KR20200127180A - 살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질 - Google Patents

살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질 Download PDF

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KR20200127180A
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제니퍼 쇼크
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지머젠 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 고도로 이질적인 환경 공급원으로부터 신규 살충 단백질을 발견하기 위한 플랫폼을 제공한다. 이 방법론은 메타게놈 농축 절차와 고유한 유전자 증폭 기술을 활용하여 광범위한 종류의 알려지지 않은 미생물 다양성과 그에 따른 프로테옴에 접근할 수 있게 한다. 공개된 살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)은 계산적으로 구동될 수 있으며 분자 생물학, 자동화 및 고급 기계 학습 프로토콜을 통합할 수 있다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 특성화되지 않고 복잡한 미생물 환경 샘플에서 생산되는 미개발 살충 단백질의 방대한 레퍼토리에 빠르고 정확하게 접근할 수 있다. 또한 본 발명에는 살충 단백질 발견 플랫폼을 사용하여 발견된 희귀한 종류의 살충 단백질에서 새로 발견된 기공 형성 독소(PFT) 그룹이 제시된다.

Description

살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질
본 발명은 매우 이종성인 환경 공급원으로부터 신규한 살충 단백질을 발견하기 위한 접근법에 관한 것이다. 이 방법론은 메타게놈 농축 절차와 고유한 유전자 증폭 기술을 활용하며, 이는 알려지지 않은 광범위한 미생물 다양성과 이의 결과적인 프로테옴의 넓은 부류에 대한 접근을 가능하게 한다.
개시된 살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)은 계산적으로 구동될 수 있고 분자 생물학, 자동화 및 진보된 기계 학습 프로토콜을 통합할 수 있다. 이 플랫폼을 통해 연구원들은 특성화되지 않은 복잡한 미생물 환경 샘플에 의해 생성된 미개발 살충 단백질의 광대한 레퍼토리에 빠르고 정확하게 접근할 수 있다.
또한, 살충 단백질 발견 플랫폼을 이용하여 발견된 희귀 부류의 살충 단백질로부터 새로 발견된 기공 형성 독소(PFT) 그룹이 본 발명에 제공된다.
2050년까지 전세계 인구는 90억 명이 넘을 것으로 추정된다. 유엔에서 농업 전문가에 의한 평가는 많은 전세계 인구에게 공급하기 위해서, 총 식량 생산은 미래의 수요를 충족시키기 위해서 70% 증가해야 한다고 추정한다. 이러한 과제는 담수 자원의 감소, 경작 가능한 토지의 공급 부족, 에너지 가격 상승, 투입 비용 증가, 현대 줄 작물 농업에 수반되는 환경 문제를 포함하여 수많은 요인에 의해 악화된다.
우리의 전세계 농업 산업이 직면하고 있는 가장 시급한 관심사 중 하나가 될 오래된 문제는 살충제 압박 및 이로부터 발생하는 수율의 연관 감소 및 감소된 생산성이다. 전통적인 합성 화학 물질은 농부들이 문제가 있는 곤충과 싸우는 데 도움을 주었지만, 이 화학 물질은 인간 건강에 미치는 영향과 잠재적인 환경에 미치는 영향에 대한 우려에 대한 증가하는 조사에 직면한다. 결과적으로, 증가하는 전세계 인구의 요구를 충족시키기 위해, 농업 해충을 퇴치하기 위한 생명공학 해결책에 대한 수요가 증가할 것이다.
하나의 선도적인 생명 공학 살충제 해결책은 그람 양성 포자 형성 박테리아 인 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis)(Bt)로부터 유래된다. Bt 박테리아는 곤충 병원체로 동정되었고 이들의 살충 활성은 Cry 유전자에 의해 암호화된 기생충 결정에 기인했으며, 이 중 100개 이상의 알려진 아이소형이 존재한다. 이러한 관찰은 특정 곤충 종의 제어를 위한 Bt 박테리아에 기초한 생물 살충제의 개발로 이어졌다. 식물은 이제 Bt 살충 단백질을 발현하도록 유전자 조작되어 식물에 대한 외부 적용의 필요성을 완화시킨다. 그러나, 화학 살충제의 지속적인 사용으로 인해 곤충 내성이 발현하는 상황과 유사하게, 식물에서 이러한 살충 Bt 단백질의 지속적인 발현은 또한 표적 해충 집단에서 내성에 대한 강력한 선택을 부과한다. 결과적으로, 업계는 곤충 집단의 놀라운 비율이 Bt 작물에 내성이 있음을 보았다. 또한, Bt 단백질은 제한된 범위의 활성을 가지며 현재 문제가 있는 곤충 종에 대해 효과적이지 않다.
따라서, 전세계 인구의 확대, 전통적인 화학 살충제와 관련된 환경 문제, 및 Bt 특성에 대한 내성 증가를 고려하여, 현대 농업에 유용한 생명공학 제품에 통합될 수 있는 신규 살충 단백질의 동정에 대한 큰 요구가 당업계에 존재한다.
본 발명은 현대 줄 작물 농업에 이용될 수 있는 신규한 살충 단백질을 제공한다. 이들 살충 단백질은 식물 종에 직접 적용하기 위해 독립형 제품으로 개발되거나 발현을 위해 숙주 식물의 게놈에 통합될 수 있다.
종래의 합성 화학 살충제와 달리, 교시된 살충 단백질은 환경 문제를 일으키지 않는다. 또한, 살충 단백질은 새롭게 발견된 부류에 속하며, 바실러스 써린지엔시스(Bt) 암호화 서열로부터 유래된 현재 산업 표준 Cry 단백질 제품에 비해 몇 가지 장점이 있다.
신규한 살곤충 단백질 자체 이외에, 본 발명은 특성화되지 않은 복잡한 미생물 환경 샘플에 의해 생성된 미개발 살충 단백질의 광범위한 레퍼토리에 접근함으로써 추가의 살충 단백질을 발견하기 위한 플랫폼을 제공한다.
살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)은 메타게놈 농축 절차 및 독특한 유전자 증폭 기술을 이용하여, 광범위한 부류의 미지의 미생물 다양성 및 이들의 결과적인 프로테옴에 접근할 수 있게 한다. 플랫폼은 계산 방식으로 구동될 수 있고 분자 생물학, 자동화 및 고급 기계 학습 프로토콜을 통합할 수 있기 때문에, 연구자들은 모델 및 검색 쿼리를 신속하고 체계적으로 개발하여 추가의 새로운 살충 단백질을 동정할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 살충 단백질을 암호화하는 슈도모나스로부터의 DNA에 대해 농축된 게놈 라이브러리를 구축하는 방법을 제공하며, a) 하나 이상의 미생물을 포함하는 초기 샘플을 제공하는 단계; b) 초기 샘플을 슈도모나스 속으로부터의 종의 성장을 풍부하게 하는 고체 영양 제한 배지에 노출시켜, 슈도모나스 에스피에 대해 농축된 후속 샘플을 생성하는 단계; c) 후속 농축 샘플로부터 DNA를 단리하는 단계; d) 분리된 DNA로부터 DNA를 추출하고 표적 살충 단백질 유전자를 증폭시키기 위해 선택된 프라이머로 축퇴 PCR을 수행하는 단계; e) PCR-증폭된 DNA를 플라스미드로 복제하는 단계; 및 f) 상기 플라스미드로부터 복제된 DNA를 서열 분석하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 서열 분석된 DNA를 게놈 라이브러리로 조립하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 동정된 살충 단백질은 알려져 있지 않다. 일부 실시태양에서, 살충 단백질 유전자를 동정하기 위해 히든 마르코프 모델이 사용된다. 일부 실시태양에서, 표 3의 임의의 유전자(즉, 뉴클레오타이드 서열) (예를 들어, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 , 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 및 71)가 발견될 수 있다. 일부 실시태양에서, 표 3에서 발견된 단백질을 암호화하는 임의의 유전자(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 , 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 및 72)가 발견될 수 있다. 일부 실시태양에서, 프라이머는 SEQ ID NO: 87에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 표적 살충 단백질 유전자를 증폭시키도록 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 및 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시태양에서, 분리된 핵산 분자는 관심 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 특정 실시태양에서, 분리된 핵산 분자는 식물 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 특정 실시태양에서, 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 및 71로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 및 72으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 뉴클레오타이드 구조체를 제공하며, 상시 핵산 분자는 이종성 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 양태에서, 이종성 조절 요소는 프로모터이다. 양태에서, 이종성 조절 요소는 식물 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 형질전환 식물 세포를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 뉴클레오타이드 구조체로부터 상기 단백질을 발현하는 안정적으로 형질전환된 식물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 곤충은 형질전환 식물을 먹고 사멸된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 및 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질을 제공한다. 일부 실시태양에서, 분리된 살충 단백질은 재조합체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 단백질을 발현하는 형질전환 식물 세포를 제공한다. 일부 실시태양에서, 곤충은 형질전환 식물을 먹고 사멸된다. 일부 실시태양에서, 상기 살충 단백질은 농업용 조성물에 함유된다. 일부 실시태양에서, 상기 농업 조성물은 효과적인 곤충 방제를 제공하기 위해 식물 및/또는 곤충에 분무하는 데 사용된다. 일부 실시태양에서, 살충 단백질은 세포 용해물에서 발견되고 세포 용해물은 곤충 해충 집단을 제어하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 천연 슈도모나스 숙주 유기체는 조성물로 제제화되고 곤충 해충을 퇴치하는 데 이용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 신규 살충 단백질을 제공하며, 여기서 단백질은 521.5이상의 비트 점수를 갖는 아미노산 서열 및/또는 표 6에서 HMM을 사용하여 점수를 매길 때 7.9e-161 이하의 E-값에서 매칭되는 서열을 갖는다. 이들 단백질은 임의의 형태(예를 들어, 단리되거나 재조합 단백질로서) 또는 본 발명에 개시된 임의의 조성물(예를 들어, 식물 또는 농업용 조성물)의 일부로 제공될 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 교시된 살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)의 흐름도를 개략적으로 도시한다.
도 2는 교시된 살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)의 흐름도를 개략적으로 나타내고, 현재 IPDP에 의해 요구되지 않는 종래 기술의 방법에 의해 이용되는 두 단계를 도시한다.
도 3은 IPDP를 이용하여 발견된 표 3에서 발견된 8개의 신규 살충 단백질(ZIP1, ZIP2, ZIP6, ZIP8, ZIP9, ZIP10, ZIP11, ZIP12)의 다중 서열 정렬을 도시 한다.
도 4는 모나리신과 비교하여 IPDP를 이용하여 발견된 표 3에서 발견된 8개의 신규 살충 단백질(ZIP1, ZIP2, ZIP6, ZIP8, ZIP9, ZIP10, ZIP11, ZIP12)의 다중 서열 정렬을 도시한다.
도 5는 IPDP를 이용하여 발견된 표 3 및 도 3에서 발견된 8개의 신규 살충 단백질의 계통 발생 수를 도시한다.
도 6은 모나리신과 비교하여 IPDP를 이용하여 발견된 표 3 및 도 4에서 발견된 8개의 신규 살충 단백질의 계통 발생 수를 도시한다.
도 7은 표 3에 발견된 10개의 정제된 살충 단백질에 의한 곤충 생체분석 실험의 결과를 도시한다. IPDP를 통해 발견된 정제된 살충 단백질(ZIP1, ZIP2, ZIP4, ZIP6, ZIP8, ZIP9, ZIP10, ZIP11 및 ZIP12 및 ZIP16)을 함유하는 물을 섭취한 곤충(썩덩나무노린재(Halyomorpha halys - Brown Marmorated Stink Bug)은 다양한 정도의 사망률을 나타내었다. 이 실험에 사용된 정제된 살충 단백질의 농도는 또한 도 7에 제시된다.
도 8은 썩덩나무노린재에 대해 표 3에서 발견된 3개의 정제된 살충 단백질(ZIP1, ZIP2 및 ZIP4)에 의한 곤충 생물분석 실험의 결과를 도시한다. 다양한 농도의 정제된 단백질은 곤충에 의해 섭취되고(N = 분석된 곤충의 수) 사망률 데이터는 프로빗 분석(Probit Analysis)하여 상한 및 하한 95% 신뢰 구간으로 모집단의 50%(LC50)를 사멸시키는 데 필요한 치사 농도를 생성하였다.
도 9a-b는 2개의 주요 곤충 목; 가을 거염벌레 및 남부 옥수수 뿌리벌레의 구성원에 대해 표 3에서 발견된 3개의 정제된 살충 단백질(ZIP1, ZIP2 및 ZIP4)에 의한 곤충 생물분석 실험의 결과를 도시한다. 완충제 단독 대조군과 비교하여 고형식과 혼합된 나열된 농도의 정제된 단백질을 섭취한 곤충의 평균 중량의 백분율 감소가 보고된다. 도 9a는 가을 가염벌레(Spodoptera frugiperda)에서 수행된 실험을 나타내며, 도 9b는 남부 옥수수 뿌리벌레(Diabrotica undecimpunctata)에서 수행된 실험을 나타낸다.
도 10은 곤충 용해물 실험의 결과를 도시한다. IPDP를 통해 발견된 정제된 살충 단백질을 함유하는 박테리아 용해물을 섭취한 곤충(썩덩나무노린재(Halyomorpha halys) - Brown Marmorated Stink Bug)은 100%의 사망률을 나타내었다.
도 11은 대두 및 옥수수 잎으로부터 ZIP 단백질의 발현을 나타내는 실시예 6의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다. 레인 1 및 11: 음성 대조군(형질전환되지 않은 대두 잎); 레인 2 및 3: ZIP1 형질전환된 대두 잎; 레인 4-10: ZIP2 형질전환된 대두 잎; 레인 12 및 13: ZIP4 형질전환된 대두 잎; 레인 14: 음성 대조군(형질전환되지 않은 옥수수 잎); 레인 15 및 16: ZIP2 형질전환된 옥수수 잎.
정의
다음의 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 생각되지만, 다음 정의는 본 발명에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
용어 하나("a" 또는 "an")는 그 실체 중 하나 이상을 의미하며, 즉 복수의 지시대상을 의미할 수 있다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "세포 생물", "미세유기체" 또는 "미생물"은 광범위하게 이해되어야 한다. 이 용어들은 상호 교환적으로 사용되며, 두 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류 및 원생 생물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 "미세유기체" 또는 "세포유기체" 또는 "미생물"을 의미한다. 이런 특성화는 표와 도면의 동정된 분류학적 속과 동정된 분류학적 종뿐만 아니라 상기 표 또는 도면의 임의의 유기체의 다양한 신규하고 새로운 동정된 또는 디자인된 균주를 의미할 수 있다. 동일한 특성화는 실시예에서와 같이, 명세서의 다른 부분에서 이런 용어의 인용에 대해서도 마찬가지이다.
용어 "원핵 생물"은 당업계에 공지되어 있으며 핵 또는 다른 세포 기관을 함유하지 않는 세포를 의미한다. 원핵생물은 일반적으로 두 영역, 박테리아와 고세균의 하나로 분류된다. 고세균과 박테리아 영역의 유기체 사이의 명확한 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오타이드 염기 서열의 근본적인 차이에 기초한다.
용어 "고세균"은 전형적으로 특이한 환경에서 발견되고 세포벽에서 리보솜 단백질의 수 및 뮤라민산의 부족을 포함하는 몇몇 기준에 의해 나머지 원핵 생물과 구별되는 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 문의 유기체의 범주를 의미한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 두 계통발생학적으로 다른 그룹으로 구성된다: 크렌고세균(Crenarchaeota) 및 유리고세균(Euryarchaeota). 생리학을 기초로, 고세균은 세 가지 유형으로 구성될 수 있다: 메테인 생성균(methanogens)(메테인을 생성하는 원핵 생물); 고염성 세균(extreme halophiles)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 사는 원핵 생물; 및 고온성(초고온성) 세균(extreme(hyper) thermophilus)(초고온에서 사는 원핵 생물). 박테리아와 구별되는 통일된 고세균의 특징(즉, 세포벽, 에스터-연결 막 지질 등에 뮤레인 없음)이외에, 이런 원핵 생물은 이들의 특정한 서식 환경에 적응시키는 특이한 구조 또는 생화학적 특성을 나타낸다. 크렌고세균은 주로 초고온성 황 의존성 원핵 생물로 이루어지며 유리고세균은 메테인 생성균과 고염성 세균을 함유한다.
"박테리아" 또는 "진정세균(eubacteria)"은 원핵 생물의 영역을 의미한다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 구별된 그룹을 포함한다: (1) 그람 양성 (그람+) 박테리아, 2개위 주요 세부구분이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(액티노마이세테스, 마이코박테리아, 마이크로코콕커스, 기타) (2) 낮은 G+C 그룹(바실러스, 클로스트리디아, 락토바실러스, 스타필로콕키, 스트렙토콕키, 마이코플라스마스); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성 + 비 광합성 그람 음성 박테리아 (대부분의 "일반적인" 그람 음성 박테리아 포함); (3) 사이아노박테리아, 예를 들면, 산소성 광영양생물; (4) 스피로체테스 및 관련 종; (5) 플랭크토마이세스; (6) 박테로이데스, 플라보박테리아; (7) 클라마이디아; (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비 황 박테리아(또한 혐기성 광영양식물); (10) 방사성 저항성 마이크로콕키 및 동족; (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
"진핵 생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 다른 소기관을 함유하는 임의의 유기체이다. 진핵 생물은 분류군 Eukarya 또는 Eukaryota에 속한다. 진핵 생물 세포를 원핵 생물(박테리아와 고세균)와 구분시키는 정의하는 특징은 막으로 둘러싸인 유전자 물질, 특히 유전자 물질을 함유하고 핵막에 의해 둘러싸인 핵을 가진다는 것이다.
용어 "유전자 변형된 숙주 세포", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되고 본 발명의 클로닝 및 형질전환 방법에 의해 유전자 변형된 숙주 세포를 의미한다. 따라서, 이 용어는 유전자 변경, 변형 또는 조작되어, 숙주 세포가 유도된 자연 발생 유기체와 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 암호화에 영향을 미칠 때) 숙주 세포(예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 곰팡이 세포, CHO, 인간 세포 등)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 이 용어는 문제의 특정 재조합 숙주 세포뿐만 아니라 이런 숙주 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "야생형 미생물" 또는 "야생형 숙주 세포"는 자연에서 발생하는 세포, 즉 유전자 변형되지 않은 세포를 기술한다.
용어 "유전자 조작된"은 (예를 들어, 삽입, 결실, 돌연변이 또는 핵산의 대체에 의한) 숙주 세포의 게놈의 임의적 조작을 의미할 수 있다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 숙주 세포"는 유전자 변형 또는 실험적 치료의 효과를 측정하기 위한 적절한 비교기 숙주 세포를 의미한다. 일부 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 세포이다. 다른 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 치료 숙주 세포를 분화시키는 유전자 변형(들)을 제외하고, 유전자 변형된 숙주 세포와 유전적으로 동일하다.
본 발명에 사용된 용어 "대립 유전자(들)"은 유전자의 하나 이상의 대안 형태의 임의의 것을 의미하며, 이의 모두 대립 유전자는 적어도 하나의 형질 또는 특성과 관련된다. 이배체 세포에서, 소정의 유전자의 두 대립 유전자는 한 쌍의 상동 염색체 상에 상응하는 유전자좌를 차지한다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자좌"(복수 유전자좌)는 예를 들어 유전자 또는 유전자 마커가 발견되는 염색체 상의 특정 장소 또는 장소들 또는 위치를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "유전적으로 연결된"은 교차를 통해 분리하기가 어려워 번식 동안 높은 비율로 공동유전되는 2개 이상의 형질을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "재조합" 또는 "재조합 사건"은 염색체 교차 또는 독립된 분류를 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "표현형"은 개체의 유전적 구성(즉, 유전자형)과 환경 사이의 상호작용으로부터 기인하는 개별 세포, 세포 배양, 유기체 또는 유기체의 그룹의 관찰 가능한 특성을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 단백질 서열을 기술할 때 용어 "키메라" 또는 "재조합체"는 적어도 2개의 이종 폴리 뉴클레오타이드 또는 2개의 이종 폴리펩타이드를 단일 거대분자 속에 연결하거나 적어도 하나의 천연 핵산 또는 단백질 서열의 하나 이상의 요소를 재배열하는 핵산 또는 단백질 서열을 의미한다. 예를 들어, 용어 "재조합체"는 예를 들어, 화학적 합성 또는 유전 공학 기술에 의한 핵산의 분리된 단편의 조작에 의해 서열의 두 개의 분리된 단편의 인공적 조합을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "합성 뉴클레오타이드 서열" 또는 "합성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 발생하는 것으로 알려지지 않았거나 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드 서열이다. 일반적으로, 이런 합성 뉴클레오타이드 서열은 임의의 다른 자연 발생 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 뉴클레오타이드 차이를 포함할 것이다.
본 발명에 사용된 "합성 아미노산 서열" 또는 "합성 펩타이드" 또는 "합성 단백질"은 자연에서 발생하지 않거나 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열이다. 일반적으로, 이런 합성 단백질 서열은 임의의 다른 자연 발생 단백질 서열과 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 차이를 포함할 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1 차 구조를 의미하며, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥의 DNA뿐 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑된 핵산과 같은 변형된 핵산, 변형된 염기를 함유하는 핵산, 골격 변형 등과 같은 변형 핵산을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 단편을 의미한다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 그의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유전자는 또한, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 원하는 파라미터를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동 기관(homologous)" 또는 "상동체(homologue)"또는 "오르쏘로그(ortholog)"는 당업계에 공지되어 있고 공통 조상 또는 가족 구성원을 공유하고 서열 동일성의 정도에 기초하여 유추될 수 있는 관련 서열을 의미한다. 용어 "상동성", "상동 기관", "실질적으로 유사" 및 "상응하게 실질적으로"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 유전자 발현을 중재하거나 특정 표현형을 생성시키는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 이런 용어는 또한 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 특정 예시적인 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다. 이런 용어는 한 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 발견된 유전자 및 다른 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 상응하는 또는 동등한 유전자 사이의 관계를 기술한다. 본 발명을 위해서, 상동성 서열이 비교된다. "상동 서열" 또는 "상동체"또는 "오르쏘로그"는 기능적으로 관련이 있다고 생각되고, 믿거나 알려진다. 기능적 관계는 (a) 서열 동일성 및/또는 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 방식 중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는, (a) 및 (b) 모두가 표시된다. 상동성은 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, 섹션 7.718, 표 7.71에서 논의된 바와 같은 당해분야에서 용이하게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수있다. 일부 정렬 프로그램은 맥벡터(MacVector)(Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN 플러스(Plus)(Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 및 AlignX(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하여 시퀀처(Sequencher)(Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)이다.
본 발명에 사용된 용어 "내인성" 또는 "내인성 유전자"는 숙주 세포 게놈 내에서 자연적으로 발견되는 위치에서 자연 발생 유전자를 의미한다. 본 발명과 관련하여, 이종 프로모터를 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 것은 이 유전자가 자연적으로 존재하는 위치에서 기존 유전자 앞에 이종성 프로모터 서열을 유전적으로 삽입하는 것을 의미한다. 본 발명에 기재된 내인성 유전자는 본 발명의 방법 중 어느 하나에 따라 돌연변이된 자연 발생 유전자의 대립 유전자를 포함할 수있다.
본 발명에 사용된 용어 "외인성"는 용어 "이종성(heterologous)"과 상호 교환적으로 사용되고, 자연 공급원 이외의 일부 공급원으로부터 유도하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 용어 "외인성 단백질" 또는 "외인성 유전자"는 비 자연 공급원 또는 위치의 단백질 또는 유전자 및 생물학적 시스템에 공급된 단백질 또는 유전자를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변화"는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미한다. 예를 들어 돌연변이는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 생성하나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 어떻게 만들어지는지를 변형하지 않는 변경을 함유한다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 변형"은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실 및 또는 삽입을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩타이드의 "적어도 일부" 또는 "단편"은 전장 분자를 포함하는 전장 분자의 이런 서열 또는 임의의 더 큰 단편의 최소 크기 특성을 갖는 부분을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 유전자 조절 요소를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 일부를 분리하고 본 발명에 기재된 바와 같은 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드의 일부는 전장 폴리펩타이드까지 이르는 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산 등일 수 있다. 사용될 부분의 길이는 특정 용도에 따라 다를 것이다. 하이브리드화 프로브로서 유용한 핵산의 일부는 12개 뉴클레오타이드 정도로 짧을 수 있으며; 일부 실시태양에서, 이것은 20개 뉴클레오타이드이다. 에피토프로서 유용한 폴리펩타이드의 일부는 4개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. 전장 폴리펩타이드의 기능을 수행하는 폴리펩타이드의 일부는 일반적으로 4개 이상의 아미노산보다 길 수 있다.
변이체 폴리뉴클레오타이드는 또한 DNA 셔플링과 같은 돌연변이 및 재조합 절차로부터 유도된 서열을 포함한다. 그러한 DNA 셔플링을위한 전략은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, Stemmer(1994) PNAS 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al.(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al.(1997) PNAS 94:4504-4509; Crameri et al.(1998) Nature 391:288-291; 및 미국 특허 제5,605,793호 및 제5,837,458호 참조.
본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 증폭을 위해, 임의의 관심 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하기 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)에 개시된다. PCR의 공지된 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적 불일치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 DNA 중합효소를 부착시키는 증폭 표적에 대한 어닐링을 행할 수 있어, 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓일 때, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 중합화제의 존재하에서 및 적절한 온도 및 pH에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. (증폭) 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 바람직하게는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 중합화제의 존재 하에서 증량 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 조성(A/T 대 G/C 함량)을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다. 한 쌍의 양방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 하나의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 서열은 근위 및 더 원위 상류 요소로 구성되고, 후자의 요소는 종종 인핸서로 의미된다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며, 프로모터의 선천적인 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 완전히 유도되거나 자연계에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유도된 상이한 요소로 구성되거나 심지어 합성 DNA 단편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형, 또는 상이한 발달 단계 또는 상이한 환경 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 지시할 수 있음은 당업자에게 이해된다. 또한, 대부분의 경우에, 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 일부 변이체의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인식된다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 구조체", "발현 구조체", "키메라 구조체", "구조체" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 재조합 구조체는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구조체는 상이한 공급원으로부터 유도된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되지만 자연계에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구조체는 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 주지된 바와 같이 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선별 및 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건이 발현의 상이한 수준 및 패턴을 유도한다는 것을 인식할 것이며(Jones et al., (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen Genetics 218 : 78-86), 따라서 다수의 사건은 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 라인을 수득하기 위해 선별돼야한다. 이러한 선별은 다른 것들 중에서, DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅 분석 또는 표현형 분석에 의해 실행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등일 수있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제하지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 모두로 구성된 폴리뉴클레오타이드, 폴리-라이신-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 펩타이드-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이드된 DNA 등일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "발현"은 기능적 최종 산물, 예를 들어 mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙)의 생산을 의미한다.
"작동 가능하게 연결된"은 추가 폴리뉴클레오타이드의 전사를 초래하는 추가의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의한 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 순차적 배열을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "관심 생성물" 또는 "생체분자"는 원료로부터 미생물에 의해 생성된 임의의 생성물을 의미한다. 일부 경우에, 관심 생성물은 소분자, 효소, 펩타이드, 아미노산, 유기산, 합성 화합물, 연료, 알코올 등일 수 있다. 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체분자는 임의의 1차 또는 2차 세포외 대사산물일 수 있다. 1차 대사산물은 특히 에탄올, 시트르산, 락트산, 글루탐산, 글루탐산염, 라이신, 트레오닌, 트립토판 및 다른 아미노산, 비타민, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 2차 대사산물은 특히 페니실린과 같은 항생물질 또는 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제, 지베렐린과 같은 식물 호르몬, 로바스타틴과 같은 스타틴 약물, 그리세오풀빈과 같은 살균제 등일 수 있다. 관심 생성물 또는 생체분자는 또한 카탈라아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 글루코오스 아이소머라제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 락타아제, 스트렙토 키나아제 및 여러 다른 것을 포함하는 미생물 효소와 같은 미생물에 의해 생성된 임의의 세포내 성분일 수 있다. 세포내 성분은 또한 인슐린, B형 간염 백신, 인터페론, 과립구 콜로니-자극 인자, 스트렙토키나아제 및 기타와 같은 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "탄소원"은 일반적으로 세포 성장을 위한 탄소원으로 사용되기에 적합한 물질을 의미한다. 탄소원은 바이오매스 가수분해물, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 자일로오스 및 리그닌뿐만 아니라 이들 기질의 단량체 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 탄소원은 폴리머, 탄수화물, 산, 알코올, 알데하이드, 케톤, 아미노산, 펩타이드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 다양한 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 글루코오스, 덱스트로스(D-글루코오스), 말토오스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 포화 또는 불포화 지방산, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 등, 또는 이의 혼합물과 같은 다양한 모노사카라이드를 포함한다. 광합성 유기체는 광합성의 산물로서 탄소원을 추가로 생산할 수 있다. 일부 실시태양에서, 탄소원은 바이오매스 가수분해물 및 글루코오스로부터 선택될 수 있다.
용어 "공급원료"는 미생물 또는 발효 공정에 공급되는 원료 또는 원료의 혼합물로서 다른 생성물이 제조될 수 있는 것으로 정의된다. 예를 들어, 바이오매스 또는 바이오매스에서 유도된 탄소 화합물과 같은 탄소 공급원은 발효 공정에서 관심 생성물(예를 들어, 소분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)을 생산하는 미생물의 공급원료이다. 그러나, 공급원료는 탄소 공급원 이외의 영양분을 함 유할 수 있다.
용어 "체적 생산성" 또는 "생산 속도"는 단위 시간당 매질의 부피당 형성된 생성물의 양으로 정의된다. 체적 생산성은 시간당 리터 당 그램(g/L/h)으로 보고될 수 있다.
용어 "비 생산성"은 생성물의 형성 속도로 정의된다. 비 생산성은 본 발명에서 시간당 세포 건조 중량의 그래당 그램 생성물(g/g CDW/h)의 비 생산성으로서 더 정의된다. 소정의 미생물에 대한 OD600에 대한 CDW의 관계를 사용하여, 비 생산성은 시간당 600nm(OD)(g/L/h/OD)에서 배양액의 광학 밀도당 배양 배지당 그램 생성물로 표현될 수 있다.
용어 "수율"은 원료의 단위 중량당 수득된 생성물의 양으로 정의되며 g 기질 당 g 생성물(g/g)로 표현될 수 있다. 수율은 이론적 수율의 백분율로 표현될 수있다. "이론적 수율"은 생성물을 제조하는데 사용된 신진대사 경로의 화학양론에 따라 결정된 소정량의 기질당 생성될 수 있는 최대 생성물로 정의된다.
용어 "역가(titre 또는 titer)"는 용액의 강도 또는 용액 속의 물질의 농도로 정의된다. 예를 들어, 발효액에서 관심 생성물(예를 들어, 소분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)의 역가는 발효액 1 리터당 용액 속 관심 제품의 g(g/L)로 기술된다.
용어 "총 역가"는 용액 속의 관심 생성물, 적용 가능한 경우 기체상의 관심 생성물, 공정으로부터 제거되고 공정에서 최초 부피 또는 공정에서 작동 부피에 따라 회수된 임의의 관심 생성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 공정에서 생산된 모든 관심 생성물의 합으로 정의된다.
용어 "살충(insecticidal) 단백질" 또는 "농약(pesticidal) 단백질" 또는 "살충(insecticidal) 독소" 또는 "농약(pesticidal) 독소"는 하나 이상의 해충에 대해 독성 활성을 갖는 단백질을 지칭하는 데 사용된다. 해충의 예는 예를 들면 나비목(Lepidopterans), 파리목(Dipterans), 노린재목(Hemipterans) 및 딱정벌레목(Coleopterans)을 포함하는 다양한 목의 곤충을 포함한다. 해충은 또한 예를 들어, 선형동물문(Nematoda phylum)의 구성원을 포함하여 농업에 해충인 비 곤충 유기체를 포함한다.
살충제/농약 단백질
본 발명은 살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질을 교시한다. 그러나, 용어 "살충"은 단지 곤충에만 국한된 것이 아니라, 일반적으로 "해충"으로 지칭되는 유기체의 보다 광범위한 분류학적 그룹을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 결과적으로, 문구 "살충 단백질"은 "농약 단백질"과 동의어로 간주될 수 있고 문구 "살충 단백질 발견 플랫폼"은 "농약 단백질 발견 플랫폼"과 동의어로 간주될 수 있다. 또한, 일부 양태에서, 본 발명은 살충 독소 및 살충 독소를 발견하기 위한 플랫폼을 제공하며, 이는 단백질 실시태양으로 제한되지 않을 수 있다.
살충 단백질 - 모나리신
슈도모나스 엔토모필라는 초파리를 감염시키고 사멸시키는 병원성 박테리아이다. P. 엔토모필리아 병원성은 초파리 소화관에 돌이킬 수 없는 손상을 유발하여 상피 재생 및 복구를 방지하는 능력과 관련이 있다. 최근 오포타와 동료들은 "모나리신"이라고 불리는 새로운 기공 형성 독소(PFT)의 동정이 초파리에 대한 P. 엔토모필리아의 독성에 기여한다고 보고하였다. Opota, et al., "Monalysin, a Novel ß-Pore-Forming Toxin from the Drosophila Pathogen Pseudomonas entomophila, Contributes to Host Intestinal Damage and Lethality," PLoS Pathogens, September 2011, Vol. 7, Issue 9. 오포타는 모나리신이 N-말단 절단이 완전히 활성화되고, 시험관 내에서 올리고머를 형성하며, 인공 지질 막에서 기공 형성을 유도한다는 것을 입증하였다. 막-스패닝 도메인의 이차 구조의 예측은 모나리신이 β-타입의 PFT임을 나타낸다. 모나리신의 발현은 P. 엔토모필라 병원성을 제어하는 2개의 신호 전달 시스템인 GacS/GacA 2 성분 시스템 및 Pvf 조절제 둘 다에 의해 조절된다. 또한, P. 엔토모필라에 의해 분비된 메탈로프로테아제인 AprA는 프로-모나리신의 활성 형태로의 빠른 절단을 유도할 수 있다. 감소된 세포 사멸은 모나리신 생산이 결핍된 돌연변이체에 감염된 경우 관찰되며, 이는 모나리신이 장 세포 손상을 유도하는 P. 엔토모필라 능력에서 역할을 하는 것으로 나타났으며, 이는 PFT로서의 활성과 일치한다. 오포타의 연구는 바실루스 써린지엔시스 Cry 독소의 잘 확립된 작용과 함께 PFT 생산이 곤충 소화관 항상성을 방해하는 곤충 병원체의 일반적인 전략임을 시사한다.
오포타는 알려지지 않은 유전자 pseen3174의 단백질 산물을 특성화함으로써 모나리신(PSEEN3174)을 발견하였다. 오포타에 따르면, 모나리신 아미노산 서열은 슈도모나스 푸티다 F1 균주에서 발견되는 2개의 특성화되지 않은 오르쏘로그를 제외하고 P 블라스트를 사용하는 다른 서열과 상동성을 나타내지 않았다(오포타의 도 S1). P. 엔토모필라 또는 P. 퓨티다 유전자 산물은 어떠한 명백한 단백질 도메인을 보이지 않았다. 그러나, 오포타는 HHpred 소프트웨어(HMM-HMM 비교에 의한 상동성 탐지 및 구조 예측)를 사용하여 일련의 세린 및 트레오닌 잔기가 플랭킹되는 극성 및 소수성 잔기가 교차하는 내부 영역, β-배럴 기공 형성 독소 영역의 막 스패닝 영역의 특징의 존재를 밝혔다. Id.
오포타의 DNA 서열 검색 및 분석은 슈도모나스 게놈 데이터베이스("www" 접두사를 사용하여 전세계 웹에서 접근할 수 있는 pseudomonas.com)를 사용하여 수행되었다. 모나 리신 유전자 (ORF PSEEN3174)는 수탁 번호 YP_608728.1에 해당한다. Pseudomonas putida Pput_1063 및 Pput_1064의 모나리신 추정 오르쏘로그는 각각 수탁 번호 YP_001266408.1, YP_001266409.1에 해당한다. VI형 분비 시스템의 생산과 관련된 ORF PSEEN0535는 수탁 번호 YP_606298.1에 해당한다.
살충 단백질 - 슈도모나스 살충 단백질(PIP)
PIP-1, 45, 47, 64, 72, 74, 75 및 77을 포함하는 몇몇 슈도모나스 살충 단백질 패밀리가 공지되어있다. 이들 PIP 단백질은 동정 특성과 함께하기 표 1에 제공된다. (1) 본 발명에 참조로 포함된 U. Schellenberger et al., "A selective insecticidal protein from Pseudomonas for controlling corn rootworms," Science, 2016 Nov 4;354(6312):634-637 (providing IPD072Aa, an 86 AA protein, GenBank Accession No. KT795291) ; 및 (2) 본 발명에 참조로 포함된 Jun-Zhi Wei et al., "A selective insecticidal protein from Pseudomonas mosselii for corn rootworm control," Plant Biotechnology Journal, 2018, Vol. 16, pgs. 649-659 (providing PIP-47aa)
슈도모나스 살충 단백질 (PIP) 및 모나리신
출처 공개공보 1 PIP 동정자 아미노산 서열 2 출처 유기체
13792861 / US9688730B2 PIP-1
SEQ ID NO:2
MPIKEELSQPQSHSIELDDLKSEQGSLRAALTSNFAGNFDQFPTKRGGFAIDSYLLDYSAPKQGCWVDGITVYGDIFIGKQNWGTYTRPVFAYLQYMDTISIPQQVTQTRSYQLTKGHTKTFTTNVSAKYSVGGSIDIVNVGSDISIGFSNSESWSTTQTFSNSTQLTGPGTFIVYQVVMVYAHNATSAGRQNGNAFAYNKTNTVGSRLDLYYLSAITQNSTVIVDSSKAIAPLDWDTVQRNVLMENYNPGSNSGHFSFDWSAYNDPHRRY

(SEQ ID NO: 73)
P. chlororaphis
15543689 / US20170367349A1 PIP-45-1 SEQ ID NO:1
MSTPFKQFTSPAGQAPKDYNKLGLENQLPQFETDWNNDLTGWTQSAIIGNPWSGLNDAPRSGYYNPLVEGYGPTTPPAITWAPFPNRLWTFFYNNGTAVIPQLGGKAMSLQQVMELTDNGQITINNTLYMLYDPNKQGTLLQLPVTRCPTIDWQGKYKDFSPSGPRGWLDEYCEWSIVRDADGNMRKITFTCENPAYFLAMWRIDPNAVLGLYRDYIDPQVQLEDLYLRYTADCPTGKAGDPVIDPTTGQPAYDTVNKWNAGTACVPGQYGGAMHLTSGPNTLSAEVYLAAAATILRPLASSQNSQALICCAQYGQNYRNSDPHIGFSANSVAVNNRLSLTNPIGLYLQQPTDFSAWKGPQGQDVSQYWKITRGTAKSAANGSDQILQAVFEVPVSAGFSINDITISGQPIDYVWVIAQQLLVGLSVTTTPISPTPDSCPCVKDRVNGVQPWPVQLLPLDLFYGQSPTDLPAWLAPGTSGQFALVVQGADLKTTAETARVQFSNPGVTAQVTQFLPDASAIPGQTNSGGTQGYLLTITVSPTAAPGLVTVRALNPGEADNPSATEHPWESGLALVPGA

(SEQ ID NO: 74)
P. brenneri
15543689 / US20170367349A1 PIP-45-2 SEQ ID NO:2
MSRLRLSVLSLLTSVVLSLFAMQAAYASPTSDADACVQQQLVFNPKSGGFLPINNFNATGQSFMNCFGWQLFIALNWPVNPGWPATPALAGEPDMNSTLAQFGVPTASGQPMSVAPVWASYKDANDIFLPGAPAPTGWGVQTLVPSNCSTQGSLRAISVGARKFMTATSESAINARHGFHLSSGTLASIPDPIMEASGGWLTDQSQNLVFFERKVGKAEFDYIVSKGLYDAANQLTVAQNLDNQNPGGLSLPIGEPMRSLPPNPVPQEQLGALEVKAAWRILTGKPELYGRYLTTVAWLKNPATLQCTQQVVGLVGLHIINKTQASPNFIWTTFEQVDNVPEPNQVPPQQTPPDSFAFNNPNCGTGPECTPNVARIQCKQHHPDRDCTEPFPRDQPVQTTREHPLPTELQALNGAVQANFAQQSQGKSVFQYYKLINVLWTLTPNPPTQPEPGVSAQVPLSYGPFISQGNVPVANTTLETYVQGDNCNACHQYATIAGSSTLASDFSFLFNSADSASKNSLVKRVKAFQTLKDQP

(SEQ ID NO: 75)
P. brenneri
15543689 / US20170367349A1 PIP-64-1 SEQ ID NO:53
MGSITDHNQLLAWVASLDIPEASGVKTRSRNVVARANAEDEGAAVVRGSITSFVTGLSQQARDDVQNSTLLMQLAADKKFNPEKQREEWFKFYTDGLANLGWGRVSSYYQSYQPRNTNVTMDQVVLEVIAAVVGADSAVYKVTEKTFSSLQDNPKNQAPLKLFDSSSTRDSVGTFQILPVMQDRDGNVVMVLTTVNASTTVQRGSFLFWSWSKTTAWMYRAAQQTVLNESVYATVRQSVIKKLGKNAEEFIDDLEI

(SEQ ID NO: 76)
P. brenneri
15543689 / US20170367349A1 PIP-64-2 SEQ ID NO:54
MKLSADEVYVISGNLLSATPSLTDPTVLEDIANSNLLCQLAADKNQGTRFIDPAAWLDFYRSSLGRLFWRISNSGTVSYAIPQLVHKITVKEVLEKTFYKTLDRPQRIRVEESIELLGEQSADSPSATLYSLKTQVNFNETTSSPGLLPHSISSVNLQLSVVHSETCISVCSVYFKTSTRIGDDVFNQKFPVKELLGNVSVSTFEAKLLESSYAGIRQSIIDKLGEDNIRENILLVPAVSPSLSNTRHAGALQFVQELDI

(SEQ ID NO: 77)
P. brenneri
15543689 / US20170367349A1 PIP-74-1 SEQ ID NO:73
MAKLTQFSTPADIQDFSDSPAQQERMNAAWSGNINRWVNAALVGDVWDLINYGPRPAFYNPLDTDTPSTSVNAPITWNAFPGRIPALFPNQSANWLQWADQGVPANVTTNLCTQQSVPPAPYSPTGPRGWQDEYCEWSVTRNAAGQITSVMFTCENPEYWMTLWQVDPGKVLQRYQQLINPAVQLADLSLKDAQGQTVIDPVTGAPCYNPLNKWNSGTQTLPGSGGAMHLTSSPNTLGAEYDLAAAATMPRELNNEPVTSASQLVCYARYGRIGRHSDPTIGQNVNQYVNYTSGLTEVRATLTNPPGLYIQTPDFSGYTTPDGSPAAACWTINRGHLAQTSDDIDRILHATFSVPAGKNFTVSDISINGAKIQYASQIAGTITMGLMATVFGNSGVTQQPVAGTLDSDNPSPSVSALQPLSVFNAYRAQELASNEQALSIPILALAIRPGQQVDNIALLLNTSQTPNGASFSVVEGGVSISITGTQDLPGLDMSLYLVSISADANAAPGDRTVLASVPGMASTQQAAIGLLTVGGPTLVTSQTGPSKPNFRRGRG

(SEQ ID NO: 78)
P. rhodesiae
15543689 / US20170367349A1 PIP-74-2 SEQ ID NO:74
MRRRPTVLLGLALLLGLPATQAMGAPLCGSPFVPSPTLQPTLAPPNFSASDSAVDCFMWQTMVYLNWPATPGQRGVPNAAASLGSPGPSVWQTYKDYNELYLPNGQQPPAWNDNFLSVQRLQTRGVARALPSIRLLNSTSKVFRAANANESPALREIEQVGGGVLYDQAGSPVYYEMLVNEVNFDFIYNNQLYNPAQQNLYAKQKGIVLPNNSIEIKAAWKVLSDPDNPQRFLTAQALLPGSSTPVTVGLVGLHVFQMPSSAFNQGFWATFQQLDNAPTVAGATPGAHYSFNNPQCAPAQCPPNDKTSNPTQVVQNFPPTPEAQNINHYMQNLIAQQAPGSALQYYQLVDVQWPTSPQAIGQPGATAPAPSGTPNHDTLINPVLETFLQANHKSCLGCHVYASVAADGSNPPTHYQASFSFLLGHAKSPALGSNLKSLAQQIEDASLSLQH

(SEQ ID NO: 79)
P. rhodesiae
15543689 / US20170367349A1 PIP-75 SEQ ID NO:79
MKLSNVLLLSIVFAWQGMAFADTQKSNAETLLSNDKPPLTQAAQEKEQENVEADRNECWSAKNCSGKILNNKDAHNCKLSGGKSWRSKTTGQCTNL

(SEQ ID NO: 80)
P. antarctica
15543689 / US20170367349A1 PIP-77 SEQ ID NO:88
MSAQENFVGGWTPYHKLTPKDQEVFKEALAGFVGVQYTPELVSTQVVNGTNYRYQSKATLPGSSESWQAVVEIYAPIKGKPHITQIHRI

(SEQ ID NO: 81)
P. chlororaphis
14912356 / US20160186204A1 PIP-47Aa SEQ ID NO:2
MHAPGAIPSEKESAHAWLTETKANAKSTALRGNIFAQDYNRQLLTATGQSMRSGADAINPFFSPAKGTATGSYAKDADANVSPGSAPVSIYEGLQTAIDIARRRSGYNPLDQPTDQKPKSAGDREHFIAFTQQIAEIPFLSLLAAQVTQIQQKSHDANALVDSFVKGFIGLKNQDVEQIKQSLSSLVNAALSYSEQTERQSNFNQNILQTGDSGSVNFMLYASEFTIKASSHKGTITFQSSYTLSQAIYQLSVESWNNVKDVFSKQQKTDTQQWLGDTTTQVREGSKLRAICLVS

(SEQ ID NO: 82)
P. putida
14912356 / US20160186204A1 PIP-47Bb SEQ ID NO:4
MNAPGAAPSEKEVAHAWLEGKARVKSTTAHGNIFAHDYNHPHQLTSTGRAMRTGADAINPFFSPAAGAATDSYANDANKNVSPGKAPVSIYEGLQTAIDIARRRSEYNPLDQPTDQRPKAKGDREHFIAFTQQIAEIPFLSLLAAQVTQIQQKSHDANALIDSFVKGFIGLAAKDVEQIKKSLSSLVNAALSYSEQTERQSNFNQNILQTGIAGSVNFMLYASEFTIKATSKKGTITFQSSYTLSQAVYQLSVESWENVRDVFAKQQKTDTQQWLGDTTTPVKPGSSLRAICLVS

(SEQ ID NO: 83)
P. putida
14912356 / US20160186204A1 PIP-47Ba SEQ ID NO:6
MHAPTVKELAHAWLTETTAKANSTIVRGNIFAHEYNHQLLTPTGLSMRSGADAINPFYSPASGAATDSYAKDANNNVSPGSAPVSIYEGLQTSIDIARRRSGYNPLDQPTDQKPKAAGDREHFIAFTQQIANIPFLSLLAAQVTQIQQKSHDANALVDSFVKGFIGLKNQDVEQIKQSLSSLVNAALSYSEQTERQSNFNQNILQTGNGGSVNFMLYASEFTIKASSHKGTITFQSSYTLSQAIYQLSVESWNNVKDTFSKQQKTDTEQWLDDTTTPVKEGSKLRAICLVG

(SEQ ID NO: 84)
P. fulva
14912356 / US20160186204A1
PIP47Fa
SEQ ID NO:8
MSTQNHKHITEKTLAWLNTTHESNKLSTQTNPNIFVLDRSRSSFSESLLTPGSRADIANPFFAPAGSLATARYLQAANNNASSGSAPTSLQDGLQTCVNMARTRSGWNPNDPPTAANPHTTGDYEHFISFTKEISRIPFLTLESASSSLVMQQSHNADDLINSFANGFHGLETADIEETKRGLKELVKAALSECEKTNRESFFNQHTLQQKDDTAIYLIYSSTFSIVATDQKGTINFQSSYLLTQSKYTLSNATWDRIKDLFYDQQKTDTNTWLNGMKTLPRAGSTARATCLEGQ

(SEQ ID NO: 85)
P. chlororaphis
15022109 / US20160366891A1 PIP-72Aa SEQ ID NO:2
MGITVTNNSSNPIEVAINHWGSDGDTSFFSVGNGKQETWDRSDSRGFVLSLKKNGAQHPYYVQASSKIEVDNNAVKDQGRLIEPLS
(SEQ ID NO: 86)
P. chlororaphis
Monalysin from Opota et al. is also derived from a Pseudomonas Monalysin MTIKEELGQPQSHSIELDEVSKEAASTRAALTSNLSGRFDQYPTKKGDFAIDGYLLDYSSPKQGCWVDGITVYGDIYIGKQNWGTYTRPVFAYLQYVETISIPQNVTTTLSYQLTKGHTRSFETSVNAKYSVGANIDIVNVGSEISTGFTRSESWSTTQSFTDTTEMKGPGTFVIYQVVLVYAHNATSAGRQNANAFAYSKTQAVGSRVDLYYLSAITQRKRVIVPSSNAVTPLDWDTVQRNVLMENYNPGSNSGHFSFDWSAYNDPHRRY
(SEQ ID NO: 87) 		P. entomophila
1표 1의 모든 출원 공개공보는 본 발명에 참조로 포함된다.
2서열 이전에 원래의 출처 출원/공개공보부터의 SEQ ID NO, 서열 이후에 나열되고 밑줄 친 현재의 공개공보에 따른 SEQ ID NO
살충 단백질 - Cry 단백질
바실루스 써린지엔시스(Bt)는 병원성을 갖는 그람 양성 포자 형성 박테리아이다. Bt는 포자화 단계 동안 기생충 결정으로서 살충 단백질을 생산한다. 이러한 결정은 주로 δ-내독소라고도 하는 하나 이상의 단백질(Cry 및 Cyt 독소)로 구성된다. Cry 단백질은 표적 유기체에 실험적으로 검증 가능한 독성 효과를 나타내거나 알려진 Cry 단백질과 상당한 서열 유사성을 갖는 바실루스 써린지엔시스의 기생충 내포(결정) 단백질이다. 유사하게, Cyt 단백질은 용혈 활성을 나타내거나 알려진 Cyt 단백질과 명백한 서열 유사성을 갖는 바실러스 써린지엔시스로부터의 기생충 포함 단백질이다. 이 독소는 대상 곤충에 매우 특이적이고 인간, 척추 동물 및 식물에 무해하며 완전히 생분해된다. Bravo A, Gill SS, Soberon M., "Mode of action of　Bacillus thuringiensis　Cry and Cyt toxins and their potential for insect control,"　Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 2007;49(4):423-435.　
Bt Cry 및 Cyt 독소는 이들 숙주의 세포막 내로 삽입 또는 전위하기 위해 입체 형태 변화를 겪는 수용성 단백질로서 분비되는 기공 형성 독소(PFT)로 알려진 박테리아 독소 부류에 속한다. PFT에는 두 가지 주요 그룹이 있다 : (i) α-나선 영역이 막 투과 기공을 형성하는 α-나선 독소, 및 (ii) 각 단량체의 β- 시트 헤어핀으로 구성된 β-배럴 독소. Parker MW, Feil SC, "Pore-forming protein toxins: from structure to function," Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005 May; 88(1):91-142 참조. PFT의 제 1 부류는 콜리신, 외독소 A, 디프테리아 독소 및 또한 Cry 3ro 도메인 독소와 같은 독소를 포함한다. 한편, 에어로리신, α-헤모리신, 탄저균 보호 항원, 퍼프린고리신 O로서의 콜레스테롤 의존 독소 및 Cyt 독소는 β-배럴 독소에 속한다. Id. 일반적으로, PFT-생산 박테리아는 이들의 독소를 분비하고, 이들 독소는 숙주 세포 표면 상에 위치된 특정 수용체와 상호 작용한다. 대부분의 경우에, PFT는 삽입 가능한 올리고머 구조의 형성을 유도하는 수용체 결합 후 숙주 프로테아제에 의해 활성화된다. 마지막으로, 막 삽입은, 대부분의 경우, 단백질의 용융된 소구체 상태를 유도하는 pH의 감소에 의해 유발된다. Id.
Bt Cry 단백질을 생산하는 유전자 변형 작물의 개발은 환경 친화적인 대안에 의한 화학 살충제의 대체를 허용하였다. 유전자 변형 식물에서, Cry 독소는 지속적으로 생산되어 독소를 분해로부터 보호하고 독소를 씹으며 구멍을 뚫는 곤충에 도달하게 만든다. 식물에서의 Cry 단백질 생산은 식물 편향 코돈 사용에 의해 cry 유전자를 조작하고, 추정된 스플라이싱 신호 서열의 제거 및 전독소의 카복시-말단 영역의 결실에 의해 개선되었다. Schuler TH, et al., "Insect-resistant transgenic plants," Trends Biotechnol. 1998;16:168-175 참조. 곤충 내성 작물의 사용은 이러한 유전자 변형 작물이 심어진 지역에서 화학 살충제 사용을 상당히 줄였다. Qaim M, Zilberman D, "Yield effects of genetically modified crops in developing countries," Science. 2003 Feb 7; 299(5608):900-902 참조.
공지된 Cry 단백질은 δ-내독소 유전자의 Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51, Cry52, Cry 53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59. Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 및 Cry71 부류 및 B. 써린지엔시스 세포용해 cyt1 및 cyt2 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 δ-내독소를 포함한다.
B. 써린지엔시스 살충 단백질의 이런 부류의 구성원은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: CrylAa1 (Accession # AAA22353); Cry1Aa2 (Accession # AAA22552); Cry1Aa3 (Accession # BAA00257); Cry1Aa4 (Accession # CAA31886); Cry1Aa5 (Accession # BAA04468); Cry1Aa6 (Accession # AAA86265); Cry1Aa7 (Accession # AAD46139); Cry1Aa8 (Accession # 126149); Cry1Aa9 (Accession # BAA77213); CrylAa10 (Accession # AAD55382); CrylAa11 (Accession # CAA70856); Cry1Aa12 (Accession # AAP80146); Cry1Aa13 (Accession # AAM44305); Cry1Aa14 (Accession # AAP40639); Cry1Aa15 (Accession # AAY66993); Cry1Aa16 (Accession # HQ439776); Cry1Aa17 (Accession # HQ439788); Cry1Aa18 (Accession # HQ439790); Cry1Aa19 (Accession # HQ685121); Cry1Aa20 (Accession # JF340156); Cry1Aa21 (Accession # JN651496); Cry1Aa22 (Accession # KC158223); Cry1Abl (Accession # AAA22330); Cry1Ab2 (Accession # AAA22613); Cry1Ab3 (Accession # AAA22561); Cry1Ab4 (Accession # BAA00071); Cry1Ab5 (Accession # CAA28405); Cry1Ab6 (Accession # AAA22420); Cry1Ab7 (Accession # CAA31620); Cry1Ab8 (Accession # AAA22551); 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δ-내독소의 예는 또한 미국 특허 5,880,275, 7,858,849 8,530,411, 8,575,433, 및 8,686,233의 Cry1A 단백질; 미국 특허 8,304,604, 8,304,605 및 8,476,226의 DIG-3 또는 DIG-11 독소(Cry1A, Cry3A와 같은 cry 단백질의 α-나선 1 및/또는 α-나선 2 변이체의 N-말단 결실); 미국 특허 출원 Ser. 10/525,318의 Cry1B; 미국 특허 6,033,874의 Cry1C; 미국 특허 5,188,960 및 6,218,188의 Cry1F; 미국 특허 7,070,982; 6,962,705 및 6,713,063의 Cry1A/F 키메라; 미국 특허 7,064,249의 Cry2Ab 단백질과 같은 Cry2 단백질; 적어도 2개의 상이한 Cry 단백질의 가변 영역 및 불변 블럭의 독특한 조합의 융합에 의해 생성된 조작된 하이브리드 살충 단백질(eHIP)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 Cry3A 단백질(미국 특허 출원 공개 번호 2010/0017914); Cry4 단백질; Cry5 단백질; Cry6 단백질; 미국 특허 7,329,736, 7,449,552, 7,803,943, 7,476,781, 7,105,332, 7,378,499 및 7,462,760의 Cry8 단백질; 미국 특허 8,802,933의 Cry9D 단백질 및 미국 특허 8,802,934의 Cry9B 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E 및 Cry9F 패밀리의 구성원과 같은 Cry9 단백질; Naimov, et al., (2008), "Applied and Environmental Microbiology," 74:7145-7151의 Cry15 단백질; 미국 특허 6,127,180, 6,624,145 및 6,340,593의 Cry34Abl 단백질; 미국 특허 6,248,535, 6,326,351, 6,399,330, 6,949,626, 7,385,107 및 7,504,229의 CryET33 및 CryET34 단백질; 미국 특허 공개 번호 2006/0191034, 2012/0278954 및 PCT 공개 번호 WO 2012/139004의 CryET33 및 CryET34 상동체; 미국 특허 6,083,499, 6,548,291 및 6,340,593의 Cry35Abl 단백질; Cry46 단백질, Cry 51 단백질, Cry 이진 독소; TIC901 또는 관련 독소; 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0295207의 TIC807; PCT US 2006/033867의 ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128; 미국 특허 8,513,494의 TIC853 독소, 미국 특허 8,236,757의 AXMI-027, AXMI-036 및 AXMI-038; 미국 특허 7,923,602의 AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049; WO 2006/083891의 AXMI-018, AXMI-020 및 AXMI-021; WO 2005/038032의 AXMI-010; WO 2005/021585의 AXMI-003; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0250311의 AXMI-008; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0216186의 AXMI-006; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0210965의 AXMI-007; 미국 특허 출원 번호 2004/0210964의 AXMI-009; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0197917의 AXMI-014; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0197916의 AXMI-004; WO 2006/119457의 AXMI-028 및 AXMI-029; WO 2004/074462의 AXMI-007, AXMI-008, AXMI-008orf2, AXMI-009, AXMI-014 및 AXMI-004; 미국 특허 번호 8,084,416의 AXMI-150; 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0023184의 AXMI-205; 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0263488의 AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 및 AXMI-064; 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0197592의 AXMI-R1 및 관련 단백질; WO 2011/103248의 AXMI221z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z 및 AXMI225z; WO 2011/103247 및 미국 특허 8,759,619의 AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 및 AXMI231; 미국 특허 8,334,431의 AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 및 AXMI-184; 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0298211의 AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 및 AXMI-045; 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0144852의 AXMI-066 및 AXMI-076; 미국 특허 8,318,900의 AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189; 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0005543의 AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI103, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107, AXMI107 AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137, 미국 특허 출원 공개 US20140223599의 AXMI279, 미국 특허 8,319,019의 변형 단백질 가수분해 부위를 갖는 Cry1A 및 Cry3A와 같은 Cry 단백질; 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0064710의 바실루스 써린지엔시스 균주 VBTS 2528로부터의 Cry1Ac, Cry2Aa 및 Cry1Ca 독소 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 Cry 단백질은 당업자에게 주지되어 있다. N. Crickmore, et al., "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," Microbiology and Molecular Biology Reviews," (1998) Vol 62: 807-813 참조; "www" 접두사를 사용하여 전세계 웹에 접근할 수 있는 btnomenclature.info에서 N. Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2016) 참조.
유전자 변형 식물 형질로서 Cry 단백질의 사용은 당업자에게 주지되어 있고 CrylAc, Cry1Ac+Cry2Ab, CrylAb, CrylA.105, CrylF, Cry1Fa2, CrylF+CrylAc, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c and CBI-Bt를 발현하는 식물을 포함하나 이에 제한되지 않는 Cry-유전자 변형 식물은 규제 승인을 받았다. "www" 접두사를 사용하여 전세계 웹에 접근할 수 있는 cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database의 Sanahuja et al., "Bacillus thuringiensis: a century of research, development and commercial applications," (2011) Plant Biotech. Journal, April 9(3):283-300 and the CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. 참조. 당업계에 주지된 하나 이상의 살충 단백질은 Vip3Ab & CrylFa (US2012/0317682); CrylBE & CrylF (US2012/0311746); CrylCA & CrylAB (US2012/ 0311745); CrylF & CryCa (US2012/0317681); CrylDa& CrylBe (US2012/0331590); CrylDA & CrylFa (US2012/ 0331589); CrylAb & CrylBe (US2012/0324606); CrylFa & Cry2Aa 및 Cry1I & CrylE (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab and Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/ VCry35Ab & Cry3Aa (US20130167268); CrylAb & CrylF (US20140182018); 및 Cry3A 및 CrylAb 또는 Vip3Aa (US20130116170)와 같은 식물에서 발현될 수 있다. 살충 단백질은 또한 미국 특허 7,491,869의 지질 아실 가수분해효소 및 스트렙토마이세스(Purcell et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 15:1406-1413)와 같은 콜레스테롤 산화효소를 포함하는 곤충 리파아제를 포함한다.
살충 단백질 - Vips
살충 단백질은 또한 Vip(식물성 살충 단백질) 독소를 포함한다.
당업계에 기술된 바와 같이, "병원성 박테리아는 봉입체 또는 기생충 결정체(상기 Cry 및 Cyt 단백질과 같은)에 축적된 살충 단백질뿐만 아니라 배양 배지로 분비되는 살충 단백질을 생성한다. 이중에서 후자는 아미노산 동일성에 따라 4 가지 패밀리로 나뉘는 Vip 단백질이다. Vip1 및 Vip2 단백질은 이원 독소로서 작용하며 콜로프테라 및 헤미프테라의 일부 구성원에게 독성이 있다. Vip1 성분은 곤충 중장의 막에서 수용체에 결합하는 것으로 생각되며, Vip2 성분은 세포로 들어가서 액틴에 대한 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 나타내어 미세필라멘트 형성을 방지한다. Vip3는 Vip1 또는 Vip2와 서열 유사성이 없으며 나비목 구성원의 다양한 품종에 유독하다. Vip3A 단백질은 Cry 단백질과의 결합 부위를 공유하지 않지만, 이의 작용 방식은 단백질 가수 분해 활성화, 중장 상피 막에 대한 결합 및 기공 형성의 관점에서 Cry 단백질의 그것과 유사한 것으로 나타났다. 후자의 특성은 형질전환 식물(바실루스 써린지엔스-처리 작물[Bt 작물])에서 Cry 단백질과 결합하여 곤충 저항성을 예방하거나 지연시키고 살충 스펙트럼을 넓힐 수 있는 좋은 후보가 된다. Cry 단백질과 조합하여 Vip3Aa 단백질을 발현하는 Bt 면화 및 Bt 옥수수의 상업적으로 재배된 품종이 있다. 가장 최근에 보고된 Vip4 패밀리의 경우, 아직 표적 곤충이 발견되지 않았다. Chakroun et al., "Bacterial Vegetative Insecticidal Proteins (Vip) from Entomopathogenic Bacteria," Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2016 Mar 2;80(2):329-350 참조.
VIP는 미국 특허 5,877,012, 6,107,279 6,137,033, 7,244,820, 7,615,686, 및 8,237,020 등에서 발견될 수 있다. 다른 VIP 단백질은 당업자에게 주지되어 있다("www" 접두사를 사용하여 전세계 웹에서 접근할 수 있는 lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html 참조).
살충 단백질 - 독소 복합체(TC) 패밀리 단백질
살충 단백질은 또한 제노하브더스(Xenorhabdus), 포토하브더스(Photorhabdus) 및 페니바실러스(Paenibacillus)와 같은 유기체로부터 얻을 수 있는 독소 복합체(TC) 단백질을 포함한다(미국 특허 7,491,698 및 8,084,418 참조). 일부 TC 단백질은 "독립" 살충 활성을 가지며 다른 TC 단백질은 동일한 주어진 유기체에 의해 생산된 독립 독소의 활성을 향상시킨다. "독립형" TC 단백질(예를 들어 제노하브더스, 포토하브더스 및 페니바실러스)의 독성은 다른 속의 출처 유기체로부터 유래된 하나 이상의 TC 단백질 "증강제"에 의해 향상될 수 있다. 3개의 주요 유형의 TC 단백질이 존재한다. 본 발명에 언급된 바와 같이, 부류 A 단백질 ("단백질 A")은 독립형 독소이다. 부류 B 단백질("단백질 B") 및 부류 C 단백질("단백질 C")은 부류 A 단백질의 독성을 향상시킨다. 부류 A 단백질의 예는 TcbA, TcdA, XptAl 및 XptA2이다. 부류 B 단백질의 예는 TcaC, TcdB, XptB1Xb 및 XptClWi이다. 부류 C 단백질의 예는 TccC, XptClXb 및 XptB1 Wi이다. 살충 단백질은 또한 거미, 뱀 및 전갈 독 단백질을 포함한다. 거미 독 펩타이드의 예는 리코톡신-1 펩타이드 및 이의 돌연변이체를 포함하나 이에 제한되지 않는다(미국 특허 8,334,366).
살충 단백질 - 조합
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 살충 단백질의 조합을 이용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 단백질이 감수성 곤충 종에서 발견되는 특정 수용체만을 표적으로 하기 때문에, Cry 단백질은 모든 일반적인 농업 해충에 대해 유용성이 제한적이라고 알려져 있다. 결과적으로, 본 발명에 교시된 바와 같이 새로운 살충 단백질과 함께 Cry를 발현시킴으로써, 식물 종은 더 광범위한 부류의 곤충에 대한 보호를 확장시킬 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 교시된 바와 같은 신규 살충 단백질을 생산하는 조작된 식물 종을 고려하며, 상기 식물 종과 함께 하나 이상의 다른 살충 단백질, 예를 들어 모나리신, PIP, Cry, Cyt, VIP, TC 및 이들의 조합을 발현한다.
발견된 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자
본 발명의 한 양태는 살충 폴리펩타이드, 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 핵산 서열, 및 서열 상동성 영역을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 동정하기 위해 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 분자를 포함하는 단리 또는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, 재조합 DNA, cDNA, 게놈 DNA, 플라스스티드 DNA, 미토콘드리아 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수있다.
"분리된" 핵산 분자(또는 DNA)는 본 발명에서 더 이상 자연 환경에 있지 않은, 예를 들어 시험관 내의 핵산 서열(또는 DNA)을 지칭하기 위해 본 발명에서 사용된다. "재조합" 핵산 분자(또는 DNA)는 본 발명에서 재조합 박테리아 또는 식물 숙주 세포에 있는 핵산 서열(또는 DNA)을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시태양에서, "분리된" 또는 "재조합" 핵산은 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연스럽게 핵산을 플랭크하는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없다. 본 발명의 목적 상, 핵산 분자를 지칭하는 데 사용될 때 "분리된" 또는 "재조합"은 분리된 염색체를 배제한다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 본 발명의 살충 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자는 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연스럽게 핵산 분자를 플랭크하는 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만의 핵산 서열을 함유할 수 있다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 천연 또는 게놈 핵산 서열과 비교하여 핵산 서열에서 하나 이상의 변화를 갖는다. 일부 실시태양에서, 천연 또는 게놈 핵산 서열의 변화는 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 핵산 서열의 변화; 천연 또는 게놈 서열과 비교하여 아미노산 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가로 인한 핵산 서열의 변화; 하나 이상의 인트론의 제거; 하나 이상의 상류 또는 하류 조절 영역의 결실; 및 게놈 핵산 서열과 관련된 5' 및/또는 3' 비번역 영역의 결실을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 비-게놈 서열이다.
본 발명의 살충 단백질을 암호화하는 다양한 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 적합한 프로모터, 전사 종결 및/또는 폴리아데 닐화 서열에 작동 가능하게 연결된 경우 숙주 세포에서 살충 단백질의 생산에 유용하다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 또한 추가 살충 단백질을 암호화하는 상동성 또는 실질적으로 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 분리하기 위한 프로브로서 유용하다.
본 발명의 살충 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 개시된 서열로부터 새로 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 유전자의 서열은 유전 코드를 사용하여 개시된 단백질 서열로부터 추론될 수 있다. "BackTranslate"(GCG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, Calif.)와 같은 컴퓨터 프로그램은 펩타이드를 펩타이드를 암호화하는 상응하는 뉴클레오타이드 서열로 변환할 수 있다.
또한, 본 발명의 합성 폴리뉴클레오타이드 서열은 식물에서 발현되도록 디자인될 수 있다. 미국 특허 5,500,365는 합성된 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현 수준을 향상시키기 위해 식물 유전자를 합성하는 방법을 기술한다. 이 방법은 외인성 이식유전자의 구조적 유전자 서열을 변형하여 식물에 의해 보다 효율적으로 전사, 처리, 번역 및 발현되게 한다. 식물에서 잘 발현되는 유전자의 특징은 살충 단백질의 독성 부분의 아미노산 서열을 실질적으로 유지하면서 유전자 전사체의 암호화 영역에서 원하지 않는 인트론 스플라이싱 또는 폴리아데닐화를 유발할 수 있다. 외떡잎 식물에서 유전자이식의 향상된 발현을 얻기 위한 유사한 방법이 미국 특허 5,689,052에 개시되어 있다. "보체"는 소정의 핵산 서열과 혼성화되어 안정한 이중체를 형성할 수 있도록 소정의 핵산 서열에 충분하게 상보적인 핵산 서열을 지칭하기 위해 본 발명에 사용된다. "폴리뉴클레오타이드 서열 변이체"는 유전 코드의 축퇴성을 제외하고 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 지칭하기 위해 본 발명에 사용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 비-게놈 핵산 서열이다. 본 발명에 사용된 바와 같이 "비-게놈 핵산 서열" 또는 "비-게놈 핵산 분자"는 천연 또는 게놈 핵산 서열과 비교하여 핵산 서열에서 하나 이상의 변화를 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 천연 또는 게놈 핵산 분자에 대한 변화는 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 핵산 서열의 변화; 식물에서 발현을 위한 핵산 서열의 코돈 최적화; 천연 또는 게놈 서열과 비교하여 아미노산 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가로 인한 핵산 서열의 변화; 게놈 핵산 서열과 관련된 하나 이상의 인트론의 제거; 하나 이상의 이종성 인트란스의 삽입; 하나 이상의 이종성 상류 또는 하류 조절 영역의 삽입; 게놈 핵산 서열과 관련된 5' 및/또는 3' 비 번역 영역의 결실; 이종성 5' 및/또는 3' 비번역 영역의 삽입; 및 폴리아데딜화 부위의 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 비-게놈 핵산 분자는 cDNA이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에서 교시된 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 이의 단편 및 이의 조합을 갖는 본 발명에서 교시된 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 교시한다.
또한, 궁극적으로 기능성 살충 단백질을 생산하기 위해 후속적으로 스플라이 싱되는 전사 및/또는 번역 산물을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 스플라이싱은 시험관 내 또는 생체 내에서 달성될 수 있으며, 시스-또는 트랜스-스플라이싱을 포함할 수 있다. 스플라이싱을 위한 기질은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNA 전 사체) 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 시스-스플라이싱의 예는 암호화 서열에 삽입된 인트론이 제거되고 2개의 플랭킹 엑손 영역이 스플라이 싱되어 살충 단백질 암호화 서열을 생성하는 경우이다. 트랜스-스플라이싱의 예는 개별적으로 전사되고 스플라이스되어 전장 살충 단백질 암호화 서열을 형성할 수 있다. 구조체에 도입될 수 있는 스플라이싱 인핸서 서열의 사용은 시스에서 스플라이싱 또는 폴리 펩타이드의 트랜스-스플라이싱을 용이하게 할 수 있다(미국 특허 6,365,377 및 6,531,316). 따라서, 일부 실시태양에서 폴리뉴클레오타이드는 전장 살충 단백질을 직접 암호화하지 않고 오히려 동일한 한 단편 또는 단편들을 암호화한다.
살충 단백질을 암호화하는 전술한 서열의 단편인 핵산 분자는 실시태양에 포함된다. 본 발명에 사용된 "단편"은 살충 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 일부를 지칭한다. 핵산 서열의 단편은 단백질의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수 있거나 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로 사용될 수있는 단편일 수 있다. 핵산 서열의 단편인 핵산 분자는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드, 또는 본 발명에 교시된 살충 단백질을 암호화하는 전장 핵산 서열에 존재하는 뉴클레오타이드의 최대 숫자를 포함한다. "인접 뉴클레오타이드"는 본 발명에서 사용되어 서로 바로 인접한 뉴클레오타이드 잔기를 지칭한다. 실시태양의 핵산 서열의 단편은 살충 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 단백질 단편을 암호화할 것이다. 일부 실시태양에서, 핵산 서열의 단편은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 또는 그 이상의 인접 아미노산, 또는 본 발명에 교시된 살충 단백질을 암호화하는 전장 핵산 서열에 존재하는 아미노산의 최대 숫자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 단편은, 예를 들어, 단백질 분해, 시작 코돈의 삽입, 정지 코돈의 동시 삽입과 함께 결실된 아미노산을 암호화하는 코돈의 결실, 암호화 서열에 정지 코돈의 삽입에 의한 본 발명에 교시된 살충 단백질에 비해 N-말단 및/또는 C-말단으로부터의 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단 절단이다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 71의 핵산 서열과 충분하게 유사한 핵산 서열에 의해 암호화된다. "충분하게 유사한"은 본 발명에서 표준 매개 변수를 사용하여 본 발명에 기술되거나 당업자에게 공지된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교한 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가진 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭하도록 사용된다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 71의 핵산 서열과 충분한 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다. "충분한 서열 동일성"은 본 발명에서 표준 매개 변수를 사용하여 본 발명에 기술되거나 당업자에게 공지된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교한 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가진 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭하도록 사용된다.
동일성 백분율 계산
당업자는 상기 값이 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 등을 고려함으로써 2개의 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질의 상응하는 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해 적절하게 조정될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, 서열 동일성은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전장 서열에 대한 것이다. 일부 실시태양에서, 서열 동일성은 모든 디폴트 파라미터를 갖는 Vector NTI® 프로그램 스위트(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)의 ALIGNX® 모듈에서 ClustalW 알고리즘을 사용하여 계산된다. 일부 실시태양에서, 서열 동일성은 모든 디폴트 파라미터를 갖는 벡터 NTI 프로그램 스위트(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)의 ALIGNX 모듈에서 ClustalW 알고리즘을 사용하여 계산된 폴리펩타이드의 전장에 걸쳐있다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다(즉, 동일성 백분율 = 동일 위치 수/전체 위치 수(예를 들어, 중첩 위치) x l00). 한 실시태양에서, 두 서열은 동일한 길이이다. 또 다른 실시태양에서, 비교는 참조 서열 전체에 걸친 것이다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 간격을 허용하거나 허용하지 않고 아래에 설명된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 비율을 계산할 때 일반적으로 정확한 일치가 계산된다.
두 서열(핵산 또는 아미노산) 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 비 제한적인 예는 Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서 변형된 바와 같이 Karlin and Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 실시태양의 살충 핵산 분자에 상동성인 핵산 서열을 얻기 위해 BLASTN 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 실시태양의 살충 핵산 분자에 상동성인 핵산 서열을 얻기 위해 BLASTX 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 간격 정렬을 얻기 위해, Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST(BLAST 2.0에서)이 사용될 수 있다. 선택적으로, PSI-Blast는 분자 간의 먼 관계를 감지하는 반복 검색을 수행하도록 사용될 수 있다. Altschul, et al., (1997) supra 참조. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 기본 매개 변수(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)를 사용될 수 있다. 정렬은 검사를 통해 수동으로 수행될 수도 있다.
서열 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비 제한적인 예는 ClustalW 알고리즘이다(Higgins, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22 : 4673-4680). ClustalW는 서열을 비교하고 아미노산 또는 DNA 서열 전체를 정렬함으로써 전체 아미노산 서열의 서열 보존에 대한 데이터를 제공할 수 있다. ClustalW 알고리즘은 Vector NTI® Program Suite(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)의 ALIGNX® 모듈과 같은 여러 상용 DNA/아미노산 분석 소프트웨어 패키지에서 사용된다. 아미노산 서열을 ClustalW와 정렬한 후, 아미노산 동일성 백분율이 평가될 수 있다. ClustalW 정렬 분석에 유용한 소프트웨어 프로그램의 비 제한적인 예는 GENEDOC™이다. GENE-DOC™(Karl Nicholas)은 여러 단백질 간의 아미노산(또는 DNA) 유사성과 동일성을 평가할 수 있다. 서열 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비 제한적인 예는 Myers and Miller, (1988) CABIOS 4 : 11-17의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10 (Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, Calif., USA)의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 간격 길이 패널티 및 4의 간격 패널티가 사용될 수 있다.
서열 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비 제한적인 예는 Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48 (3):443-453의 알로리즘이며, GAP 버전 10 소프트웨어를 사용하여 다음 디폴트 파라미터: GAP 가중치 50 및 길이 가중치 3을 사용하는 핵산 서열에 대한 % 동일성 및 유사성 %; GAP 가중치 8 및 길이 가중치 2를 사용한 아미노산 서열에 대한 % 동일성 또는 % 유사성 및 BLOSUM62 점수 프로그램을 사용하여 서열 동일성 또는 유사성을 결정한다. 동등한 프로그램도 사용될 수 있다. 따라서, 문제의 임의의 두 서열에 대해, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 일치하는 정렬을 생성하고 서열 동일성 백분율을 계산하는 임의의 서열 비교 프로그램이 사용될 수 있다.
핵산 분자 변이체
본 발명은 살충 단백질 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 서열을 암호화하는 "변이체"는 본 발명에 개시된 살충 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있지만, 유전 코드의 축퇴성 및 상기 논의된 바와 같이 충분히 동일한 것들로 인해 보존적으로 상이한 서열을 포함할 수 있다. 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 잘 알려진 분자 생물학 기술과 아래에 요약된 혼성화 기술을 사용하여 동정될 수 있다. 변이체 핵산 서열은 또한 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 생성되었지만 여전히 개시된 살충 단백질을 암호화하는 합성 유래 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 살충 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 본 발명의 단백질을 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 표 A는 각 아미노산에 대한 동의어 코돈을 제공하는 코돈 표이다. 예를 들어, 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG 및 CGU는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 특정되는 본 발명의 핵산의 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변경하지 않고 상기 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. RNA 서열의 U는 DNA 서열의 T에 해당하는 것으로 이해된다.
유사한 코돈 표
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당업자는 핵산 서열의 돌연변이에 의해 변화가 도입되어 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않고 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변화시킬 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 따라서, 변이체 핵산 분자는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 추가 및/또는 결실을 본 발명에 개시된 상응하는 핵산 서열에 도입함으로써 생성될 수 있으며, 이에 따라 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 암호화 된 단백질에 도입된다. 돌연변이는 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 이러한 변이체 핵산 서열은 또한 본 발명에 포함된다.
대안적으로, 변이체 핵산 서열은 포화 돌연변이 유발과 같이 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입함으로써 만들어질 수 있으며, 생성된 돌연변이는 활성을 유지하는 돌연변이를 동정하기 위해 살충 활성을 부여하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 유발 후, 암호화된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있으며 단백질의 활성은 표준 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 그의 단편은 예를 들어, Ausubel, Berger 및 Sambrook에 제시된 바와 같은 표준 클로닝 방법에 더하여 다양한 재조합 및 반복적 재조합 반응을 위한 기질로서 선택적으로 사용되어, 즉, 원하는 특성을 가진 살충 단백질 동족체 및 이의 단편을 생산한다. 이러한 다양한 반응이 알려져 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드를 제 2 (또는 그 이상의) 폴리뉴클레오타이드와 재귀 적으로 재조합하여 변이체 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 형성하는 것을 포함하여 본 발명에 열거된 임의의 핵산의 변이체를 생산하는 방법은 또한 본 발명의 실시태양이며, 생산된 라이브러리, 라이브러리를 포함하는 세포 및 이러한 방법에 의해 생성된 임의의 재조합 폴리뉴클레오타이드도 본 발명의 실시태양이다.
핵산 재귀적 재조합 프로토콜을 포함하는 다양한 다양성 생성 프로토콜이 이용 가능하며 당업계에 완전히 설명되어있다. 절차는 암호화된 단백질의 변이체뿐만 아니라 핵산의 하나 이상의 변이체 또는 핵산 세트를 생성하기 위해 개별적으로 및/또는 조합하여 사용될 수 있다. 개별적으로 및 집합적으로, 이러한 절차는, 예를 들어, 새롭고 및/또는 개선된 특징을 가진 핵산, 단백질, 경로, 세포 및/또는 유기체의 조작 또는 신속한 진화에 유용한 다양한 핵산 및 핵산 세트(예를 들어, 핵산 라이브러리 포함)를 생성하는 강력하고 광범위하게 적용 가능한 방법을 제공한다.
명확성을 위해 후속 논의 과정에서 구별 및 분류가 이루어지지만, 기술은 종종 상호 배타적이지 않음을 이해할 것이다. 실제로, 다양한 서열 변이체에 접근하기 위해 다양한 방법이 단독으로 또는 조합하여, 병렬 또는 직렬로 사용될 수 있다.
본 발명에 기술된 임의의 다양성 생성 절차의 결과는 바람직한 특성을 갖거나 부여하는 핵산에 대해 선택 또는 스크리닝될 수 있거나 바람직한 특성을 갖거나 부여하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산의 생성일 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 방법 또는 당업자에게 달리 이용 가능한 하나 이상의 방법에 의한 다양화 후, 생산되는 임의의 핵산은 원하는 활성 또 특성, 예를 들어, 살충 활성을 위해 선택될 수 있다. 이것은 예를 들어, 자동화 또는 자동화 가능한 형식으로, 기술 분야의 임의의 분석에 의해 검출될 수 있는 임의의 활성을 동정하는 것을 포함할 수 있다, 예를 들어, 살충 활성 스크리닝의 논의, 아래 참조. 다양한 관련(또는 관련이 없는) 속성은 실무자의 재량에 따라 직렬 또는 병렬로 평가될 수 있다.
변형된 핵산 서열을 생성하기 위한 다양한 다양성 생성 절차, 예를 들어 살충 활성을 갖는 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 절차에 대한 설명은 다음 간행물 및 본 발명에 인용된 참고 문헌에서 발견된다: Soong, et al., (2000) Nat. Genet. 25(4):436-439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4: 1-4; Ness, et al., (1999) Nat. Biotechnol. l7:893-896; Chang, et al., (1999) Nat. Biotechnol. l7:793-797; Minshull and Stemmer, (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290; Christians, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; Crameri, et al.,(1997) Nat. Biotechnol. 15:436-438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504-4509; Patten, et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:724-733; Crameri, et al., (1996) Nat. Med. 2:100-103; Crameri, et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319; Gates, et al., (1996) J. Mol. Biol. 255:373-386; Stemmer,(1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp. 447-457; Crameri and Stemmer, (1995) BioTechniques 18: 194-195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Biotechnology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391 및 Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747-1075.
다양성을 생성하는 돌연변이 방법은, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발(Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2): 157-178; Dale, et al., (1996) Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith, (1985) Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein and Shortle, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem. J. 237: 1-7 and Kunkel, (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin)); 주형을 함유하는 우라실을 사용하는 돌연변이 유발(Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol. 154:367-382 and Bass, et al., (1988) Science 242:240-245); 올리고뉴클레오타이드 지정 돌연변이 유발(Zoller and Smith, (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller and Smith, (1987) Methods Enzymol. 154:329-350 (1987); Zoller and Smith, (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-6500), phosphorothioate-modified DNA mutagenesis (Taylor, et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:8749-8764; Taylor, et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:8765-8787 (1985); Nakamaye and Eckstein, (1986) Nucleic Acids Res. 14:9679-9698; Sayers, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:791-802 and Sayers, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:803-814); 간격 이중체 DNA를 사용하는 돌연변이 유발(Kramer, et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:9441-9456; Kramer and Fritz, (1987) Methods Enzymol. 154:350-367; Kramer, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:7207 및 Fritz, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:6987-6999)을 포함한다.
추가의 적절한 방법은 점 불일치 손상(Kramer, et al., (1984) Cell 38:879-887), 복구 결핍 숙주 균주를 사용하는 돌연변이 유발(Carter, et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 and Carter, (1987) Methods in Enzymol. 154:382-403), 결실 돌연변이 유발(Eghtedarzadeh and Henikoff, (1986) Nucleic Acids Res. 14: 5115), 제한-선택 및 제한-정제(Wells, et al., (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A317:415-423), 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발(Nambiar, et al., (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar and Khorana, (1988) Nucleic Acids Res. 14:6361-6372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315-323 and Grundstriim, et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:3305-3316), 이중 가닥 파괴 복구(Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7177-7181 and Arnold, (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:450-455)를 포함한다. 여러 상기 방법에 대한 추가 세부 내용은 Methods Enzymol Volume 154에서 찾을 수 있으며, 이는 또한 다양한 돌연변이 유발 방법으로 트러블 슈팅(trouble-shooting) 문제를 위한 유용한 컨트롤을 기술한다.
다양한 다양성 생성 방법에 관한 추가 세부 내용은 다음 미국 특허, PCT 공개공보 및 출원 및 EPO 공개공보에서 발견될 수 있다: 미국 특허 5,723,323, 미국 특허 5,763,192, 미국 특허 5,814,476, 미국 특허 5,817,483, 미국 특허 5,824,514, 미국 특허 5,976,862, 미국 특허 5,605,793, 미국 특허 5,811,238, 미국 특허 5,830,721, 미국 특허 5,834,252, 미국 특허 5,837,458, WO 1995/22625, WO 1996/33207, WO 1997/20078, WO 1997/35966, WO 1999/41402, WO 1999/41383, WO 1999/41369, WO 1999/41368, EP 752008, EP 0932670, WO 1999/23107, WO 1999/21979, WO 1998/31837, WO 1998/27230, WO 1998/27230, WO 2000/00632, WO 2000/09679, WO 1998/42832, WO 1999/29902, WO 1998/41653, WO 1998/41622, WO 1998/42727, WO 2000/18906, WO 2000/04190, WO 2000/42561, WO 2000/42559, WO 2000/42560, 및 WO 2001/23401.
관련 핵산을 찾기 위한 핵산 분자 프로브
실시태양의 뉴클레오타이드 서열은 또한 다른 유기체, 특히 다른 박테리아, 특히 슈도모나스 종으로부터 상응하는 서열을 분리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, PCR, 혼성화 등과 같은 방법은 본 발명에 제시된 서열에 대한 서열 상 동성을 기반으로 이러한 서열을 동정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 제시된 전체 서열 또는 이의 단편에 대한 서열 동일성에 기초하여 선택되는 서열은 실시태양에 포함된다. 이러한 서열은 개시된 서열의 오르쏘로그인 서열을 포함한다. 용어 "오르쏘로그"는 공통 조상 유전자에서 유래하고 종 분화의 결과로 다른 종에서 발견되는 유전자를 의미한다. 다른 종에서 발견된 유전자는 이들의 뉴클레오타이드 서열 및/또는 이들의 암호화된 단백질 서열이 본 발명의 다른 곳에서 정의된 실질적인 동일성을 공유할 때 오르쏘로그로 간주된다. 오르쏘로그의 기능은 종종 종들 사이에서 매우 보존된다.
PCR 접근법에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 관심 유기체로부터 추출 된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터 상응하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 PCR 반응에 사용하도록 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하는 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며 Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY), 이하에서 "Sambrook"에 개시되어 있다. 또한, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) 참조. 공지된 PCR 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 중첩된 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴된 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적으로 일치하지 않는 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
세균 수집물로부터 본 발명의 살충 단백질을 동정하기 위해, 박테리아 세포 용해물은 웨스턴 블롯팅 및/또는 ELISA 방법을 사용하여 교시된 단백질에 대해 생성된 항체로 스크리닝될 수 있다. 이러한 유형의 분석은 고 처리량 방식으로 수행될 수 있다. 양성 샘플은 항체 기반 단백질 정제 및 동정과 같은 다양한 기술로 추가로 분석될 수 있다. 항체를 생성하는 방법은 아래에서 논의되는 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
대안적으로, 질량 분석 기반 단백질 동정 방법은 문헌의 프로토콜을 사용하여 교시된 단백질의 상동체를 동정하는 데 사용될 수 있다(Scott Patterson, (1998), 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology published by John Wiley & Son Inc). 구체적으로, LC-MS/MS 기반 단백질 동정 방법을 사용하여 주어진 세포 용해물 또는 원하는 분자량이 풍부한 샘플(관련 분자량 밴드의 SDS-PAGE 겔에서 본 발명에 교시된 단백질로 절제됨)의 MS 데이터를 교시된 단백질과 동족체의 서열 정보와 연관시킬 수 있다. 펩타이드 서열의 일치는 샘플에서 상동체를 가질 가능성을 나타낸다. 추가 기술(단백질 정제 및 분자 생물학)을 사용하여 단백질을 분리하고 상동체의 서열을 동정할 수 있다.
혼성화 방법에서, 살충 핵산 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이러한 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며 상기 Sambrook and Russell (2001)에 개시되어 있다. 소위 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편 또는 기타 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며 32P와 같은 검출 가능한 그룹 또는 기타 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조 인자와 같은 임의의 다른 검출 가능한 마커로 표지화될 수 있다. 혼성화를 위한 프로브는 본 발명에 개시된 공지된 펩타이드-암호화 핵산 서열에 기초하여 합성 올리고뉴클레오타이드를 표지함으로써 제조될 수 있다. 보존된 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열 또는 암호화된 아미노산 서열에서 아미노산 잔기를 기반으로 디자인된 축퇴 프라이머가 추가로 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 엄격한 조건 하에서 본 발명의 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 핵산 서열의 적어도 약 12, 적어도 약 25, 적어도 약 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200개의 연속적인 뉴클레오티드에 혼성화하는 핵산 서열의 영역을 포함한다. 혼성화를 위한 프로브의 제조 방법은 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며 본 발명에 참조로 포함된 상기 Sambrook and Russell, (2001)에 개시된다.
예를 들어, 본 발명에서 교시된 살충 단백질을 암호화하는 전체 핵산 서열, 또는 이의 하나 이상의 부분은 유사 서열 및 메신저 RNA를 암호화하는 상응하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브로서 사용될 수 있다. 다양한 조건 하에서 특이적 혼성화를 달성하기 위해, 이러한 프로브는 고유하고 바람직하게는 길이가 적어도 약 10개 뉴클레오타이드 또는 적어도 약 20개 뉴클레오타이드인 서열을 포함한다. 이러한 프로브는 PCR에 의해 선택된 유기체로부터 상응하는 살충 서열을 증폭하는 데 사용될 수 있다. 이 기술은 원하는 유기체로부터 추가 암호화 서열을 분리하는 데 사용될 수 있거나 유기체에서 암호화 서열의 존재를 결정하기 위한 진단 분석으로서 사용될 수 있다. 혼성화 기술은 플레이트된 DNA 라이브러리의 혼성화 스크리닝을 포함한다(플라크 또는 콜로니; 예를 들어, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조).
이러한 서열의 혼성화는 엄격한 조건 하에서 수행될 수 있다. "엄격한 조건"또는 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 다른 서열보다 검출 가능하게 더 큰 정도로 (예를 들어, 배경에 대해 적어도 2배) 그의 표적 서열에 혼성화할 조건을 지칭하기 위해 본 발명에서 사용된다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 상이한 상황에 따라 다를 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격성을 제어함으로써, 프로브에 100% 상보적인 표적 서열이 동정될 수 있다(상동 프로빙). 대안적으로, 더 낮은 유사성이 검출되도록 (이종 프로빙) 서열에서 일부 불일치를 허용하도록 엄격성 조건이 조정될 수 있다. 일반적으로, 프로브는 길이가 약 1000개 뉴클레오타이드 미만, 바람직하게는 길이가 뉴클레오타이드 500개 미만이다.
전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5M Na 이온 미만, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도(또는 기타 염)이고 온도는 약 짧은 프로브(예를 들어, 10개 내지 50개 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 30℃ 및 긴 프로브(예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드와 같은 불안정화제를 첨가하여 달성될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건은 30 내지 35% 포름아마이드, 1M NaCl, 37℃에서 1% SDS(sodium dodecyl sulphate)의 완충 용액에 의한 혼성화 및 50 내지 55℃에서 1x 내지 2xSSC(20xSSC = 3.0M NaCl/0.3M 트라이소듐 시트레이트)의 세척을 포함한다. 예시적인 중간 엄격한 조건은 40 내지 45% 포름아마이드, 1.0M NaCl, 37℃에서 1% SDS의 혼성화 및 55 내지 60℃에서 0.5x 내지 1xSSC의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격한 조건은 50% 포름아마이드, 1M NaCl, 37℃에서 1% SDS의 혼성화 및 60 내지 65℃에서 0.1xSSC의 세척을 포함한다. 선택적으로 세척 완충액은 약 0.1% 내지 약 1% SDS를 포함할 수 있다. 혼성화 기간은 일반적으로 약 24시간 미만, 일반적으로 약 4 내지 약 12시간이다.
특이성은 전형적으로 혼성화 후 세척의 함수이며, 중요한 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. DNA-DNA 혼성화의 경우, Tm은 Meinkoth and Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-284의 방정식에서 근사될 수 있다: Tm = 81.5℃ + 16.6(log M) +0.41(% GC)-0.61(% 형태)-500/L; 여기서 M은 1가 양이온의 몰 농도, % GC는 DNA에서 구아노신 및 시토신 뉴클레오타이드의 백분율, % 형태는 혼성화 용액에서 포름아마이드의 백분율, L은 염기쌍의 혼성체 길이이다. Tm은 상보적 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 프로브에 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 아래)이다. Tm은 1%의 불일치에 대해 약 1℃ 감소된다; 따라서, Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건은 원하는 동일성의 서열에 혼성화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 90% 동일성을 가진 서열을 찾는 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 이의 보체에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 그러나, 매우 엄격한 조건은 열 융점(Tm)보다 낮은 1, 2, 3 또는 4℃에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다; 적당히 엄격한 조건은 열 융점(Tm)보다 낮은 6, 7, 8, 9 또는 10℃에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다; 낮은 엄격한 조건은 열 융점(Tm)보다 낮은 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 원하는 Tm을 사용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격성의 변화가 본질적으로 설명된다는 것을 이해할 것이다. 원하는 정도의 불일치가 45℃(수용액) 또는 32℃(포름아마이드 용액) 미만의 Tm을 초래하는 경우, 더 높은 온도를 사용할 수 있도록 SSC 농도를 높이는 것이 바람직하다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 가이드가 Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, N.Y.); and Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)에서 발견된다. Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 참조.
새로 발견된 살충 단백질, 변이체 및 이의 단편
신규 살충 단백질이 상기 단백질의 변이체 및 이의 단편과 함께 본 발명에 개시되어 있다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 두 용어 사이의 분리가 단순히 아미노산 서열의 수에 의존할 수 있다는 것이 당업계에서 이해되기 때문에 일부 경우 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 살충 단백질은 하나 이상의 곤충 또는 해충에 대한 살충 또는 농약 활성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열에 충분하게 상동성이다. "충분히 상동성"은 본 발명에서 표준 매개 변수를 사용하여 본 발명에 기술되거나 당업자에게 공지된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교한 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭하는 데 사용된다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열에 충분한 서열 동일성을 가진다. "충분한 서열 동일성"은 본 발명에서 표준 매개 변수를 사용하여 본 발명에 기술되거나 당업자에게 공지된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교한 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭하는 데 사용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 71의 핵산 서열에 의해 암호화되는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질", "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자는 번역 후 변형, 예를 들어 이황화 결합 형성, 글리코실화, 인산화 또는 올리고머화와 같은 변형을 겪을 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "단백질", "펩타이드 분자" 또는 "폴리펩타이드"는 임의의 생물학적 또는 비 생물학적 과정에 의해 변형된 임의의 단백질을 포함한다.
"재조합 단백질"은 더 이상 자연 환경이 아닌, 예를 들어 시험관 내 또는 재조합 박테리아 또는 식물 숙주 세포에 있는 단백질을 지칭하기 위해 본 발명에서 사용된다. 세포 물질이 실질적으로 없는 살충 단백질은 약 30%, 20%, 10% 또는 5% (건조 중량 기준) 미만의 비 살충 단백질(본 발명에서 "오염 단백질"이라고도 함)을 갖는 단백질 제제를 포함한다.
"단편" 또는 "생물학적 활성 부분"은 본 발명에서 교시된 단백질과 충분히 동일하고 살충 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편을 포함한다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72에 개시된 아미노산 서열의 단편을 고려한다.
일부 실시태양에서, 단백질 단편은, 예를 들어, 단백질 분해, 시작 코돈의 삽입, 정지 코돈의 동시 삽입과 함께 결실된 아미노산을 암호화하는 코돈의 결실, 암호화 서열에 정지 코돈의 삽입에 의해, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72에 비해 N-말단 및/또는 C-말단으로부터의 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 절단이다.
본 발명에 사용된 "변이체"는 부모 아미노산 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
핵산 또는 아미노산의% 서열 동일성과 관련하여 본 발명에서 사용되는 용어 "약"은 0.1% 증분으로 ±1.0% 이하를 의미한다. 예를 들어, "약 90%" 서열 동일성은 89.0%, 89.1%, 89.2%, 89.3%, 89.4%, 89.5%, 89.6%, 89.7%, 89.8%, 89.9%, 90%, 90.1%, 90.2%, 90.3%, 90.4%, 90.5%, 90.6%, 90.7%, 90.8%, 90.9%, 및 91%를 포함한다. 서열 동일성 %의 맥락에서 사용되지 않는 경우 "약"은 ±10%를 의미한다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열의 전장을 가로질러 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다.
일부 실시태양에서, 살충 단백질은 변형된 물리적 특성을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 용어 "물리적 특성"은 단백질의 물리적-화학적 특성을 설명하는 데 적합한 임의의 매개 변수를 의미한다. 본 발명에서 사용된 "관심 물리적 특성" 및 "관심 특성"은 조사 및/또는 변형되는 단백질의 물리적 특성을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 물리적 특성의 예는 단백질 표면의 순 표면 전하 및 전하 분포, 단백질 표면의 순 소수성 및 소수성 잔류물 분포, 표면 전하 밀도, 표면 소수성 밀도, 표면 이온화 가능 그룹의 총 수, 표면 장력, 단백질 크기 및 용액에서의 분포, 용융 온도, 열용량 및 2차 바이리얼 계수를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 물리적 특성의 예는 또한 용해도, 접힘, 안정성 및 분해성을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 교시된 살충 단백질은 곤충 장에서 단백질 분해 단편의 증가된 분해성을 갖는다. 모방된 위액에 의한 소화를 위한 모델은 당업자에게 공지되어 있다(Fuchs, R. L. and J. D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J. D., et al Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu T J et al J. Agric. Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).
일부 실시태양에서, 변이체는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열이 상이한 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명에 포함되는 변이체 단백질은 생물학적으로 활성이며, 즉 이들은 천연 단백질의 원하는 생물학적 활성(즉, 살충 활성)을 계속 보유한다. 일부 실시태양에서, 변이체는 천연 단백질의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 살충 활성을 가질 것이다. 일부 실시태양에서, 변이체는 천연 단백질에 비해 개선된 활성을 가질 수 있다.
박테리아 유전자는 오픈 리딩 프레임의 시작 부분에 근접하여 다수의 메티오닌 개시 코돈을 매우 자주 보유한다. 자주, 이러한 시작 코돈 중 하나 이상에서 번역 개시는 기능성 단백질의 생성을 유도할 것이다. 이러한 시작 코돈은 ATG 코돈을 포함할 수 있다. 그러나 바실루스 sp.와 같은 박테리아는 코돈 GTG를 시작 코돈으로 인식하고 GTG 코돈에서 번역을 개시하는 단백질은 첫 번째 아미노산에 메티오닌을 포함한다. 드물게, 박테리아 시스템의 번역은 TTG 코돈에서 개시할 수 있지만, 이 경우 TTG는 메티오닌을 암호화한다. 또한, 이러한 코돈 중 어떤 것이 박테리아에서 자연적으로 사용되는지 선험적으로 결정되지 않는 경우가 많다. 따라서, 대체 메티오닌 코돈 중 하나를 사용하면 살충 단백질이 생성될 수도 있음이 이해된다. 이러한 살충 단백질은 본 발명에 포함되며 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 식물에서 발현될 때, 적절한 번역을 위해 대체 시작 코돈을 ATG로 변경하는 것이 필요함을 이해할 것이다.
다른 양태에서, 살충 단백질은 다단계 번역 후 단백질 스플라이싱을 촉매하는 개재 서열을 갖는 전구체 단백질로서 발현될 수 있다. 단백질 스플라이싱은 새로운 폴리펩타이드를 생성하기 위해 플랭킹 서열의 동시 결합과 함께 폴리펩타이드로부터 개재 서열의 절제를 포함한다(Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22159-22168). 이 개재 서열 또는 단백질 스플라이싱 요소는 인테인(intein)으로 불리며, N-말단 및 C-말단 스플라이스 접합부에서 3개의 조정된 반응을 통해 자신의 절제를 촉매한다: N-말단 시스테인 또는 세린의 아실 재배열; 분지형 에스터 또는 티오에스터 중간체를 형성하는 두 말단 사이의 에스터 교환 반응 및 인테인을 유리화하는 인테인 C-말단 아스파라긴의 고리화와 결합된 펩타이드 결합 절단(Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9091-9094. 단백질 스플라이싱 메커니즘의 해명은 많은 인테인 기반 응용으로 이어졌다(Comb, et al., U.S. Pat. No. 5,496,714; Comb, et al., U.S. Pat. No. 5,834,247; Camarero and Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al.,(1998) Nucleic Acids Res. 26:5109-5115; Chong, et al.,(1998) J. Biol. Chem. 273:10567-10577; Cotton, et al.,(1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al.,(1999) J. Biol. Chem. 274:18359-18363; Evans, et al.,(1999) J. Biol. Chem. 274:3923-3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256-2264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9091-9094; Iwai and Pluckthun, (1999) FEBS Lett. 459:166-172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1-13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 13638-13643; Severinov and Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207: 187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27: 110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889-892; Wu, et al.,(1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231; Wu, et al., (1998b) Biochim. Biophys. Acta 1387:422-432; Xu, et al.,(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592). 식물 유전자이식에 인테인 응용의 경우, Yang, et al.,(Transgene Res. 15:583-593 (2006)) 및 Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375-392 (2005)) 참조.
또 다른 양태에서, 살충 단백질은 전구체 단백질의 인테인이 분할 인테인이라 불리는 2개의 유전자로부터 오는 2개의 개별 유전자에 의해 암호화될 수 있으며, 전구체의 두 부분은 펩타이드 결합에 의해 결합된다. 이 펩타이드 결합 형성은 인테인 매개 트랜스 스플라이싱에 의해 달성된다. 이를 위해, 2개의 개별 유전자를 포함하는 제 1 및 제 2 발현 카세트는 단백질 트랜스-스플라이싱을 매개할 수 있는 인테인을 추가로 암호화한다. 트랜스-스플라이싱에 의해, 제 1 및 제 2 단편에 의해 암호화된 단백질 및 폴리펩타이드는 펩타이드 결합 형성에 의해 연결될 수 있다. 트랜스-스플라이싱 인테인은 진핵 생물, 고세균 및 진정 세균을 포함하는 상이한 유기체의 핵 및 세포 기관 게놈으로부터 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 인테인은 "www" 접두사를 사용하여 전세계 웹에서 접근할 수 있는 neb.com/neb/inteins.html에 나열된다. 인테인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 인테인의 5' 및 3' 부분을 암호화하는 5' 및 3' 부분으로 분할될 수 있다. 인테인 스플라이싱에 필요하지 않은 서열 부분(예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제 도메인)은 삭제될 수 있다. 인테인 암호화 서열은 5' 및 3' 부분이 트랜스-스플라이싱할 수 있도록 분할된다. 인테인 암호화 서열의 적합한 분할 부위를 선택하기 위해, Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926에 의해 발표된 고려사항이 이어질 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트를 구성할 때, 5' 인테인 암호화 서열은 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 암호화하는 첫 번째 단편의 3' 말단에 연결되고 3' 인테인 암호화 서열은 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 암호화하는 두 번째 단편의 5' 말단에 연결된다.
일반적으로, 트랜스-스플라이싱 파트너는 임의의 자연 발생 또는 인위적으로 분할된 인테인을 포함하는 임의의 분할 인테인을 사용하여 디자인될 수 있다. 여러 자연 발생 분할 인테인이 공지되어 있다, 예를 들어: 시네코시스티스 sp.PCC6803의 DnaE 유전자(Wu, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(16):9226-31 and Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275(13):9091-4 참조) 및 노스탁 펑크티포르메의 DnaE 유전자(Iwai, et al., (2006) FEBS Lett. 580(7): 1853-8 참조)의 분할 인테인. 비분할 인테인은 새로운 분할 인테인, 예를 들어:인공적으로 분할된 Ssp DnaB 인테인(Wu, et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1387: 422-32 참조) 및 분할 Seee VMA 인테인(Brenzel, et al. ., (2006) Biochemistry 45(6): 1571-8 참조) 및 인공적으로 분할된 곰팡이 미니 인테인(Elleuche, et al., (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355 (3):830-4 참조)을 생성하기 위해 실험실에서 인공적으로 분할되었다. 자연적으로 발생하는 비분할 인테인은 인공적으로 분할된 분할 인테인을 디자인할 때 일반적으로 제거될 수 있는 엔도뉴클레아제 또는 기타 효소 활성을 가질 수 있다. 이러한 미니 인테인 또는 최소화된 분할 인테인은 당 업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 200개 미만의 아미노산 잔기 길이이다(Wu, et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1387:422-32 참조). 적합한 분할 인테인은 폴리펩타이드 요소가 구조에 추가되게 하는 다른 정제를 가질 수 있으며, 단, 그러한 요소는 분할 인테인의 스플라이싱을 억제하지 않거나 스플라이싱 전에 제거될 수 있는 방식으로 추가된다. 단백질 스플라이싱은 박테리아 인테인 유사(BIL) 도메인(Amitai, et al., (2003) Mol. Microbiol. 47: 61-73 참조) 및 hedgehog(Hog) 자동 처리 도메인(후자는 Hog/인테인 수퍼패밀리 또는 HINT 패밀리(Dassa, et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:32001-7 참조)로 언급될 때 인테인과 결합된다)를 포함하는 단백질을 사용하여 보고되었고 이들과 같은 도메인은 인공적으로 분할된 인테인을 제조하는 데 사용될 수 있다. 특히, 이러한 계열의 비 스플라이싱 구성원은 분자 생물학 방법론에 의해 변형되어 이러한 관련 종에서 스플라이싱 활성을 도입하거나 복원할 수 있다.
재조합 DNA 방법의 개발은 단백질 폴딩, 구조 및 기능에 대한 서열 전이의 효과를 연구하는 것을 가능하게 하였다. 새로운 서열을 생성하는 데 사용되는 접근 방식은 아미노산 서열의 선형 재구성에 의해 관련된 자연 발생 단백질 쌍과 유사하다(Cunningham, et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218-3222; Teather and Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:3837-3841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13-19; Yamiuchi and Minamikawa, (1991) FEBS Lett. 260:127-130; MacGregor, et al., (1996) FEBS Lett. 378:263-266). 이러한 유형의 단백질 재배열의 첫 시험관 내 응용은 Goldenberg와 Creighton에 의해 기술되었다(J. Mol. Biol. 165 : 407-413, 1983). 순환 치환된 변이체를 생성할 때, 새로운 N-말단은 원래 서열의 내부 부위(중단점)에서 선택되며, 새로운 서열은 원래 C-말단에 있거나 그 근처에 있는 아미노산에 도달할 때까지 중단점에서 원래와 동일한 순서의 아미노산을 갖는다. 이 시점에서 새로운 서열은 직접 또는 서열의 추가 부분(링커)을 통해 원래 N-말단에 있거나 그 근처에 있는 아미노산에 연결되고 새로운 서열은 원래 서열의 중단점 부위에 대해 N-말단이었던 아미노산에 있거나 그 근처에 있는 지점에 도달할 때까지 원래와 동일한 서열로 계속되며, 이 잔기는 사슬의 새로운 C-말단을 형성한다. 링커의 아미노산 서열의 길이는 경험적으로 또는 구조적 정보의 지침에 따라 또는 두 가지 접근법의 조합을 사용하여 선택될 수 있다. 구조 정보를 사용할 수 없는 경우, 길이가 0 내지 50Å 범위에 걸쳐 있고 서열이 표면 노출과 일치하도록 순서가 선택되는 디자인(hydrophilicity, Hopp and Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483-489; Kyte and Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132; solvent exposed surface area, Lee and Richards,(1971) J. Mol. Biol. 55:379-400) 및 및 살충 폴리펩타이드의 배열을 변형하지 않고 필요한 형태를 채택할 수 있는 능력(형태적으로 유연함; Karplus and Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212-213)을 사용하여 테스트를 위해 일련의 작은 링커가 준비될 수 있다. 평균 번역이 잔기당 2.0 내지 3.8Å라고 가정하면, 이것은 테스트할 길이가 0 내지 30개 잔기이며 0 내지 15개 잔기가 선호되는 범위임을 의미한다. 이러한 경험적 시리즈의 예는 n회 반복되는 Gly-GlyGly-Ser와 같은 카세트 서열을 사용하여 링커를 구축하는 것이며, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이다. 당업자는 링커 역할을 할 수 있는 길이 또는 구성이 다양한 이러한 서열이 많이 있음을 인식할 것이며, 1차 고려 사항은 지나치게 길거나 짧지 않아야 한다는 것이다(cf., Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437-462); 너무 길면 엔트로피 효과로 인해 3차원 접힘이 불안정해질 수 있으며 접힘이 동역학적으로 비실용적일 수 있으며, 너무 짧으면 비틀림 또는 입체 변형으로 인해 분자가 불안정해질 수 있다. 단백질 구조 정보 분석의 당업자는 c-알파 탄소 사이의 거리로 정의되는 사슬 말단 사이의 거리를 사용하여 사용할 서열의 길이를 정의하거나 최소한 링커의 경험적 선택에서 테스트해야 하는 가능성의 수를 제한하는 데 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 또한 폴리펩타이드 사슬의 말단 위치가 x선 회절 또는 핵 자기 공명 분광법 데이터에서 파생된 구조 모델에서 잘못 정의되어 있는 경우가 있으며, 사실인 경우, 이 상황이 필요한 링커의 길이를 적절하게 추정하기 위해 고려할 필요가 있을 것을 인식할 것이다. 이로부터 위치가 잘 정의된 잔기는 연속적으로 사슬 말단에 가까운 선택된 두 개의 잔기이며 이들의 c-알파 탄소 사이의 거리는 이들 사이의 링커에 대한 대략적인 길이를 계산하기 위해 사용된다. 계산된 길이를 가이드로 사용하여, 다양한 잔기 수(잔기 당 2 내지 3.8Å를 사용하여 계산)가 있는 링커가 선택된다. 이들 링커는 원래 서열로 구성될 수 있고, 필요에 따라 단축 또는 연장될 수 있으며, 연장될 때 추가 잔기는 전술한 바와 같이 유연하고 친수성이 되도록 선택될 수 있다; 또는 선택적으로 원래 서열은 일련의 링커를 사용하기 위해 대체될 수 있으며, 한 가지 예는 상기 언급된 Gly-Gly-Gly-Ser 카세트 접근법이고; 또는 선택적으로 적절한 총 길이를 갖는 원래 서열과 새로운 서열의 조합이 사용될 수 있다. 생물학적 활성 상태로 접힐 수 있는 살충 폴리펩타이드의 서열은 상기 기재된 링커 서열을 사용하면서 원래 폴리펩타이드 사슬 내에서 시작(아미노 말단) 및 종료(카복실 말단) 위치를 적절하게 선택함으로써 제조될 수 있다. 아미노 및 카복실 말단은 아래에 기술된 지침을 사용하여 중단점 영역으로 지칭되는 일반적인 서열 범위 내에서 선택된다. 따라서 새로운 아미노산 서열은 동일한 중단점 영역 내로부터 아미노 및 카복실 말단을 선택함으로서 생성된다. 많은 경우에 새로운 말단의 선택은 카복실 말단의 원래 위치가 아미노 말단의 위치 바로 앞에 오도록 할 것이다. 그러나, 당업자는 영역 내의 어느 곳에서나 말단의 선택이 기능할 수 있고, 이것이 새로운 서열의 아미노 또는 카복실 부분에 대한 결실 또는 부가를 효과적으로 유도할 것임을 인식할 것이다.
단백질의 1차 아미노산 서열이 생물학적 기능의 발현에 필요한 3차원 구조로 접힘을 지시한다는 것은 분자 생물학의 핵심 교리이다. 단일 단백질 결정의 x-선 회절 또는 단백질 용액의 핵 자기 공명 분광법을 사용하여 3차원 구조 정보를 얻고 해석하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 중단점 영역의 동정과 관련된 구조 정보의 예는 단백질 2차 구조의 위치 및 유형(알파 및 3-10 나선, 평행 및 역평행 베타 시트, 사슬 반전 및 회전, 및 루프; Kabsch and Sander, (1983) Biopolymers 22:2577-2637; 아미노산 잔기의 용매 노출 정도, 잔기 간의 상호 작용 정도 및 유형(Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537-572) 및 폴리펩타이드 사슬을 따른 입체 형태의 정적 및 동적 분포(Alber and Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154: 511-533)를 포함한다. 일부 경우에 잔기의 용매 노출에 대한 추가 정보가 알려져 있다; 한 가지 예는 단백질의 표면에 반드시 존재하는 탄수화물의 번역 후 부착 부위이다. 실험적 구조 정보가 없거나 얻을 수 없는 경우, 단백질 3차 및 2차 구조, 용매 접근성 및 회전 및 루프 발생에 대한 예측을 하기 위해 1차 아미노산 서열을 분석하는 방법이 이용될 수 있다. 생화학적 방법은 또한 직접적인 구조적 방법이 불가능할 때 표면 노출을 경험적으로 결정하기 위해 적용할 수 있다; 예를 들어, 표면 노출을 추론하기 위해 제한된 단백질 분해 후 사슬 절단 부위의 동정을 사용한다(Gentile and Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218 : 603-621). 따라서 실험적으로 파생된 구조 정보 또는 예측 방법(예를 들어, Srinivisan and Rose, (1995) Proteins : Struct., Funct. & Genetics 22: 81-99)을 사용하여, 부모 아미노산 서열을 검사하여 이들이 2차 및 3차 구조의 유지에 필수적인지 아닌지에 따라 영역을 분류하도록 검색된다. 주기적 2차 구조(알파 및 3-10 나선, 평행 및 반 평행 베타 시트)에 관여하는 것으로 알려진 영역 내에서 서열의 발생은 피해야 하는 영역이다. 유사하게, 낮은 정도의 용매 노출을 갖는 것으로 관찰되거나 예측되는 아미노산 서열의 영역은 단백질의 소위 소수성 코어의 일부일 가능성이 더 높으며 아미노 및 카복실 말단의 선택을 위해 피해야 한다. 대조적으로, 표면 회전 또는 루프에 있는 것으로 알려지거나 예측되는 영역 및 특히 생물학적 활성에 필요하지 않은 것으로 알려진 영역은 폴리펩타이드 사슬의 극단 위치에 대해 선호되는 부위이다. 상기 기준에 기초하여 바람직한 아미노산 서열의 연속적인 스트레치를 중단점 영역이라고 한다. 원래의 C-말단과 N-말단을 분리하는 링커 영역을 포함하는 새로운 N-말단/C-말단을 갖는 원형 치환된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본질적으로 Mullins, et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529-5533에 기술된 방법에 따라 만들어질 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭의 여러 단계는 단백질의 1차 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 재배열하는 데 사용된다. 원래 C-말단과 N-말단을 분리하는 링커 영역을 포함하는 새로운 N-말단/C-말단을 갖는 원형 치환된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427-431에 기술된 직렬 복제 방법을 기반으로 제조될 수 있다. 새로운 N-말단/C-말단 유전자의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 직렬 복제된 주형 DNA를 사용하여 수행된다.
새로운 살충 단백질을 포함하는 융합 단백질
다른 양태에서, 아미노산 서열 내에 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 및 이의 활성 단편을 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 디자인 및 구축 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 살충 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 원핵 및/또는 진핵 세포의 특정 구획으로의 폴리펩타이드의 국부화를 지시 및/또는 원핵 또는 진핵 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 지시할 신호 서열에 융합될 수 있다. 예를 들어, 대장균에서, 단백질의 발현을 주변 세포질 공간으로 유도하기를 원할 수 있다.
살충 폴리펩타이드가 융합될 수 있는 신호 서열 또는 단백질(또는 이의 단편)의 예는 박테리아의 주변 세포질 공간으로 폴리펩타이드의 발현을 지시하기 위해 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: pelB 신호 서열, 말토오스 결합 단백질(MBP) 신호 서열, MBP, ompA 신호 서열, 주변 세포질 대장균 열 불안정성 장독소 B-서브유닛의 신호 서열, 및 알칼리성 포스파타제의 신호 서열.
융합 단백질의 구축을 위해 여러 벡터가 상업적으로 이용 가능하며, 이는 New England Biolabs®(240 County Road, Ipswich, Mass. 01938-2723)로부터 구입 가능한 pMAL 시리즈 벡터(pMAL-p 시리즈)와 같은 단백질의 국소화를 지시할 것이다. 특정 실시태양에서, 폴리펩타이드는 pelB 펙테이트 리아제 신호 서열에 융합되어 그람-음성 박테리아에서 이러한 폴리펩타이드의 발현 및 정제 효율을 증가시킬 수 있다(미국 특허 5,576,195 및 5,846,818 참조). 식물 색소체 수송 펩타이드/폴리펩타이드 융합은 당업계에 잘 알려져 있다(미국 특허 7,193,133 참조). 벼 또는 보리 알파-아밀라제 분비 신호와 같은 아포플라스트 수송 펩타이드도 당업계에 잘 알려져 있다. 색소체 수송 펩타이드는 일반적으로 표적화될 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 파트너)에 N-말단에 융합된다. 그러나, 융합 단백질이 적어도 부분적으로 색소체에 표적화된다면 추가 아미노산 잔기는 색소체 수송 펩타이드에 대해 N-말 단일 수 있다. 특정 실시태양에서, 색소체 수송 펩타이드는 융합 단백질의 N-말단 절반, N-말단 1/3, 또는 N-말단 1/4에 있다. 색소체 수송 펩타이드의 대부분 또는 전부는 일반적으로 색소체에 삽입될 때 융합 단백질로부터 절단된다. 절단 위치는 특정 세포 간 조건 또는 사용된 이동 펩타이드/융합 파트너의 특정 조합의 결과로 다른 식물 발달 단계에서 식물 종간에 약간 다를 수 있다. 한 실시태양에서, 색소체 전달 펩타이드 절단은 절단 부위가 융합 단백질 집단에서 동일하도록 균질하다. 또 다른 실시태양에서, 색소체 수송 펩타이드는 균질하지 않아, 절단 부위는 융합 단백질 집단에서 1-10개 아미노산만큼 다양하다. 색소체 수송 펩타이드는 여러 방법 중 하나로 두 번째 단백질에 재조합적으로 융합될 수 있다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 C-말단에 상응하는 위치에서 수송 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열에 도입될 수 있고 동일하거나 적합한 부위가 이의 N-말단 끝에 표적화될 단백질의 뉴클레오타이드 서열로 조작될 수 있다. 원하는 융합 단백질의 합성을 허용하기 위해 수송 펩타이드 및 두 번째 단백질의 암호화 서열이 "프레임 내"로 유지되도록 이러한 부위를 디자인할 때 주의를 기울여야 한다. 어떤 경우에, 새로운 제한 부위가 도입될 때 두 번째 단백질의 개시제 메티오닌 코돈을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 부모 분자 모두에 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 도입 및 재조합 DNA 기술을 통한 후속 결합은 수송 펩타이드와 두 번째 단백질 사이에 하나 이상의 추가 아미노산의 첨가를 초래할 수 있다. 이것은 일반적으로 수송 펩타이드 절단 부위가 접근 가능한 상태로 유지되고 두 번째 단백질의 기능이 N-말단에서 이러한 여분의 아미노산의 추가에 의해 변경되지 않는 한 표적 활성에 영향을 미치지 않는다. 대안적으로, 당업자는 유전자 합성(Stemmer, et al., (1995) Gene 164: 49-53) 또는 유사한 방법을 사용하여 수송 펩타이드와 제 2 단백질(이의 개시제 메티오닌이 있거나 없는) 사이에 정확한 절단 부위를 생성할 수 있다. 또한, 수송 펩타이드 융합은 절단 부위의 아미노산 하류를 의도적으로 포함할 수 있다. 성숙한 단백질의 N-말단에 있는 아미노산은 단백질을 색소체로 표적화하는 수송 펩타이드의 능력 및/또는 단백질 도입 후 절단 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이는 표적화될 단백질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Comai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263 (29):15104-9 참조.
일부 실시태양에서, 본 발명에 교시된 살충 폴리펩타이드 및 아미노산 링커에 의해 연결된 또 다른 살충 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 R1-L-R2, R2-L-R1, R1-R2 또는 R2-R1로 이루어진 그룹에서 선택된 화학식으로 표시되며, R1은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드이며 R2는 다른 살충 폴리펩타이드이다. R1 폴리펩타이드는 직접 또는 링커(L) 세그먼트를 통해 R2 폴리펩타이드에 융합된다. 용어 "직접"은 폴리펩타이드가 펩타이드 링커없이 연결되는 융합을 정의한다. 따라서 "L"은 R1 및 R2가 프레임에서 융합되는 화학적 결합 또는 폴리펩타이드 세그먼트를 나타내며, 가장 일반적으로 L은 R1 및 R2가 L의 아미노 말단에 대해 R1의 카복시 말단 및 R2의 아미노 말단에 대해 L의 카복시 말단을 연결하는 아마이드 결합에 의해 결합되는 선형 펩타이드이다. "프레임 내 융합"은 R1과 R2의 판독 프레임 사이에 번역 종료 또는 중단이 없음을 의미한다. 연결기(L)는 일반적으로 아미노산 길이가 1개 내지 500개 사이인 폴리펩타이드이다. 두 분자를 연결하는 링커는 바람직하게는 (1) 두 분자가 서로 독립적으로 접히고 작용하도록 허용하고, (2) 두 분자의 기능적 도메인을 방해할 수 있는 정렬된 이차 구조를 개발하려는 경향이 없고, (3) 기능적 단백질 도메인과 상호 작용할 수 있는 최소 소수성 또는 전하 특성을 가지며, (4) R1 및 R2가 단일 세포에서 상응하는 수용체와 동시에 상호 작용할 수 있도록 R1 및 R2의 입체 분리를 제공하도록 디자인된다. 일반적으로 유연한 단백질 영역의 표면 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. Gly, Asn 및 Ser을 포함하는 아미노산 서열의 거의 모든 순열은 링커 서열에 대한 위의 기준을 충족할 것으로 예상된다. Thr 및 Ala와 같은 다른 중성 아미노산은 링커 서열에 사용될 수 있다. 융합의 구성을 용이하게하기 위해 링커 서열에 고유한 제한 부위의 추가로 인해 추가 아미노산이 링커에 포함될 수도 있다.
일부 실시태양에서, 링커는 n이 정수인 (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (Gly5Ser)n, (GlynSer)n 또는 (AlaGlySer)n의 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 매우 유연한 링커의 한 예는 필라멘트 박테리오파지, 예를 들어, 박테리오파지 M13 또는 fd의 알약 단백질 내에 존재하는 (GlySer) 풍부한 스페이서 영역이다(Schaller, et al., 1975). 이 영역은 알약 표면 단백질의 두 도메인 사이에 길고 유연한 스페이서 영역을 제공한다. 엔도펩티다제 인식 서열이 포함되는 링커도 포함된다. 이러한 절단 부위는 융합의 개별 성분을 분리하여 이들이 적절하게 접혀 있고 시험관 내에서 활성인지를 결정하는 데 유용할 수 있다. 다양한 엔도펩티다제의 예는 플라스민, 엔테로키나제, 칼리케린, 우로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 클로스트리파인, 키모신, 콜라게나제, 러셀 바이퍼 베놈 프로테아제(Russell's Viper Venom Protease), 포스트 프롤린 절단 효소, VS 프로테아제, 트롬빈 및 인자 Xa를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시태양에서, 중쇄 면역글로불린 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE의 힌지 영역으로부터의 펩타이드 링커 세그먼트는 부착된 폴리펩타이드 사이의 각도 관계를 제공한다. 융합 단백질은 사용되는 링커 서열의 형태, 크기 또는 수에 의해 제한되지 않으며 링커의 유일한 요구 사항은 기능적으로 융합의 개별 분자의 접힘 및 기능을 방해하지 않는다는 것이다.
또 다른 양태에서, 키메라 유전자를 생성하기 위해 원래 분리된 살충 단백질을 암호화하는 교시된 살충 단백질 유전자의 2개 이상의 부분을 결합함으로써 생성되는 키메라 단백질이 제공된다. 키메라 유전자의 번역은 각각의 원래 단백질로부터 유래된 영역, 모티프 또는 도메인을 갖는 단일 키메라 단백질을 생성한다. 특정 실시태양에서, 키메라 단백질은 임의의 조합으로 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 부분, 모티프 또는 도메인을 포함한다.
DNA 서열은 다양한 방법에 의해 변경될 수 있으며, 이러한 변경은 야생형 (또는 천연) 살충 단백질에 의해 암호화된 것과 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 생성할 수 있음이 인식된다. 일부 실시태양에서, 본 발명에서 교시된 살충 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72와 비교된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 결실, 절단, 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다.
이러한 조작을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 알려져있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 이것은 또한 여러 형태의 돌연변이 유발 및/또는 유도 진화 중 하나에 의해 달성될 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 서열에서 암호화된 변화는 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않을 것이다. 이러한 변이체는 원하는 살충 활성을 가질 것이다. 그러나, 살충 활성을 부여하는 교시된 폴리펩타이드의 능력은 본 발명의 조성물에 이러한 기술을 사용함으로써 개선될 수 있음이 이해된다.
예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경하지 않고 교시된 폴리펩타이드의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 다음을 포함한다: 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산); 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아마이드(예를 들어, 아스파르트 산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민); 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인); 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기(예를 들어, 알라닌, 세린, 트레오닌, 프랄린, 글리신); 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프로라인, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 큰 지방족, 비극성 잔기(예를 들어, 메티오닌, 류신, 이소류신, 발린, 시스테인); 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신); 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘); 큰 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)를 가진 아미노산.
기능을 보유하는 비 보존 영역에서 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 이러한 치환은 보존된 아미노산 잔기 또는 보존된 모티프 내에 존재하는 아미노산 잔기에 대해 이루어지지 않으며, 이러한 잔기는 단백질 활성에 필수적이다. 보존되고 단백질 활성에 필수적일 수 있는 잔기의 예는, 예를 들어, 실시태양의 서열과 유사하거나 관련된 독소의 정렬에 포함된 모든 단백질 사이에 동일한 잔기(예를 들어, 상동체의 정렬이 동일한 잔기)를 포함한다. 보존되지만 보존적 아미노산 치환을 허용하고 여전히 활성을 유지할 수 있는 잔기의 예는, 예를 들어, 실시태양의 서열에 대한 유사하거나 관련된 독소의 정렬에 포함된 모든 단백질 사이에 보존적 치환만을 갖는 잔기(예를 들어, 상동체의 정렬에 포함된 모든 단백질 사이에 보존적 치환만 있는 잔기)를 포함한다. 그러나, 당업자는 기능적 변이체가 보존된 잔기에서 약간의 보존되거나 보존되지 않은 변경을 가질 수 있음을 이해할 것이다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 본 발명에 참조로 포함된 Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC)의 모델에서 발견될 수 있다.
이러한 변화를 만드는데, 아미노산의 친수도 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호 작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 친수도 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해되고 있다(Kyte and Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105-132). 아미노산의 상대적인 친수도 특성은 결과 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 받아 들여지며, 이는 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호 작용을 정의한다.
특정 아미노산이 유사한 친수도 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 대체될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 즉, 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 여전히 수득한다. 각 아미노산에 소수성 및 전하 특성을 기반으로하여 친수도 지수가 지정되었다. 친수도 지수는 다음이다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프랄린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산염(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9) 및 아르기닌(-4.5). 이러한 변화를 만드는데, 친수도 지수가 +2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, +1 이내의 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, +0.5 이내의 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다.
또한 친수성에 기초하여 유사 아미노산의 치환이 효과적으로 이루어질 수 있음이 당업계에서 이해된다. U.S. Pat. 미국 특허 4,554,101은 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 단백질의 생물학적 특성과 관련이 있다고 말한다. U.S. Pat. 미국 특허 4,554,101, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+ 3.0. + 0.1); 글루타메이트 (+ 3.0. + 0.1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프랄린 (-0.5. + 0.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 및 트립토판 (-3.4).
대안적으로, 활성에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 아미노 또는 카복시 말단에서 많은 단백질의 단백질 서열을 변경시킬 수 있다. 이것은 PCR 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오타이드에 아미노산 암호화 서열을 포함시킴으로써 단백질 암호화 서열을 변경하거나 연장하는 PCR 증폭을 포함하는 PCR과 같은 현대 분자 방법에 의해 도입된 삽입, 결실 또는 변경을 포함할 수 있다. 대안적으로, 추가된 단백질 서열은 단백질 융합을 생성하기 위해 당업계에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 전체 단백질 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 종종 (1) 관심 단백질의 발현을 증가시키기 위해 (2) 결합 도메인, 효소 활성 또는 에피토프를 도입하여 단백질 정제, 단백질 검출 또는 당업계에 알려진 다른 실험적 용도를 촉진하기 위해 (3) 그람 음성 박테리아의 주변 세포질 공간, 식물의 미토콘드리아 또는 엽록체 또는 진핵 세포의 소포체로의 단백질의 분비 또는 번역을 표적으로 하는 데 사용되며, 후자는 종종 단백질의 글리코실화를 초래한다.
본 발명의 변이체 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 또한 DNA 셔플링과 같은 돌연변이 유발 및 재조합 과정으로부터 유래된 서열을 포함한다. 이러한 절차로, 하나 이상의 상이한 살충 폴리펩타이드 암호화 영역을 사용하여 원하는 특성을 갖는 새로운 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 재조합 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 실질적인 서열 동일성을 갖고 시험관 내 또는 생체 내에서 상동적으로 재조합될 수 있는 서열 영역을 포함하는 관련 서열 폴리뉴클레오타이드의 집단으로부터 생성된다. 예를 들어,이 접근법을 사용하여, 관심 도메인을 암호화하는 서열 모티프를 살충 유전자와 다른 알려진 살충 유전자 사이에서 섞어 살충 활성 증가와 같은 개선된 관심 특성을 가진 단백질을 암호화하는 새로운 유전자를 얻을 수 있다. 그러한 DNA 셔플링을 위한 전략은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389- 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; 및 미국 특허 5,605,793 및 5,837,458 참조.
도메인 스와핑 또는 셔플링은 변경된 폴리펩타이드를 생성하기 위한 또 다른 메커니즘이다. 도메인은 폴리펩티드간에 교환되어 살충 활성 또는 표적 스펙트럼이 개선된 하이브리드 또는 키메라 독소를 생성할 수 있다. 재조합 단백질을 생성하고 살충 활성을 테스트하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925 참조).
DNA 셔플링 및 부위 지정 돌연변이 유발 모두는 살충 활성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 정의하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 모티프를 추가로 정의하기 위해 다른 단백질 또는 기능적 분석에 대한 비교를 사용할 수 있을 것이다. 고 처리량 스크리닝을 사용하여 특정 잔기의 역할을 결정하기 위해 이러한 모티프의 변형을 테스트할 수 있다.
수용체 동정 및 분리
교시된 살충 단백질, 또는 이의 변이체 또는 단편에 대한 수용체도 포함된다. 수용체를 동정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Hofmann, et. al., (1988) Eur. J. Biochem. 173:85-91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27277-27282 참조), 감수성 곤충으로부터 브러시 경계 막 소포를 사용하여 교시된 살충 단백질을 인식하는 수용체를 동정하고 분리하는 데 사용될 수 있다. 인용된 문헌에 나열된 방사성 라벨링 방법 외에도 교시된 단백질은 형광 염료 및 스트렙타비딘과 같은 기타 일반적인 표지로 표지화될 수 있다. 대두 루퍼 및 악취 벌레와 같은 감수성 곤충의 브러시 테두리 막 소포(BBMV)는 참고 문헌에 나열된 프로토콜에 따라 준비되고 SDS-PAGE 젤에서 분리하고 적절한 막에 블롯팅할 수 있다. 표지된 단백질은 BBMV의 블롯된 막으로 배양되고 표지된 리포터로 동정될 수 있다. 단백질과 상호 작용하는 단백질 밴드(들)의 동정은 N-말단 아미노산 기상 시퀀싱 또는 질량 분석 기반 단백질 동정 방법에 의해 탐지될 수 있다(Patterson, (1998) 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology published by John Wiley & Son Inc). 일단 단백질이 동정되면, 해당 유전자는 감수성 곤충의 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리에서 복제될 수 있으며 결합 친화도는 단백질로 직접 측정될 수 있다. 교시된 단백질에 의한 살충 활성에 대한 수용체 기능은 RNAi 유형의 유전자 녹아웃 방법에 의해 검증될 수 있다(Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277 : 46849-46851).
뉴클레오타이드 구조체, 발현 카세트 및 벡터
본 발명에서 용어 "뉴클레오타이드 구조체"의 사용은 DNA를 포함하는 뉴클레오타이드 구조체로 실시태양을 제한하려는 것이 아니다. 당업자는 뉴클레오타이드 구조체, 특히 리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드의 조합으로 구성된 올리고뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 개시된 방법에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 핵산 및 뉴클레오타이드 서열은 추가로 이러한 구조체, 분자 및 서열의 모든 상보적 형태를 포함한다. 추가로, 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 뉴클레오타이드 분자 및 뉴클레오타이드 서열은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 식물을 형질전환하기 위한 실시태양의 방법에 사용될 수 있는 모든 뉴클레오타이드 구조체, 분자 및 서열을 포함한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드는 자연 발생 분자 및 합성 유사체를 모두 포함한다. 실시태양의 뉴클레오티드 구조체, 핵산 및 뉴클레오타이드 서열은 또한 단일 가닥 형태, 이중 가닥 형태, 헤어핀, 스템-앤-루프 구조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 형태의 뉴클레오타이드 구조체를 포함한다.
추가 실시태양은 식물 및 곤충 세포, 박테리아, 효모, 바큘로바이러스, 원생 동물, 선충류 및 조류로부터 선택된 유기체와 같은 형질전환된 유기체에 관한 것이다. 형질전환된 유기체는 실시태양의 DNA 분자, DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 형질전환된 유기체의 게놈에 안정적으로 혼입될 수 있는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다.
실시태양의 서열은 관심 유기체에서의 발현을 위한 DNA 구조체에 제공된다. 구조체는 실시태양의 서열에 작동 가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 것이다. 본 발명에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터와 제 2 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기서 프로모터 서열은 제 2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 것은 연결된 핵산 서열이 연속적이며 동일한 리딩 프레임에서 두 개의 단백질 암호화 영역을 연결하는 데 필요하다는 것을 의미한다. 구조체는 유기체로 공동 형질전환될 하나 이상의 추가 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 추가 유전자(들)는 다중 DNA 구조체에 제공될 수 있다.
일부 실시태양에서, DNA 구조체는 이종성 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명에서 교시된 살충 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, DNA 구조체는 이종성 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명에서 교시된 살충 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, 및 SEQ ID NO: 71 또는 관심 숙주 세포, 예를 들어 일부 실시태양에서 식물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 상기 언급된 것에 상응하는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, DNA 구조체는 이종성 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명에서 교시된 살충 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72 또는 이의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
이러한 DNA 구조체는 조절 영역의 전사 조절하에 있는 폴리펩타이드 유전자 서열의 삽입을 위한 다수의 제한 부위가 제공된다. DNA 구조체는 선택 가능한 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
DNA 구조체는 일반적으로 5' 내지 3' 전사 방향에 포함될 것이다: 전사 및 번역 개시 영역(즉, 프로모터), 실시태양의 DNA 서열, 및 숙주 역할을 하는 유기체, 예를 들어 박테리아 세포 또는 식물 세포에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역(즉, 종결 영역).
전사 개시 영역(즉, 프로모터)은 숙주 유기체 및/또는 실시태양의 서열과 천연, 유사, 외래 또는 이종성일 수 있다. 추가로, 프로모터는 천연 서열 또는 대안 적으로 합성 서열일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "외래"는 프로모터가 프로모터가 도입 된 천연 유기체에서 발견되지 않음을 나타낸다. 프로모터가 실시태양의 서열에 대해 "이종"성인 경우, 프로모터는 실시태양의 작동 가능하게 연결된 서열에 대해 천연 또는 자연 발생 프로모터가 아닌 것으로 의도된다(즉, 천연 위치가 아님). 본 발명에 사용된 키메라 유전자는 암호화 서열에 이종성인 전사 개시 영역에 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 포함한다. 프로모터가 천연 또는 자연 서열인 경우, 작동 가능하게 연결된 서열의 발현은 야생형 발현에서 변경되어, 표현형의 변형을 초래한다.
일부 실시태양에서, DNA 구조체는 또한 전사 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열을 말하며 프로모터의 선천적 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다. 예를 들어, 식물에서 유전자 발현을 향상시키는 특성을 갖는 인트란스(미국 특허 출원 공개 번호 2009/0144863, 유비퀴틴 인트론(즉, 옥수수 유비퀴틴 인트론 1(예를 들어, NCBI 서열 S94464 참조; Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5 : 213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18 : 675-689)), 오메가 인핸서 또는 오메가 프라임 인핸서(Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, New York) 237-256 and Gallie, et al., (1987) Gene 60 : 217-25), CaMV 35S 인핸서(예를 들어, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9 : 1685-96), 옥수수 Adhl 인트론(Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228 : 40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35 : 353-357) ), 미국 특허 7,803,992의 인핸서 및 W02013130813의 사탕 수수 바실리폼 바이러스(SCBV) 인핸서가 또한 사용될 수 있으며, 이들 각각은 참고로 포함된다. 상기 전사 인핸서 목록은 제한하려는 것이 아니다. 임의의 적절한 전사 인핸서가 실시태양에서 사용될 수 있다.
종결 영역은 전사 개시 영역에 고유할 수 있고, 작동 가능하게 연결된 관심 DNA 서열에 고유할 수 있거나, 식물 숙주에 고유할 수 있거나, 다른 공급원(즉, 외래 또는 이종성 프로모터, 관심 서열, 식물 숙주 또는 이들의 임의 조합)으로부터 유래될 수 있다.
예를 들어 옥토핀 신타아제 및 노팔린 신타아제 종결 영역인 편리한 종결 영역은 A. 투메파시엔스 (A. tumefaciens)의 Ti-플라스미드에서 이용할 수 있다. Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Magen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 and Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 참조.
적절한 경우, 핵산은 숙주 유기체에서 증가된 발현을 위해 최적화될 수 있다. 따라서 숙주 유기체가 식물인 경우, 합성 핵산은 개선된 발현을 위해 식물 선호 코돈을 사용하여 합성될 수 있다. 호스트 선호 코돈 사용에 대한 논의는, 예를 들어, Campbell and Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11 참조. 예를 들어, 실시태양의 핵산 서열이 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 종 모두에서 발현될 수 있지만, 서열은 단자엽 또는 쌍떡잎 식물의 특정 코돈 선호도 및 GC 함량 선호도를 설명하도록 변형될 수 있다(Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498).
따라서, 당업자는 본 발명의 살충 단백질을 발현하기 위한 최적의 서열을 유도하기 위해 특정 식물 코돈 사용 표를 이용하는 방법을 이해할 것이다. 예를 들어, US 2016/0366891(미국 출원 15/022,109), 그 전체가 본 발명에 참조로 포함된다.
추가 서열 변형은 세포 숙주에서 유전자 발현을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이들은 스퓨리어스 폴리아데닐화 신호, 엑손-인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포존 유사 반복, 및 유전자 발현에 해로울 수 있는 기타 잘 특성화된 서열을 암호화하는 서열의 제거를 포함한다. 서열의 GC 함량은 숙주 세포에서 발현되는 공지된 유전자를 참조하여 계산된 바와 같이, 소정의 세포 숙주에 대한 수준 평균으로 조정될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터를 함유하고 발현 벡터의 복제 및/또는 발현을 지원하는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵 세포 또는 효모, 곤충, 양서류 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포 또는 단자엽 또는 쌍떡잎 식물 세포일 수 있다. 외떡잎 숙주 세포의 한 예는 옥수수 숙주 세포이다. 가능한 경우, 서열은 예측된 헤어핀 2차 mRNA 구조를 피하기 위해 변형된다.
발현 카세트는 5' 리더 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 향상시키는 역할을 할 수 있다. 번역 리더는 당업계에 공지되어 있으며 피코마바이러스 리더, 예를 들어 EMCV 리더(뇌근근염 5' 비암호화 영역) (ElroyStein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); 포티바이러스 리더, 예를 들어 TEV 리더(Tobacco Etch Virus)(Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), MDMV 리더(Maize Dwarf Mosaic Virus), 인간 면역 글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP)(Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); 알팔파 모자이크 바이러스의 외피 단백질 mRNA로부터의 번역되지 않은 리더(AMY RNA 4)(Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); 담배 모자이크 바이러스 리더(TMV) (Gallie, et al., (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256)) 및 옥수수 엽록소 반점 바이러스 리더(MCMV)(Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385)을 포함한다. 또한, Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol 84:965-968 참조.
이러한 구조체는 또한 엽록체(또는 다른 색소체), 소포체 또는 골지 장치와 같은 특정 세포내 구조로의 펩타이드의 동시 번역 또는 번역 후 수송을 촉진하기 위해 "신호 서열" 또는 "리더 서열"을 함유할 수 있다. 본 발명에 사용된 "신호 서열"은 세포막을 가로 질러 동시 번역 또는 번역 후 펩타이드 수송을 야기하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 서열을 지칭한다. 진핵 생물에서, 이것은 일반적으로 골지로의 분비를 포함하며 일부 결과적인 글리코실화가 있다. 박테리아의 살충 독소는 종종 표적 해충의 장에서 양성자 분해 활성화되는 프로독신으로 합성된다(Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). 일부 실시태양에서, 신호 서열은 천연 서열에 위치하거나 실시태양의 서열로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 사용된 "리더 서열"은 번역될 때 세포하 소기관으로 펩타이드 사슬의 동시 번역 수송을 유발하기에 충분한 아미노산 서열을 생성하는 임의의 서열을 지칭한다. 따라서, 이것은 소포체로의 통과, 액포로의 통과, 엽록체, 미토콘드리아 등을 포함하는 색소체로의 통과에 의한 수송 및/또는 당화를 표적으로 하는 리더 서열을 포함한다. 엽록체 틸라코이드 루멘 구획을 표적으로 하는 핵 암호화 단백질은 기질 표적화 신호 펩타이드 및 루멘 표적화 신호 펩타이드로 구성된 특징적인 이분 수송 펩타이드를 갖는다. 기질 표적화 정보는 전이 펩타이드의 아미노-근위 부분에 있다. 루멘 표적 신호 펩타이드는 수송 펩타이드의 카복실-근위 부분에 있으며 루멘 표적화를위한 모든 정보를 포함한다. 고등 식물 엽록체의 단백질체학에 대한 최근 연구는 여러 핵 암호화 루멘 단백질(Kieselbach et al. FEBS Lett. 480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319-341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys. Acta 1503:350-356, 2001)의 동정을 달성하였고, 이의 루멘 표적화 신호 펩타이드는 본 발명에 따라 잠재적으로 사용될 수 있다. 아라비돕시스의 약 80개의 단백질과 시금치와 완두콩의 동종 단백질이 Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003에 보고된다. 특히, 이 간행물의 표 2는 본 명세서에 참조로 설명되어 있으며, 수탁 번호에 의해 동정된 엽록체 내강으로부터의 85 개 단백질을 개시한다(미국 특허 출원 공개 2009/09044298 참조). 또한, 벼 게놈의 공개된 초안 버전(Goff et al, Science 296:92-100, 2002)은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 루멘 표적화 신호 펩타이드에 적합한 공급원이다.
적합한 엽록체 수송 펩타이드(CTP)는 당업자에게 잘 알려져 있으며 오리자 사티바(Oryza sativa)-1-데옥시-D 자일로오스-5-포스페이트 신타아제, 오리자 사티바-슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 오리자 사티바-수용성 전분 신타아제, 오리자 사티바-NADP-의존성 말산 효소, 오리자 사티바-포스포-2-데하이드로-3-데옥시헵토네이트 알도라제 2, 오리자 사티바-L-아스코르베이트 퍼록시다아제 5, 오리자 사티바-포스포글루칸 물 다이키나제, 제아 마이스(Zea Mays) ssRUBISCO, 제아 마이스-베타-글루코시다제, 제아 마이스-말라테 데하이드로게나제, 제아 마이스 티오레독신 M-타입(미국 특허 공개공보 2012/0304336)로부터 CTP로부터의 N-말단 도메인, 중앙 도메인 또는 C-말단 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는 키메릭 CTP를 포함한다. 미국 특허 공개공보 US20130205440Al, US20130205441A1 및 US20130210114Al의 엽록체 수송 펩타이드. 엽록체에 표적화 될 폴리펩티드 유전자는 식물 핵과 이 세포 기관 사이의 코돈 사용 차이를 설명하기 위해 엽록체에서의 발현에 최적화될 수 있다.
발현 카세트를 제조할 때, 다양한 DNA 단편을 조작하여 적절한 배향 및 적절한 판독 프레임으로 DNA 서열을 제공할 수 있다. 이를 위해, 어댑터 또는 링커를 사용하여 DNA 단편을 결합하거나 편리한 제한 부위, 불필요한 DNA 제거, 제한 부위 제거 등을 제공하기 위해 다른 조작이 관련될 수 있다. 이를 위해, 시험관 내 돌연변이 유발, 프라이머 복구, 제한, 어닐링, 재치환, 예를 들어, 전이 및 전환이 포함될 수 있다.
프로모터
다수의 프로모터가 실시태양의 실행에 사용될 수 있다. 프로모터는 원하는 결과에 따라 선택될 수 있다. 핵산은 숙주 유기체에서의 발현을 위해 구조성, 조직 선호, 유도성 또는 기타 프로모터와 조합될 수 있다. 본 발명의 프로모터는 본 발명의 프로모터 서열과 상동성을 나타내는 유전자 조절에 영향을 미치는 것으로 알려진 cis 요소의 상동체를 포함한다. 이러한 cis 요소에는 산소 반응성 cis 요소, 광 조절 요소(Bruce and Quaill, Plant Cell 2 (11):1081-1089 (1990); Bruce et al., EMBO J. 10:3015-3024 (1991); Rocholl et al., Plant Sci. 97:189-198 (1994); Block et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5387-5391 (1990); Giuliano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7089-7093 (1988); Staiger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6930-6934 (1989); Izawa et al., Plant Cell 6:1277-1287 (1994); Menkens et al., Trends in Biochemistry 20:506-510 (1995); Foster et al., FASEB J. 8:192-200 (1994); Plesse et al., Mol. Gen. Gene. 254:258-266 (1997); Green et al., EMBO J. 6:2543-2549 (1987); Kuhlemeier et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 38:221-257 (1987); Villain et al., J. Biol. 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프로모터의 예는 미국 특허 6,437,217(옥수수 RS81 프로모터), 미국 특허 5,641,876(쌀 액틴 촉진제), 미국 특허 6,426,446(옥수수 RS324 프로모터), 미국 특허 6,429,362(옥수수 PR-1 프로모터), 미국 특허 6,232,526(옥수수 A3 프로모터), 미국 특허 6,177,611(구조성 옥수수 촉진제), 미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196(35S 프로모터), 미국 특허 6,433,252(옥수수 L3 올레 오신 프로모터, P-Zm.L3), 미국 특허 6,429,357(쌀 액틴 2 프로모터 및 라이스 액틴 2 인트론), 미국 특허 5,837,848(루트 특이적 프로모터), 미국 특허 6,294,714(광 유도성 프로모터), 미국 특허 6,140,078(염 유도성 프로모터), 미국 특허 6,252,138(병원체 유도성 프로모터), 미국 특허 6,175,060(인 결핍 유도성 프로모터), 미국 특허 6,635,806(감마-코이진 프로모터, P-CI.Gcx), 미국 특허 출원 Ser. 09/757,089(옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터) 및 미국 특허 8,772,466(옥수수 전사 인자 핵 인자 B(NFB2))에 기술된 것을 포함한다.
식물 숙주 세포에서 사용하기에 적합한 구조성 프로모터는, 예를 들어, Rsyn7 프로모터의 코어 프로모터 및 WO 1999/43838 및 미국 특허 6,072,050에 개시된 기타 구조성 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 (Odell, et al., (1985) Nature 313 : 810-812); 벼 액틴(McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2 : 163-171); 유비퀴틴(Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12 : 619-632 및 Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18 : 675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81 : 581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3 : 2723-2730); ALS 프로모터 (미국 특허 번호 5,659,026) 등을 포함한다.
다른 구조성 프로모터는 예를 들어 다음에서 논의된 것들을 포함한다: 미국 특허 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 및 6,177,611.
적합한 구조성 프로모터는 또한 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 거의 모든 조직에서 강한 발현을 갖지만 꽃가루에서 낮은 발현을 갖는 프로모터를 포함한다: 미국 특허 8,338,662에 개시된 바나나 줄무늬 바이러스(Acuminata Yunnan) 프로모터(BSV(AY)); 미국 특허 8,350,121에 개시된 바나나 스트리크 바이러스(Acuminata Vietnam) 프로모터(BSV AV)); 및 미국 특허 8,395,022에 개시된 바나나 스트릭 바이러스(Mysore) 프로모터(BSV (M YS)).
원하는 결과에 따라, 유도성 프로모터로부터 유전자를 발현하는 것이 유익 할 수 있다. 식물에서 실시태양의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하기 위해 특히 흥미로운 것은 상처 유도성 프로모터이다. 이러한 상처 유도성 프로모터는 곤충 섭식으로 인한 손상에 반응할 수 있으며 본 발명에 참조로 포함된 감자 프로 테이나제 억제제(pin II) 유전자(Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl and wun2, U.S. Pat. No. 5,428,148; winl and win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); 시스테민(McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIPl (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73-76); MPI 유전자(Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141-150) 등을 포함한다.
추가로, 병원체 유도성 프로모터가 실시태양의 방법 및 뉴클레오타이드 구조체에 사용될 수 있다. 이러한 병원체 유도성 프로모터는 병원균에 의한 감염 후 유도되는 발병 기전 관련 단백질(PR 단백질)의 것; 예를 들어, PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나제, 키티나제 등을 포함한다. 예를 들어, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89 : 245-254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4 : 645-656 및 Van Loon, (1985) Plant Mol. Biol. 4 : 111-116 참조. 또한, 본 발명에 참조로 포함된 WO 1999/43819 참조.
관심이 있는 것은 병원체 감염 부위 또는 그 근처에서 국소적으로 발현되는 프로모터이다. 예를 들어, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325- 331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98 and Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977 참조. 또한 Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. A cad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961-968; U.S. Pat. No. 5,750,386(nematode-inducible) 및 본 발명에 인용된 참조문헌 참조. 특히 흥미로운 것은 옥수수 PRms 유전자에 대한 유도성 프로모터이며, 그 발현은 병원체 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme)에 의해 유도된다(예를 들어, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 : 189-200 참조).
화학적 조절 프로모터가 사용되어 외인성 화학적 조절제의 적용을 통해 식물에서 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 목적에 따라, 프로모터는 화학적 유도성 프로모터일 수 있으며, 여기서 화학적 적용은 유전자 발현을 유도하거나 화학적 억제 성 프로모터는 화학적 적용이 유전자 발현을 억제한다. 화학적 유도성 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며, 벤젠설폰아마이드 제조체 경감제에 의해 활성화되는 옥수수 In2-2 프로모터, 발아전 제초제로 사용되는 소수성 친 전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터, 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-la 촉진제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 기타 화학적으로 조절되는 관심 프로모터는 본 발명에 참조로 포함된 스테로이드 반응성 프로모터(예를 들어, the glucocorticoid-inducible promoter in Schena, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 and McNellis, et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257 참조) 및 테트라 사이클린 유도성 및 테트라 사이클린 억제성 프로모터(예를 들어, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 및 미국 특허 5,814,618 및 5,789, 156 참조)를 포함한다.
조직 선호 프로모터는 특정 식물 조직 내에서 강화된 폴리펩타이드 발현을 표적으로 하기 위해 사용될 수 있다. 조직 선호 프로모터는 Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 and Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505에 논의된 것을 포함한다. 이러한 프로모터는 필요하다면 약한 발현을 위해 변형될 수 있다.
잎 선호 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gator, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 및 Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 참조.
뿌리 선호 또는 뿌리 특이적 프로모터는 공지되어 있으며 문헌에서 입수할 수 있는 많은 것 중에서 선택되거나 다양한 호환 가능한 종으로부터 분리된 새로운 프로모터로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (soybean root specific glutamine synthetase gene); Keller and Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (root specific control element in the GRP 1.8 gene of French bean); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (root specific promoter of the mannopine synthase (MAS) gene of Agrobacterium tumefaciens) and Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (full length cDNA clone encoding cytosolic glutamine synthetase (GS), which is expressed in roots and root nodules of soybean) 참조. 또한 Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2 (7) : 633-641 참조, 여기서 질소 고정 비콩과 식물(Parasponia andersonii) 및 관련 비 질소 고정 비콩과 식물(Trema tomentosa)의 헤모글로빈 유전자에서 분리된 두 가지 뿌리 특이적 프로모터가 기술된다. 이들 유전자의 프로모터는 β-글루쿠로니다제 리포터 유전자에 연결되어 비콩과 식물(Nicotiana tabacum) 및 콩과 식물(Lotus corniculatus) 모두에 도입되었으며 두 경우 모두 뿌리 특이적 프로모터 활성이 보존되었다. Leach와 Aoyagi(1991)는 아그로박테리움 리히조게네스의 고도로 발현된 rolC 및 rolD 뿌리 유도 유전자의 프로모터에 대한 분석을 기술한다(Plant Science (Limerick) 79 (1):69-76 참조). 그들은 인핸서와 조직이 선호하는 DNA 결정 인자가 이러한 프로모터에서 해리된다는 결론을 내렸다. Teeri 등 (1989)은 lacZ에 대한 유전자 융합을 사용하여 옥토핀 신타아제를 암호화하는 아그로박테리움 T-DNA 유전자가 뿌리 끝의 표피에서 특히 활동적이며 TR2' 유전자가 온전한 식물에서 뿌리 특이적이며 잎 조직의 상처에 의해 자극, 살충 또는 유충 유전자와 함께 사용하기에 특히 바람직한 특성 조합이라는 것을 입증하였다(EMBO J. 8 (2) : 343-350 참조). nptll(네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II)에 융합된 TRI' 유전자는 유사한 특성을 보였다. 추가의 뿌리 선호 프로모터는 VfENOD-GRP3 유전자 프로모터(Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4) : 759-772) 및 rolB 프로모터(Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25 (4) : 681-691))를 포함한다. 또한, 미국 특허 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 및 5,023,179 참조. 애기 장대(Arabidopsis thaliana) 뿌리 선호 조절 서열은 미국 특허 출원 US20130117883에 개시되어 있다. 뿌리 선호 수수(Sorghum bicolor) RCc3 프로모터는 미국 특허 출원 US2012/0210463에 개시되어 있다. 미국 특허 출원 공개 2003/0131377, 미국 특허 7,645,919 및 8,735,655의 뿌리 선호 옥수수 프로모터. 미국 특허 출원 공개 2013/0025000의 뿌리 캡 특이적 1(ZmRCP1) 옥수수 프로모터. 미국 특허 출원 공개 2013/0312136의 뿌리 선호 옥수수 프로모터.
"종자 선호 프로모터"는 "종자 특이적" 프로모터(종자 저장 단백질의 프로모터와 같은 종자 성장 동안 활성인 프로모터) 및 "종자 발아" 프로모터(종자 발아 동안 활성인 프로모터) 모두를 포함한다. 본 발명에 참조로 포함된 Thompson, et al ., (1989) BioEssays 10:108 참조. 이러한 종자 선호 프로모터는 Ciml(사이토키닌-유도 메시지), cZ19Bl(옥수수 19kDa 제인) 및 milps(미오이노시톨-1-포스페이트 신타아제)(미국 특허 번호 6,225,529, 본 발명에 참조로 포함)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 감마-제인 및 Glb-1은 내배유 특이적 프로모터이다. 쌍자엽의 경우 종자 특이적 프로모터는 쿠니츠 트립신 억제제 3(KTi3)(Jofuku and Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1079-1093), 콩 β-파세오린, 나핀, β-콘글리시닌, 글리시닌 1, 콩 렉틴, 크루시페린 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단자엽 식물의 경우, 종자 특이적 촉진제는 옥수수 15kDa 제인, 22kDa 제인, 27kDa 제인, g-제인, 왁스, 슈런큰 1, 슈런큰 2, 글로불린 1 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, WO 2000/12733 참조, 여기서 end1 및 end2 유전자로부터의 종자 선호 프로모터가 개시된다; 본 발명에 참조로 포함된다. 쌍자엽에서, 종자 특이적 프로모터는 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 종자 코트 프로모터, pBAN; 및 아리비돕시스로부터의 초기 종자 프로모터, p26, p63 및 p63tr(미국 특허 7,294,760 및 7,847,153)의 초기 종자 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 조직에서 "선호하는" 발현을 갖는 프로모터는 적어도 하나의 다른 식물 조직에서보다 더 큰 정도로 그 조직에서 발현된다. 일부 조직 선호 프로모터는 특정 조직에서 거의 독점적으로 발현을 나타낸다.
낮은 수준의 발현이 요구되는 경우, 약한 프로모터가 사용될 것이다. 일반적으로, 본 발명에 사용된 용어 "약한 프로모터"는 낮은 수준에서 암호화 서열의 발현을 유도하는 프로모터를 지칭한다. 약 1/1000 전사체 내지 약 1/100,000 전사체 내지 약 1/500,000 전사체의 수준에서 낮은 수준의 발현이 의도된다. 대안적으로, 용어 "약한 프로모터"는 또한 총 낮은 수준의 발현을 제공하기 위해 다른 세포에서가 아닌 소수의 세포에서만 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 것으로 인식된다. 프로모터가 허용할 수 없을 정도로 높은 수준에서 발현을 유도하는 경우, 프로모터 서열의 일부를 삭제하거나 변형하여 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 이러한 약한 구조성 프로모터는, 예를 들어, Rsyn7 프로모터의 코어 프로모터(WO 1999/43838 및 미국 특허 6,072,050), 코어 35S CaMV 프로모터 등을 포함한다. 다른 구조성 프로모터는, 예를 들어, 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 및 6,177,611에 개시된 것들을 포함한다.
상기 프로모터 목록은 제한하려는 의도가 아니다. 임의의 적절한 프로모터가 실시태양에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 발현 카세트는 형질전환된 세포의 선택을 위한 선택 가능한 마커 유전자를 포함할 것이다. 선택 가능한 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선택에 사용된다. 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(NEO) 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT)를 암호화하는 것과 같은 항생제 내성을 암호화하는 유전자뿐만 아니라 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논 및 2,4-다이클로로페녹시아세테이트(2,4-D)와 같은 제초 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 적합한 선택 가능한 마커 유전자의 추가 예는 클로람페니콜에 대한 내성을 암호화하는 유전자(Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2 : 987-992); 메토트렉세이트(Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303 : 209-213 및 Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16 : 807-820); 스트렙토마이신(Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210 : 86-91); 스펙티노마이신(Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5 : 131-137); 블레오마이신(Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7 : 171-176); 설폰아마이드(Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15 : 127-136); 브로목시닐(Stalker, et al., (1988) Science 242 : 419-423); 글리포세이트(Shaw, et al., (1986) Science 233 : 478-481 및 미국 특허 출원 10/004,357 및 10/427,692); 포스피노트리신(DeBlock, et al., (l987) EMBO J. 6 : 2513-2518)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al.,(1987) Cell 49:603-612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248: 480-483; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman,(1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin) 및 Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724 참조. 이러한 개시는 본 발명에 참조로 포함된다.
상기 선택 가능한 마커 유전자의 목록은 제한을 의미하지 않는다. 임의의 선택 가능한 마커 유전자가 실시태양에서 사용될 수 있다.
식물 변형
실시태양의 방법은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 식물에 도입하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 "도입"은 서열이 식물의 세포 내부에 접근할 수 있는 방식으로 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 식물에 제시하는 것을 의미한다. 실시태양의 방법은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 식물에 도입하기 위한 특정 방법에 의존하지 않고, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 식물의 적어도 하나의 세포 내부에 접근할 수 있는 경우에만 의존한다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 식물에 도입하는 방법은 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 포함하나 이에 제한되지 않으며 당 업계에 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 "안정한 형질전환"은 식물에 도입된 뉴클레오타이드 구조체는 식물의 게놈에 통합되고 그의 자손에 의해 유전될 수 있음을 의미한다. 본 발명에 사용된 "일시적 형질전환"은 폴리뉴클레오타이드가 식물에 도입되고 식물의 게놈에 통합되지 않거나 폴리펩타이드가 식물에 도입되는 것을 의미한다. 본 발명에 사용된 "식물"은 전체 식물, 식물 기관(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체, 배아 및 이의 자손을 지칭한다. 식물 세포는 분화되거나 미분화될 수 있다(예를 들어, 캘러스, 현탁 배양 세포, 원형질체, 잎 세포, 뿌리 세포, 체관 세포 및 꽃가루).
뉴클레오타이드 서열을 식물에 도입하기 위한 프로토콜뿐만 아니라 형질전환 프로토콜은 형질전환을 위해 표적화된 식물 또는 식물 세포, 즉 단자엽 또는 쌍자엽의 유형에 따라 달라질 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 식물 세포에 도입하고 이후 식물 게놈에 삽입하는 적합한 방법은 미세주입(Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4 : 320-334), 전기천공(Riggs, et al., (1986) Proc. Natl)을 포함합니다. . Acad. Sci. USA 83 : 5602-5606), 아그로박테리움 매개 형질전환(미국 특허 5,563,055 및 5,981,840), 직접 유전자 전달(Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3 : 2717-2722) 및 탄도 입자 가속(예를 들어, 미국 특허 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244 and 5,932,782; Tomes, et al., (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) and McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926) 및 Led 형질전환(WO 00/28058)을 포함한다. 감자 변형의 경우, Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 and Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71-78 참조. 추가 변환 절차는 Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (onion); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soybean); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926 (soybean); Finer and McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soybean); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soybean); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (rice); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maize); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maize); U.S. Pat. Nos. 5,240,855; 5,322,783 and 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maize); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (maize); Hooykaas Van Slogteren, et al., (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S. Pat. No. 5,736,369 (cereals); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, N.Y.), pp. 197-209 (pollen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker-mediated transformation); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporation); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maize via Agrobacterium tumefaciens)에서 발견될 수 있으며; 이들 모두는 본 발명에 참조로 포함된다.
특정 실시태양에서, 실시태양의 서열은 다양한 일시적 형질전환 방법을 사용하여 식물에 제공될 수 있다. 이러한 일시적 형질전환 방법은 식물에 직접 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 및 단편을 도입하거나 식물에 폴리펩타이드 전사체를 도입하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은, 예를 들어, 미세주입 또는 입자충격을 포함한다. 예를 들어, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2176-2180 and Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784 참조, 이들 모두는 본 발명에 참조로 포함된다.
대안적으로, 폴리펩타이드 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 일시적으로 식물로 형질전환될 수 있다. 이러한 기술은 바이러스 벡터 시스템 및 DNA의 후속 방출을 방지하는 방식으로 폴리뉴클레오타이드의 침전이 포함한다. 따라서, 입자 결합 DNA로부터의 전사가 발생할 수 있지만, 방출되어 게놈에 통합되는 빈도는 크게 감소된다. 이러한 방법은 폴리에틸렌이민(PEI; Sigma #P3143)으로 코팅된 입자의 사용을 포함한다.
식물 게놈의 특정 위치에서 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 실시태양에서, 원하는 게놈 위치에서 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 부위 특이적 재조합 시스템을 사용하여 달성된다. 예를 들어, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 및 WO 1999/25853 참조, 이들 모두는 본 발명에 참조로 포함된다. 간단히 말해서, 실시태양의 폴리뉴클레오타이드는 두 개의 동일하지 않은 재조합 부위가 플랭킹된 전달 카세트에 포함될 수 있다. 전달 카세트는 이식 카세트의 부위에 상응하는 두 개의 동일하지 않은 재조합 부위가 플랭킹된 표적 부위를 게놈에 안정적으로 통합시켰다. 적절한 재조합 효소가 제공되고 전송 카세트가 표적 부위에 통합된다. 따라서 관심 폴리뉴클레오타이드는 식물 게놈의 특정 염색체 위치에 통합된다.
식물 형질전환 벡터는 식물 형질전환을 달성하기 위해 필요한 하나 이상의 DNA 벡터로 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 연속적인 DNA 절편으로 구성된 식물 형질전환 벡터를 이용하는 것은 당업계에서 일반적인 관행이다. 이러한 벡터는 당업계에서 "이진 벡터"로 종종 언급된다. 이진 벡터 및 헬퍼플라스미드가 있는 벡터는 아그로박테리움 매개 형질전환에 가장 자주 사용되며, 효율적인 형질전환을 달성하는 데 필요한 DNA 세그먼트의 크기와 복잡성이 상당히 크며, 기능을 별도의 DNA 분자로 분리하는 것이 유리하다. 이진 벡터는 일반적으로 T-DNA 전달에 필요한 시스-작용 서열(예를 들어, 왼쪽 경계 및 오른쪽 경계), 식물 세포에서 발현할 수 있도록 조작된 선택 마커 및 "관심 유전자"(유전자이식 식물의 생성이 필요한 식물 세포에서 발현 할 수 있도록 조작된 유전자)를 포함하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 또한 이 플라스미드 벡터에는 박테리아 복제에 필요한 서열이 있다. 시스-작용 서열은 식물 세포로의 효율적인 전달 및 그 안에서 발현을 허용하는 방식으로 배열된다. 예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자와 살충 유전자는 왼쪽과 오른쪽 경계 사이에 위치된다. 종종 두 번째 플라스미드 벡터는 아그로박테리움에서 식물 세포로의 T-DNA 전달을 매개하는 트랜스-작용 인자를 포함한다. 이 플라스미드는 종종 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염을 허용하는 독성 기능(Vir 유전자)을 포함하고, 당업계에서 이해되는 바와 같이 경계 서열에서의 절단 및 Vir-매개 DNA 전달에 의한 DNA 전달을 허용한다(Hellens and Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). 여러 유형의 아그로박테리움 균주(예를 들어, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 등)는 식물 형질전환에 사용될 수 있다. 두 번째 플라스미드 벡터는 미세사출, 미세주사, 전기천공, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 다른 방법으로 식물을 형질전환하는 데 필요하지 않다.
일반적으로, 식물 형질전환 방법은 이종성 DNA를 표적 식물 세포(예를 들어, 미성숙 또는 성숙한 배아, 현탁 배양, 미분화 캘러스, 원형질체 등)로 전달한 다음 (선택 가능한 마커 유전자에 따라) 적절한 선택의 최대 역치 수준을 적용하여 형질전환되지 않은 세포 덩어리 그룹에서 형질전환된 식물 세포를 회수하는 것을 필요로 한다. 이종성 외래 DNA를 식물 세포에 통합한 후, 배지에서 적절한 선택의 최대 역치 수준을 적용하여 형질전환되지 않은 세포를 죽이고 이 선택 처리에서 살아남은 추정적으로 형질전환된 세포를 신선한 배지로 정기적으로 옮겨 분리 및 증식시킨다. 적절한 선택을 통한 연속 계대 및 챌린지에 의해 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포를 동정하고 증식한다. 그런 다음 분자 및 생화학적 방법을 사용하여 형질전환 식물의 게놈 내로 통합된 이종성 유전자의 존재를 동정할 수 있다.
외식편은 일반적으로 동일한 배지의 새로운 공급원으로 옮겨지고 일상적으로 배양된다. 그 후, 형질전환된 세포는 최대 역치 수준의 선별제가 보충된 재생 배지에 배치된 후 새싹으로 분화된다. 그런 다음 싹을 뿌리 싹 또는 묘목을 복구하기 위해 선택적인 뿌리 배지로 옮긴다. 그런 다음 유전자이식 묘목은 성숙한 식물로 자라 비옥한 종자를 생산한다(예를 들어, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). 외식편은 일반적으로 동일한 배지의 새로운 공급원으로 옮겨지고 일상적으로 배양된다. 형질전환 식물을 생성하는 기술과 방법에 대한 일반적인 설명은 Ayres and Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13 : 219-239 및 Bommineni and Jauhar, (1997) Maydica 42 : 107-120에서 발견된다. 형질전환된 물질은 많은 세포를 포함하기 때문에; 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포는 모두 대상 캘러스 또는 조직 또는 세포 그룹의 임의의 조각에 존재한다. 형질전환되지 않은 세포를 죽이고 형질전환된 세포가 증식하도록 허용하는 능력은 형질전환된 식물 배양을 초래한다. 종종 형질전환되지 않은 세포를 제거하는 능력은 형질전환된 식물 세포의 빠른 회복과 유전자이식 식물의 성공적인 생성에 한계가 된다.
형질전환된 세포는 통상적인 방법에 따라 식물로 성장될 수 있다. 예를 들어, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84 참조. 그런 다음, 이들 식물은 성장될 수 있고, 동일한 형질전환된 균주 또는 상이한 균주로 수분될 수 있고, 생성된 하이브리드는 동정된 원하는 표현형 특성의 구조성 또는 유도성 발현을 갖는다. 원하는 표현형 특성의 발현이 안정적으로 유지되고 유전되도록 2개 이상의 세대를 성장시킨 다음 원하는 표현형 특성의 발현이 달성되었는지 동정하기 위해 종자가 수확될 수 있다.
실시태양의 뉴클레오타이드 서열은 식물을 바이러스 또는 바이러스 핵산과 접촉시킴으로써 식물에 제공될 수있다. 일반적으로, 이러한 방법은 바이러스 DNA 또는 RNA 분자 내에 관심 뉴클레오타이드 구조체를 통합하는 것을 필요로 한다. 실시태양의 재조합 단백질은 처음에 바이러스성 다단백질의 일부로서 합성될 수 있으며, 이는 나중에 원하는 폴리펩타이드를 생산하기 위해 생체내 또는 시험관 내 단백질 분해에 의해 처리될 수 있음이 인식된다. 또한, 실시태양의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 이러한 바이러스성 다단백질은 원하는 살충 활성을 가질 수 있음이 인식된다. 이러한 바이러스 다단백질 및 이들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 실시태양에 포함된다. 식물에 뉴클레오타이드 구조체를 제공하고 바이러스 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 식물에서 암호화된 단백질을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367 및 5,316,931 참조; 본 발명에 참조로 포함된다.
엽록체의 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 8526-8530; Svab 및 Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 913-917; Svab 및 Maliga, (1993) EMBO J. 12 : 601-606 참조. 이 방법은 선택 가능한 마커를 포함하는 DNA의 입자 총 전달과 상 동성 재조합을 통해 색소체 게놈에 대한 DNA의 표적화에 의존한다. 추가로, 색소체 형질전환은 핵 암호화 및 색소체 유도 RNA 중합 효소의 조직-선호 발현에 의해 침묵 색소체 매개 유전자이식의 트랜스 활성화에 의해 달성될 수 있다. 이러한 시스템은 McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305에 보고되었다.
실시태양은 추가로 종자, 괴경, 구경, 구근, 잎 및 뿌리 및 새싹의 삽수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 실시태양의 형질전환된 식물의 식물 번식 물질에 관한 것이다.
형질전환되고 살충 단백질을 발현할 수 있는 식물 종
실시태양은 단자엽 및 쌍자엽을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있다. 관심 식물의 예는 옥수수(Zea mays), 브라시카(예를 들어, B. napus, B. rapa, B. juncea), 특히 종자유, 알팔파(Medicago sativa), 쌀(Oryza sativa), 호밀(Secale cereale), 수수(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 기장(예를 들어, 진주 기장(Pennisetum glaucum), 기장(Panicum miliaceum), 여우꼬리 기장(Setaria italica), 손가락 기장(Eleusine coracana)), 해바라기(Helianthus annuus), 잇꽃(Carthamus tinctorius), 밀(Triticum aestivum), 대두(Glycine max), 담배(Nicotiana tabacum), 감자(Solanum tuberosum), 땅콩(Arachis hypogaea), 면화(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), 고구마(Ipomoea batatus), 카사바(Manihot esculenta) , 커피(Coffea spp.), 코코넛(Cocos nucifera), 파인애플(Ananas comosus), 감귤류(Citrus spp.), 코코아(Theobroma cacao), 차(Camellia sinensis), 바나나(Musa spp.), 아보카도 (Persea americana), 무화과(Ficus casica), 구아바(Psidium guajava), 망고(Mangifera indica), 올리브(Olea europaea), 파파야(Carica papaya), 캐슈(Anacardium occidentale), 마카다미아(Macadamia integrifolia), 아몬드(Prunus amygdalus), 사탕무(Beta vulgaris), 사탕수수(Saccharum spp.), 귀리, 보리, 채소, 관상 식물 및 침엽수를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
야채는 토마토(Lycopersicon esculentum), 상추(예를 들어, Lactuca sativa), 녹색 콩(Phaseolus vulgaris), 리마 콩(Phaseolus limensis), 완두콩(Lathyrus spp.), 및 오이(C. sativus)와 같은 쿠쿠미스(Cucumis) 속의 구성원, 칸탈로프(C. cantalupensis) 및 머스크 멜론(C. melo)을 포함한다. 관상 식물은 진달래(Rhododendron spp.), 수국(Macrophylla hydrangea), 히비스커스(Hibiscus rosasanensis), 장미(Rosa spp.), 튤립(Tulipa spp.), 수선화(Narcissus spp.), 피튜니아(Petunia hybrida), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima) 및 국화를 포함한다. 실시태양을 실행하는 데 사용될 수 있는 침엽수는 예를 들어, 로블리 소나무(Pinus taeda), 슬래시 소나무(Pinus elliottii), 폰데로사 소나무(Pinus ponderosa), 로지폴 소나무(Pinus contorta) 및 몬테레이 소나무(Pinus radiata)와 같은 소나무; 더글러스 전나무(Pseudotsuga menziesii); 서양 헴록(Tsuga canadensis); 시트카 스프루스(Picea glauca); 레드 우드(Sequoia sempervirens); 은 전나무(Abies amabilis) 및 발삼 전나무(Abies balsamea)와 같은 참 전나무; 서양 적 삼나무(Thuja plicata) 및 알래스카 황색 삼나무(Chamaecyparis nootkatensis)와 같은 삼나무를 포함한다. 실시태양의 식물은 옥수수 및 대두 식물과 같은 작물 식물(예를 들어, 옥수수, 알팔파, 해바라기, 브라시카, 대두, 목화, 잇꽃, 땅콩, 수수, 밀, 기장, 담배 등)을 포함한다.
잔디 그래스는 연간 블루그래스(Poa annua); 연간 라이그래스(Lolium multiflorum); 캐나다 블루그래스(Poa compressa); 츄잉 페스큐(Festuca rubra); 콜로니얼 벤트그래스(Agrostis tenuis); 크리핑 벤트그래스(Agrostis palustris); 크레스트 휘트그래스(Agropyron desertorum); 페어웨이 휘트그래스(Agropyron cristadtum); 하드 페스큐(Festuca longifolia); 켄터키 블루그래스(Poa pratensis); 오키드그래스(Dactylis glomerata); 다년생 라이그래스(Lolium perenne); 레드 페스큐(Festuca rubra); 레드탑(Agrostis alba); 러프 블루그래스(Paa trivialis); 쉽 페스큐(Festuca ovina); 스무스 브로메그래스(Bromus inermis); 톨 페스큐(Festuca arundinacea); 티모시(Phleum pratense); 벨벳 벤트 그래스(Agrostis canina); 수양 알칼리그래스(Puccinellia distans); 웨스턴 휘트그래스(Agropyron smithi); 버뮤다그래스(Cynodon spp.); 세인트 어거스틴 그래스(Stenotaphrum secundatum); 조이시아 그래스(Zoysia spp.); 바이아 그래스(Paspalum notatum); 카펫 그래스(Axonopus aifinis); 센티페드 그래스(Eremochloa ophiuroides); 카쿠유 그래스(Pennisetum clandesinum); 씨쇼어 파스팔룸(Paspalum vaginatum); 블루 그램마(Bouteloua gracilis); 버팔로 그래스(Buchloe dactyloids); 사이드오츠 그램마(Bouteloua curtipendula)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
관심 식물은 곡물, 관심 종자를 제공하는 곡물 식물, 유지 종자 식물 및 콩과 식물을 포함한다. 관심 종자는 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 수수, 호밀, 기장 등과 같은 곡물 종자를 포함한다. 유지 종자는 면화, 대두, 홍화, 해바라기, 브라시카, 옥수수, 알팔파, 야자, 코코넛, 아마, 피마자, 올리브 등을 포함한다. 콩과 식물은 콩과 완두콩을 포함한다. 콩은 구아, 메뚜기콩, 호로파, 대두, 정원 콩, 동부, 녹두, 리마콩, 누에콩, 렌즈 콩, 병아리콩 등을 포함한다.
형질전환 평가
이종성 외래 DNA를 식물 세포에 도입한 후, 이종성 유전자의 식물 게놈 내로의 형질전환 또는 통합은 통합 유전자와 관련된 핵산, 단백질 및 대사 산물의 분석과 같은 다양한 방법에 의해 동정된다.
PCR 분석은 토양에 이식하기 전에 초기 단계에서 통합된 유전자의 존재에 대해 형질전환된 세포, 조직 또는 새싹을 스크리닝하는 빠른 방법이다(Sambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). PCR은 관심 유전자 또는 아그로박테 리움 벡터 배경 등에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행된다.
식물 형질전환은 게놈 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 동정될 수 있다(Sambrook and Russell, (2001) supra). 일반적으로 총 DNA는 형질전환체에서 추출되어 적절한 제한 효소로 분해되고 아가로스 겔에서 분별되어 나이트로셀룰로오스 또는 나일론 막으로 옮겨진다. 이어서, 막 또는 "블롯"은 표준 기술에 따라 식물 게놈으로 도입된 유전자의 통합을 동정하기 위해 방사성 표지된 32P 표적 DNA 단편으로 프로브된다(Sambrook and Russell, (2001) supra).
노던 블롯 분석에서, RNA는 형질전환체의 특정 조직으로부터 분리되고, 포름 알데하이드 아가로스 겔에서 분별되고, 당업계에서 일상적으로 사용되는 표준 절차에 따라 나일론 필터에 블롯팅된다(Sambrook and Russell, (2001) supra). 살충 유전자에 의해 암호화된 RNA의 발현은 그 후 당해 분야에 공지된 방법에 의해 필터를 살충 유전자로부터 유래된 방사성 프로브에 혼성화함으로써 테스트된다(Sambrook and Russell, (2001) supra).
웨스턴 블롯, 생화학적 분석 등은 교시된 살충 단백질에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 사용하여 표준 절차(Sambrook and Russell, 2001, supra)에 의해 살충 유전자에 의해 암호화된 단백질의 존재를 동정하기 위해 유전자이식 식물에서 수행될 수 있다.
식물에서 유전자이식 형질 누적
유전자이식 식물은 본 발명에 개시된 하나 이상의 살충 폴리뉴클레오타이드의 스택을 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오타이드와 함께 포함하여 다중 폴리펩타이드 서열의 생성 또는 억제를 초래할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 스택을 포함하는 유전자이식 식물은 전통적인 육종 방법 중 하나 또는 둘 모두에 의해 또는 유전 공학 방법을 통해 얻을 수 있다. 이들 방법은 각각 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 개개의 계통을 육종하고, 본 발명에 개시된 유전자를 포함하는 유전자이식 식물을 후속 유전자로 형질전환시키고, 유전자를 단일 식물 세포로 공동-형질전환하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "누적된"은 동일한 식물에 존재하는 다중 형질을 갖는 것을 포함한다(즉, 두 형질 모두 핵 게놈에 통합되고, 하나의 형질이 핵 게놈에 통합되고, 하나의 형질이 색소체의 게놈에 통합되거나 두 형질이 색소체의 게놈에 통합된다). 하나의 비 제한적인 예에서, "누적된 형질"은 서열이 서로 물리적으로 인접한 분자 스택을 포함한다. 본 발명에 사용된 형질은 특정 서열 또는 서열 그룹으로부터 유래된 표현형을 지칭한다. 유전자의 공동-형질전환은 다중 유전자를 포함하는 단일 형질전환 벡터 또는 다중 벡터 상에서 개별적으로 운반되는 유전자를 사용하여 수행될 수 있다. 서열이 식물을 유전적으로 형질전환하여 누적되는 경우, 관심 폴리뉴클레오타이드 서열은 언제든지 임의의 순서로 조합될 수 있다. 형질은 임의의 형질전환 카세트 조합에 의해 제공되는 관심 폴리뉴클레오타이드와 함께 공동 형질전환 프로토콜에서 동시에 도입될 수있다. 예를 들어, 두 개의 서열이 도입되는 경우, 두 서열은 별도의 형질전환 카세트(trans)에 포함되거나 동일한 형질전환 카세트(cis)에 포함될 수 있다. 서열의 발현은 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 특정 경우에, 관심 폴리뉴클레오타이드의 발현을 억제할 형질전환 카세트를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 식물에서 원하는 형질의 조합을 생성하기 위해 다른 억제 카세트 또는 과발현 카세트의 임의의 조합과 조합될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 부위-특이적 재조합 시스템을 사용하여 원하는 게놈 위치에 누적될 수 있다는 것이 추가로 인식된다. 예를 들어, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 및 WO 1999/25853 참조, 이들 모두는 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에서, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 곤충 저항성 형질과 함께 누적된 본 발명에 개시된 살충 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 추가 입력 형질(예를 들어, 제초제 저항성, 진균 저항성, 바이러스 저항성, 스트레스 내성, 질병 저항성, 남성 불임, 줄기 강도 등) 또는 출력 형질(예를 들어, 증가된 수율, 변형된 전분, 개선된 오일 프로파일, 균형 잡힌 아미노산, 높은 라이신 또는 메티오닌, 증가된 소화율, 개선된 섬유 품질, 가뭄 저항성 등)로 누적될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드 실시태양은 임의의 수의 농경 해충을 유연하고 비용 효과적으로 제어할 수 있는 능력과 함께 개선된 작물 품질의 완전한 농경 패키지를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
누적에 유용한 유전자이식은 다른 살충 단백질, 예를 들어 모나리신, PIP, Cry, Cyt, Vip, TC 및 이들의 임의 조합을 포함한다. 이러한 살충 단백질은 세부내용의 이전 섹션에서 매우 자세히 설명되었다.
교시된 살충 단백질과 함께 누적하는 데 유용한 다른 유전자이식은 식물 질병 저항성, 곤충 특이적 호르몬 또는 페로몬, 항진균 활성 및 살선충 활성을 암호화하는 유전자를 포함한다.
제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자이식은 또한 다음을 포함하는 교시된 살충 단백질과 누적될 수 있다(아래 9개의 제초제 부류의 비 제한적 부류):
(1) 이미다졸리논 또는 설포닐우레아와 같은 성장 점 또는 분열 조직을 억제하는 제초제에 대한 내성을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. 예를 들어, Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 and Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449에 기술된 바와 같이 이 범주의 예시적인 유전자는 돌연변이 ALS 및 AHAS 효소를 돌연변이 ALS 및 AHAS 효소에 대해 암호화한다. 또한, 미국 특허 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937 및 5,378,824; 미국 특허 출원 Ser. 11/683,737 및 국제 공개공보 WO 1996/33270 참조.
(2) 글리포세이트(각각 돌연변이 5-에놀피루블-3-포스피키메이트 신타아제(EPSPS) 및 aroA 유전자에 의해 내성이 부여됨) 및 글루포시네이트(포스피노트리 신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 및 스트렙토마이세스 하이드로스포피쿠스 포스피노오트리신 아세틸 트랜스페라제(bar) 유전자), 피리딘옥시 또는 페녹시 프로프리온산 및 사이클로헥손(ACCase 억제제 암호화 유전자)에 대한 내성을 위한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. 예를 들어, Shah, et al의 미국 특허 4,940,835는 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 EPSPS 형태의 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 또한, 이런 목적을 위해 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허 6,566,587; 6,338, 961; 6,248,876 Bl; 6,040,497; 5,804,425; 5,633,435; 5,145, 783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 5,094,945, 4,940, 835; 5,866,775; 6,225,114 Bl; 6,130,366; 5,310,667; 4,535, 060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; Re. 36,449; RE 37,287 E 및 5,491,288 및 국제 공개공보 EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 및 EP 1173582 참조. 글리포세이트 내성은 또한 이런 목적을 위해 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허 5,776,760 및 5,463,175에 상세하게 기술된 바와 같이 글리포세이트 옥시도-리덕타제 효소를 암호화하는 유전자를 발현하는 식물에 부여된다. 또한, 글리포세이트 내성은 글리포세이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자의 과발현에 의해 이 식물에 부여될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 7,462,481; 7,405,074 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2008/0234130 참조. 돌연변이 aroA 유전자를 암호화하는 DNA 분자는 ATCC® 수탁 번호 39256으로 얻을 수 있으며, 돌연변이 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Comai의 미국 특허 4,769,061에 개시된다. Kumada et al의 EP 출원 번호 0 333 033 및 Goodman, et al의 미국 특허 4,975,374는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 신타아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Leemans et al의 EP 출원 번호 0 242 246 및 0 242 236에 제공되며, De Greef et al., (1989) Biol Technology 7:61은 포스 피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 유전자이식 식물의 생산을 기술한다. 또한 미국 특허 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616 B1 및 5,879,903 참조, 이 목적을 위해 본 발명에 참조로 포함된다. 페녹시 프로피온산 및 사이클로 헥산, 예컨대 세톡시딤 및 할옥시에 대한 내성을 부여하는 예시적인 유전자는 Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435에 의해 기술된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다.
(3) 트라이아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조나이트릴(나이트릴라제 유전자)과 같은 광합성을 억제하는 제초제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3 : 169는 돌연변이 psbA 유전자를 암호화하는 플라스미드에 의한 클라미도모나스의 형질전환을 기술한다. 나이트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 Stalker의 미국 특허 5,569,085에 개시되어 있으며 이들 유전자를 포함하는 DNA 분자는 ATCC® 수탁 번호 53435, 67441 및 67442로 구입할 수 있다. 글루타티온 S-전이 효소를 암호화하는 DNA의 클로닝 및 발현은 Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173에 의해 기술된다.
(4) 이 효소를 발현하는 식물이 여러 종류의 제초제에 내성을 갖도록 만드는 것으로 밝혀진 아세토하이드록시 산 합성 효소에 대한 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 다양한 식물에 도입되었다(예를 들어, Hattori, et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:419 참조). 제초제에 대한 내성을 부여하는 다른 유전자는 쥐 사이토크롬 P4507Al 및 효모 NADPH-사이토크롬 P450 산화환원효소의 키메라 단백질을 암호화하는 유전자(Shiota, et al., (1994) Plant Physiol. 106 : l 7), 글루타티온 환원효소에 대한 유전자 및 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol. 36 : 1687) 및 다양한 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자(Datta, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20 : 619)를 포함한다.
(5) 엽록소 생산에 필요한 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스)를 표적으로하는 제초제에 대한 내성을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. 프로톡스 효소는 다양한 제초 화합물의 표적 역할을 한다. 이 제초제는 또한 존재하는 모든 다른 종의 식물의 성장을 억제하여 완전한 파괴를 일으킨다. 이러한 제초제에 내성이 있는 변경된 프로톡스 활성을 포함하는 식물의 개발은 미국 특허 6,288,306 Bl; 6,282,837 Bl 및 5,767,373 및 국제 공개 WO 2001/12825에 기술된다.
(6) aad-1 유전자(원래 스핀고비움 허비시도보란스(Sphingobium herbicidovorans)에서 유래)는 아릴옥시알카노에이트 다이옥시게나제(AAD-1) 단백질을 암호화한다. 이 형질은 2,4-다이클로로 페녹시 아세트산 및 아릴옥시페녹시 프로피오네이트(일반적으로 퀴잘로포프와 같은 "fop"제초제라고 함) 제초제에 대한 내성을 부여한다. 식물에서 제초제 내성을 위한 aad-1 유전자 그 자체가 WO 2005/107437에 처음 공개되었다(US 2009/0093366 참조). 델피티아 아시도보란스에서 유래된 aad-12 유전자는 페녹시 옥신(예를 들어, 2,4-D, MCPA) 및 피리딜옥시 옥신(예를 들어, 플루록시피르, 트라이클로피르)을 포함하는 아릴옥시알카노에이트 모이어티로 여러 제초제를 불활성화함으로써 2,4-다이클로로페녹시아세트산 및 피리딜옥시아세테이트 제초제에 내성을 부여하는 아릴옥시알카노에이트 다이옥시게나제(AAD-12) 단백질을 암호화한다.
(7) 디캄바 내성을 부여하기 위해 미국 특허 출원 공개공보 2003/0135879에 개시된 제초제 저항성 디캄바 모노옥시게나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(8) 브로목시닐 내성을 부여하기 위한 미국 특허 4,810,648에 개시된 브로목시닐 나이트릴라제(Bxn)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
(9) 노르플루라존 내성의 경우 Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833-840 및 Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481-489에 기술된 피토엔(crtl)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
변경된 곡물 특성을 부여하거나 그에 기여하는 유전자이식은 또한 다음을 포함하여 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다(곡물의 변경된 지방산에 관한 아래의 비제한적 부류): (1) 식물의 스테아르산 함량을 증가시키는 스테아로일-ACP의 하향 조절. Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 and WO 1999/64579 (Genes to Alter Lipid Profiles in Corn) 참조. (2) FAD-2 유전자 변형을 통한 올레산 상승 및/또는 FAD-3 유전자 변형을 통한 리놀렌산 감소(미국 특허 6,063,947; 6,323,392; 6,372,965 및 WO 1993/11245 참조). (3) WO 2001/12800에서와 같이 공액 리놀렌산 또는 리놀레산 함량 변경. (4) LECl, AGP, Dekl, Superall, mil ps, Ipal, Ipa3, hpt 또는 hggt와 같은 다양한 Ipa 유전자 변경. 예를 들어, WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, U.S. Pat. 6,423,886, 6,197,561, 6,825,397 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2003/0079247, US 2003/0204870 및 Rivera-Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5620-5624. (5) 장쇄 다중 불포화 지방산을 만들기위한 델타-8(미국 특허 8,058, 571 및 8,338,152), 포화 지방을 낮추기 위한 델타-9 불포화 효소(미국 특허 8,063,269), 오메가-3 지방산 프로파일을 개선하기 위한 프리뮬라 A6 불포화효소 암호화하는 유전자. (6) 지질 및 당 대사 조절과 관련된 분리된 핵산 및 단백질, 특히 유전자이식 식물을 생산하고 지질, 지방산, 전분 또는 종자 저장 단백질을 포함하는 종자 저장 화합물의 수준을 조절하는 방법에 사용된, 특히, 지질 대사 단백질(LMP) 및 식물의 종자 크기, 종자 수, 종자 무게, 뿌리 길이 및 잎 크기를 조절하는 방법에 사용(EP 2404499). (7) 식물에서 HSI2의 발현을 증가 또는 감소시키기 위해 식물에서 높은 수준의 당-유도성 2(HSI2) 단백질 발현의 변화. HSI2의 발현을 증가시키면 오일 함량이 증가하는 반면 HSI2의 발현이 감소하면 앱시스산 민감도가 감소하고 가뭄 저항성이 증가합니다 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0066794). (8) 시토크롬 b5(Cb5)를 단독으로 또는 FAD2와 함께 발현하여 식물 종자의 오일 함량을 조절하고, 특히 오메가-3 지방산의 수준을 높이고 오메가-6 대 오메가-3 지방산의 비율을 개선한다(미국 특허 출원 공개공보 2011/0191904). (9) 당 대사를 조절하기 위한 주름진 1-유사 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자(미국 특허 8,217,223).
변경된 곡물 특성을 부여하거나 그에 기여하는 유전자이식은 또한 다음을 포함하여 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다(곡물의 변경된 인 함량에 관한 아래의 비제한적 부류): (1) 유전자를 암호화하는 피타제의 도입은 피테이트의 분해를 향상시켜서, 형질전환된 식물에 더 많은 유리 인산염을 추가시킨다. 예를 들어, 아스퍼길루스 니거 피타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 공개에 대해서는 Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87 참조. (2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자 조절. 예를 들어, 옥수수에서, 이것은 WO 2005/113778에서와 같이 낮은 수준의 피트 산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에서 동정된 LPA 대립 유전자와 같은 하나 이상의 대립 유전자와 관련된 DNA를 복제한 다음 재도입 및/또는 WO 2002/059324, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0009011, WO 2003/027243, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0079247, WO 1999/05298, 미국 특허 6,197,561, 미국 특허 6,291,224, 미국 특허 6,391,348, WO 2002/059324, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0079247, WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147에서와 같이 이노시톨 키나제 활성을 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
변경된 곡물 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자이식은 또한 다음을 포함하여 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다(곡물의 변경된 탄수화물 함량과 관련된 아래의 비제한적인 부류): (1) 전분의 분지 패턴에 영향을 미치는 효소에 대한 유전자 또는 NTR 및/또는 TRX와 같은 티오레독신을 변경하는 유전자를 변형(이 목적을 위해 참조로 포함된 미국 특허 6,531,648 참조) 및/또는 감마 제인 녹아웃 또는 cs27 또는 TUSC27 또는 en27과 같은 돌연변이체(이 목적을 위해 참조로 포함된 미국 특허 6,858,778 및 미국 특허 출원 공개공보 2005/0160488, 미국 특허 출원 공개공보 2005/0204418 참조). Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (nucleotide sequence of Streptococcus mutant fructosyltransferase gene), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (nucleotide sequence of Bacillus subtilis levansucrase gene), Pen, et al., (1992) Biotechnology 10:292 (production of transgenic plants that express Bacillus licheniformis alpha-amylase), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (nucleotide sequences of tomato invertase genes), Segaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (site-directed mutagenesis of barley alpha-amylase gene) and Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (maize endosperm starch branching enzyme II), WO 1999/10498 (improved digestibility and/or starch extraction through modification of UDP-D-xylose 4-epimerase, Fragile 1 and 2, Refl, HCHL, C4H), U.S. Pat. No. 6,232,529 (method of producing high oil seed by modification of starch levels (AGP)) 참조. 본 발명에 언급된 지방산 변형 유전자는 또한 전분 및 오일 경로의 상호관계를 통해 전분 함량 및/또는 조성에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다.
변경된 곡물 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자이식은 또한 다음을 포함하여 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다(곡물의 변경된 항산화 함량에 관한 아래의 비제한적 부류): (1) 토코페롤 또는 토코트리에놀의 변경. 예를 들어, 항산화제 수준의 조작을 필요로 하는 미국 특허 6,787,683, 미국 특허 출원 공개공보 2004/0034886 및 호모젠티세이트 제라닐제라닐 트랜스퍼라제(hggt)의 변경을 통한 WO 2003/082899 참조.
변경된 곡물 특성을 부여하거나 그에 기여하는 유전자이식은 또한 다음을 포함하는 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다: (곡물의 변경된 필수 아미노산 함량에 관한 아래의 비제한적인 부류): (1) 예를 들어, 미국 특허 6,127,600 (method of increasing accumulation of essential amino acids in seeds), 미국 특허 6,080,913 (binary methods of increasing accumulation of essential amino acids in seeds), 미국 특허 5,990,389 (high lysine), WO 1999/40209 (alteration of amino acid compositions in seeds), WO 1999/29882 (methods for altering amino acid content of proteins), 미국 특허 5,850,016 (alteration of amino acid compositions in seeds), WO 1998/20133 (proteins with enhanced levels of essential amino acids), 미국 특허 5,885,802 (high methionine), 미국 특허 5,885,801 (high threonine), 미국 특허 6,664,445 (plant amino acid biosynthetic enzymes), 미국 특허 6,459,019 (increased lysine and threonine), 미국 특허 6,441,274 (plant tryptophan synthase beta subunit), 미국 특허 6,346,403 (methionine metabolic enzymes), 미국 특허 5,939,599 (high sulfur), 미국 특허 5,912,414 (increased methionine), WO 1998/56935 (plant amino acid biosynthetic enzymes), WO 1998/45458 (engineered seed protein having higher percentage of essential amino acids), WO 1998/42831 (increased lysine), 미국 특허 5,633,436 (increasing sulfur amino acid content), 미국 특허 5,559, 223 (synthetic storage proteins with defined structure containing programmable levels of essential amino acids for improvement of the nutritional value of plants), WO 1996/01905 (increased threonine), WO 1995/15392 (increased lysine), 미국 특허 출원 공개공보 2003/0163838, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0150014, 미국 특허 출원 공개공보 2004/0068767, 미국 특허 6,803,498, WO 2001/79516 참조.
남성 불임을 부여하거나 기여하는 유전자이식은 또한 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다. 부위 특이적 DNA 통합을 위한 부위를 생성하는 유전자이식은 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다.
작물 식물의 비 생물적 스트레스 저항성에 영향을 미치는 유전자이식은 개화, 이삭 및 종자 발달, 질소 이용 효율 향상, 변형된 질소 반응성, 가뭄 저항성 또는 내성, 추위 저항성 또는 내성 및 염 저항성 또는 내성 및 스트레스 하의 증가된 수율을 포함하나 이에 제한되지 않는 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다. 교시된 살충 단백질과 누적될 수 있는 비 생물적 스트레스 저항성 유전자의 추가 예는 다음을 포함한다: (1) 물 사용 효율이 말레이트의 변형을 통해 변형되는 WO 2000/73475; 미국 특허 5,892,009, 5,965,705, 5,929,305, 5,891,859, 6,417,428, 6,664,446, 6,706,866, 6,717,034, 6,801,104, WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/035727 WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521. (2) CBF 유전자를 포함하는 유전자 및 식물에 대한 동결, 고염도 및 가뭄의 부정적인 영향을 완화하고 식물 표현형에 다른 긍정적인 효과를 부여하는 데 효과적인 전사 인자를 기술하는 WO 199938977. (3) 앱시스산이 식물에서 변경되어 수확량 증가 및/또는 비 생물학적 스트레스에 대한 내성 증가와 같은 개선된 식물 표현형을 생성하는 미국 특허 출원 공개공보 2004/0148654 및 WO 2001/36596. (4) 사이토키닌 발현이 변형되어 가뭄 내성 및/또는 수확량 증가와 같은 스트레스 내성이 증가된 식물을 생성하는 WO 2000/006341, WO 2004/090143, 미국 특허 7,531,723 및 6,992,237. 또한, WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, 미국 특허 6,084,153, WO 2001/64898, 미국 특허 6,177,275 및 미국 특허 6,107,547(enhancement of nitrogen utilization and altered nitrogen responsiveness) 참조. (5) 에틸렌 변형의 경우, 미국 특허 출원 공개공보 2004/0128719, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0166197 및 WO 2000/32761 참조. (6) 식물 전사 인자 또는 비 생물적 스트레스의 전사 조절제에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0098764 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0078852. (7) 수율 증가를 위해 AVP1(미국 특허 번호 8,058,515)과 같은 액포 파이로포스파타제의 발현을 증가시키는 유전자; HSF A4 또는 HSFA5(부류 A4 또는 A5의 열 충격 인자) 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 수송 단백질(OPT4-유사) 폴리펩타이드; 플라스토크론 2-유사(PLA2-유사) 폴리펩타이드 또는 우스첼 관련 호메오박스 I-유사(WOXl-유사) 폴리펩타이드(미국 특허 출원 공개공보 US 2011/0283420)를 암호화하는 핵산. (8) 활력 증가를 위해 프로그램된 세포 사멸을 조절하는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 하향 조절(미국 특허 8,058,510) (9) 가뭄 저항성을 부여하기 위한 DTP21 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(미국 특허 출원 공개공보 US 2011/0277181). (10) 발달 조절, 스트레스에 대한 반응 조절 및 스트레스 내성 조절을 위한 ACC 신타아제 3(ACS3) 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(미국 특허 출원 공개공보 US 2010/0287669). (11) 가뭄 내성을 부여하기 위해 가뭄 내성 표현형(DTP)을 부여하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(WO 2012/058528). (12) 가뭄 및 염 내성을 부여하기 위한 토코페롤 사이클라제(TC) 유전자(미국 특허 출원 공개공보 2012/0272352). (13) 스트레스 내성을 위한 CAAX 아미노 말단 패밀리 단백질(미국 특허 8,338,661). (14) SAL1 암호화 유전자의 돌연변이는 가뭄 저항성 증가를 포함하여 스트레스 내성이 증가하였다(미국 특허 출원 공개공보 2010/0257633). (15) GRF 폴리펩타이드, RAAl-유사 폴리펩타이드, SYR 폴리펩타이드, ARKL 폴리펩타이드 및 YTP 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 발현은 수율 관련 형질을 증가시킨다(미국 특허 출원 공개공보 2011/0061133). (16) 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시키고, 특히 종자 수확량을 증가시키기 위한 부류 III 트레할로스 인산염 인산분해 효소(TPP) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현 조절(미국 특허 출원 공개공보 2010/0024067). (17) 가뭄 내성 표현형(DTP6) 폴리펩타이드, 특히 미국 특허 출원 공개공보 2014/0223595의 AT-DTP6을 암호화하는 핵산 서열의 발현.
수확량, 개화, 식물 성장 및/또는 식물 구조와 같은 식물 성장 및 농경학적 특성에 영향을 미치는 기타 유전자 및 전사 인자는 식물에 도입되거나 유전자침투될 수 있으며, 예를 들어, WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 및 미국 특허 6,573,430 (TFL), 미국 특허 6,713,663 (FT), WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FRI), WO 1997/29123, 미국 특허 6,794,560, 미국 특허 6,307,126 (GAI), WO 1999/09174 (D8 및 Rht) 및 WO 2004/076638 및 WO 2004/031349 (전사 인자) 참조.
작물에 증가된 수확량을 부여하는 유전자이식은 또한 교시된 살충 단백질과 함께 누적될 수 있다: (1) 1-아미노사이클로프로페인-1-카복실레이트 데아미나제-유사 폴리펩타이드(ACCDP) 암호화 핵산에 의해 형질전환된 유전자이식 작물 식물, 여기서 작물 식물에서 핵산 서열의 발현은 식물의 야생형 품종과 비교하여 식물의 증가된 뿌리 성장, 및/또는 증가된 수확량 및/또는 환경 스트레스에 대한 증가된 내성을 초래한다(미국 특허 8,097,769). (2) 종자 선호 프로모터를 사용한 옥수수 징크 핑거 단백질 유전자(Zm-ZFP1)의 과발현은 식물 성장을 향상시키고, 식물 당 커널 수 및 총 커널 중량을 증가시키는 것으로 나타났다(미국 특허 출원 공개공보 2012/0079623). (3) 옥수수 측면 기관 경계(LOB) 도메인 단백질(Zm-LOBDP1)의 구조성 과발현은 식물 당 커널 수와 총 커널 중량을 증가시키는 것으로 나타났다(미국 특허 출원 공개공보 2012/0079622). (4) VIM1(Variant in Methylation 1)-유사 폴리펩타이드 또는 VTC2-유사(GDP-L-갈락토스 포스포릴라제) 폴리펩타이드 또는 DUF1685 폴리펩타이드 또는 ARF6-유사(Auxin Responsive Factor) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 식물에서 발현을 조절하여 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시킨다(WO 2012/038893). (5) Ste20-유사 폴리펩타이드 또는 이의 상동체를 암호화하는 핵산의 식물에서 발현을 조절하면 대조군 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공한다(EP 2431472). (6) 식물의 뿌리 구조를 변형하기 위한 뉴클레오시드 다이포스파타제키나제(NDK) 폴리펩타이드 및 이의 상동체를 암호화하는 유전자(미국 특허 출원 공개공보 2009/0064373).
일부 양태에서, 살충 단백질은 규제 승인을 받은 임의의 유전적 특성과 함께 누적될 수 있다. 이러한 형질의 비 포괄적 목록은 US 2016/0366891 A1의 표 4A-4F에서 찾을 수 있으며, 이는 여기에 참조로 포함된다. 또한, 본 발명에서 교시된 신규 살충 단백질은 아래에 열거된 표 B-G의 임의의 유전적 형질과 누적되거나 조합될 수 있다.
표 B - 살충 단백질과 조합될 수 있는 쌀 형질
Figure pct00002
표 C - 살충 단백질과 조합될 수 있는 알팔파 특성
Figure pct00003
표 D - 살충 단백질과 조합될 수 있는 밀 형질
Figure pct00004
표 E - 살충 단백질과 조합될 수 있는 해바라기 형질
Figure pct00005
표 F - 살충 단백질과 조합될 수 있는 대두 형질
Figure pct00006
Figure pct00007
표 G - 살충 단백질과 조합될 수 있는 옥수수 형질
Figure pct00008
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살충 단백질을 발현하기 위한 미생물의 이용
관심있는 하나 이상의 작물의 "식물권"(계층, 계통권, 근권 및/또는 리조플라나)을 차지하는 것으로 알려진 미생물 숙주가 선택될 수 있다. 이러한 미생물은 특정 환경에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있고, 본 발명에서 교시된 살충 단백질을 발현하는 유전자의 안정적인 유지 및 발현을 제공하고, 환경 분해 및 비활성화로로부터 살충제의 개선된 보호를 제공하도록 선택된다.
이러한 미생물은 박테리아, 조류 및 진균을 포함한다. 특히 박테리아, 예를 들어, 슈도모나스(Pseudomonas), 에르위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 클레브시엘라(Klebsiella), 잔토모나스(Xanthomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 메틸리우스(Methylius), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실루스(Lactobacillus), 아트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 레우코노스톡(Leuconostoc) 및 알칼리젠스(Alcaligenes), 진균, 특히 효모, 예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토콕커스(Cryptococcus), 글루이베로마이세스(Kluyveromyces), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula) 및 아우레오바시디움(Aureobasidium)과 같은 미생물이 관심을 받는다. 특히 슈도모나스 시린지애(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 질루오레센스(Pseudomonas jluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 세라티아 마세센스(Serratia marcescens), 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum), 아그로박테리아(Agrobacteria), 로도슈도모나스 스피에로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 잔토모나스 캠페스트리스(Xanthomonas campestris), 리히조비움 멜리오티(Rhizobium melioti), 알칼리겐스 엔트로푸우스(Alcaligenes entrophus), 클라비박터 자일리(Clavibacter xyli) 및 아조토박터 바이넬란디(Azotobacter vinelandii)와 같은 식물권 박테리아 및 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), R. 글루티니스(R. glutinis), R. 마리나(R. marina), R. 아우란티아카(R. aurantiaca), 크립토콕커스 알비두스(Cryptococcus albidus), C. 디플루엔스(C. diffluens), C. 라우렌티(C. laurentii), 사카로마이세스 로세이(Saccharomyces rosei), S. 프레토리엔시스(S. pretoriensis), S. 세레브스재(S. cerevzszae), 스포로볼로마이세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), S. 오도루스(S. odorus), 클루이베로마이세스 베로내(Kluyveromyces veronae) 및 아우레오바시디움 폴루란스(Aureobasidium pollulans)와 같은 식물권 효모가 관심을 받고 있다. 특히 착색 미생물이 관심을 받고 있다. 특히 관심 숙주 유기체는 로도토룰라 spp.(Rhodotorula spp.), 아우레오바실디움 spp.(Aureobasidium spp.), 사카로마이세스 spp.(예를 들어, S. cerevisiae), 스포로볼로마이세스 spp.(Sporobolomyces spp.)와 같은 효모, 슈도모나스 spp.(예를 들어, P. aeruginosa, P.jluorescens, P. chlororaphis), 에르위니아 spp. 및 플라보박테리움 spp과 같은 계층 유기체 및 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 대장균(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 등을 포함하는 다른 이런 유기체이다.
교시된 살충 단백질을 암호화하는 유전자는 식물(착생식물(epiphytes))에서 증식하는 미생물에 도입될 수 있다. 착생식물은 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있다. 뿌리 콜로니화 박테리아는 당업계에 공지된 방법에 의해 관심 식물로부터 분리될 수 있다. 교시된 살충 단백질을 암호화하는 유전자는, 예를 들어, 전기 형질전환을 통해 뿌리 콜리니화 또는 착생 박테리아에 도입될 수 있다. 유전자는 셔틀 벡터, 예를 들어 pHT3101에 복제될 수 있다(Lerecius, et al., (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60 : 211-218). 특정 폴리펩타이드 유전자에 대한 암호화 서열을 함유하는 셔틀 벡터 pHT3101는, 예를 들어, 전기 천공법을 통해 박테리아로 형질전환될 수 있다(Lerecius, et al., (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60 : 211-218). 교시된 살충 단백질이, 예를 들어, 대장균과 같은 그람 음성 박테리아의 세포질 외부에서 분비되도록 발현 시스템이 디자인될 수 있다.
본 발명에서 교시된 살충 단백질은 박테리아 숙주에서 발효될 수 있고, 생성 된 박테리아는 Bt 균주가 살충 스프레이로 사용된 것과 동일한 방식으로 미생물 스프레이로 처리되고 사용될 수 있다. 바실러스로부터 분비되는 살충 단백질의 경우, 분비 신호는 당업계에 공지된 절차를 사용하여 제거되거나 돌연변이된다. 이러한 돌연변이 및/또는 결실은 발효 과정에서 단백질이 성장 배지로 분비되는 것을 방지한다. 살충 단백질은 세포 내에 유지되고 세포는 캡슐화된 단백질을 생성하기 위해 처리된다. 임의의 적절한 미생물이 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 슈도모나스는 Bt 독소를 캡슐화된 단백질로 발현하고 생성된 세포를 살충제로 처리하고 살포하는 데 사용되었다(Gaertner, et al., (1993), in: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).
대안적으로, 교시된 살충 단백질은 이종성 유전자를 세포 숙주에 도입함으로써 생산된다. 이종성 유전자의 발현은 직접 또는 간접적으로 살충제의 세포내 생산 및 유지에 영향을 미친다. 그런 후에 이러한 세포는 세포가 표적 해충(들)의 환경에 적용될 때 세포에서 생성된 독소의 활성을 연장하는 조건에서 처리된다. 생성된 생성물은 독소의 독성을 유지한다. 이러한 자연적으로 캡슐화된 단백질은 표적 해충, 예를 들어, 식물의 토양, 물 및 잎사귀를 호스팅하는 환경에 적용하기 위한 통상적인 기술에 따라 제제화될 수 있다. 예를 들어, EPA 0192319 및 본 발명에 인용된 참고 문헌 참조.
살충제 조성물
일부 실시태양에서, 활성 성분은 조성물의 형태로 적용될 수 있고, 다른 화합물로 동시에 또는 연속적으로 처리될 작물 영역 또는 식물에 적용될 수 있다. 이들 화합물은 비료, 제초제, 동결 방지제, 계면 활성제, 세제, 살충 비누, 휴면 오일, 중합체 및/또는 제제의 단일 적용 후 표적 영역의 장기간 투여를 허용하는 시간 방출 또는 생분해성 담체 제제일 수 있다. 이들은 또한, 원하는 경우, 농업적으로 허용 가능한 담체, 계면 활성제 또는 제제 업계에서 통상적으로 사용되는 도포 촉진 보조제와 함께 선택적인 제초제, 화학 살충제, 바이러스 박멸제, 살균제, 아베마 살충제, 살충제, 살진균제, 살균제, 선충제, 연체제 또는 이들 제제의 혼합물일 수 있다. 적합한 담체(즉, 농업적으로 허용 가능한 담체) 및 보조제는 고체 또는 액체일 수 있으며 제형 기술에서 일반적으로 사용되는 물질, 예를 들어 천연 또는 재생 미네랄 물질, 용제, 분산제, 습윤제, 접착제, 점착제, 결합제 또는 비료에 해당한다. 마찬가지로, 제제는 식용 미끼로 제조되거나 해충 트랩으로 만들어 살충 제제의 급식 또는 표적 해충에 의한 섭취를 허용할 수 있다.
박테리아 균주에 의해 생산된 교시된 살충 단백질 중 하나 이상을 함유하는 활성 성분 또는 농약 조성물을 적용하는 방법은 잎 적용, 종자 코팅 및 토양 적용을 포함한다. 적용 횟수와 적용 속도는 해당 해충의 감염 강도에 따라 다르다.
상기 조성물은 분말, 분진, 펠릿, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드, 용액 등으로 제제화될 수 있으며, 폴리펩타이드를 포함하는 세포 배양물의 건조, 동결 건조, 균질화, 추출, 여과, 원심 분리, 침강 또는 농축과 같은 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 이러한 살충 폴리펩타이드를 함유하는 이러한 모든 조성물에서, 폴리펩타이드는 약 1중량% 내지 약 99중량%의 농도로 존재할 수 있다.
나비목, 파리목, 노린재목, 노린재아목, 회충목 또는 딱정벌레목은 본 발명의 방법에 의해 소정의 영역에서 죽이거나 그 수가 감소될 수 있거나, 감수성 해충에 의한 침입을 방지하기 위해 환경 영역에 예방적으로 적용될 수있다. 바람직하게는 해충은 개시된 살충 단백질의 살충 유효량을 섭취하거나 접촉된다. "살충 유효량"은 적어도 하나의 해충을 죽일수 있거나 해충의 성장, 급식 또는 정상적인 생리적 발달을 현저하게 감소시킬 수 있는 살충제의 양을 의미한다. 이 양은, 예를 들어, 제어할 특정 표적 해충, 특정 환경, 위치, 식물, 작물 또는 처리될 농업 현장, 환경 조건 및 살충 효과가 있는 단백질 조성물의 적용 방법, 비율, 농도, 안정성, 및 양과 같은 인자에 의해 달라질 것이다. 제제는 또한 기후 조건, 환경 고려 사항 및/또는 적용 빈도 및/또는 해충 침입의 심각성에 따라 달라질 수 있다.
기술된 살충제 조성물은 원하는 농업상 허용 가능한 담체와 함께 박테리아 세포, 결정 및/또는 포자 현탁액, 또는 분리된 단백질 성분을 제제화함으로써 제조될 수 있다.
조성물은 투여 전에 동결 건조, 동결 건조, 건조와 같은 적절한 수단으로 또는 수성 담체, 매질 또는 적절한 희석제, 예컨대 식염수 또는 다른 완충액으로 제제화될 수 있다. 제제화된 조성물은 분진 또는 과립 물질 또는 오일 중 현탁액(식물성 또는 광물성) 또는 물 또는 오일/물 에멀젼 중의 현탁액 또는 습윤성 분말로서 또는 농업 적용에 적합한 임의의 다른 담체 물질과 조합된 형태일 수 있다. 적합한 농업용 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며 당업계에 잘 알려져 있다. 용어 "농업적으로 허용 가능한 담체"는 살충제 제제 기술에서 일반적으로 사용되는 모든 보조제, 불활성 성분, 분산제, 계면 활성제, 접착제, 점착제, 결합제 등을 포함하며; 이들은 살충제 제제의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 제제는 하나 이상의 고체 또는 액체 보조제와 혼합되고 다양한 수단에 의해, 예를 들어 통상적인 제제 기술을 사용하여 적절한 보조제와 살충 조성물을 균질하게 혼합, 블렌딩 및/또는 분쇄함으로써 제조될 수 있다. 적합한 제제 및 적용 방법은 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허 6,468,523에 기술된다. 식물은 또한 하나 이상의 제초제, 살충제 또는 살진균제를 포함하는 하나 이상의 화학적 조성물로 처리될 수 있다.
예시적인 화학적 조성물은 다음을 포함한다: 과일/야채 제초제: 아트라진, 브로마실, 디우론, 글리포세이트, 리누론, 메트리부진, 시마진, 트라이플루랄린, 플루아지포프, 글루포시네이트, 할로 설푸론 고완, 파라콰트, 프로피자미드, 세톡시딤, 부타페나실, 할로설푸론, 인다지플람; 과일/야채 살충제; 알디카브, 바실루스 써린지엔시스, 카바릴, 카보푸란, 클로르피리포스, 사이퍼메트린, 델타메트린, 디아지논, 말라티온, 아바멕틴, 사이플루트린/베타사이플루트린, 에스펜발레레이트, 람다-사이할로트린, 아세퀴노실, 바이페나제이트, 메톡시페노지드, 노발루론, 클로마펜조이드, 티아클로프리드, 디노테푸란, 플루아크리피림, 톨펜피라드, 클로티아니딘, 스피로디클로펜, 감마-사이할로트린, 스피로메시펜, 스피노사드, 리낙시피르, 사이아지피르, 스피네토람, 트라이플루무론, 스피로테트라마트, 이미다클로프리드, 플루벤다이아마이드, 티오디카브, 메타플루미존, 설폭사플로르, 사이플루메토펜, 사이아노피라펜, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 스피네토람, 티오디카브, 플로니카미드, 메티오카브, 에마멕틴 벤조에이트, 인독사카브, 프로티아제이트, 펜아미포스, 카두사포스, 피리프록시펜, 펜부타틴 옥사이드, 헥스티아족스, 메토밀, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온; 과일 야채 살균제: 카벤다짐, 클로로티알로닐, EBDCs, 황, 티오파네이트-메틸, 아족시스트로빈, 사이목사닐, 플루아지남, 포세틸, 아이프로디논, 크렉소임-메틸, 메타락시/메페녹삼, 트라이플루옥시스트로빈, 에타복삼, 아이프로발리카브, 트라이플록시스트로빈, 펜헥사미드, 옥시포코나졸 퓨마레이트, 사이아조파미드, 펜아미돈, 족사미드, 피콕시스트로빈, 피라클로스토로빈, 사이플루펜아미드, 보스칼리드; 곡초 제초체: 아이소프로투론, 브로목시닐, 옥시닐, 페녹시엔스, 클로르설푸론, 클로디나포프, 디클로포프, 디플루페니칸, 페녹사프로프, 플로라술람, 플루오로옥시피르, 메트설푸론, 트라이아설푸론, 플루카바존, 로도설푸론, 프로폭시카바존, 피콜리나펜, 메소설푸론, 베플루부타미드, 피녹사덴, 아미도설푸론, 티펜설푸론 메틸, 트라이베누론, 플루피르설푸론, 설포설푸론, 피라설포톨, 피록술람, 플루페나세트, 트라알콕시딤, 피록사설폰; 곡초 살균제: 카벤다짐, 클로로탈로닐, 아족시스트로빈, 사이프로코나졸, 사이프로디닐, 펜프로피모르피, 에폭시코나졸, 크렉스옥심-메틸, 퀴녹시펜, 테부코나졸, 트라이플록시스트로빈, 시메코나졸, 피콕시스트로빈, 피라클로스트로빈, 딤옥시스트로빈, 프로티오코나졸, 플록사스트로빈; 곡초 살충제: 디메토에이트, 람다-사이할로트린, 델타메트린, 알파-사이퍼메트린, β-사이플루트린, 바이펜트린, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세타미프리드, 디네토푸란, 클로르피리포스, 메타미도포스, 옥사이드메톤 메틸, 피리미카브, 메티오카브; 옥수수 제초제: 아트라진, 알클로로, 브로목시닐, 아세토클로르, 디캄바, 클로피라리드, S-다이메텐아미드, 클루포시네이트, 글리포세이트, 아이소옥사플루톨, S-메톨라클로르, 메소트리온, 니코설푸론, 프리미설푸론, 림설푸론, 설코트리온, 포람설푸론, 토프라메존, 템보트리온, 사플루페나실, 티엔카바존, 플루페나세트, 피로옥사설폰; 옥수수 살충제: 카보푸란, 클로르피리포스, 바이펜트린, 피프로닐, 이미다클로프리드, 람다-사이할로트린, 테플루트린, 터부포스, 티아메톡삼, 클로티아니딘, 스피로메시펜, 플루벤다이아미드, 트라이플루무론, 리낙시피르, 델타메트린, 티오디카브, β-사이플루트린, 사이퍼메트린, 비펜트린, 루페누론, 트라이플루모론, 테플루트린, 테부피림포스, 에티프롤, 사이아지피르, 티아클로프리드, 아세타미프리드, 디네토퓨란, 아베멕틴, 메티오카브, 스피로디클로펜, 스피로네트라매트; 옥수수 살균제: 페니트로판, 티람, 프로티오코나졸, 테부코나졸, 트라이플록시스트로빈; 쌀 제초제: 부타클로르, 프로파닐, 아짐설푸론, 벤설푸론, 사이할로포프, 다이무론, 펜트라즈아마이드, 이마조설푸론, 메페나세트, 옥사지클로메폰, 피라조설푸론, 피리부티카브, 퀸클로락, 티오벤카브, 인다노판, 플루페나세트, 펜트라자미드, 할로설푸론, 옥사지클로메폰, 벤조바이사이클론, 피리프탈리드, 페녹술람, 비스피리박, 옥사디아르질, 에톡시설푸론, 프레틸라클로르, 메소트리온, 테푸릴트리온, 옥시다이아존, 페녹사프로프, 피리미설푸란; 쌀 살충제: 디아지논, 페니트로티온, 페노부카브, 모노크로토포스, 벤푸라카브, 부프로페진, 디노테푸란, 피프로닐, 이미다클로프리드, 아이소프로카브, 티아클로프리드, 클로마페노지드, 티아클로프리드, 디노테푸란, 클로티아니딘, 에티프롤, 플루벤다이아마이드, 리낙시피르, 델타메트린, 아세타미프리드, 티아메톡삼, 사이아지피르, 스피노사드, 스피네토람, 에마멕틴-벤조에이트, 사이퍼메트린, 클로르피리포스, 카르탭, 메타미도포스, 에토펜프록스, 트라이아조포스, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 카보퓨란, 벤퓨라카브; 쌀 살균제: 티오파네이트-메틸, 아족시스트로빈, 카프로파미드, 에디펜포스, 페림존, 이프로벤포스, 아이소프로티오레인, 펜사이큐론, 프로베나졸, 피로퀴론, 트라이사이클라졸, 트라이플록시스트로빈, 디클로사이메트, 페녹사닐, 시메코나졸, 티아디닐; 면 제초체: 디루론, 플루오메투론, MSMA, 옥시플루오르펜, 프로메트린, 트라이플루라린, 카펜트라존, 클레토딤, 플루아지포프-부틸, 글리포세이트, 노르플라존, 펜디메탈린, 피리티오박-소듐, 트라이플록시설푸론, 테프랄옥시딤, 글루포시네이트, 플루미옥사진, 티디아주론; 면 살충제: 아세페이트, 알디카브, 클로르피리포스, 사이퍼메트린, 델타메트린, 말라티온, 모노크로토포스, 아바멕틴, 아세타미프리드, 에마멕틴 벤조에이트, 이미다클로프리드, 인독사카브, 람다-사이할로트린, 스피노사드, 티오다이카브, 감마-사이할로트린, 스피로메시펜, 피리달일, 플로니카미드, 플루벤다이아마이드, 트라이플루무론, 라닉시피르, 베타-사이플루트린, 스피로테트라매트, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 다이네토푸란, 플루벤다이아마이드, 사이아지피르, 스피노사드, 스피네토람, 감마 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 티오디카브, 아베멕틴, 플로니카미드, 피리달일, 스피로메시펜, 설폭사플로로, 프로페노포스, 트리아조포스, 엔도설판; 면 살균제: 에트리디아졸, 메타락실, 퀸토젠; 대두 제초체: 알라클로르, 벤타존, 트라이플루랄린, 클로리무론-에틸, 클로란설람-메틸, 페녹사프로프, 포메사펜, 플루아지포프, 글리포세이트, 이마자목스, 이마자퀸, 이마제타피르, (S-)메톨라클로르, 메트리부진, 펜디메탈린, 테프랄옥시딤, 글루포시네이트; 대두 살충제: 람다-사이할로트린, 메토밀, 파라티온, 티오카브, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세타미프리드, 디네토퓨란, 플루벤다이아마이드, 리낙시피르, 사이아지피르, 스피노사드, 스피네토람, 에마멕틱-벤조에이트, 피프로닐, 에티프롤, 델타메트린, β-사이플루트린, 감마 및 람다 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 스피로테트라매트, 스피노다이클로펜, 트라이플루무론, 플로니카미드, 티오다이카브, 베타-사이플루트린; 대두 살균제: 아족시스트로빈, 사이프로코나졸, 에폭시코나졸, 플루트라이아폴, 피라클로스트로빈, 테부코나졸, 트라이플록시스트로빈, 프로티오코나졸, 테트라코나졸; 사탕무 제초체: 클로리다존, 데스메디팜, 에토퓨메세이트, 펜메디펨, 트라이알레이트, 클로피라리드, 플루아지포프, 레나실, 메타미트론, 퀸메락, 사이클로옥시딤, 트라이플루설푸론, 테프랄옥시딤, 퀴잘로포프; 사탕무 살충제: 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세트미프리드, 디네토퓨란, 델타메트린, β-사이플루트린, 감마/람다 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 테플루트린, 리낙시피르, 사이악시피르, 피프로닐, 카보퓨란; 캐놀라 제초제: 클로피랄리드, 디클로포프, 플루아지포프, 클루포시네이트, 글리포세이트, 메타자클로르, 트라이플루라린 에타메트설퓨론, 퀸메락, 퀴자로포프, 클레토딤, 테프라옥시딤; 캐놀라 살균제: 아족시스트로빈, 카벤다짐, 플루디옥소닐, 이프로디논, 프로클로라즈, 빈클로졸린; 캐놀라 살충제: 카보퓨란 오가노포스페이트, 피레트로이드, 티아클로프리드, 델타메트린, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 아세타미프리드, 디네토퓨란, β-사이플루트린, 감마 및 람다 사이할로트린, 타우-플루발레리에이트, 에티프롤, 스피노사드, 스피네토람, 플루벤다이아마이드, 리낙시피르, 사이아지피르, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온.
해충
"해충"은 곤충, 진균, 박테리아, 선충류, 진드기, 진드기 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 곤충 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 새털이아목, 매미목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목, 집게벌레목, 흰개미, 이아목, 벼룩, 날도래목 등, 특히 나비목 및 딱정벌레목으로부터 선택된 곤충을 포함한다.
당업자는 모든 화합물이 모든 해충에 대해 동등하게 효과적인 것은 아니라는 것을 인식할 것이다. 실시태양의 화합물은 경제적으로 중요한 농경, 산림, 온실, 종묘장 장식물, 식품 및 섬유, 공공 및 동물 건강, 가정 및 상업 구조물, 가정 및 저장 제품 해충을 포함할 수 있는 해충에 대한 활성을 나타낸다.
나비목의 유충은 밤나방과(Noctuidae) Spodoptera frugiperda J E Smith (가을 거염벌레); S. exigua Hubner(비트 거염벌레); S. litura Fabricius(담배 야도충, 클러스터 애벌레); Mamestra configurata Walker(베르싸 거염벌레); M. brassicae Linnaeus(양배추 나방); Agrotis ipsilon Hufnagel(검은 야도충); A. orthogonia Morrison(웨스턴 야도충); A. subterranea Fabricius(과립 야도충); Alabama argillacea Hubner(면화 잎 벌레); Trichoplusia ni Hubner(양배추 자벌레); Pseudoplusia includens Walker(대두 자벌레); Anticarsia gemmatalis Hubner(벨벳 콩 애벌레); Hypena scabra Fabricius(그린 클로버 벌레); Heliothis virescens Fabricius(담배 나방); Pseudaletia unipuncta Haworth(거염벌레); Athetis mindara Barnes and Mcdunnough(거친 표면 야도충); Euxoa messoria Harris(어두운면 야도충); Earias insulana Boisduval(스피니 볼웜(spiny bollworm)); E. vittella Fabricius(스폿티드 볼웜(spotted bollworm)); Helicoverpa armigera Hubner(아메리칸 볼웜(American bollworm)); H. zea Boddie(옥수수 이어웜(corn earworm) 또는 면화 볼웜(cotton bollworm)); Melanchra picta Harris(얼룩말 애벌레); Egira(Xylomyges) curialis Grote(시트러스 야도충)의 거염벌레(armyworms), 야도충(cutworms), 자벌레(loopers) 및 헬리오틴(heliothines); 명나방과(Pyralidae) Ostrinia nubilalis Hubner(유럽 옥수수 천공충); Amyelois transitella Walker(나발 오렌지웜(naval orangeworm)); Anagasta kuehniella Zeller(지중해 밀가루 나방); Cadra cautella Walker(아몬드 나방); Chilo suppressalis Walker(라이스 스템 천공충; C. partellus,(수수 천공충); Corcyra cephalonica Stainton(쌀 나방); Crambus caliginosellus Clemens(옥수수 뿌리 거미집벌레); C. teterrellus Zincken(블루그래스 거미집벌레); Cnaphalocrocis medinalis Guenee(쌀 잎 롤러(roller); Desmia funeralis Hubner(포도 립폴더(leaffolder)); Diaphania hyalinata Linnaeus(멜론 웜); D. nitidalis Stoll(피클웜(pickleworm)); Diatraea grandiosella Dyar(남서부 옥수수 천공충), D. saccharalis Fabricius (사탕수수 천공충); Eoreuma loftini Dyar(멕시코 쌀 천공충); Ephestia elutella Hubner(담배(카카오) 나방); Galleria mellonella Linnaeus(꿀벌부채명나방(greater wax moth)); Herpetogramma licarsisalis Walker(소드 거미집벌레(sod webworm)); Homoeosoma electellum Hulst(해바라기 나방); Elasmopalpus lignosellus Zeller(레서 옥수수대 천공충(lesser cornstalk borer)); Achroia grisella Fabricius(레서 왁스 나방(lesser wax moth)); Loxostege sticticalis Linnaeus(비트 거미집벌레); Orthaga thyrisalis Walker(차 나무 거미집 나방); Maruca testulalis Geyer(옥수수 깍지 천공충); Plodia interpunctella Hubner(인디언 밀 나방); Scirpophaga incertulas Walker(옐로우 스템 천공충(yellow stem borer)); Udea rubigalis Guenee(셀러리 립티어(celery leaftier))의 천공충(borers), 케이스 베어러(case bearers), 거미집벌레(webworms), 콘벌레(coneworms), 및 스켈레토나이저(skeletonizers); 및 잎말이나방과(Pyralidae) Acleris gloverana Walsingham(웨스턴 블랙헤드 버드웜(Western blackheaded budworm)); A. variana Fernald(이스턴 블랙헤드 버드웜(Eastern blackheaded budworm)); Archips argyrospila Walker(과일 나무 ?? 롤러(fruit tree leaf roller)); A. rosana Linnaeus(유러피언 립 롤러(European leaf roller))의 립롤러, 버드웜, 씨드웜 및 과일 웜; 및 다른 Archips 종, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm(서머 푸룻 토릭스 나방(summer fruit tortrix moth)); Cochylis hospes Walsingham(밴디드 썬플라워 나방(banded sunflower moth)); Cydia latiferreana Walsingham(필베르트웜(filbertworm)); C. pomonella Linnaeus(콜딩 나방(colding moth)); Platynota flavedana Clemens(베리게이티드 립롤러(variegated leafroller)); P. stultana Walsingham(잡식성 립롤러(omnivorous leafroller)); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller(유럽 포도덩굴 나방); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller(아이스폿티드 버드 나방(eyespotted bud moth)); Endopiza viteana Clemens(그레이프 베리 나방(grape berry moth)); Eupoecilia ambiguella Hubner(덩굴 나방(vine moth)); Bonagota salubricola Meyrick(브라질리언 애플 립롤러(Brazilian apple leafroller)); Grapholita molesta Busck(오리엔탈 푸룻 나방(oriental fruit moth)); Suleima helianthana Riley(해바라기 버드 나방(sunflower bud moth)); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
나비목의 선택된 다른 농경 해충은 Alsophila pometaria Harris(가을 자벌레(fall cankerworm)); Anarsia lineatella Zeller(복숭아나무 가지 천공충); Anisota senatoria J. E. Smith(오렌지 스트라이프 오크웜(orange striped oakworm)); Antheraea pernyi Guerin-Meneville(차이니스 오크 투사하 나방(Chinese Oak Tussah Moth)); Bombyx mori Linnaeus(실크웜(Silkworm)); Bucculatrix thurberiella Busck(면화 잎 천공충(cotton leaf perforator)); Colias eurytheme Boisduval(알팔파 애벌레); Datana integerrima Grote & Robinson(호두나무 애벌레); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov(시베리아 실크 나방, Ennomos subsignaria Hubner(느름나무 자벌레(elm spanworm)); Erannis tiliaria Harris(보리수 자벌레(linden looper)); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus(갈색꼬리 나방(browntail moth)); Harrisina americana Guerin-Meneville(포도잎 스켈레토나이저(grapeleaf skeletonizer)); Hemileuca oliviae Cockrell(레인지 애벌레(range caterpillar)); Hyphantria cunea Drury(가을 거미집벌레(fall webworm)); Keiferia lycopersicella Walsingham(토마토 핀웜(tomato pinworm)); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst(이스턴 헴락 자벌레(Eastern hemlock looper)); L. fiscellaria lugubrosa Hulst(웨스턴 헴락 자벌레(Western hemlock looper); Leucoma salicis Linnaeus(사틴 나방(satin moth)); Lymantria dispar Linnaeus(집시 나방(gypsy moth)); Manduca quinquemaculata Haworth(박쥐나방(five spotted hawk moth), 토마토 혼웜(tomato hornworm)); M. sexta Haworth (토마토 홈웜(tomato homworm), 토마토 혼웜(tobacco hornworm)); Operophtera brumata Linnaeus(겨울 나방); Paleacrita vernata Peck(봄 자벌레); Papilio cresphontes Cramer(자이언트 스왈로우테일 오렌지 도그(giant swallowtail orange dog)); Phryganidia californica Packard(캘리포니아 오크웜(California oakworm)); Phyllocnistis citrella Stainton(시트러스 립마이너(citrus leafminer)); Phyllonorycter blancardella Fabricius(스폿티드 덴티폼 립마이너(spotted tentiform leafminer)); Pieris brassicae Linnaeus(대형 흰색 나비); P. rapae Linnaeus(소형 흰색 나비); P. napi Linnaeus(녹색 덩굴 흰색 나비); Platyptilia carduidactyla Riley(아티초크 깃털 나방(artichoke plume moth)); Plutella xylostella Linnaeus(배추좀나방(diamondback moth); Pectinophora gossypiella Saunders(핑크 볼웜(pink bollworm)); Pontia protodice Boisduval and Leconte(서던 캐비지웜(Southern cabbageworm)); Sabulodes aegrotata Guenee(잡식성 자벌레); Schizura concinna J. E. Smith(레드 헴프 애벌레(red humped caterpillar)); Sitotroga cerealella Olivier(잉고우모이스 그레인 나방)(Angoumois grain moth); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller(파인 프로세세셔너리 애벌레(pine processionary caterpillar); Tineola bisselliella Hummel(웨빙 클로스 나방(webbing clothes moth)); Tuta absoluta Meyrick(토마토 립마이너(tomato leafminer)); Yponomeuta padella Linnaeus(집나방(ermine moth)); Heliothis subflexa Guenee; Malacosoma spp. 및 Orgyia spp를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
소바구미과(Anthribidae), 콩바구미과(Bruchidae) 및 바구미과(Curculionidae)로부터의 위빌(Anthonomus grandis Boheman(볼 위빌(boll weevil)); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel(라이스 워터 위빌(rice water weevil)); Sitophilus granarius Linnaeus(그라나리 위빌(granary weevil)); S. oryzae Linnaeus(라이스 위빌(rice weevil)); Hypera punctata Fabricius(클로버 잎 위빌(clover leaf weevil)); Cylindrocopturus adspersus LeConte(해바라기 줄기 위빌(sunflower stem weevil)); Smicronyx fulvus LeConte(적색 해바라기 종자 위빌(red sunflower seed weevil)); S. sordidus LeConte(회색 해바라기 종자 위빌(gray sunflower seed weevil)); Sphenophorus maidis Chittenden(옥수수 빌버그(maize billbug)를 포함하나 이에 제한되지 않음); 잎벌레상과(Chrysomelidae)의 벼룩 잎벌레, 옥수 잎벌레, 뿌리벌레, 잎벌레, 감자 잎벌레 및 립마이너(leafminers)(Leptinotarsa decemlineata Say(콜로라도 감자 잎벌레); Diabrotica virgifera virgifera LeConte(웨스턴 옥수수 뿌리벌레); D. barberi Smith and Lawrence(노던 옥수수 뿌리벌레); D. undecimpunctata howardi Barber(서든 옥수수 뿌리벌레); Chaetocnema pulicaria Melsheimer(옥수수 벼룩 잎벌레); Phyllotreta cruciferae Goeze(십자화과 벼룩 잎벌레); Phyllotreta striolata(줄무늬 벼룩 잎벌레); Colaspis brunnea Fabricius(포도 콜라스피스(grape colaspis)); Oulema melanopus Linnaeus(시리얼 잎벌레); Zygogramma exclamationis Fabricius(해바라기 잎벌레)를 포함하나 이에 제한되지 않음); 무당벌레과(Coccinellidae)의 잎벌레(Epilachna varivestis Mulsant(멕시칸 콩 잎벌레)를 포함하나 이에 제한되지 않음); 풍뎅이과(Scarabaeidae)의 풍뎅이 및 다른 잎벌레(Popillia japonica Newman(일본 잎벌레); Cyclocephala borealis Arrow(노던 마스크 풍데이, 화이트 그럽(northern masked chafer, white grub); C. immaculata Olivier(서든 마스크 풍데이, 화이트 그럽(southern masked chafer, white grub); Rhizotrogus majalis Razoumowsky(유럽 풍뎅이); Phyllophaga crinita Burmeister(화이트 그럽(white grub)); Ligyrus gibbosus De Geer(당근 잎벌레)를 포함하나 이에 제한되지 않음); 수시렁이과(Dermestidae)의 카펫 잎벌레; 방아벌레과(Elateridae), Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.의 와이어웜; 노린재과(Scolytidae)의 수피 잎벌레 및 거저리과(Tenebrionidae)의 잎벌레를 포함하는 딱정벌레목의 유충과 성충이 관심을 받는다.
립마이너 Agromyza parvicornis Loew(콘 블로치 립마이너(corn blotch leafminer)); 모기붙이(Contarinia sorghicola Coquillett(수수 모기붙이); Mayetiola destructor Say(헤시안 플라이(Hessian fly)); Sitodiplosis mosellana Gehin(밀 모기붙이; Neolasioptera murtfeldtiana Felt(해바라기 종자 모기붙이); 과일 플라이(Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus(과일 플라이)를 포함하나 이에 제한되지 않음); 구더기(Delia platura Meigen(씨드콘 구더기(seedcorn maggot)); D. coarctata Fallen(밀 벌브 플라이(wheat bulb fly) 및 다른 Delia spp., Meromyza americana Fitch(밀 스템 구더기(wheat stem maggot)); Musca domestica Linnaeus(하우스 플라이(house flies)); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein(레서 하우스 플라이(lesser house flies)); Stomoxys calcitrans Linnaeus(스테이블 플라이(stable flies)를 포함하나 이에 제한되지 않음)); 페이스 플라이(face flies), 혼 플라이(horn flies), 블로우 플라이(blow flies), Chrysomya spp.; Phormia spp. 및 다른 모스코이드 플라이 해충(muscoid fly pests), 호오스 플라이(horse flies) Tabanus spp.; 보트 플라이(bot flies) Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; 캐틀 그럽(cattle grubs) Hypoderma spp.; 디어 플라이(deer flies) Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) 및 다른 짧은뿔파리목(Brachycera), 모기 Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; 블랙 플라이(black flies) Prosimulium spp.; Simulium spp.; 바이팅 구더기(biting midges), 샌드 플라이(sand flies), 검정날개버섯파리과(sciarids), 및 다른 긴뿔파리류(Nematocera)를 포함하는 파리목의 성충 및 유충이 관심을 받는다.
솔송나무솜벌레과(Adelgidae)의 아델지드, 장님노린재과(Miridae)의 식물 벌레, 매미상과(Cicadidae)의 매미, 매미충과(Cicadellidae)의 매미충(leafhoppers), Empoasca spp., 장삼벌레과(Cixiidae), 선녀벌레과(Flatidae), 꽃매미상과(Fulgoroidea), 알멸구과(Issidae) 및 멸구과(Delphacidae)의 벼멸구(planthoppers), 뿔매미과(Membracidae)의 뿔매비(treehoppers), 나무이과(Psyllidae)의 나무이(psyllids), 온실가루이과(Aleyrodidae)의 온실가루이(whiteflies), 진딧물과(Aphididae)의 진딧물(aphids), 필록세라과(Phylloxeridae)의 필록세라(phylloxera), 가루깍지벌레과(Pseudococcidae)의 가루깍지벌레(mealybugs), 아스테로레카니대의(Asterolecanidae), 밀깍지벌레과(Coccidae), 닥틸로피대(Dactylopiidae), 깍지벌레과(Diaspididae), 단풍주머니깍지벌레과(Eriococcidae), 도롱이깍지벌레과(Ortheziidae), 포에니코코시대(Phoenicococcidae) 및 솔껍질깍지벌레과(Margarodidae)의 깍지벌레(scales), 군배충과(Tingidae)의 군배충, 노린재과(Pentatomidae)의 노린재, 씬치 버그(cinch bugs, Blissus spp).; 및 긴노린재과(Lygaeidae)의 다른 종자 벌레, 쥐머리거품벌레과(Cercopidae)의 거품벌레, 허리노린재과(Coreidae)의 허리노린재, 별노린재과(Pyrrhocoridae)의 레드 버그(red bugs) 및 커튼 스테이너(cotton stainers)와 같으나 이에 제한되지 않는 노린재목과 매미목의 성충과 유충이 관심 곤충으로 포함된다.
매미목의 농경적으로 중요한 구성원은 Acyrthisiphon pisum Harris(완두수염진딧물; Aphis craccivora Koch(아까시아 진딧물); A. fabae Scopoli(검은콩 진딧물); A. gossypii Glover(면화 진딧물, 멜론 진딧물); A. maidiradicis Forbes(옥수수 뿌리 진딧물); A. pomi De Geer(사과 진딧물); A. spiraecola Patch(조팝나무 진딧물); Aulacorthum solani Kaltenbach(싸리수염 진딧물); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(딸기 진딧물); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko(러시안 밀 진딧물); Dysaphis plantaginea Paaserini(장미 사과 진딧물); Eriosoma lanigerum Hausmann(사과 면충); Brevicoryne brassicae Linnaeus(양배추 진딧물); Hyalopterus pruni Geoffroy(복숭아 가루 진딧물); Lipaphis erysimi Kaltenbach(무테두리 진딧물); Metopolophium dirrhodum Walker(시리얼 진딧물); Macrosiphum euphorbiae Thomas(감자 진딧물); Myzus persicae Sulzer(복숭아 진딧물, 녹색 복숭아 진딧물); Nasonovia ribisnigri Mosley(상추 진딧물); Pemphigus spp.(뿌리 진딧물 및 혹 진딧물); Rhopalosiphum maidis Fitch(옥수수 잎 진딧물); R. padi Linnaeus(버드 캐리-오트 진딧물(bird cherry-oat aphid)); Schizaphis graminum Rondani(그린버그); Sipha flava Forbes(노란 사탕수수 진딧물); Sitobion avenae Fabricius(잉글리쉬 그레인 진딧물); Therioaphis maculata Buckton(스폿티드 알팔파 진딧물(spotted alfalfa aphid)); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe(검은 감귤 진딧물) 및 T. citricida Kirkaldy(갈색 감귤 진딧물); Melanaphis sacchari(사탕수수 진딧물); Adelges spp.(아델지드); Phylloxera devastatrix Pergande(호두 필록세라(pecan phylloxera)); Bemisia tabaci Gennadius(담배 화이트플라이, 감자 화이트플라이); B. argentifolii Bellows & Perring(실버립 화이트플라이); Dialeurodes citri Ashmead(감귤 화이트플라이); Trialeurodes abutiloneus(구브러진 날개 화이트플라이)와 T. vaporariorum Westwood(그린하우스 화이프플라이); Empoasca fabae Harris(감자 매미충); Laodelphax striatellus Fallen(애멸구(smaller brown planthopper)); Macrolestes quadrilineatus Forbes(애스터 멸구(aster leafhopper); Nephotettix cinticeps Uhler(녹색 멸구(green leafhopper); N. nigropictus Stal(벼멸구); Nilaparvata lugens Stal(갈색 멸구); Peregrinus maidis Ashmead(옥수수 멸구); Sogatella furcifera Horvath(흰등멸구(white backed planthopper)); Sogatodes orizicola Muir(벼멸구(rice delphacid)); Typhlocyba pomaria McAtee(흰색 사과 멸구(white apple leafhopper)); Erythroneoura spp.(포도 멸구(grape leafhoppers)); Magicicada septendecim Linnaeus(주기매미(periodical cicada)); Icerya purchasi Maskell(이세리아깍지벌레(cottony cushion scale)); Quadraspidiotus perniciosus Comstock(산호세깍지벌레(San Jose scale)); Planococcus citri Risso(귤가루깍지벌레(citrus mealybug); Pseudococcus spp.(다른 깍지벌레 컴플렉스); Cacopsylla pyricola Foerster(배나무이(pear psylla); Trioza diospyri Ashmead(감나무이)를 추가로 포함하나 이에 제한되지 않는다.
매미목의 농경적으로 중요한 관심 종은 Acrosternum hilare Say(녹색 노린재); Anasa tristis De Geer(허리 노린재); Blissus leucopterus leucopterus Say (긴 노린재); Corythuca gossypii Fabricius(코튼 레이스 버그(cotton lace bug)); Cyrtopeltis modesta Distant(토마토 버그); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer(코튼 스테이너(cotton stainer)); Euschistus servus Say(갈색 노린재); E. variolarius Palisot de Beauvais(한 점 노린재(one spotted stink bug)); Graptostethus spp.(종자 버그의 컴플렉스(complex of seed bugs)); Leptoglossus corculus Say(소나무허리노린재(leaf footed pine seed bug)); Lygus lineolaris Palisot de Beauvais(장님노린재(tarnished plant bug)); L. Hesperus Knight(웨스턴 장님노린재(Western tarnished plant bug)); L. pratensis Linnaeus(커먼 매도우 버그(common meadow bug)); L. rugulipennis Poppius(유럽 장님노린재(European tarnished plant bug)); Lygocoris pabulinus Linnaeus(커먼 그린 캡시드(common green capsid)); Nezara viridula Linnaeus(서든 그린 노린재(southern green stink bug)); Oebalus pugnax Fabricius(쌀 노린재(rice stink bug)); Oncopeltus fasciatus Dallas(큰 밀크위드 벌레(large milkweed bug)); Pseudatomoscelis seriatus Reuter(면화 딱정벌레(cotton flea hopper)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 실시태양은 Calocoris norvegicus Gmelin(딸기 벌레); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen(애플 캡시드(apple capsid)); Cyrtopeltis modestus Distant(토마토 벌레); Cyrtopeltis notatus Distant(석플라이(suckfly)); Spanagonicus albofasciatus Reuter(흰표시 딱정벌레(whitemarked fleahopper)); Diaphnocoris chlorionis Say(주엽나무 식물 벌레(honeylocust plant bug)); Labopidicola allii Knight(양파 식물 벌레(onion plant bug)); Pseudatomoscelis seriatus Reuter(면화 딱정벌레(cotton fleahopper)); Adelphocoris rapidus Say(빠른 식물 벌레(rapid plant bug)); Poecilocapsus lineatus Fabricius(줄무늬 장님노린재(four lined plant bug)); Nysius ericae Schilling(가짜 긴노린재(false chinch bug)); Nysius raphanus Howard(가짜 긴노린재(false chinch bug)); Nezara viridula Linnaeus(서든 그린 노린재(Southern green stink bug)); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. 및 Cimicidae spp와 같은 매미목에 대해 효과적일 수 있다.
Aceria tosichella Keifer(밀 컬 응애(wheat curl mite)); Petrobia latens Muller(갈색 밀 응애(brown wheat mite)); 응애과, Panonychus ulmi Koch(유럽 적색 응애); Tetranychus urticae Koch(두 점 거미 응애); (T. mcdanieli McGregor(맥다니엘 응애(McDaniel mite); T. cinnabarinus Boisduval(진홍색 거미 응애(carmine spider mite)); T. turkestani Ugarov & Nikolski(딸기 거미 응애)와 같은 거미 응애 및 적색 응애; 애응애과, Brevipalpus lewisi McGregor(감귤 편평한 응애)의 편평한 응애; 혹응애과의 녹응애 및 꽃눈 응애 및 다른 잎 섭식 응애 및 인간과 동물 건강에 중요한 응애, 즉, 먼지진드기과(Epidermoptidae)의 먼지 응애, 모닝진드기과(Demodicidae)의 모낭 응애, 고기진드기과(Glycyphagidae)의 과립 응애, 참진드기과(Ixodidae) Ixodes scapularis Say(사슴 진드기)의 진드기; I. holocyclus Neumann(호주 마비 진드기(Australian paralysis tick)); Dermacentor variabilis Say(미국 개 진드기(American dog tick)); Amblyomma americanum Linnaeus(론스타 진드기(lone star tick)) 및 양진드기과(Psoroptidae), 물집진드기과(Pyemotidae) 및 옴진드기과(Sarcoptidae)의 딱지 응애 및 가려움 응애와 같은 진드기목(응애)의 성충 및 유충이 또한 포함된다.
Lepisma saccharina Linnaeus(양좀); Thermobia domestica Packard(얼룩좀)과 같은 좀목(Thysanura)의 곤충 해충이 관심을 받는다.
포함된 추가 절지 동물 해충은 다음을 포함한다: Loxosceles reclusa Gertsch 및 Mulaik(갈색 은둔 거미) 및 Latrodectus mactans Fabricius (검은 과부 거미)와 같은 거미목(Araneae)의 거미 및 Scutigera coleoptrata Linnaeus(집 지네)와 같은 그리마목(Scutigeromorpha)의 지네.
관심 곤충 해충은 노린재과(Pentatomidae)(Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, and Bagrada hilaris(바그라다 버그(Bagrada Bug)), 알노린재과(Plataspidae)(Megacopta cribraria-Bean plataspid) 및 땅노린재과(Cydnidae)(Scaptocoris castanea­Root stink bug)에 속하는 종 및 다이아몬드등 나방, 예를 들어, Helicoverpa zea Boddie; 대두 자벌레, 예를 들어, Pseudoplusia includens Walker 및 벨벳 콩 애벌레, 예를 들어, Anticarsia gemmatalis Hubner를 포함하나 이에 제한되지 않는 나비 종을 포함하나 이에 제한되지 않는 노린재 및 다른 관련 곤충의 상과(superfamily)를 포함한다.
살충 활성을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Czapla and Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 및 미국 특허 5,743, 477 참조, 이의 전부는 전문이 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적으로 단백질은 혼합되어 사료 공급 분석에 사용된다. 예를 들어, Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 참조. 이러한 분석은 식물을 하나 이상의 해충과 접촉시키고 식물의 생존 및/또는 해충의 죽음을 유발하는 능력을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
선충류는 Heterodera spp., Meloidogyne spp. and Globodera spp.를 포함하는 뿌리 매듭, 낭종 및 병변 선충과 같은 기생 선충; 특히 Heterodera glycines(대두 낭종 선충); Heterodera schachtii(비트 낭종 선충); Heterodera avenae(시리얼 낭종 선충) 및 Globodera rostochiensis 및 Globodera pailida(감자 낭종 선충)를 포함하나 이에 제한되지 않는 낭충 선충의 구성원을 포함한다. 병변 선충류는 Pratylenchus spp.를 포함한다.
일부 양태에서, 교시된 살충 단백질은 Cry 단백질에 저항성인 곤충에 대해 활성이다. 예를 들어, 교시 된 살충 단백질은 mCry3A, Cry3Bb1, eCry3.1Ab 및 이원 단백질 복합체 Cry34Ab1/Cry35Ab1에 저항성인 곤충에 대해 활성일 수 있다. 양태에서, 교시된 살충 단백질은 Cry 단백질(예를 들어, MON88017에 의해 발현된 Cry3Bb1 단백질)에 저항성이 있는 서부 옥수수 뿌리 벌레(WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)에 대해 활성이다. 양태에서, 교시된 살충 단백질은 Cry 단백질(예를 들어, mCry3A)에 저항성인 서부 옥수수 뿌리 벌레(WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)에 대해 활성이다. 양태에서, 교시된 살충 단백질은 Diabrotica barberi 및 Diabrotica undecimpunctata howardi의 옥수수 뿌리벌레 및 Diabrotica speciosa 및 Phyllotreta cruciferae와 같은 다른 딱정벌레 종에 독성이 있을 수 있다. 양태에서, 교시된 살충 단백질은 점박이 딱정벌레(Coleomegilla maculata) 또는 특정 나비목 또는 특정 노린재목에 독성이 없다. 본 발명에 참조로 포함된 U. Schellenberger et al., "A selective insecticidal protein from Pseudomonas for controlling corn rootworms," Science, 2016 Nov 4;354(6312):634-637 (providing IPD072Aa, an 86 AA protein, GenBank Accession No. KT795291); 및 본 발명에 참조로 포함된 Jun-Zhi Wei et al., "A selective insecticidal protein from Pseudomonas mosselii for corn rootworm control," Plant Biotechnology Journal, 2018, Vol. 16, pgs. 649-659 (providing PIP-47aa) 참조.
종자 처리
수확량 생산 및 형질 기술을 보호하고 향상시키기 위해, 종자 처리 옵션은 곤충, 잡초 및 질병에 대한 추가 작물 계획 유연성 및 비용 효과적인 방제를 제공 할 수 있다. 종자 물질은 화학적 또는 생물학적 제초제, 제초제 완화제, 살충제, 살진균제, 발아 억제제 및 증진제, 영양소, 식물 성장 조절제 및 활성화제, 살균제, 선충류 및/또는 연체 동물의 조합을 포함하는 조성물로 처리되고, 전형적으로 표면 처리될 수 있다.
이들 화합물은 전형적으로 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 추가 담체, 계면 활성제 또는 적용 촉진 보조제와 함께 제제화된다. 코팅은 번식 물질을 액체 제제로 함침시키거나 결합된 습식 또는 건식 제제로 코팅함으로써 적용될 수 있다. 종자 처리제로 사용할 수 있는 다양한 유형의 화합물의 예는 본 발명에 참조로 포함된 The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., Published by the British Crop Production Council에 제공된다.
작물 종자에 사용될 수 있는 일부 종자 처리제는 압시식산, 아시벤 졸라-S-메틸, 아버멕틴, 아미트롤, 아자코나졸, 아조스피릴룸, 아자디라크틴, 아족시스트 로빈, 바실러스 종(of cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis 및/또는 thuringiensis 종의 하나 이상을 포함), 브라디리조비움 종(betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi 및/또는 yuanmingense의 하나 이상을 포함), 캡탄, 카복신, 키토산, 클로티아니딘, 구리, 시아지피르, 디페노코나졸, 에티디아졸, 피프로닐, 플루디옥소닐, 플루옥사스트로빈, 플루퀸코나졸, 플루라졸, 플럭소페님, 헤어핀 단백질, 이마잘릴, 이미다클로프리드, 이프코나졸, 아이소플라베노이드, 리포-키토올리고사카라이드, 만코제브, 망간, 마네브, 메페녹삼, 메탈락실, 메코나졸, 마이클로부타닐, PCNB, 펜플루펜, 페니실륨, 펜티오피라드, 퍼메트린, 피콕시스트로빈, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 리낙스피르, S-메톨라클로르, 사포닌, 세닥산, TCMTB, 테부코나졸, 티아벤다졸, 티아메톡삼, 티오카브, 티람, 톨클로포스-메틸, 트라이아다이메놀, 트라이코더마, 트라이플로록시스트로빈, 트라이티코나졸 및/또는 아연을 포함하나 이에 제한되지 않는다. PCNB 시드 코트는 퀸토젠과 테라졸을 포함하는 EPA 등록 번호 00293500419를 의미한다. TCMTB는 2-(티오시아노메틸티오) 벤조티아졸을 의미한다.
특정 유전자이식 형질을 가진 종자 품종 및 종자는 어느 종자 처리 옵션 및 적용 비율이 수율을 향상시키기 위해 이러한 품종 및 유전자이식 형질을 보완할 수 있는지를 결정하기 위해 테스트될 수 있다. 예를 들어, 수율 잠재력이 좋은 품종이지만 머리 얼룩 감수성은 머리 얼룩에 대한 보호를 제공하는 종자 처리의 사용으로 이익을 얻을 수 있으며, 수율 잠재력이 좋은 품종이지만 낭종 선충 감수성은 낭종 선충에 대한 보호 등을 제공하는 종자 처리의 사용으로 이익을 얻을 수 있다. 마찬가지로, 곤충 저항성을 부여하는 유전자이식 형질을 포함하는 품종은 종자 처리에 의해 부여되는 제 2 작용 방식으로부터 이익을 얻을 수 있으며, 제초제 저항성을 부여하는 유전자이식 형질을 포함하는 품종은 제초제 등에 식물 저항성을 향상시키는 약해제를 사용한 종자 처리로부터 이익을 얻을 수 있다. 또한, 종자 처리의 적절한 사용으로 인한 좋은 뿌리 형성과 조기 출현은 보다 효율적인 질소 사용, 가뭄에 더 잘 견딜 수 있는 능력 및 종자 처리와 결합하면 특정 형질을 포함하는 품종 또는 품종들의 수율 잠재력의 전체적인 증가를 가져올 수 있다.
해충을 죽이고 곤충 개체수를 제어하는 방법
일부 실시태양에서, 곤충 해충을 본 발명에 교시된 바와 같은 살충 유효량의 재조합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하여 곤충 해충을 죽이는 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 곤충 해충을 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 살충 유효량의 살충 단백질 또는 이의 변종과 접촉시키는 단계를 포함하여 곤충 해충을 죽이는 방법이 제공된다.
일부 실시태양에서, 곤충 해충을 본 발명에 교시된 바와 같은 살충 유효량의 재조합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하여 곤충 해충 개체를 제어하는 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 곤충 해충을 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 살충 유효량의 살충 단백질 또는 이의 변종과 접촉시키는 단계를 포함하여 곤충 해충 개체를 제어하는 방법이 제공된다.
본 발명에 사용된 "해충 개체 제어" 또는 "해충을 제어한다"는 해충이 야기하는 손상을 제한하는 결과를 초래하는 해충에 대한 임의의 효과를 지칭한다. 해충을 제어하는 것은 해충을 죽이고, 해충의 발생을 억제하고, 해충이 식물에 더 적은 피해를 제공하는 방식으로 해충의 번식력 또는 성장을 변경하고, 생산된 자손의 수를 감소시키고, 덜 튼튼한 해충을 생산하고, 포식자 공격에 더 취약한 해충을 생산하거나 해충이 식물을 먹지 못하게 하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 곤충 해충을 본 발명에 교시된 바와 같은 살충 유효량의 재조합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하여 살충 단백질에 저항성인 곤충 해충 개체를 제어하는 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 곤충 해충을 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 살충 유효량의 재조합 살충 단백질 또는 이의 변종과 접촉시키는 단계를 포함하여 살충 단백질에 저항성인 곤충 해충 개체를 제어하는 방법이 제공된다.
일부 실시태양에서, 식물 또는 이의 세포에서 본 발명에 교시된 살충 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계를 포함하여 해충으로부터 식물을 보호하는 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 식물 또는 이의 세포에서 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72의 살충 단백질 또는 이의 변종을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함하여 식물을 곤충 해충으로부터 보호하는 방법이 제공된다.
식물 수율 증가 방법
식물 수율을 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명에 개시된 살충 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물 또는 식물 세포를 제공하고 폴리펩타이드가 살충 활성을 갖는 해충이 감염된 밭에서 식물 또는 이의 종자를 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리펩타이드는 나비목, 딱정벌레목, 파리목, 노린재류 또는 선충류 해충에 대해 살충 활성을 가지며, 밭은 나비목, 노린재류, 딱정벌레목, 파리목 또는 선충류 해충으로 감염된다.
본 발명에 정의된 바와 같이, 식물의 "수율"은 식물에 의해 생산된 바이오 매스의 품질 및/또는 양을 의미한다. 본 발명에 사용된 "바이오매스"는 임의의 측정된 식물 제품을 지칭한다. 바이오매스 생산의 증가는 측정된 식물 제품의 생산량의 향상이다. 식물 수율 증가는 여러 가지 상업적 응용을 가진다. 예를 들어, 식물 잎 바이오 매스를 늘리면 인간 또는 동물 소비를 위한 잎 채소의 수율이 증가할 수 있다. 또한 증가하는 잎 바이오매스를 사용하여 식물 유래 의약품 또는 산업 제품의 생산을 늘릴 수 있다. 수율의 증가는 살충 서열을 발현하지 않는 식물에 비해 적어도 1% 증가, 적어도 3% 증가, 적어도 5% 이상 증가, 적어도 10% 이상 증가, 적어도 20% 이상 증가, 적어도 30% 이상 증가, 적어도 50% 이상 증가, 적어도 70% 이상 증가, 적어도 100% 이상 증가를 포함하나 이에 제한되지 않는 통계적으로 유의 한 증가를 포함할 수 있다. 특정 방법에서, 식물 수율은 본 발명에 개시된 살충 단백질을 발현하는 식물의 개선된 해충 저항성의 결과로 증가된다.
히든 마르코프 모델
히든 마르코프 모델(HMM)은 직접 관찰할 수 없는 내부 요인에 의존하는 관찰 가능한 이벤트의 진화를 설명하는 데 사용할 수있는 통계 모델입니다. 관찰된 이벤트를 "기호"라고 하며 관찰의 기본이 되는 보이지 않는 요소를 "상태"라고 한다. HMM은 두 가지 확률적 프로세스, 즉 숨겨진 상태의 보이지 않는 프로세스와 관찰 가능한 기호의 가시적 프로세스로 구성된다. 히든 상태는 마르코프 체인을 형성하고 관찰된 기호의 확률 분포는 기본 상태에 따라 다르다. 이러한 이유로 HMM은 이중 내장 확률 프로세스라고도 한다. 많은 실제 문제가 원시 관측 값을 더 의미있는 여러 범주 또는 클래스 레이블로 분류하는 것을 다루기 때문에 이 두 계층에서 관찰을 모델링하는 것은 매우 유용하다. 이 접근 방식은 단백질 및 DNA 서열과 같은 생물학적 서열을 모델링하는 데 유용하다. 일반적으로 생물학적 서열은 서로 다른 기능을 가진 더 작은 하위 구조로 구성되며 서로 다른 기능 영역은 종종 뚜렷한 통계적 특성을 표시한다. 예를 들어, 단백질은 일반적으로 여러 도메인으로 구성된다는 것은 잘 알려져 있다. 새로운 단백질이 주어지면, HMM은 구성 도메인(HMM의 하나 이상의 상태에 해당)과 아미노산 서열에서의 위치(관찰)를 예측하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이 새로운 단백질 서열이 속한 단백질 패밀리를 찾고 싶을 수도 있다. 실제로, HMM은 생물학적 서열을 나타내는 데 매우 효과적인 것으로 나타났다. 결과적으로, HMM은 전산 분자 생물학, 생물 정보학에서 점점 인기를 얻고 있으며 HMM을 기반으로 하는 많은 최신 서열 분석 알고리즘이 구축되었다. Byung-Jun Yoon, "Hidden Markov Models and Their Applications in Biological Sequence Analysis," Current Genomics, 2009, Vol. 10, pgs. 402-415, for a comprehensive review 참조, 상기 문헌은 참조로 본 발명에 포함된다.
따라서, 마르코프 모델은 마르코프 체인을 생성하는 시스템이고, 히든 마르코프 모델은 체인 생성 규칙이 알려지지 않았거나 "숨겨진" 모델임을 알 수 있다. 규칙은 두 가지 확률을 포함한다: (i) 특정 관찰이 있을 것이고 (ii) 특정 시간에 모델의 상태를 고려하면, 특정 상태 전환이 있을 것이다. 히든 마르코프 모델(HMM) 방법은 특정 유형의 문제를 해결하는 수학적 접근 방식이다: (i) 모델이 주어지면, 관측 확률을 찾는다; (ii) 모델과 관측이 주어지면, 가장 가능성이 높은 상태 전이 궤적을 찾는다; 및 (iii) 모델의 매개 변수를 조정하여 i 또는 ii를 최대화한다. 이러한 각 문제에 대해, 알고리즘이 개발되었으며, 다른 것들 중에서, 예를 들어: (i) 포워드-백워드, (ii) Viterbi 및 (iii) Baum-Welch(및 Segmental K-평균 대안).
HMMER 소프트웨어
HMMER는 단백질 또는 DNA 서열의 상동체에 대한 서열 데이터베이스를 검색하고 서열 정렬을 만드는 데 사용되는 HMM 소프트웨어 패키지이다. HMMER는 단일 쿼리 시퀀스로 시퀀스 데이터베이스를 검색하는 데 사용할 수 있지만 쿼리가 시퀀스 패밀리의 여러 인스턴스를 정렬하는 경우 특히 강력하다. HMMER는 대체, 삽입 및 삭제에 대한 위치 특이적 스코어링 시스템을 할당하는 쿼리 프로필을 만든다. HMMER 프로파일은 "프로파일 히든 마르코프 모델"(프로필 HMM)이라고하는 확률 모델이다(Krogh et al., 1994; Eddy, 1998; Durbin et al., 1998). BLAST, FASTA 및 이전 스코어링 방법론을 기반으로 한 기타 시퀀스 정렬 및 데이터베이스 검색 도구와 비교하여 HMMER는 기본 확률 모델의 장점으로 인해 훨씬 더 정확하고 동떨어진 상동체를 더 잘 감지할 수 있는 것을 목표로 한다.
프로파일 HMM은 다중 서열 정렬 또는 단일 서열의 통계 모델이다. 이들은 정렬의 각 열이 얼마나 보존되었는지, 어떤 잔류물이 있을 가능성이 있는지에 대한 위치 특이적 정보를 캡처한다. UC 산타 크루즈의 앤더스 크로그, 데이비드 허슬러 및 동료들은 음성 인식에서 수년 동안 사용된 HMM 기술을 채택하여 컴퓨터 생물학에 프로파일 HMM을 도입하였다(Krogh et al., 1994). HMM은 크로그/허슬러 연구 이전에, 특히 게리 처칠(Churchill, 1989)에 의해 생물학에 사용되었지만 크로그 논문은 HMM 기술이 단일 쿼리 시퀀스 대신 여러 시퀀스 정렬을 사용하여 데이터베이스를 검색하는 인기 있는 "프로파일" 방법에 매우 적합했기 때문에 극적인 영향을 미쳤다. "프로파일"은 그리브코프와 동료들(Gribskov et al., 1987, 1990)에 의해 소개되었으며, 다른 여러 그룹은 "유연한 패턴"(Barton, 1990) 및 "템플릿"과 같은 유사한 접근 방식을 거의 동시에 도입하였다(Bashford et al., 1987; Taylor, 1986). "프로파일"이라는 용어는 지속된다. 모든 프로파일 방법(PSI-BLAST (Altschul et al., 1997) 포함)은 다중 서열 정렬의 합의에 대한 다소 통계적 설명이다. 이들은 아미노산 또는 뉴클레오타이드(잔기)에 대해 위치 특이적 점수를 사용하고 삽입 또는 결실을 열고 확장하기 위해 위치 특이적 페널티를 사용한다. 전통적인 쌍 정렬(예를 들어, BLAST(Altschul et al., 1990), FASTA(Pearson and Lipman, 1988) 또는 Smith/Waterman 알고리즘(Smith and Waterman, 1981))은 위치 독립적 스코어링 매개 변수를 사용한다. 프로파일의 이런 속성은 다중 정렬의 다양한 위치에서 보존 정도와 간격 및 삽입이 허용되는 다양한 정도에 대한 중요한 정보를 캡처한다.
HMM 사용의 장점은 HMM이 공식적인 확률 기반을 갖는다는 것이다. 이들은 확률 이론을 사용하여 모든 스코어링 매개 변수를 설정하는 방법을 안내한다. 예를 들어, HMM은 위치 특이적 간격 및 삽입 점수를 설정하는 일관된 이론을 가지고 있다. 이 방법은 일관되고 따라서 고도로 자동화되어 수백 개의 프로파일 HMM 라이브러리를 만들고 이를 전체 게놈 분석에 매우 대규모로 적용할 수 있다. 단백질 도메인 모델의 그러한 데이터베이스 중 하나는 Pfam(Sonnhammer et al., 1997; Finn et al., 2010)이며, 이는 Interpro 단백질 도메인 주석 시스템의 중요한 부분이다(Mulder et al., 2003). Pfam의 구성 및 사용은 HMMER 소프트웨어 패키지와 밀접하게 연결되어 있다.
살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)
본 발명은 고도로 이질적인 환경 공급원으로부터 신규 살충 단백질을 발견하기 위한 플랫폼을 제공한다. 이 방법론은 메타게놈 농축 절차와 유전적 증폭 기술을 이용하여 다양한 분류의 알려지지 않은 미생물 다양성과 그 결과 프로테옴에 접근할 수 있게 한다.
도 1은 아래에서 상세히 논의될 IPDP를 예시하는 전체 워크플로우를 제공한다.
토양 샘플 수집
풍부한 미생물 다양성을 포함하는 환경 시료로부터 1-10g의 물질을 수집한다.
완충 용액에 재현탁
환경 물질을 재현탁하고 10-100mL의 PBS(인산염 완충 용액)에서 15분 동안 지속적으로 교반한다. 그런 다음 큰 미립자를 침전시킨다.
고체 영양 제한 한천 배지에 희석 및 플랜팅
일련의 상청액 희석액을 사이클로헥사미드를 함유하는 영양 제한 한천에 플레이팅하여 진균 성장을 감소시킨다.
특정 미생물 군의 성장을 촉진하기 위해 다양한 배지 레시피가 문헌에 기술되어 있다.
현재의 IPDP는 특정 속(예를 들어, 특정 실시태양에서 슈도모나스)의 미생물을 풍부하게 하기 위해 독점 배지 및 배지 성장 절차를 이용한다.
플레이트에서 박테리아 성장 수집 - 용해 및 침전을 통해 농축된 샘플에서 모든 게놈 DNA를 혼합물로 분리
플레이트 상의 모든 박테리아 성장은 물로 세척하여 수집하고, 세포는 원심 분리에 의해 펠릿화하고, 상청액은 버린다.
표준 박테리아 게놈 DNA 분리 기술을 사용하여 펠렛화된 메타 게놈 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하였다.
모나리신 클래스의 단백질을 암호화하는 유전자는 축퇴(Degenerate) PCR을 사용하여 추가로 강화되고 회수 및 시퀀싱을 위해 플라스미드 벡터로 복제된다
메타게놈 DNA 샘플에서 모나리신 클래스의 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭하기 위해 독점 축퇴 프라이머를 사용하였다.
단백질의 "모나리신 부류"는, 예를 들어, 표 1의 SEQ ID NO: 87에 대한 유사도를 갖는 단백질일 수 있다. 본 IPDP는 독점 축퇴 프라이머의 실질적인 라이브러리를 가지고 있으며, 이는 이 부류의 단백질을 검색하는 데 사용될 수 있다.
~800bp 크기의 증폭된 DNA를 겔 전기 영동으로 분리하고 표준 기술을 사용하여 회수하였다.
축퇴 프라이머는 DNA 플라스미드로의 클로닝에 적합한 꼬리를 포함한다. PCR-증폭된 DNA를 클로닝하고 시퀀싱하여 Opota et al에서 공개된 모나리신 서열과 유사한 단백질을 암호화하는 전장 유전자를 확인하였다.
1) 영양 제한 한천에서 특정 미생물 집단의 초기 농축, 2) 농축된 집단으로부터 분리된 게놈 DNA로부터 축퇴 PCR을 사용하여 모나리신-클래스 단백질을 암호화하는 유전자의 증폭의 다음의 조합은, 일부 실시태양에서, 모나리신 유사 단백질을 암호화하는 유전자를 회수하는 데 둘 다 바람직하다.
"모나리신-유사" 단백질은 Opota, et al에 기술된 모나리신에 대한 일부 유사도를 갖는 단백질로 정의될 수 있으며, Opota, et al., "Monalysin, a Novel ß-Pore-Forming Toxin from the Drosophila Pathogen Pseudomonas entomophila, Contributes to Host Intestinal Damage and Lethality," PLoS Pathogens, September 2011, Vol. 7, Issue 9 참조(본 발명에 참조로 포함된다). 단백질의 "모나리신 유사" 및 "모나리신 부류"라는 용어는 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 앞서 언급한 바와 같이, 본 출원은 표 1의 Opota 및 SEQ ID NO : 87에 기술된 모나리신에 대한 서열을 제공한다.
원래의 환경 샘플에서 풍부한 배지에서 분리된 박테리아로부터 수집된 게놈 DNA는 축퇴 PCR을 사용하여 증폭된 산물을 생성하지 않았다. 따라서, 영양 제한 한천(특정 속의 미생물을 풍부하게 하기 위해 개발됨) 단계는 IPDP가 당업계의 현재 방법에서 종종 이용 가능하지 않은 미생물 유기체에 접근할 수 있게하는 데 성공적이다. 더욱이, 농축된 게놈 DNA의 시퀀싱은 위에 기술된 결합된 접근법(즉, 농축 및 축퇴 PCR 증폭)을 사용하여 최종적으로 얻은 서열의 수를 생산하지 않았으며, 이는 발견된 살충 단백질 서열이 농축된 집단에서도 매우 드물다는 것을 시사하며 농축 후 증폭 단계가 일부 양태에서 바람직하다.
상동성 및 프로파일/HMM 방법을 이용하는 새로운 살충 단백질 동정
IPDP는 선택적으로 살충 단백질을 동정하기 위해 HMM의 사용을 포함할 수 있다. 공지된 살충 단백질을 기반으로 구축된 HMM 프로파일(예를 들어, 공지된 모나 리신을 기반으로 구축된 HMM)을 사용하여 HMM 프로파일을 사용하여 분석할 때 높은 점수를 받는 아미노산 서열을 가진 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 강화된 DNA 라이브러리를 스캔할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 새로운 살충 단백질은 강화된 DNA 라이브러리의 서열을 게놈 데이터베이스에서 공지된 살충 단백질을 암호화하는 서열과 비교하여 동정할 수 있다. 예를 들어, BLAST와 같은 서열 분석 도구를 사용하고 GENBANK의 서열에 대해 상호 최고 히트 서열을 검색한다.
HMM 공정의 예는 실시예 5에 기재되고 본 발명에 기술된 방법을 사용하여 동정된 살충 단백질을 사용하여 구축된 HMM의 예가 표 6에 제공된다. HMM은 IPDP를 통해 발견되고 표 3에서 발견된 8 개의 살충 단백질을 사용하여 구축되었다. 이들 단백질은 a) ZIP1인 SEQ ID NO: 2, b) ZIP2인 SEQ ID NO: 4, c) ZIP6인 SEQ ID NO: 12, d) ZIP8인 SEQ ID NO: 14, e) ZIP9인 SEQ ID NO: 16, f) ZIP10인 SEQ ID NO: 18, g) ZIP11인 SEQ ID NO: 20 및 h) ZIP12인 SEQ ID NO: 22에 도시된 아미노산 서열을 가진다. 새로운 살충 단백질을 발견하기 위해, 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 구축된 강화된 게놈 DNA 라이브러리는 표 6에 제공된 HMM을 사용하여 검색될 수 있다. 이러한 비교에 기초하여 높은 점수를 받은 서열은 새로운 살충 단백질로 동정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 높은 점수를 받는 서열은 521.5의 비트 점수 이상으로 점수를 매기는 서열 및/또는 표 6의 HMM을 사용하여 점수를 매길 때 7.9e-161 이하의 E-값과 일치하는 서열이다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 신규 살충 단백질, 521.5의 비트 점수 이상으로 점수를 매기는 아미노산 서열 및/또는 표 6의 HMM을 사용하여 점수를 매길 때 7.9e-161 이하의 E-값과 일치하는 서열을 갖는 단백질을 제공한다. 이들 단백질은 임의의 형태(예를 들어, 분리된 또는 재조합 단백질로서) 또는 본 발명에 개시된 임의의 조성물(예를 들어, 식물 또는 농업 조성물)의 일부로서 제공될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 다양한 실시태양을 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 청구항의 범위에 의해 정의 된 바와 같이 본 발명의 취지 내에 포함되는 그 안의 변경 및 다른 용도는 당업자에 의해 인식될 것이다.
독자를 돕기 위한 목적으로만 아래에 간단한 목차가 제공된다. 이 목차의 어떤 것도 출원의 실시예 또는 내용의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실시예 부분의 내용 테이블
실시예 제목 간략한 설명
1 살충 단백질 발견 플랫폼 (IPDP) 새로운 살충 단백질 발견 플랫폼의 구현을 기술한다.
2 IPDP로 발견된 새로운 살충 단백질 IPDP를 통해 동정된 새로운 살충 단백질 세트를 기술한다.
3 살충 단백질 - 용해물 곤충 섭식 분석법 IPDP를 통해 발견된 살충 단백질을 포함하는 용해물 공급 분석을 설명하며 노린재과(즉, Halyomorpha halys Stal, 1855)의 해충에 대해 100% 사망률을 보여준다.
4 살충 단백질 - 정제된 단백질 곤충 섭식 분석법 정제된 살충 단백질이 본 발명에서 교시된 바와 같이 다수의 곤충 종에 대해 활성이 있음을 입증하는 다양한 분석으로 수행된 실험을 기술한다.
5 IPDP - HMM 구축 발견되지 않은 살충 단백질을 예측하기 위한 IPDP의 히든 마르코프 모델 기능 구현에 대해 기술한다.
6 형질전환된 식물 살충 단백질을 발현하도록 변형된 식물을 시연하는 실험을 기술한다.
실시예 1 : 살충 단백질 발견 플랫폼(IPDP)
이 실시예는 IPDP의 구현예를 기술한다. IPDP에 대한 자세한 내용은 앞서 언급한 IPDP 섹션에서 찾을 수 있으며, 이 섹션은 실시예 섹션 바로 앞에 있다.
먼저, 미생물 다양성이 풍부한 환경 샘플로부터 5g의 물질을 수집하여 저장 하였다.
이 물질을 50mL의 PBS에 재현탁하고 15분 동안 연속적으로 교반하였다. 15분 후, 큰 미립자를 침전시키고 상청액의 연속 희석액을 사이클로헥사미드를 함유하는 독점 영양 제한 한천 배지에 플레이팅하여 곰팡이 성장을 감소시켰다. 플레이트를 18℃에서 10-14일 동안 성장시켰다.
이들 플레이트 상의 박테리아 성장은 4mL의 물로 반복 세척하여 수집하고 15mL 원뿔형 튜브에 수집하였다. 미생물 세포를 원심 분리에 의해 펠릿화하고 상청액을 버렸다.
프로메가의 위자드 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 세포 펠릿으로부터 게놈 DNA를 분리하였다.
PCR을 통해 DNA를 증폭하기 위해 독점 축퇴 프라이머를 사용하였다. ~800bp의 앰플리콘을 겔 정제하고 DNA 플라스미드 벡터에 클로닝하였다.
복제된 앰플리콘은 Sanger 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱되었고 암호화된 단백질은 공개된 모나리신 서열과 비교되었다(즉, Opota et al에 기술되고 표 1 및 SEQ ID NO: 87에서 발견됨).
실시예 2 : IPDP로 발견된 새로운 살충 단백질
상기 실시예 1의 IPDP는 적어도 36개의 신규 살충 단백질을 동정할 수 있었으며, 이는 하기 표 3에 제시되어 있다.
이들 36개의 신규 살충 단백질로부터, 상동성 기반 분석은 이들 단백질 중 적어도 32개가 이 부류의 임의의 살충 단백질의 공지된 서열 동일성과 적어도 20%의 서열 동일성 차이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이것은 당업계에서 발견된 것보다 새로운 살충 단백질을 찾는 데 있어서 교시된 IPDP의 힘을 보여주기 때문에 중요한 발견이다.
적어도 20%의 서열 동일성 차이를 갖는 32개의 서열 중에서, 이 부류의 임의의 공지된 단백질과 적어도 20%의 서열 동일성 차이를 갖는 8개의 살충 단백질이 추가 분석을 위해 선택되었으며, 다음을 포함한다: (1) ZIP1, (2) ZIP2, (3) ZIP6, (4) ZIP8, (5) ZIP9, (6) ZIP10, (7) ZIP11 및 (8) ZIP12. 이들 단백질은 서로간에 상당한 상동성을 공유하므로 이 새로운 살충 단백질 그룹간에 공유될 수 있는 보존된 살충 도메인을 가리킨다. 이들 8개의 단백질에 대한 다중 서열 정렬은 도 5에서 발견되는 상응하는 계통 발생 트리와 함께 도 3에서 찾을 수 있다.
IPDP를 통해 동정된 새로운 살충 단백질
동정자 뉴클레오타이드 아미노산
ZIP1 SEQ ID NO: 1
ATGACGATCAAGGAAGAGCTGAGCCAACCCCAAAGCCATTCGGTCGAGCTCGACCAGTTGCAAGTCGGGGAAGTCTCTGCACGCGAAGCGTTGACCTCCAACTTCGCCGGCAGTTTCGATCAGTTCCCGACCAAAAGCGGCAGCTTCGAGATCGACAAATACCTGCTCAACTACGCGGATCCGAAAAAAGGCTGCTGGCTGGACGGCGTCACCGTCTACGGTGACATCTACATCGGCAAGCAGAACTGGGGCACCTACACGCGCCCGGTGTTCGCCTACCTGCAGCACACCGACACCATCTCGATTCCGCAGCAGGTGACGCAGACCAAGAGCTACCAGTTGAGCAAAGGCCACACCCAGTCGTTCACCAAGTCGGTCAGCGCCAAATACAGCGTTGGCGGCAGTATCGACATCGTCAACATCAGCTCGGATATCACCGTTGGTTTCAGCAGCACCGAGGCCTGGTCGACGAACCAGACCTTCACCCAAAGCACCGAGCTGGCCGGCCCTGGCACCTTCTTTGTCTATCAGGTGGTGTTTGTCTATGCGCACAACGCCACTTCGGCCGGTGGGCAGAATGGCAATGCCTTTGCCTATAGCAAGACCCAGCAGGTGAACTCGCGGCTCGACCTTTACTACCTGTCGGCCATCACCCAGGACCGTACGGTCATCGTCGAGTCCAGCAATGCAATCGACCCGCTGGACTGGGATACCGTGCAGCGCAACGTGCTGATCCAGAACTACAACCCGGCCAGCAACAGCGGGCACTTCTCGTTCGACTGGAGCGCCTACAACGATCCTCATCGCCGTTAT		 SEQ ID NO: 2
MTIKEELSQPQSHSVELDQLQVGEVSAREALTSNFAGSFDQFPTKSGSFEIDKYLLNYADPKKGCWLDGVTVYGDIYIGKQNWGTYTRPVFAYLQHTDTISIPQQVTQTKSYQLSKGHTQSFTKSVSAKYSVGGSIDIVNISSDITVGFSSTEAWSTNQTFTQSTELAGPGTFFVYQVVFVYAHNATSAGGQNGNAFAYSKTQQVNSRLDLYYLSAITQDRTVIVESSNAIDPLDWDTVQRNVLIQNYNPASNSGHFSFDWSAYNDPHRRY
ZIP2 SEQ ID NO: 3
ATGACGATCAAGGAAGAGCTGAGCCAACCCCAAAGCCATTCGGTCGAGCTCGACCAGTTGCAAGTCGGGGAAGTCTCTGCACGCGAAGCGTTGACCTCCAACTTCGCCGGCAGTTTCGATCAGTTCCCGACCAAAAGCGGCAGCTTCGAGATCGACAAATACCTGCTCAACTACGCGGATCCGAAAAAAGGCTGCTGGCTGGACGGCGTCACCGTCTACGGTGACATCTACATCGGCAAGCAGAACTGGGGCACCTACACGCGCCCGGTGTTCGCCTACCTGCAGCACACCGACACCATCTCGATTCCGCAGCAGGTGACGCAGACCAAGAGCTACCAGTTGAGCAAAGGCCACACCCAGTCGTTCACCAAGTCGGTCAGCGCCAAATACAGCGTTGGCGGCAGTATCGACATCGTCAACATCAGCTCGGATATCACCGTTGGTTTCAGCAGCACCGAGGCCTGGTCGACGAACCAGACCTTCACCCAAAGCACCGAGCTGGCCGGCCCTGGCACCTTCTTTGTCTATCAGGTGGTGTTTGTCTATGCGCACAACGCCACTTCGGCCGGTGGGCAGAATGGCAATGCCTTTGCCTATAGCAAGACCCAGCAGGTGAACTCGCGGCTCGACCTTTACTACCTGTCGGCCATCACCCAGGACCGTACGGTCATCGTCGAGTCCAGCAATGCAATCGACCCGCTGGACTGGGATACCGTGCAGCGCAACGTGCTGATCCAGAACTACAACCCGGCCAGCAACAGCGGGCACTTCTCGTTCGACTGGAGCGCCTACACGATCCTCATCGCCGTTATTGAACTGAGATCCGGCTGC		 SEQ ID NO: 4
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ZIP3 SEQ ID NO: 5
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ZIP36 SEQ ID NO: 65
ATGACGATCAAGGAAGAGCTGGGCCAGCCTCAAAGCCATTCGATCGAACTGGACGAGGTGAGCAAGGAGGCCGCAAGTACGCGGGCCGCGTTGACTTCCAACCTGTCTGGCCGCTTCGACCAGTACCCGACCAAGAAGGGCGACTTTGCGATCGATGGTTATTTGCTGGACTACAGCTCACCCAAGCAAGGTTGCTGGGTGGACGGTATCACTGTCTATGGCGATATCTACATCGGCAAGCAGAACTGGGGCACTTATACCCGCCCGGTGTTTGCCTACCTACAGTATGTGGAAACCATCTCCATTCCACAGAATGTGACGACCACCCTCAGCTATCAGCTGACCAAGGGGCATACCCGTTCCTTCGAGACCAGTGTCAACGCCAAGTACAGCGTTGGCGCCAACATAGATATCGTCAACGTGGGTTCGGAGATTTCCACCGGGTTTACCCGCAGCGAGTCCTGGTCCACCACGCAGTCGTTCACCGATACCACCGAGATGAAGGGGCCAGGGACGTTCGTCATTTACCAGGTCGTGCTGGTGTATGCGCACAACGCCACCTCGGCAGGGCGGCAGAATGCCAATGCCTTCGCCTACAGCAAAACCCAGGCAGTGGGCTCGCGGGTGGACTTGTACTACTTGTCGGCCATTACCCAGCGCAAGCGGGTCATCGTTCCGTCGAGCAATGCCGTCACGCCGCTGGACTGGGATACGGTGCAACGCAACGTGCTGATGGAAAACTACAACCCAGGCAGTAACAGCGGACACTTCAGCTTCGACTGGAGTGCCTACAACGATCCTCATCGCCGTTAT		 SEQ ID NO: 66
MTIKEELGQPQSHSIELDEVSKEAASTRAALTSNLSGRFDQYPTKKGDFAIDGYLLDYSSPKQGCWVDGITVYGDIYIGKQNWGTYTRPVFAYLQYVETISIPQNVTTTLSYQLTKGHTRSFETSVNAKYSVGANIDIVNVGSEISTGFTRSESWSTTQSFTDTTEMKGPGTFVIYQVVLVYAHNATSAGRQNANAFAYSKTQAVGSRVDLYYLSAITQRKRVIVPSSNAVTPLDWDTVQRNVLMENYNPGSNSGHFSFDWSAYNDPHRRY
ZIP37 SEQ ID NO: 67
ATGACGATCAAGGAAGAGCTGGGCCAGCCTCAAAGCCATTCGATCGAACTGGACGAGGTGAGCAAGGAGGCCGCAAGTACGCGGGCCGCGTTGACTTCCAACCTGTCTGGCCGCTTCGACCAGTACCCGACCAAGAAGGGCGACTTTGCGATCGATGGTTATTTGCTGGACTACAGCTCACCCAAGCAAGGTTGCTGGGTGGACGGTATCACTGTCTATGGCGATATCTACATCGGCAAGCAGAACTGGGGCACTTATACCCGCCCGGTGTTTGCCTACCTACAGTATGTGGAAACCATCTCCATTCCACAGAATGTGACGACCACCCTCAGCTATCAGCTGACCAAGGGGCATACCCGTTCCTTCGAGACCAGTGTCAACGCCAAGTACAGCGTTGGCGCCAACATAGATATCGTCAACGTGGGTTCGGAGATTTCCACCGGGTTTACCCGCAGCGAGTCCTGGTCCACCACGCAGTCGTTCACCGATACCACCGAGATGAAGGGGCCAGGGACGTTCGTCATTTACCAGGTCGTGCTGGTGTATGCGCACAACGCCACCTCGGCAGGGCGGCAGAATGCCAATGCCTTCGCCTACAGCAAAACCCAGGCAGTGGGCTCGCGGGTGGACTTGTACTACTTGTCGGCCATTACCCAGCGCAAGCGGGTCATCGTTCCGTCGAGCAATGCCGTCACGCCGCTGGACTGGGATACGGTGCAACGCAACGTGCTGATGGAAAACTACAACCCAGGCAGTAACAGCGGACACTTCCGCTCCGACTGGAGCGCCTACAACGATCCTCATCGCCGTTAT		 SEQ ID NO: 68
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ZIP38 SEQ ID NO: 69
ATGACGATCAAGGAAGAGCTGAGCCAACCCCAAAGCCATTCGGTCGAGCTCGACCAGTTGCAAGTCGGGGAAGTCTCTGCACGCGAAGCGTTGACCTCCAACTTCGCCGGCAGTTTCGATCAGTTCCCGACCAAAAGCGGCAGCTTCGAGATCGACAAATACCTGCTCAACTACGCGGATCCGAAAAAAGGCTGCTGGCTGGACGGCGTCACCGTCTACGGTGACATCTACATCGGCAAGCAGAACTGGGGCACCTACACGCGCCCGGTGTTCGCCTACCTGCAGCACACCGGCACCATCTCGATTCCGCAGCAGGTGACGCAGACCAAGAGCTACCAGTTGAGCAAAGGCCACACCCAGTCGTTCACCAAGTCGGTCAGCGCCAAATACAGCGTTGGCGGCAGTATCGACATCGTCAACATCAGCTCGGATATCACCGTTGGTTTCAGCAGCACCGAGGCCTGGTCGACGAACCAGACCTTCACCCAAAGCACCGAGCTGGCCGGCCCTGGCACCTTCTTTGTCTATCAGGTGGTGTTTGTCTATGCGCACAACGCCACTTCGGCCGGTGGGCAGAATGGCAATGCCTTTGCCTATAGCAAGACCCAGCAGGTGAACTCGCGGCTCGACCTTTACTACCTGTCGGCCATCACCCAGGACCGTACGGTCATCGTCGAGTCCAGCAATGCAATCGACCCGCTGGACTGGGATACCGTGCAGCGCAACGTGCTGATCCAGAACTACAACCCGGCCAGCAACAGCGGGCACTTCTCGTTCGACTGGAGCGCCTACAACGATCCTCATCGCCGTTAT		 SEQ ID NO: 70
MTIKEELSQPQSHSVELDQLQVGEVSAREALTSNFAGSFDQFPTKSGSFEIDKYLLNYADPKKGCWLDGVTVYGDIYIGKQNWGTYTRPVFAYLQHTGTISIPQQVTQTKSYQLSKGHTQSFTKSVSAKYSVGGSIDIVNISSDITVGFSSTEAWSTNQTFTQSTELAGPGTFFVYQVVFVYAHNATSAGGQNGNAFAYSKTQQVNSRLDLYYLSAITQDRTVIVESSNAIDPLDWDTVQRNVLIQNYNPASNSGHFSFDWSAYNDPHRRY
ZIP39 SEQ ID NO: 71
ATGACGATCAAGGAAGAGCTGAGCAATCCTCAAAGCCATTCGGTCGAGCTCGACCAGTTGCAAGTCGGGGAAGTCTCTGCACGCGAAGCGTTGACCGCCAACTTCGCCGGCAGTTTCGATCAGTTCCCGACCAAAAGCGGCAGCTTCGAGATCGACAAATACCTGCTCAACTACGCAGACCCGAAACAAGGCTGCTGGCTGGACGGCGTCACCGTCTACGGTGACATCTACATCGGCAAGCAGAACTGGGGCACCTACACGCGCCCGGTGTTCGCCTACCTGCAGCACACGGACACCATCTCGATTCCGCAGCAGGTGACGCAGACCAAGAGCTACCAGCTGAGCAAAGGCCACACCCAGTCGTTCACCAAGTCGGTCAGCGCCAAGTACAGCGTTGGCGGCAGTATCGACATCGTCAACGTCAGCTCGGATATCACTGTCGGTTTCAGCAGCACCGAGGCCTGGTCGACGACCCAGACCTTCACCCAAAGCACCGAGCTGGCCGGTCCGGGCACCTTCTTTGTCTATCAGGTGGTGTTTGTCTACGCGCACAACGCCACCTCGGCGGGCCGGCAGAATGGCAATGCCTTTGCCTATAGCAAGACCCAGCAGGTGGATTCGCGGCTCGATCTCTACTACCTGTCGGCCATCACCCAGGACCGTACGGTCATCGTCGAGTCCAGCAAGGCAATCAACCCGCTGGACTGGGATACCGTGCAGCGCAACGTGCTGATCGAGAACTACAACCCGGCCTCCAACAGTGGGCACTTCCGCTTCGACTGGAGCGCCTACAACGATCCTCATCGTCGTTAC		 SEQ ID NO: 72
MTIKEELSNPQSHSVELDQLQVGEVSAREALTANFAGSFDQFPTKSGSFEIDKYLLNYADPKQGCWLDGVTVYGDIYIGKQNWGTYTRPVFAYLQHTDTISIPQQVTQTKSYQLSKGHTQSFTKSVSAKYSVGGSIDIVNVSSDITVGFSSTEAWSTTQTFTQSTELAGPGTFFVYQVVFVYAHNATSAGRQNGNAFAYSKTQQVDSRLDLYYLSAITQDRTVIVESSKAINPLDWDTVQRNVLIENYNPASNSGHFRFDWSAYNDPHRRY
발견된 살충 단백질(즉, ZIP1, ZIP2, ZIP6, ZIP8, ZIP9, ZIP10, ZIP11 및 ZIP12)과 모나리신의 단백질을 비교하는 다중 서열 정렬을 보여주는 도 4를 참조할 수 있으며, 상응하는 계통 발생 트리는 도 6에서 발견된다.
아래의 표 4는 동일성 매트릭스로, 이 부류의 임의의 공지된 단백질과 적어도 20%의 서열 동일성 차이를 갖는 전술한 32개의 단백질 간의 동일성 백분율을 예시한다.
더욱이, 표 5는 새롭게 발견된 32개의 단백질로부터의 동일성을 이 부류에서 발견된 제 1 단백질인 모나리신의 동일성을 비교한다. 표 5에서 볼 수 있듯이, 교시된 살충 단백질은 아미노산 수준에서 모나리신과 충분히 다르다.
이 결과는 새로운 단백질을 발견하기 위한 교시된 IPDP의 힘을 추가로 설명한다.
[표 4]
IPDP를 통해 동정된 표 3으로부터의 32개 신규한 살충 단백질의 서열 동일성 매트릭스
Figure pct00016
[표 5]
IPDP를 통해 동정된 표 3으로부터의 32개 신규한 살충 단백질 및 모나리신의 서열 동일성 매트릭스
Figure pct00017
표 3의 8개 신규 살충 단백질(즉, ZIP1, ZIP2, ZIP6, ZIP8, ZIP9, ZIP10, ZIP11 및 ZIP12)에 대한 다중 서열 정렬은 도 3에서 찾을 수 있으며, 상응하는 계통 발생 트리는 도 5에서 발견된다. 표 3의 8개 신규 살충 단백질(즉, ZIP1, ZIP2, ZIP6, ZIP8, ZIP9, ZIP10, ZIP11 및 ZIP12)과 모나리신의 다중 서열 정렬은 도 4에서 발견될 수 있으며, 상응하는 계통 발생 트리는 도 6에서 발견된다.
실시예 3 : 살충 단백질 - 용해물 곤충 섭식 분석
ZIP1(SEQ ID NO : 2) 또는 빈 벡터 대조군을 발현하는 박테리아로부터의 용 해물을 썩덩나무노린재(Brown Marmorated Stinkbugs)(Halyomorpha halys)를 이용한 곤충 섭식 분석에서 물과 비교하였다.
2cm의 심지를 0.5mL의 용해물 또는 물로 적시고 2개의 제 1 유충이 있는 플레이트에 놓았다(1회 관찰). 용해물 또는 물당 8개의 관찰을 샘플당 총 16개의 곤충에 대해 테스트하였다.
7일 후 사망률을 측정하였다.
빈 벡터를 포함하는 세포로부터 세균 용해물을 섭취하도록 허용된 곤충은 물을 섭취하는 것과 유사한 수준의 사망률을 나타내었다.
ZIP1(SEQ ID NO: 2)을 발현하는 박테리아 용해물을 섭취하도록 허용된 곤충은 이 분석에서 100% 사망률을 나타냈다. 이러한 결과는 도 10에 설명된다.
결과적으로, 본 발명에 교시된 살충 단백질은 노린재목 및 노린재과의 구성원에 대해 상당한 살충 활성을 나타낸다.
실시예 4: 살충 단백질 - 정제된 단백질 곤충 섭식 분석
표 3에 나타난 36개의 신규 살충 단백질로부터 정제를 위해 N-말단 6xHis 단백질 태그와 융합될 10개의 단백질 서열을 조작하였다: a) ZIP1인 SEQ ID NO: 2, b) ZIP2인 SEQ ID NO: 4, c) ZIP4인 SEQ ID NO: 8, d) ZIP6인 SEQ ID NO: 12, e) ZIP8인 SEQ ID NO: 14, f) ZIP9인 SEQ ID NO: 16, g ) ZIP10인 SEQ ID NO: 18, h) ZIP11인 SEQ ID NO: 20, i) ZIP12인 SEQ ID NO: 22 및 i) ZIP16인 SEQ ID NO: 26.이들 10개의 태그가 부착된 단백질을 발현하는 박테리아의 용해물을 Ni-NTA 비드(Qiagen)와 함께 배양하여 단백질에 특이적으로 결합하였다. 이들 단백질은 비드에서 용출되고, 투석되어 썩덩나무노린재(Brown Marmorated Stinkbugs)(Halyomorpha halys)를 이용한 곤충 섭식 분석에서 사용되었다.
썩덩나무노린재의 경우, 2cm의 심지를 0.5mL의 정제된 단백질, 또는 완충제 대조군 또는 물로 적신 다음, 2개의 제 1 유충(1회 관찰)이 있는 플레이트에 배치하였다. 용해물 또는 물당 8개의 관찰이 샘플당 총 16개의 곤충에 대해 테스트하였다.
5일 후에 사망률을 측정하였다.
이들 10개의 정제된 단백질을 섭취하도록 허용된 곤충은 이 분석에서 다양한 정도의 사망률을 나타냈다. 이러한 결과는 도 7에 설명된다.
더욱이, 10개의 테스트된 단백질 중, 다양한 희석의 3개의 정제된 단백질 (ZIP1, ZIP2 및 ZIP4)을 썩덩나무노린재로 복제 곤충 섭식 분석에 사용하여 프로빗(Probit) 분석을 통해 LC50 값을 설정하였다. 이러한 결과는 도 8에 설명된다.
결과적으로, 본 발명에 교시된 살충 단백질은 노린재목 및 노린재과의 구성원에 대해 상당한 살충 활성을 나타낸다.
이들 살충 단백질에 대한 곤충의 유효 범위를 결정하기 위해, 본 발명자들은 2개의 다른 주요 곤충 목 - 나비목의 가을 거염벌레(Spodoptera frugiperda) 및 딱정벌레목과의 남부 옥수수 뿌리벌레(Diabrotica undecimpunctata)의 구성원에 대해 곤충 생체분석법을 수행하였다. 간단히 말해서, 가을 거염벌레의 경우, 따뜻한 다종 곤충 사료를 각 웰 내에서 1.5cm2의 표면적을 제공하는 1.0ml/well의 속도로 표준 128웰 생체분석법 트레이에 분배한다. 각 테스트 웰을 40μl의 정제된 단백질을 식료 표면에 도포하여 처리하였다. 적용이 건조되면, 신생아 가을 거염벌레 유충 하나를 각 웰에 넣는다. 분석은 치료당 16개의 개별 웰로 구성된다. 버퍼 전용 처리된 웰은 음성 대조군 역할을 한다. 체중에 따른 성장은 7일 후에 측정하였다.
남부 옥수수 뿌리벌레에 사용된 방법은 남부 옥수수 뿌리벌레 특이적 사료를 사용한 것을 제외하고 가을 거염벌레에 사용된 방법과 유사하였다.
ZIP1, ZIP2 및 ZIP4를 발현하는 정제된 단백질을 섭취하도록 허용된 곤충은이 분석에서 다양한 정도의 성장 억제를 나타냈다. 가을 거염벌레에 대한 결과는 도 9a에 설명되고 남부 옥수수 뿌리벌레에 대한 결과는 도 9b에 설명된다.
결과적으로, 본 발명에 교시된 이러한 살충 단백질은 나미목, 밤나방과 및 딱정벌레 목 및 잎벌레과의 구성원에 대해 상당한 성장 억제 활성을 나타낸다.
실시예 5: 상동성 및 프로파일/HMM 방법(IPDP - HMM 구성원)을 이용한 신규 살충 단백질의 동정
전술한 바와 같이, IPDP는 선택적으로 HMM 알고리즘 및 모델링 절차의 이용을 포함할 수 있다. 이 절차는 당업계의 일부 방법, 예를 들어, BLAST를 사용하여 동정할 수 없는 모나리신 유사 살충 단백질을 암호화하는 유전자를 동정하는 발견된 살충 단백질 서열로부터 HMM 프로파일의 개발을 허용한다.
HMM 공정의 예는 아래에 설명되어 있으며 IPDP를 통해 발견되고 표 3에서 발견되고 도 4에서 강조 표시된 8개의 살충 단백질을 사용하여 구축하였다. 본 발명에 기술된 방법을 사용하여 동정된 8개의 살충 단백질을 사용하여 구축된 HMM의 예는 표 6에 제공된다. 이들 단백질은 다음에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다: a) ZIP1인 SEQ ID NO: 2, b) ZIP2인 SEQ ID NO: 4, c) ZIP6인 SEQ ID NO: 12, d) ZIP8인 SEQ ID NO: 14, e) ZIP9인 SEQ ID NO: 16, f) ZIP10인 SEQ ID NO: 18, g) ZIP11인 SEQ ID NO: 20 및 h) ZIP12인 SEQ ID NO: 22.
모델은 HMMER 소프트웨어(버전 3.1b2, 2015 년 2 월)를 사용하여 구축하였고 출력 모델은 표 6에서 찾을 수 있다. HMM은 앞서 언급한 8개의 시퀀스를 사용하여 "모나리신 유사" 서열(8개의 활용된 서열을 기반으로)이 필요로 할 것의 모델을 생성하였다. 이제 HMM을 기반으로 IPDP로 발견된 미래의 추정 살충 단백질을 분석하여 새로 발견된 서열이 "모나리신 유사" 서열일 가능성을 판단할 수 있다.
실시예 6: 형질전환된 식물
본 발명에 개시된 살충 단백질의 안정된 발현을 위해 관심 식물(예를 들어, 옥수수 및 대두)을 형질전환시키기 위한 실험을 수행하였다. 시험관 내 생체분석법(예를 들어, 실시예 4 참조)에서 곤충을 죽이는 것으로 입증된 3개의 ZIP 단백질 인 ZIP1, ZIP2 및 ZIP4를 선택하여 두 가지 관심 작물인 대두와 옥수수로 형질전환하였다. 이들 서열은 관심 식물에서 최적의 발현을 위해 코돈 최적화되었고 대두와 옥수수 모두에 대한 특정 발현 벡터로 합성 및 클로닝되었다.
대두
대두 종자는 20% 클로록스(Clorox)에서 표면 살균하고 멸균 수로 헹구고 실온에서 2시간 동안 방치하여 프라이밍하였다. 종를 밤새 발아 배지에 담근다. 분열조직 외식편은 다음 날 종자에서 종자 코트와 자엽을 제거하여 준비한다. 분열조직 외식편은 다양한 조건에서 건조되거나 신선하게 사용한다. 생물학적 DNA 전달의 경우 표준 프로토콜에 따라 Bio-Rad PDS-1000 헬륨 건을 통해 입자 충돌을 위해 벡터를 금 입자(0.6 μm)에 코팅한다. 입자 충격을 위해, 외식편을 밤새 사전 배양하고, 충격하고, 휴식을 취한 다음 선택으로 옮긴다. 스펙티노마이신 내성 묘목의 새싹을 수확하고 IAA 및 스펙티노마이신을 포함하는 발근 배지에 뿌리를 내린다. 뿌리 식물을 토양에 이식하고 온실에서 재배하여 T1 종자를 생산한다.
옥수수
온실 또는 들판에서 재배된 Hi-II 옥수수로부터의 미성숙 배아(1.5-2.0mm)를 멸균 후드에서 절개한다. 배아는 고체 공동 배양 배지에서 ~0.4축 측면 아래의 최종 OD660에서 아크로박테리움 균주 AGL-1과 함께 어둠 속에서 23℃에서 1-2일 동안 공동 배양한다. 그런 다음 배아를 고체 유도 배지로 옮기고 축 방향을 아래로 하고 28℃에서 5일 동안 어둠 속에서 배양한다. 그런 다음 배아를 고체 선택 1 배지(비 아라포스)로 옮기고 28℃에서 2주 동안 암실에서 배양한다. 배아를 고체 선택 배지 2(비아라포스)로 옮기고 어둠 속에서 28℃에서 배양한다. 저항성 캘러스 형성 배아는 직경이 약 1.5-2cm가 될 때까지 2주마다 옮긴다. 저항성 캘러스를 2주 동안 28℃에서 고체 재생 배지 1로 옮긴다. 새싹과 뿌리가 생길 때까지 16시간 동안 28℃에서 캘러스를 재생 배지 2로 옮긴다. 묘목을 토양으로 옮기고 성숙시킨다.
본 발명에서 교시된 살충 단백질을 발현하는 식물을 선택하기 위해, 항생제 선택 배지를 사용하여 캘러스로부터 재생된 새싹의 추가 성장을 수행하고, 재생된 식물을 본 발명에 개시된 살충 단백질의 발현에 대해 테스트하였다. 도 11에 도시 된 바와 같이, ZIP1, ZIP2 및 ZIP4 단백질의 발현은 형질전환된 대두 식물의 잎(도 11의 레인 2-10 및 12-13)의 ZIP-특이적 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 또한 ZIP2에 특이적인 발현 벡터로 형질전환된 옥수수 식물의 잎에서 ZIP2 단백질 발현이 확인되었다(도 11의 레인 15 및 16). 표 3에서 발견되는 살충 단백질을 발현하는 다른 유전자이식 대두 및 옥수수 식물은 관심 단백질의 발현에 대해 테스트되고 있다.
더욱이, 실시예 6에 도시된 ZIP1, ZIP2 및 ZIP1, ZIP2, 및 ZIP4 및 표 3에 제시된 다른 ZIP 단백질을 포함하는 관심 살충 단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환된 식물의 일부(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과일, 종자 또는 묘목)로 곤충 섭식 분석이 수행되고 있다.
[표 6]
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
본 발명의 번호 매긴 실시태양
첨부된 청구 범위에도 불구하고, 본 발명은 다음 번호가 매겨진 실시태양을 제시한다:
분리된 핵산
1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
2. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화한다.
3. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화한다.
4. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화한다.
5. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 살충 단백질을 암호화한다,
6. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
7. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 식물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
8. 제 1 실시태양의 분리된 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, 및 SEQ ID NO: 71로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
9. 표 3에 제시된 분리된 핵산.
10. 표 3에 제시된 분리된 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 이의 변이체.
뉴클레오타이드 구조체
1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 뉴클레오타이드 구조체, 상기 핵산 분자는 이종성 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다.
2. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화한다.
3. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화한다.
4. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 대해 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화한다.
5. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 살충 단백질을 암호화한다.
6. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 이종성 조절 요소는 프로모터이다.
7. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 뉴클레오타이드 구조체는 발현 카세트에 함유된다.
8. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 이종성 조절 요소는 식물에서 암호화된 단백질을 발현할 수 있다.
9. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
10. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 식물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
11. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체, 여기서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, 및 SEQ ID NO: 71로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
12. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 발현 벡터.
13. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 플라스미드.
14. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 숙주 세포.
15. 곤충을 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 발현하는 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 곤충을 죽이는 방법.
16. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 원핵 숙주 세포.
17. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 진핵 숙주 세포.
18. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 식물 세포.
19. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 단자엽 식물 세포.
20. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 쌍자엽 식물 세포.
21. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체로 안정적으로 형질전환된 식물.
22. 제 1 실시태양의 뉴클레오타이드 구조체로 안정적으로 형질전환된 식물에 의해 생산된 종자.
분리된 단백질
1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질.
2. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 분리된 살충 단백질.
3. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 분리된 살충 단백질.
4. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 분리된 살충 단백질.
5. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 분리된 살충 단백질.
재조합 단백질
1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 살충 단백질.
2. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 재조합 살충 단백질.
3. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 재조합 살충 단백질.
4. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 재조합 살충 단백질.
5. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 1 실시태양의 재조합 살충 단백질.
유전자이식 식물 세포
1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 조절 서열을 포함하는 DNA 구조체를 포함하는 유전자이식 식물 세포.
2. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
3. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 여기서 상기 이종성 조절 요소는 프로모터이다.
4. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 여기서 상기 식물은 단자엽 식물 종으로부터 유래된다.
5. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 여기서 상기 식물은 옥수수, 밀, 귀리 또는 벼로부터 유래된다.
6. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 상기 식물은 쌍자엽 종으로부터 유래된다.
7. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 상기 식물은 목화, 감자 또는 대두로부터 유래된다.
8. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물 세포, 상기 식물은 농업 줄 작물 종으로부터 유래된다.
유전자이식 식물
1. a. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
b. 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 조절 서열을 포함하는 DNA 구조체에 의해 안정하게 형질전환된 유전자이식 식물.
2. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
3. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 여기서 상기 이종성 조절 요소는 프로모터이다.
4. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 여기서 상기 식물은 단자엽 식물 종이다.
5. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 여기서 상기 식물은 옥수수, 밀, 귀리 또는 벼이다.
6. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 상기 식물은 쌍자엽 종이다.
7. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 상기 식물은 목화, 감자 또는 대두이다.
8. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물, 상기 식물은 농업 줄 작물 종으로부터 유래된다.
9. 제 1 실시태양의 식물에 의해 생산된 종자.
10. 제 1 실시태양의 식물로부터 생산된 자손 식물.
11. 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물 살충 단백질, 독소 복합체 단백질, 및 이들의 임의의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 구조체를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 유전자이식 식물.
12. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 유전자이식 식물에 노출된다.
13. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 유전자이식 식물을 섭식한다.
14. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 살충 단백질에 저항성인 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 유전자이식 식물에 노출되고, 표적 해충은 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물성 살충 단백질, 독소 복합 단백질, 및 이들의 임의의 조합 중 하나에 저항성이다.
15. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 살충 단백질에 저항성인 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 유전자이식 식물을 섭식하고, 표적 해충은 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물성 살충 단백질, 독소 복합 단백질, 및 이들의 임의의 조합 중 하나에 저항성이다.
16. 제 1 실시태양의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 유전자이식 식물에 노출되고, 상기 표적 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목 또는 집게벌레목의 구성원이다.
농업 조성물
1. a. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 분리된 살충 단백질; 및
b. 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 살충 조성물.
2. 제 1 실시태양의 살충 조성물, 여기서 분리된 살충 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
3. 제 1 실시태양의 살충 조성물, 여기서 상기 분리된 살충 단백질은 살충 유효량으로 존재한다.
4. 제 1 실시태양의 살충 조성물, 여기서 상기 농업적으로 허용 가능한 담체는 보조제, 불활성 성분, 분산제, 계면 활성제, 접착제, 점착제, 결합제, 천연 또는 재생 광물 물질, 용매, 습윤제, 비료 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나이다.
5. 건조 고체로 제제화된 제 1 실시태양의 살충 조성물.
6. 액체로 제제화된 제 1 실시태양의 살충 조성물.
7. 엽면 적용을 위해 제제화된 제 1 실시태양의 살충 조성물.
8. 고랑 내 적용을 위해 제제화된 제 1 실시태양의 살충 조성물.
9. 종자 코팅 또는 종자 처리로 제제화된 제 1 실시태양의 살충 조성물.
10. 적어도 하나의 추가 농약 화합물을 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 살충 조성물.
11. 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물 살충 단백질, 독소 복합 단백질, 및 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 농약 화합물을 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 살충 조성물.
12. 적어도 하나의 추가 제초 화합물을 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 살충 조성물.
13. 상기 표적 해충에 제 1 실시태양의 살충 조성물을 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법.
14. 제 1 실시태양의 살충 조성물을 유전자좌에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 상기 유전자좌와 접촉하게 된다.
15. 제 1 실시태양의 살충 조성물을 작물에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 상기 작물과 접촉한다.
16. 제 1 실시태양의 살충 조성물을 작물에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법, 여기서 상기 표적 해충은 상기 작물과 접촉하고, 상기 표적 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목 또는 집게벌레목의 구성원이다.
세포 용해물
1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 세포 용해물.
2. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 제 1 실시태양의 세포 용해물.
3. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 제 1 실시태양의 세포 용해물.
4. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 제 1 실시태양의 세포 용해물.
5. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 또는 SEQ ID NO: 72로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 제 1 실시태양의 세포 용해물.
6. 제 1 실시태양의 세포 용해물을 상기 표적 해충에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법.
살충 단백질을 발현하는 천연 미생물로 해충을 죽이는 방법
1. 상기 표적 해충에 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 세포를 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법.
2. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 숙주 세포는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, 및 SEQ ID NO: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현한다.
3. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 숙주 세포는 원핵 숙주 세포인 방법.
4. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 숙주 세포는 자연적으로 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 방법.
5. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 숙주 세포는 슈도모나스 속 유래인 방법.
6. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 상기 표적 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목 또는 집게벌레목의 구성원이다.
살충 단백질 발견 플랫폼
1. 다음 단계를 포함하여 살충 단백질을 암호화하는 슈도모나스로부터의 DNA에 대해 농축된 게놈 라이브러리를 구축하는 방법:
a. 하나 이상의 미생물을 포함하는 초기 샘플을 제공하는 단계;
b. 초기 샘플을 슈도모나스 속으로부터의 종의 성장을 풍부하게 하는 고체 영양 제한 배지에 노출시켜, 슈도모나스 에스피에 대해 농축된 후속 샘플을 생성하는 단계;
c. 후속 농축 샘플로부터 DNA를 단리하는 단계;
d. 분리된 DNA로부터 DNA를 추출하고 표적 살충 단백질 유전자를 증폭시키기 위해 선택된 프라이머로 축퇴 PCR을 수행하는 단계;
e. PCR-증폭된 DNA를 플라스미드로 복제하는 단계; 및
f. 상기 플라스미드로부터 복제된 DNA를 서열 분석하는 단계.
2. 서열 분석된 DNA를 게놈 라이브러리로 조립하는 단계를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 방법.
3. 서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 방법.
4. 서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 방법, 여기서 상기 동정된 살충 단백질 유전자는 알려져 있지 않다.
5. 서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하기 위해 히든 마르코프 모델이 사용하는 단계를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 방법.
6. 서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 방법, 여기서 상기 동정된 살충 단백질 유전자는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 , 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 및 71로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
7. 서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 제 1 실시태양의 방법, 여기서 상기 동정된 살충 단백질 유전자는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 , 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 및 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화한다.
8. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 프라이머는 SEQ ID NO: 87에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 표적 살충 단백질 유전자를 증폭시키도록 선택된다.
9. 제 1 실시태양의 방법, 여기서 초기 샘플은 토양으로부터의 것이다.
10. 제 1 실시태양의 방법에 의해 구축된 살충 단백질을 암호화하는 슈도모나스로부터의 DNA에 대해 농축된 살충 게놈 라이브러리.
HMM 모델 단백질
1. a) 521.5의 비트 점수 이상으로 점수를 매기는 아미노선 서열; 및/또는 b) 표 6의 HMM을 사용하여 점수를 매기거나 일치될 때 7.9e-161 이하의 E-값과 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질.
표 3에 제시된 핵산을 암호화하는 살충 단백질 또는 표 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 살충 단백질은 본 발명의 실시태양 및 해충 제어를 위해 이를 사용하는 방법 및 이를 발견하는 방법이다.
본 발명에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다. 그러나, 본 발명에 인용 된 참조, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원에 대한 언급은 전세계 어느 나라에서도 유효한 선행 기술을 구성하거나 일반적인 보편 지식의 일부를 형성한다는 인정이나 제안으로 간주되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zymergen Inc. <120> INSECTICIDAL PROTEIN DISCOVERY PLATFORM AND INSECTICIDAL PROTEINS DISCOVERED THEREFROM <130> ZYMR-022/01WO 327574-2109 <150> US 62/637,515 <151> 2018-03-02 <160> 87 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 813 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> undefined Pseudomonas species <400> 1 atgacgatca aggaagagct gagccaaccc caaagccatt cggtcgagct cgaccagttg 60 caagtcgggg aagtctctgc acgcgaagcg ttgacctcca acttcgccgg cagtttcgat 120 cagttcccga ccaaaagcgg cagcttcgag atcgacaaat acctgctcaa ctacgcggat 180 ccgaaaaaag gctgctggct ggacggcgtc accgtctacg gtgacatcta catcggcaag 240 cagaactggg gcacctacac gcgcccggtg ttcgcctacc tgcagcacac cgacaccatc 300 tcgattccgc agcaggtgac gcagaccaag agctaccagt tgagcaaagg ccacacccag 360 tcgttcacca agtcggtcag cgccaaatac agcgttggcg gcagtatcga catcgtcaac 420 atcagctcgg atatcaccgt tggtttcagc agcaccgagg cctggtcgac gaaccagacc 480 ttcacccaaa gcaccgagct ggccggccct ggcaccttct ttgtctatca ggtggtgttt 540 gtctatgcgc acaacgccac ttcggccggt gggcagaatg 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Leu 145 150 155 160 Val Asp Ser Phe Val Lys Gly Phe Ile Gly Leu Lys Asn Gln Asp Val 165 170 175 Glu Gln Ile Lys Gln Ser Leu Ser Ser Leu Val Asn Ala Ala Leu Ser 180 185 190 Tyr Ser Glu Gln Thr Glu Arg Gln Ser Asn Phe Asn Gln Asn Ile Leu 195 200 205 Gln Thr Gly Asp Ser Gly Ser Val Asn Phe Met Leu Tyr Ala Ser Glu 210 215 220 Phe Thr Ile Lys Ala Ser Ser His Lys Gly Thr Ile Thr Phe Gln Ser 225 230 235 240 Ser Tyr Thr Leu Ser Gln Ala Ile Tyr Gln Leu Ser Val Glu Ser Trp 245 250 255 Asn Asn Val Lys Asp Val Phe Ser Lys Gln Gln Lys Thr Asp Thr Gln 260 265 270 Gln Trp Leu Gly Asp Thr Thr Thr Gln Val Arg Glu Gly Ser Lys Leu 275 280 285 Arg Ala Ile Cys Leu Val Ser 290 295 <210> 83 <211> 295 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 83 Met Asn Ala Pro Gly Ala Ala Pro Ser Glu Lys Glu Val Ala His Ala 1 5 10 15 Trp Leu Glu Gly Lys Ala Arg Val Lys Ser Thr Thr Ala His Gly Asn 20 25 30 Ile Phe Ala His Asp Tyr Asn His Pro His Gln Leu Thr Ser Thr Gly 35 40 45 Arg Ala Met Arg Thr Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro Phe Phe Ser Pro 50 55 60 Ala Ala Gly Ala Ala Thr Asp Ser Tyr Ala Asn Asp Ala Asn Lys Asn 65 70 75 80 Val Ser Pro Gly Lys Ala Pro Val Ser Ile Tyr Glu Gly Leu Gln Thr 85 90 95 Ala Ile Asp Ile Ala Arg Arg Arg Ser Glu Tyr Asn Pro Leu Asp Gln 100 105 110 Pro Thr Asp Gln Arg Pro Lys Ala Lys Gly Asp Arg Glu His Phe Ile 115 120 125 Ala Phe Thr Gln Gln Ile Ala Glu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Ala Gln Val Thr Gln Ile Gln Gln Lys Ser His Asp Ala Asn Ala Leu 145 150 155 160 Ile Asp Ser Phe Val Lys Gly Phe Ile Gly Leu Ala Ala Lys Asp Val 165 170 175 Glu Gln Ile Lys Lys Ser Leu Ser Ser Leu Val Asn Ala Ala Leu Ser 180 185 190 Tyr Ser Glu Gln Thr Glu Arg Gln Ser Asn Phe Asn Gln Asn Ile Leu 195 200 205 Gln Thr Gly Ile Ala Gly Ser Val Asn Phe Met Leu Tyr Ala Ser Glu 210 215 220 Phe Thr Ile Lys Ala Thr Ser Lys Lys Gly Thr Ile Thr Phe Gln Ser 225 230 235 240 Ser Tyr Thr Leu Ser Gln Ala Val Tyr Gln Leu Ser Val Glu Ser Trp 245 250 255 Glu Asn Val Arg Asp Val Phe Ala Lys Gln Gln Lys Thr Asp Thr Gln 260 265 270 Gln Trp Leu Gly Asp Thr Thr Thr Pro Val Lys Pro Gly Ser Ser Leu 275 280 285 Arg Ala Ile Cys Leu Val Ser 290 295 <210> 84 <211> 291 <212> PRT <213> Pseudomonas fulva <400> 84 Met His Ala Pro Thr Val Lys Glu Leu Ala His Ala Trp Leu Thr Glu 1 5 10 15 Thr Thr Ala Lys Ala Asn Ser Thr Ile Val Arg Gly Asn Ile Phe Ala 20 25 30 His Glu Tyr Asn His Gln Leu Leu Thr Pro Thr Gly Leu Ser Met Arg 35 40 45 Ser Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro Phe Tyr Ser Pro Ala Ser Gly Ala 50 55 60 Ala Thr Asp Ser Tyr Ala Lys Asp Ala Asn Asn Asn Val Ser Pro Gly 65 70 75 80 Ser Ala Pro Val Ser Ile Tyr Glu Gly Leu Gln Thr Ser Ile Asp Ile 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ser Gly Tyr Asn Pro Leu Asp Gln Pro Thr Asp Gln 100 105 110 Lys Pro Lys Ala Ala Gly Asp Arg Glu His Phe Ile Ala Phe Thr Gln 115 120 125 Gln Ile Ala Asn Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gln Val Thr 130 135 140 Gln Ile Gln Gln Lys Ser His Asp Ala Asn Ala Leu Val Asp Ser Phe 145 150 155 160 Val Lys Gly Phe Ile Gly Leu Lys Asn Gln Asp Val Glu Gln Ile Lys 165 170 175 Gln Ser Leu Ser Ser Leu Val Asn Ala Ala Leu Ser Tyr Ser Glu Gln 180 185 190 Thr Glu Arg Gln Ser Asn Phe Asn Gln Asn Ile Leu Gln Thr Gly Asn 195 200 205 Gly Gly Ser Val Asn Phe Met Leu Tyr Ala Ser Glu Phe Thr Ile Lys 210 215 220 Ala Ser Ser His Lys Gly Thr Ile Thr Phe Gln Ser Ser Tyr Thr Leu 225 230 235 240 Ser Gln Ala Ile Tyr Gln Leu Ser Val Glu Ser Trp Asn Asn Val Lys 245 250 255 Asp Thr Phe Ser Lys Gln Gln Lys Thr Asp Thr Glu Gln Trp Leu Asp 260 265 270 Asp Thr Thr Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Leu Arg Ala Ile Cys 275 280 285 Leu Val Gly 290 <210> 85 <211> 295 <212> PRT <213> Pseudomonas chlororaphis <400> 85 Met Ser Thr Gln Asn His Lys His Ile Thr Glu Lys Thr Leu Ala Trp 1 5 10 15 Leu Asn Thr Thr His Glu Ser Asn Lys Leu Ser Thr Gln Thr Asn Pro 20 25 30 Asn Ile Phe Val Leu Asp Arg Ser Arg Ser Ser Phe Ser Glu Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Pro Gly Ser Arg Ala Asp Ile Ala Asn Pro Phe Phe Ala Pro 50 55 60 Ala Gly Ser Leu Ala Thr Ala Arg Tyr Leu Gln Ala Ala Asn Asn Asn 65 70 75 80 Ala Ser Ser Gly Ser Ala Pro Thr Ser Leu Gln Asp Gly Leu Gln Thr 85 90 95 Cys Val Asn Met Ala Arg Thr Arg Ser Gly Trp Asn Pro Asn Asp Pro 100 105 110 Pro Thr Ala Ala Asn Pro His Thr Thr Gly Asp Tyr Glu His Phe Ile 115 120 125 Ser Phe Thr Lys Glu Ile Ser Arg Ile Pro Phe Leu Thr Leu Glu Ser 130 135 140 Ala Ser Ser Ser Leu Val Met Gln Gln Ser His Asn Ala Asp Asp Leu 145 150 155 160 Ile Asn Ser Phe Ala Asn Gly Phe His Gly Leu Glu Thr Ala Asp Ile 165 170 175 Glu Glu Thr Lys Arg Gly Leu Lys Glu Leu Val Lys Ala Ala Leu Ser 180 185 190 Glu Cys Glu Lys Thr Asn Arg Glu Ser Phe Phe Asn Gln His Thr Leu 195 200 205 Gln Gln Lys Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Phe 210 215 220 Ser Ile Val Ala Thr Asp Gln Lys Gly Thr Ile Asn Phe Gln Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Leu Leu Thr Gln Ser Lys Tyr Thr Leu Ser Asn Ala Thr Trp Asp 245 250 255 Arg Ile Lys Asp Leu Phe Tyr Asp Gln Gln Lys Thr Asp Thr Asn Thr 260 265 270 Trp Leu Asn Gly Met Lys Thr Leu Pro Arg Ala Gly Ser Thr Ala Arg 275 280 285 Ala Thr Cys Leu Glu Gly Gln 290 295 <210> 86 <211> 86 <212> PRT <213> Pseudomonas chlororaphis <400> 86 Met Gly Ile Thr Val Thr Asn Asn Ser Ser Asn Pro Ile Glu Val Ala 1 5 10 15 Ile Asn His Trp Gly Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Phe Ser Val Gly 20 25 30 Asn Gly Lys Gln Glu Thr Trp Asp Arg Ser Asp Ser Arg Gly Phe Val 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Lys Asn Gly Ala Gln His Pro Tyr Tyr Val Gln Ala 50 55 60 Ser Ser Lys Ile Glu Val Asp Asn Asn Ala Val Lys Asp Gln Gly Arg 65 70 75 80 Leu Ile Glu Pro Leu Ser 85 <210> 87 <211> 271 <212> PRT <213> Pseudomonas entomophila <400> 87 Met Thr Ile Lys Glu Glu Leu Gly Gln Pro Gln Ser His Ser Ile Glu 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Ser Lys Glu Ala Ala Ser Thr Arg Ala Ala Leu Thr 20 25 30 Ser Asn Leu Ser Gly Arg Phe Asp Gln Tyr Pro Thr Lys Lys Gly Asp 35 40 45 Phe Ala Ile Asp Gly Tyr Leu Leu Asp Tyr Ser Ser Pro Lys Gln Gly 50 55 60 Cys Trp Val Asp Gly Ile Thr Val Tyr Gly Asp Ile Tyr Ile Gly Lys 65 70 75 80 Gln Asn Trp Gly Thr Tyr Thr Arg Pro Val Phe Ala Tyr Leu Gln Tyr 85 90 95 Val Glu Thr Ile Ser Ile Pro Gln Asn Val Thr Thr Thr Leu Ser Tyr 100 105 110 Gln Leu Thr Lys Gly His Thr Arg Ser Phe Glu Thr Ser Val Asn Ala 115 120 125 Lys Tyr Ser Val Gly Ala Asn Ile Asp Ile Val Asn Val Gly Ser Glu 130 135 140 Ile Ser Thr Gly Phe Thr Arg Ser Glu Ser Trp Ser Thr Thr Gln Ser 145 150 155 160 Phe Thr Asp Thr Thr Glu Met Lys Gly Pro Gly Thr Phe Val Ile Tyr 165 170 175 Gln Val Val Leu Val Tyr Ala His Asn Ala Thr Ser Ala Gly Arg Gln 180 185 190 Asn Ala Asn Ala Phe Ala Tyr Ser Lys Thr Gln Ala Val Gly Ser Arg 195 200 205 Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Ala Ile Thr Gln Arg Lys Arg Val Ile 210 215 220 Val Pro Ser Ser Asn Ala Val Thr Pro Leu Asp Trp Asp Thr Val Gln 225 230 235 240 Arg Asn Val Leu Met Glu Asn Tyr Asn Pro Gly Ser Asn Ser Gly His 245 250 255 Phe Ser Phe Asp Trp Ser Ala Tyr Asn Asp Pro His Arg Arg Tyr 260 265 270

Claims (103)

  1. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖거나 (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산을 갖는 단백질과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 분리된 핵산 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 분리된 핵산 분자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 분리된 핵산 분자.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 분리된 핵산 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인 분리된 핵산 분자.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 관심 숙주 세포는 식물 세포인 분리된 핵산 분자.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
  9. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖거나 (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산을 갖는 단백질과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 뉴클레오타이드 구조체로서, 상기 핵산 분자는 이종성 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 살충 단백질을 암호화하는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종성 조절 요소는 프로모터인 뉴클레오타이드 구조체.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 구조체는 발현 카세트에 함유되는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종성 조절 요소는 식물에서 암호화된 단백질을 발현할 수 있는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  17. 제 9 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인 뉴클레오타이드 구조체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 관심 숙주 세포는 식물 세포인 뉴클레오타이드 구조체.
  19. 제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 뉴클레오타이드 구조체.
  20. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 플라스미드.
  22. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 숙주 세포.
  23. 곤충을 제 22 항의 숙주 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여 곤충을 죽이는 방법.
  24. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 원핵 숙주 세포.
  25. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 진핵 숙주 세포.
  26. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 식물 세포.
  27. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 단자엽 식물 세포.
  28. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 쌍자엽 식물 세포.
  29. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체로 안정적으로 형질전환된 식물.
  30. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 구조체로 안정적으로 형질전환된 식물에 의해 생산된 종자.
  31. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질.
  32. 제 31 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질.
  33. 제 31 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질.
  34. 제 31 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질.
  35. 제 31 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 살충 단백질.
  36. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 살충 단백질.
  37. 제 36 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 살충 단백질.
  38. 제 36 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 살충 단백질.
  39. 제 36 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 살충 단백질.
  40. 제 36 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 살충 단백질.
  41. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 조절 서열을 포함하는 DNA 구조체를 포함하는 유전자이식 식물 세포.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 것인 유전자이식 식물 세포.
  43. 제 41 항에 있어서,
    상기 이종성 조절 요소는 프로모터인 유전자이식 식물 세포.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 단자엽 식물 종으로부터 유래되는 것인 유전자이식 식물 세포.
  45. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 옥수수, 밀, 귀리 또는 벼로부터 유래되는 것인 유전자이식 식물 세포.
  46. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 쌍자엽 종으로부터 유래되는 것인 유전자이식 식물 세포.
  47. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 목화, 감자 또는 대두로부터 유래되는 것인 유전자이식 식물 세포.
  48. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 농업 줄 작물 종으로부터 유래되는 것인 유전자이식 식물 세포.
  49. a. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    b. 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 조절 서열을 포함하는 DNA 구조체로 안정하게 형질전환된 유전자이식 식물.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 것인 유전자이식 식물.
  51. 제 49 항에 있어서,
    상기 이종성 조절 요소는 프로모터인 유전자이식 식물.
  52. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 단자엽 식물 종인 유전자이식 식물.
  53. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 옥수수, 밀, 귀리 또는 벼인 유전자이식 식물.
  54. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 쌍자엽 종인 유전자이식 식물.
  55. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 목화, 감자 또는 대두인 유전자이식 식물.
  56. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 농업 줄 작물 종으로부터 유래되는 것인 유전자이식 식물.
  57. 제 49 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항의 식물에 의해 생산된 종자.
  58. 제 49 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항의 식물로부터 생산된 자손 식물.
  59. 제 49 항에 있어서,
    모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물 살충 단백질, 독소 복합체 단백질, 및 이들의 임의의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 구조체를 추가로 포함하는 유전자이식 식물.
  60. 제 49 항 내지 제 56 항 및 제 59 항 중 어느 한 항의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 유전자이식 식물에 노출되는 것인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 표적 해충은 유전자이식 식물을 섭식하는 것인 방법.
  62. 제 49 항 내지 제 56 항 및 제 59 항 중 어느 한 항의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 살충 단백질에 저항성인 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 유전자이식 식물에 노출되고, 표적 해충은 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물성 살충 단백질, 독소 복합 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 저항성인 방법.
  63. 제 49 항 내지 제 56 항 및 제 59 항 중 어느 한 항의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 살충 단백질에 저항성인 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 유전자이식 식물을 섭식하고, 표적 해충은 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물성 살충 단백질, 독소 복합 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질에 저항성인 방법.
  64. 제 49 항 내지 제 56 항 및 제 59 항 중 어느 한 항의 유전자이식 식물을 영역에 제공하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 유전자이식 식물에 노출되고, 상기 표적 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목 또는 집게벌레목의 구성원인 방법.
  65. a. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 분리된 살충 단백질; 및
    b. 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 살충 조성물.
  66. 제 65 항에 있어서,
    분리된 살충 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 갖는 살충 조성물.
  67. 제 65 항에 있어서,
    상기 분리된 살충 단백질은 살충 유효량으로 존재하는 것인 살충 조성물.
  68. 제 65 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농업적으로 허용 가능한 담체는 보조제, 불활성 성분, 분산제, 계면 활성제, 접착제, 점착제, 결합제, 천연 또는 재생 광물 물질, 용매, 습윤제, 비료 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 살충 조성물.
  69. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    건조 고체로 제제화된 살충 조성물.
  70. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    액체로 제제화된 살충 조성물.
  71. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    엽면 적용을 위해 제제화된 살충 조성물.
  72. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    고랑 내 적용을 위해 제제화된 살충 조성물.
  73. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종자 코팅 또는 종자 처리로 제제화된 살충 조성물.
  74. 제 65 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 농약 화합물을 추가로 포함하는 것인 살충 조성물.
  75. 제 74 항에 있어서,
    적어도 하나의 살충 화합물은 모나리신 단백질, 슈도모나스 살충 단백질, Cry 단백질, Cyt 단백질, 식물 살충 단백질, 독소 복합 단백질, 및 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 살충 조성물.
  76. 제 65 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제초 화합물을 추가로 포함하는 것인 살충 조성물.
  77. 표적 해충에 제 65 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 살충 조성물을 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법.
  78. 제 65 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 살충 조성물을 유전자좌에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 상기 유전자좌와 접촉하게 되는 것인 방법.
  79. 제 65 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 살충 조성물을 작물에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 상기 작물과 접촉하게 되는 것인 방법.
  80. 제 65 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 살충 조성물을 작물에 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법으로서, 상기 표적 해충은 상기 작물과 접촉하고, 상기 표적 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목 또는 집게벌레목의 구성원인 방법.
  81. (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 세포 용해물.
  82. 제 81 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 것인 세포 용해물.
  83. 제 81 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 것인 세포 용해물.
  84. 제 81 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 것인 세포 용해물.
  85. 제 81 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 포함하는 것인 세포 용해물.
  86. 표적 해충에 제 81 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항의 세표 용해물을 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법.
  87. 표적 해충에 (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖거나; (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 세포를 적용하는 단계를 포함하여 표적 해충을 죽이는 방법.
  88. 제 87 항에 있어서,
    숙주 세포는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것인 방법.
  89. 제 87 항에 있어서,
    숙주 세포는 원핵 숙주 세포인 방법.
  90. 제 87 항에 있어서,
    숙주 세포는 자연적으로 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것인 방법.
  91. 제 87 항에 있어서,
    숙주 세포는 슈도모나스 속으로부터 유래되는 것인 방법.
  92. 제 87 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 노린재목, 메뚜기목, 총채벌레목 또는 집게벌레목의 구성원인 방법.
  93. 다음 단계를 포함하여 살충 단백질을 암호화하는 슈도모나스로부터의 DNA에 대해 농축된 게놈 라이브러리를 구축하는 방법:
    a. 하나 이상의 미생물을 포함하는 초기 샘플을 제공하는 단계;
    b. 초기 샘플을 슈도모나스 속으로부터의 종의 성장을 풍부하게 하는 고체 영양 제한 배지에 노출시켜, 슈도모나스 에스피에 대해 농축된 후속 샘플을 생성하는 단계;
    c. 후속 농축 샘플로부터 DNA를 단리하는 단계;
    d. 분리된 DNA로부터 DNA를 추출하고 표적 살충 단백질 유전자를 증폭시키기 위해 선택된 프라이머로 축퇴 PCR을 수행하는 단계;
    e. PCR-증폭된 DNA를 플라스미드로 복제하는 단계; 및
    f. 상기 플라스미드로부터 복제된 DNA를 서열 분석하는 단계.
  94. 제 93 항에 있어서,
    서열 분석된 DNA를 게놈 라이브러리로 조립하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  95. 제 93 항에 있어서,
    서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  96. 제 93 항에 있어서,
    서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 동정된 살충 단백질 유전자는 알려져 있지 않은 것인 방법.
  97. 제 93 항, 제 95 항 및 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하기 위해 히든 마르코프 모델이 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  98. 제 93 항에 있어서,
    서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 동정된 살충 단백질 유전자는 SEQ ID NO: 1, 3, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  99. 제 93 항에 있어서,
    서열 분석된 DNA 내에서 살충 단백질 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 여기서 상기 동정된 살충 단백질 유전자는 SEQ ID NO: 2, 4, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 것인 방법.
  100. 제 93 항에 있어서,
    프라이머는 SEQ ID NO: 87에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 표적 살충 단백질 유전자를 증폭시키도록 선택되는 것인 방법.
  101. 제 93 항에 있어서,
    초기 샘플은 토양으로부터 유래되는 것인 방법.
  102. 제 93 항의 방법에 의해 구축된 살충 단백질을 암호화하는 슈도모나스로부터의 DNA에 대해 농축된 살충 게놈 라이브러리.
  103. a) 521.5의 비트 점수 이상으로 점수를 매기는 아미노선 서열; 및/또는 b) 표 6의 HMM을 사용하여 점수를 매기거나 일치될 때 7.9e-161 이하의 E-값과 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질.
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