásmido pMYC2421 se depositó en la colección permanente
de Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815
North University Street, Peoria, IL, 61604, EEUU, el 28 de marzo,
1996. El número de registro es NRRL B-21555.
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Ejemplo
7
Otras dos cepas activas contra el crisomélido
del maíz, PS149B1 y PS167H2, también producen cristales de proteínas
paraspóricos formados, en parte, por polipéptidos con una tamaño de
aproximadamente 14 y 45 kDa. Se emplearon hibridaciones Southern y
análisis de la secuencia de ADN parcial para estudiar la relación de
estas toxinas con las toxinas de 80JJ1. Se extrajo ADN de estas
cepas de B.t. como se describió anteriormente y se realizaron
hibridaciones Southern convencionales utilizando la sonda
oligonucleotídica de la toxina de 14 kDa (SEQ ID NO:29) y un
fragmento de PCR de aproximadamente 800 pb de la secuencia
codificadora del gen de la toxina de 44,3 kDa de 80JJ1. En la tabla
4 se presentan los datos RFLP representativos de estos experimentos,
que muestran los tamaños de los fragmentos de restricción de ADN
que contienen homología de secuencia con la toxina de 44,3 kDa. En
la tabla 5 se presentan los datos RFLP representativos de estos
experimentos, que muestran los tamaños de los fragmentos de
restricción de ADN que contienen homología de secuencia con la
toxina de aproximadamente 14 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada una de las tres cepas mostró patrones de
RFLP exclusivos. Los fragmentos de ADN hibridantes de PS149B1 o
PS167H2 contenían todo o parte de los genes de toxinas con homología
de secuencia con la toxina de 44,3 kDa de PS80JJ1.
Cada una de las tres cepas mostró patrones de
RFLP exclusivos. Los fragmentos de ADN hibridantes de PS149B1 o
PS167H2 contenían todo o parte de los genes de toxinas con homología
de secuencia con la toxina de 14 kDa de PS80JJ1.
Las porciones de los genes de toxinas en PS149B1
o PS167H2 se amplificaron mediante PCR utilizando parejas de
cebadores oligonucleotídicos directos e inversos diseñados basándose
en la secuencia del gen de la toxina de 44,3 kDa de PS80JJ1. Para
PS149B1, se utilizó la siguiente pareja de cebadores:
Para PS167H2 se empleó la misma pareja de
cebadores. Estos fragmentos derivados de PCR se secuenciaron
utilizando el sistema de secuenciación automática ABI373 y el
programa informático asociado. Las secuencias génicas y peptídicas
parciales obtenidas se muestran en SEQ ID NO:12-15.
Estas secuencias contienen porciones de secuencias de nucleótidos
codificadoras y secuencias peptídicas para nuevas toxinas activas
contra el crisomélido del maíz presentes en las cepas de
B.t. PS149B1 o PS167H2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se extrajo el ADN celular total de las cepas
PS149B1 y PS167H2 como se describió para PS80JJ1. Se construyeron
bancos de genes de fragmentos de restricción parcial Sau3A
fraccionados según el tamaño en Lambda-Gem 11 para
cada cepa respectiva, como se describió previamente. Los fagos
recombinantes se encapsularon y se cultivaron sobre células E.
coli KW251. Las placas se seleccionaron mediante hibridación con
la sonda oligonucleotídica específica para el gen de la toxina de
44 kDa. El fago hibridante se purificó de la placa y se utilizó
para infectar cultivos líquidos de células E. coli KW251 para
el aislamiento del ADN mediante procedimientos convencionales
(Maniatis et al., supra).
Para PS167H2, los análisis de la transferencia
Southern revelaron que uno de los aislados de fagos recombinantes
contenía una banda de HindIII de aproximadamente 4,0 a 4,4
kpb que se híbrida con la sonda oligonucleotídica 5' del gen de la
toxina de 44 kDa de PS80JJ1 (SEQ ID NO:8). Este fragmento de
restricción de ADN se subclonó mediante procedimientos
convencionales en pBluescript S/K (Stratagene, San Diego, CA) para
el análisis de la secuencia. El fragmento también se subclonó en el
vector lanzadera de alto número de copias pHT370 (Arantes, O., D.
Lereclus [1991], Gene, 108:115-119) para el análisis
de la expresión en Bacillus thuringiensis (véase a
continuación). El plásmido bifuncional de alto número de copias
recombinante resultante se denominó pMYC2427.
Los genes de la toxina de PS167H2 codificados
por pMYC2427 se secuenciaron utilizando el sistema de secuenciación
automática ABI y el programa informático asociado. La secuencia del
locus genético entero que contiene los marcos de lectura abiertos y
las secuencias de nucleótidos flanqueantes se muestra en SEQ ID
NO:34. El codón de terminación del gen de la toxina de 14 kDa está
107 pares de bases cadena arriba (5') del codón de inicio del gen
de la toxina de 44 kDa. La secuencia codificadora de la toxina de 14
kDa de PS167H2 (SEQ ID NO:35), la secuencia codificadora de la
toxina de 44 kDa (SEQ ID NO:37), y las respectivas secuencias de
aminoácidos deducidas (SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:38) son nuevas
comparadas con otros genes de toxinas conocidos que codifican
proteínas pesticidas. Los genes de las toxinas se disponen de una
manera similar a las toxinas de 14 y 44 kDa de PS84JJ1, y tienen
cierta homología con ellas.
Un subcultivo de E. coli NM522 que
contiene el plásmido pMYC2427 se depositó en la colección permanente
de Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815
North University Street, Peoria, IL, 61604, EEUU, el 26 de marzo,
1997. El número de registro es NRRL B-21672.
Para PS149B1, un análisis de la transferencia
Southern utilizando la sonda 5' oligonucleotídica de 44 kDa de
PS80JJ1 (SEQ ID NO:8) demostró la hibridación de un fragmento de ADN
ClaI de aproximadamente 5,9 kpb. Los digeridos ClaI
completos de ADN genómico de PS149B1 se fraccionaron según el tamaño
sobre geles de agarosa y se clonaron en pHTBlueII. El fragmento
también se subclonó en el vector lanzadera de alto número de copias
pHT370 (Arantes, O., D. Lereclus [1991], Gene,
108:115-119) para el análisis de la expresión en
Bacillus thuringiensis (véase a continuación). El plásmido
bifuncional de alto número de copias recombinante resultante se
denominó pMYC2429.
Los genes de la toxina de PS149B1 codificados
por pMYC2429 se secuenciaron utilizando el sistema de secuenciación
automática ABI y el programa informático asociado. La secuencia del
locus genético entero que contiene los marcos de lectura abiertos y
las secuencias de nucleótidos flanqueantes se muestra en SEQ ID
NO:39. El codón de terminación del gen de la toxina de 14 kDa está
108 pares de bases cadena arriba (5') del codón de inicio del gen
de la toxina de 44 kDa. La secuencia codificadora de la toxina de 14
kDa de PS149B1 (SEQ ID NO:40), la secuencia codificadora de la
toxina de 44 kDa (SEQ ID NO:42), y las respectivas secuencias de
aminoácidos deducidas (SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:43) son nuevas
comparadas con otros genes de toxinas conocidos que codifican
proteínas pesticidas. Los genes de las toxinas se disponen de una
manera similar a las toxinas de 14 y 44 kDa de PS80JJ1 y PS167H2, y
tienen cierta homología con ellas. Juntos, estos tres operones de
toxinas comprenden una nueva familia de toxinas pesticidas.
Un subcultivo de E. coli NM522 que
contiene el plásmido pMYC2429 se depositó en la colección permanente
de Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815
North University Street, Peoria, IL, 61604, EEUU, el 26 de marzo,
1997. El número de registro es NRRL B-21673.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El ADN y las secuencias peptídicas de las tres
nuevas toxinas de aproximadamente 45 kDa contra el crisomélido del
maíz procedentes de PS80JJ1, PS149B1 y PS167H2 (SEQ ID
NO:12-15) se alinearon con el programa informático
de análisis de secuencias Pileup de Genetics Computer Group
utilizando un peso de hueco de 3,00 y un peso de la longitud de
hueco de 0,10. Los alineamientos de secuencias se emplearon para
identificar las secuencias peptídicas conservadas para las cuales
se diseñaron los cebadores oligonucleotídicos que es probable que se
hibriden con genes que codifican miembros de esta nueva familia de
toxinas. Estos cebadores pueden utilizarse en PCR para amplificar
fragmentos de ADN de diagnóstico para estos genes de toxinas y genes
de toxinas relacionados. Son posibles numerosos diseños de
cebadores para diversas secuencias, cuatro de las cuales se
describen en la presente como ejemplo. Estas secuencias peptídicas
son:
Las correspondientes secuencias de nucleótidos
son:
Se diseñaron cebadores directos para la
amplificación con polimerasa en reacciones termocíclicas basándose
en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO:20 y 21.
Se diseñaron cebadores inversos basándose en el
complemento inverso de SEQ ID NO:22 y 23:
Estos cebadores pueden utilizarse en combinación
para amplificar fragmentos de ADN de los siguientes tamaños (tabla
6) que identifican genes que codifican nuevas toxinas del
crisomélido del maíz.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar, pueden aislarse genes
completos que codifiquen nuevas toxinas activas contra el
crisomélido del maíz mediante amplificación con polimerasas en
reacciones termocíclicas utilizando cebadores diseñados basándose
en las secuencias de ADN que flanquean los marcos de lectura
abiertos. Para la toxina de 44,3 kDa de PS80JJ1, se diseñó una de
estas parejas de cebadores, y se empleó para amplificar un fragmento
de ADN de diagnóstico de 1613 pb que incluía la secuencia
codificadora completa de la toxina. Estos cebadores son:
Para la amplificación por PCR de la toxina de 14
kDa de PS80JJ1 puede utilizarse el oligonucleótido que codifica la
secuencia peptídica N-terminal (SEQ ID NO:29), en
combinación con diversos cebadores oligonucleotídicos inversos
basados en las secuencias en el locus del gen de la toxina de
PS80JJ1. Uno de estos cebadores inversos tiene la siguiente
secuencia:
Cuando se emplea en reacciones de PCR
convencionales, esta pareja de cebadores amplifica un fragmento de
ADN de diagnóstico de 1390 pb que incluye la secuencia codificadora
completa de la toxina de 14 kDa y algunas secuencias flanqueantes
3' que se corresponden con el espaciador intergénico de 121 bases y
una porción del gen de la toxina de 44,3 kDa. Cuando se utiliza en
combinación con el cebador directo de 14 kDa, la PCR generará un
fragmento de ADN de diagnóstico de 322 pares de bases.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Una preparación de la fracción insoluble
procedente del extracto dializado de NaBr de 80JJ1 que contenía los
péptidos de 47 kDa, 45 kDa y 15 kDa se bioensayó contra el
crisomélido del maíz del oeste y se descubrió que presentaba una
actividad significativa de toxina.
\newpage
\global\parskip0.980000\baselineskip
Ejemplo
11
Las fracciones de proteínas purificadas
procedentes de PS149B1 se bioensayaron contra el crisomélido del
maíz del oeste y se descubrió que presentaban una actividad
significativa de toxina cuando se combinaban. De hecho, la
combinación restableció la actividad hasta el nivel observado en la
preparación original (P1). El siguiente conjunto de datos del
bioensayo presenta el porcentaje de mortalidad y demuestra este
efecto.
Ejemplo
12
El operón de la toxina de PS80JJ1 también se
subclonó de pMYC2421 hacia pHT370 para la comparación directa de la
bioactividad con las toxinas recombinantes clonadas a partir de
PS149B1 y PS167H2. El plásmido bifuncional de alto número de copias
recombinante resultante se denominó pMYC2426.
Un subcultivo de E. coli NM522 que
contiene el plásmido pMYC2426 se depositó en la colección permanente
de Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815
North University Street, Peoria, IL, 61604, EEUU, el 26 de marzo,
1997. El número de registro es NRRL B-21671.
Para ensayar la expresión de los genes de las
toxinas de PS80JJ1, PS149B1 y PS167H2 en B.t., los plásmidos
pMYC2426, pMYC2427 y pMYC2429 se transformaron por separado en el
hospedante B.t. acristalífero (Cry-), Cry B (A. Aronson,
Purdue University, West Lafayette, IN), mediante electroporación.
Las cepas recombinantes se denominaron MR543 (CryB [pMYC2426]),
MR544 (CryB [pMYC2427]) y MR546 (CryB [pMYC2429]), respectivamente.
La expresión de las toxinas de aproximadamente 14 y 44 kDa se
demostró mediante análisis SDS-PAGE para cada cepa
recombinante.
Las preparaciones de cristales de las toxinas de
las cepas recombinantes se ensayaron contra el crisomélido del maíz
del oeste. Su pienso fue modificado con ácido sórbico y
penicilina-estreptomicina-anfotericina
B de SIGMA. El material se cargó en la parte superior con una
proporción de 50 \mul de suspensión por cm^{2} de superficie
específica de pienso. Los bioensayos se realizaron con larvas
neonatas del crisomélido del maíz del oeste durante 4 días a
aproximadamente 25ºC. En la tabla 8 aparece el porcentaje de
mortalidad y las estimaciones de CL_{50} de carga superior para
los clones (sedimentos).
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Un aspecto de la presente invención es la
transformación de plantas con genes que codifican la toxina
insecticida. Las plantas transformadas son resistentes al ataque
por la plaga diana.
Los nuevos genes activos contra el crisomélido
del maíz descritos en la presente pueden optimizarse para la
expresión en otros organismos. Las secuencias génicas optimizadas
para el maíz que codifican las toxinas de 14 y 44 kDa de PS80JJ1 se
describen en SEQ ID NO:44 y SEQ ID NO:45, respectivamente.
Los genes que codifican toxinas pesticidas, tal
como se describen en la presente, pueden insertarse en células
vegetales utilizando una diversidad de técnicas que son muy
conocidas en la técnica. Por ejemplo, se encuentra disponible un
gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de
replicación de E. coli y un marcador que permite la
selección de las células transformadas, para la preparación para la
inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores
comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13,
pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la toxina
de B.t. puede insertarse en el vector en un sitio de
restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para la
transformación en E. coli. Las células de E. coli se
cultivan en un medio nutriente adecuado, después se recolectan y se
lisan. El plásmido se recupera. En general, se realiza el análisis
de la secuencia, el análisis de restricción, la electroforesis y
otros procedimientos biológicos
bioquímicos-moleculares como procedimientos de
análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN
utilizada puede romperse y unirse a la siguiente secuencia de ADN.
Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo plásmido o en
otros. Dependiendo del procedimiento de inserción de los genes
deseados en la planta pueden ser necesarias otras secuencias de ADN.
Por ejemplo, si se emplea el plásmido Ti o Ri para la
transformación de la célula vegetal, entonces al menos el límite
derecho, pero a menudo el límite derecho y el límite izquierdo del
ADN-T del plásmido Ti o Ri debe unirse como la
región flanqueante de los genes que se van a insertar.
El uso de ADN-T para la
transformación de células vegetales se ha investigado a fondo y se
describe suficientemente en el documento EP 120516; Hoekema (1985),
en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij
Kanters B.V., Alblasserdam, capítulo 5; Fraley et al., Crit.
Rev. Plant Sci., 4:1-46; y An et al. (1985),
EMBO J., 4:277-287.
Cuando el ADN insertado se ha integrado en el
genoma se mantiene relativamente estable y, como norma, no se
separa. Normalmente contiene un marcador de selección que confiere a
las células vegetales transformadas resistencia frente a un biocida
o un antibiótica, tal como kanamicina, G 418, bleomicina,
higromicina o cloranfenicol, entre otros. Por consiguiente, el
marcador empleado individualmente debe permitir la selección de las
células transformadas, en lugar de las células que no contienen el
ADN insertado.
Se encuentra disponible un gran número de
técnicas para insertar ADN en la célula vegetal hospedante. Estas
técnicas incluyen la transformación con ADN-T
utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección,
biolística (bombardeo de micropartículas) o electroporación, así
como otros procedimientos posibles. Si se utiliza
Agrobacterium para la transformación, el ADN que se va a
insertar debe clonarse en plásmidos especiales, es decir, en un
vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios
pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación
homóloga debido a que las secuencias son homólogas con secuencias
en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende
la región vir necesaria para la transferencia del
ADN-T. Los vectores intermedios no pueden
autorreplicarse en Agrobacterium. El vector intermedio puede
transferirse a Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido
auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden
autorreplicarse en E. coli y en Agrobacterium.
Comprenden un gen marcador de selección y un conector o
policonector que están encuadrados por las regiones del límite
derecho e izquierdo del ADN-T. Pueden transformarse
directamente en Agrobacterium (Holsters et al. [1978],
Mol. Gen. Genet., 163:181-187). El
Agrobacterium que se emplea como célula hospedante debe
comprender un plásmido que porte la región vir. La región vir es
necesaria para la transferencia del ADN-T hacia la
célula vegetal. Puede contener otro ADN-T. Las
bacterias transformadas de esta manera se emplean para la
transformación de células vegetales. De manera ventajosa, pueden
cultivarse explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens
o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia de ADN
hacia la célula vegetal. Entonces pueden regenerarse plantas
completas a partir del material vegetal infectado (por ejemplo,
trozos de hojas, segmentos del tallo, raíces, pero también
protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio
adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la
selección. Las plantas obtenidas de esta manera pueden ensayarse
para la presencia del ADN insertado. No hay requisitos especiales
para los plámidos en el caso de utilizar la inyección y la
electroporación. Es posible utilizar los plásmidos habituales,
tales como, por ejemplo, derivados de
pUC.
pUC.
Las células transformadas crecen en el interior
de las plantas de la manera habitual. Pueden formar células
germinales y transmitir el(los) rasgo(s)
transformado(s) a las plantas de la progenie. Estas plantas
pueden cultivarse de la manera normal y cruzarse con plantas que
tengan los mismos factores hereditarios u otros factores
hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tendrán las
correspondientes propiedades fenotípicas.
En una realización preferida de la presente
invención, las plantas se transformarán con genes en los que la
utilización de los codones se ha optimizado para las plantas. Véase,
por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.380.831, que se incorpora como
referencia en la presente. Además, de forma ventajosa, se utilizarán
plantas que codifiquen una toxina truncada. La toxina truncada
codificará, de forma típica, de aproximadamente 55% a
aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los
procedimientos para crear genes de B.t. sintéticos para su
uso en plantas son conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Se conoce una serie de virus que infectan
insectos. Estos virus incluyen, por ejemplo, baculovirus y
entomopoxvirus. En una realización de la presente invención, los
genes que codifican las toxinas insecticidas, tal como se describen
en la presente, pueden colocarse dentro del genoma de virus de
insectos, potenciando, con ello, la patogenicidad del virus. Los
procedimientos para construir virus de insectos que comprenden genes
de toxinas de B.t. son muy conocidos y los expertos en la
técnica pueden emplearlos con facilidad. Estos procedimientos se
describen, por ejemplo, en Merryweather et al. (Merryweather,
A.T., U. Weyer, M.P.G. Harris, M. Hirst, T. Booth, R.D. Possee
(1990), J. Gen. Virol., 71:1535-1544), y Martens
et al. (Martens, J.W.M., G. Honee, D. Zuidema, J.W.M. van
Lent, B. Visser, J.M. Vlak (1990), Appl. Environmental Microbiol.,
56(9):2764-2770).
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre(s) del(de los) solicitante(s): MYCOGEN CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- Dirección: 5501 Oberlin Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado/provincia: California
\vskip0.500000\baselineskip
- País: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- Código postal: 92121
\vskip0.500000\baselineskip
- Número de teléfono: (619) 453-8030
\vskip0.500000\baselineskip
- Número de fax: (619) 453-6991
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Toxinas pesticidas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 45
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Saliwanchik, Lloyd & Saliwanchik
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gainesville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Florida
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 32606-6669
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/633.993
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 19 de abril, 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sanders, Jay M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 39.355
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: MA-703C1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 352-375-8100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 352-372-5800
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 385 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 834 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 278 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 829 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 276 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 386 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2015 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 360 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2230 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 372 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1152 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 383 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2132 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 372 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1152 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 383 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 360 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
\hskip1,2cm
Claims (30)
1. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una toxina activa contra una
plaga de coleópteros, en el que dicha secuencia de nucleótidos se
híbrida bajo condiciones rigurosas con otra secuencia de
nucleótidos seleccionada de: ADN que codifica SEQ ID NO:2; ADN que
codifica SEQ ID NO:4; ADN que codifica SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8;
SEQ ID NO:10; ADN que codifica SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; ADN que
codifica SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14; ADN que codifica SEQ ID NO:15;
ADN que codifica SEQ ID NO:16; ADN que codifica SEQ ID NO:17; ADN
que codifica SEQ ID NO:18; ADN que codifica SEQ ID NO:19; SEQ ID
NO:20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ
ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; ADN que codifica una porción
pesticida de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:37; ADN que codifica SEQ ID
NO:38; SEQ ID NO:42; ADN que codifica SEQ ID NO:43; y SEQ ID
NO:45;
en la que las condiciones rigurosas comprenden
una hibridación durante la noche a 20-25ºC por
debajo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido de ADN en 6x
SSPE, 5x disolución de Denhardt, SDS al 0,1%, ADN desnaturalizado
0,1 mg/ml; y un lavado, dos veces a temperatura ambiente durante 15
minutos en 1x SSPE, o una vez a Tf-20ºC durante 15
minutos en 0,2x SSPE, SDS al 0,1%.
2. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 1, en el que dicha otra secuencia de nucleótidos es
ADN que codifica SEQ ID NO:2.
3. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 1, en el que dicha otra secuencia de nucleótidos es
SEQ ID NO:10.
4. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una toxina activa contra una
plaga que no es de coleópteros, en el que una porción de dicha
secuencia de nucleótidos puede amplificarse mediante PCR utilizando
una pareja de cebadores que tienen secuencias seleccionadas de: SEQ
ID NO:20 y 24, para producir un fragmento de aproximadamente 495
pb; SEQ ID NO:20 y 25, para producir un fragmento de aproximadamente
594 pb; SEQ ID NO:21 y 24, para producir un fragmento de
aproximadamente 471 pb; y SEQ ID NO:21 y 25, para producir un
fragmento de aproximadamente 580 pb.
5. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una toxina activa contra una
plaga de coleópteros, en el que dicha toxina comprende una porción
pesticida de aproximadamente 40-50 kDa, mediante
SDS-PAGE, de una secuencia de aminoácidos
seleccionada de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:34 y SEQ ID NO:39.
6. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 5, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica
una toxina que comprende una porción pesticida de la secuencia
consenso que aparece en la figura 1.
7. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una toxina activa contra una
plaga de coleópteros, en el que dicha toxina comprende una secuencia
de aminoácidos que tienen una coincidencia de al menos 75% con una
porción pesticida de una secuencia de aminoácidos seleccionada de
SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:38 y SEQ ID
NO:43.
8. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 7, en el que la coincidencia es de al menos 80%.
9. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 8, en el que la coincidencia es de al menos 90%.
10. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos
procedente de un aislado de Bacillus thuringiensis
seleccionado de PS80JJ1, PS149B1 y PS167H2, que tienen las
respectivas características identificativas de NRRL
B-18679, NRRL B-21553 y NRRL
B-21554, o un mutante del mismo que conserve la
actividad pesticida según se definió en la reivindicación 1.
11. Un polinucleótido aislado según una
cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5 y 10, en el que la toxina
tiene aproximadamente 40-50 kDa mediante
SDS-PAGE.
12. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos se híbrida
con SEQ ID NO:37 o SEQ ID NO:42.
13. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una toxina de aproximadamente
40-50 kDa de 80JJ1 activa contra una plaga de
coleópteros, en el que la secuencia de nucleótidos se ha optimizado
para su expresión en plantas.
14. Un polinucleótido según la reivindicación
13, que comprende la secuencia que aparece en SEQ ID NO:45.
15. Un anticuerpo contra una toxina de
aproximadamente 40-50 kDa, mediante
SDS-PAGE, pudiéndose obtener la toxina a partir de
un aislado según se definió en la reivindicación 10.
16. Una toxina purificada activa contra una
plaga de coleópteros, en la que dicha toxina es codificada por una
secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas
con ADN, según se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3.
17. Una toxina purificada según se definió en
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9.
18. Una toxina purificada activa contra una
plaga de coleópteros, en la que dicha toxina comprende una porción
pesticida de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID
NO:28.
19. Una toxina según la reivindicación 17, que
es codificada por un ADN que se híbrida con SEQ ID NO:37 o SEQ ID
NO:42.
20. Una toxina según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, que tiene un peso molecular de
aproximadamente 40-50 kDa.
21. Un cultivo biológicamente puro de un aislado
de Bacillus thuringiensis seleccionado de PS149B1, que tiene
las características identificativas de NRRL B-21553,
y PS167H2, que tiene las características identificativas de NRRL
B-21554, y sus mutantes que conserven la actividad
pesticida según se definió en la reivindicación 1.
22. Una composición para controlar coleópteros,
que comprende una aislado o mutante según se definió en la
reivindicación 21, en asociación con un vehículo agrícola apropiado
para su uso para el control de coleópteros.
23. Un procedimiento para controlar una plaga de
coleópteros, que comprende poner en contacto la plaga con un
aislado según se definió en la reivindicación 21, una toxina del
mismo, o un mutante del mismo que conserve la actividad pesticida
según se definió en la reivindicación 1.
24. Un procedimiento para controlar una plaga de
coleópteros, que comprende poner en contacto la plaga con una
toxina según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20.
25. Un procedimiento según la reivindicación 23
o la reivindicación 24, que comprende además poner en contacto la
plaga con una segunda toxina que tiene una característica
seleccionada de
(a) ser codificada por una secuencia de
nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas, según se
definió en la reivindicación 1, con una secuencia de nucleótidos
seleccionada de ADN que codifica SEQ ID NO:3, ADN que codifica SEQ
ID NO:5, y ADN que codifica SEQ ID NO:7;
(b) inmunorreaccionar con un anticuerpo contra
una toxina pesticida de aproximadamente 10-15 kDa
procedente de un aislado de Bacillus thuringiensis según se
definió en la reivindicación 15;
(c) ser codificada por una secuencia de
nucleótidos, en el que una porción de dicha secuencia de nucleótidos
puede amplificarse mediante PCR utilizando la pareja de cebadores
de SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:33.
26. Un procedimiento según la reivindicación 25,
en el que la segunda toxina tiene una longitud completa de
aproximadamente 10-15 kDa.
27. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, en el que la plaga es un insecto, un
ácaro o un crisomélido del maíz.
28. Un hospedante recombinante transformado para
que exprese una toxina según cualquiera de las reivindicaciones 16
a 20.
29. Un hospedante recombinante según la
reivindicación 28, que expresa además una segunda toxina según se
definió en la reivindicación 25 o la reivindicación 26.
30. Un hospedante recombinante según la
reivindicación 28 o la reivindicación 29, que se selecciona de
plantas, levaduras y bacterias.
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