ES2609332T3 - Gen pesticida AXMI-205 y métodos para su uso - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida.

Description

Gen pesticida AXMI-205 y métodos para su uso

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan genes novedosos que codifican para proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que codifican para las mismas son útiles en la preparación de formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a plagas.

Antecedentes de la invención

La introducción del DDT (dicloro-difenil-tricloroetano) y el paso posterior al uso indiscriminado de insecticidas químicos sintéticos condujo a la contaminación de fuentes de agua y alimentos, el envenenamiento de insectos beneficiosos que no eran el objetivo y el desarrollo de plagas de insectos resistentes a los insecticidas químicos. El aumento de la preocupación pública sobre los efectos medioambientales adversos del uso indiscriminado de insecticidas químicos impulsó una búsqueda de métodos alternativos para el control de plagas de insectos.

Una de las alternativas prometedoras ha sido el uso de agentes de control biológico. Existe un historial bien documentado de la aplicación segura de Bt (B. thuringiensis, una bacteria Gram-positiva del suelo) como biopesticidas eficaces y se dispone de varios informes de expresión de gen(es) de delta-endotoxinas en plantas de cultivo. Sólo se requieren unas pocas pulverizaciones con insecticida sobre cultivos transgénicos para Bt, lo que no sólo ahorra costes y tiempo, sino que también reduce los riesgos para la salud. En algunos casos, los insectos pueden desarrollar resistencia a diferentes compuestos insecticidas, lo que plantea la necesidad de identificar agentes de control biológico alternativos para el control de plagas.

Sumario de invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad pesticida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para secuencias para polipéptidos pesticidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico, y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos pesticidas y anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en constructos de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para la expresión en un organismo incluyendo, pero sin limitarse a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformados.

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que codifican para una proteína pesticida. Adicionalmente, están abarcadas secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína pesticida.

Así, la presente invención prevé una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida.

La invención también proporciona una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención, preferiblemente que es una célula huésped bacteriana o que es una célula vegetal.

La invención proporciona además un polipéptido recombinante con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida; y c) un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas. También se proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la invención. Adicionalmente, se proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención.

La invención proporciona además:

•

un método para controlar una población de plaga de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como pesticida del polipéptido de la invención;

•

un método para destruir una plaga de lepidópteros o coleópteros, que comprende poner en contacto dicha plaga,

o alimentar a dicha plaga, con una cantidad eficaz como pesticida del polipéptido de la invención; y

•

un método para producir un polipéptido con actividad pesticida, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido.

La invención proporciona además una planta que tiene incorporado de manera estable en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene actividad pesticida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 9, 10, 11 ó 12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida; en la que dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.

También se proporciona un método para proteger a una planta frente a una plaga de insectos, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido pesticida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1,9, 10, 11 ó 12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida, preferiblemente en la que dicha planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida frente a una plaga de lepidópteros o coleópteros.

Por tanto, se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención, y para usar esos polipéptidos para controlar o destruir una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros. También se hace referencia a métodos y kits para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y los métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con resistencia o tolerancia potenciada a plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad pesticida, o para detectar la presencia de proteínas o ácidos nucleicos pesticidas en productos u organismos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una alineación de AXMI-205 (SEQ ID NO:2) con proteínas MACPF de Photorhabdus luminescens (SEQ ID NO: 14) y Clavibacter michiganensis (SEQ ID NO:15).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia o tolerancia a plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Por “resistencia” se entiende que la plaga (por ejemplo, insecto) se destruye tras la ingestión u otro contacto con los polipéptidos de la invención. Po “tolerancia” se entiende una afectación o reducción del movimiento, la alimentación, reproducción, u otras funciones de la plaga. Los métodos implican transformar organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pesticida de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que presentan actividad pesticida. Por tanto, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas pesticidas de especies bacterianas. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación posterior en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de proteínas pesticidas alteradas mediante métodos conocidos en la técnica, tales como entrecruzamiento de dominios o intercambio de ADN. Las proteínas encuentran uso en el control o la destrucción de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros y nematodos y para producir composiciones con actividad pesticida.

Por “toxina pesticida” o “proteína pesticida” se entiende una toxina que tiene actividad tóxica frente a una o más plagas, incluyendo, pero sin limitarse a, miembros de los órdenes Lepidoptera, Diptera y Coleoptera, o el filo Nematoda, o una proteína que tiene homología con una proteína de este tipo. Se han aislado proteínas pesticidas de

organismos incluyendo, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas pesticidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos de longitud completa dadas a conocer en el presente documento, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, o bien debido al uso de un sitio de iniciación en el sentido de 3’ alterno, o bien debido a procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad pesticida. Puede producirse procesamiento en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína.

Por tanto, se proporcionan en el presente documento secuencias de nucleótidos aisladas o recombinantes novedosas que confieren actividad pesticida. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas. La proteína que resulta de la traducción de este gen permite que las células controlen o destruyan plagas que la ingieren.

Moléculas de ácido nucleico aisladas, y variantes y fragmentos de las mismas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y polipéptidos pesticidas o partes biológicamente activas de los mismos. También se hace referencia a moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas con regiones de homología de secuencia. Así, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1,

o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula de ácido nucleico” se entiende que incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando nucleótido análogos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

Una secuencia de ácido nucleico (o ADN) “aislada” se usa en el presente documento para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante o in vitro. En algunas realizaciones, un ácido nucleico “aislado” está libre de secuencias (preferiblemente, secuencias que codifican para proteínas) que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Para los fines de la invención, “aislada” cuando se usa para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína pesticida puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de manera natural la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Una proteína pesticida que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10% o el 5% (en peso seco) de proteína no pesticida (también denominada en el presente documento “proteína contaminante”).

Las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia expuesta en SEQ ID NO:1, y variantes, fragmentos y complementos de la misma, codificando tales variantes y fragmentos para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida. Por “complemento” se entiende una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de tal manera que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos dada para formar de ese modo un dúplex estable. La secuencia de aminoácidos correspondiente para la proteína pesticida codificada por esta secuencia de nucleótidos se expone en SEQ ID NO:2, 3 ó 4.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas pesticidas también están abarcadas por la presente invención. Por “fragmento” se entiende una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pesticida que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida. También se hace referencia a un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR usando métodos dados a conocer a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pesticida comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600 nucleótidos contiguos, o hasta el número de

nucleótidos presentes en una secuencia de longitud completa de nucleótidos que codifica para una proteína pesticida dada a conocer en el presente documento, dependiendo del uso pretendido. Por nucleótidos “contiguos” se entiende residuos de nucleótido que son inmediatamente adyacentes entre sí. Fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán para fragmentos de proteína que conservan la actividad biológica de la proteína pesticida y, así, conservan la actividad pesticida. Por “conserva la actividad” se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o más de la actividad pesticida de la proteína pesticida. En una realización, la actividad pesticida es actividad coleoptericida. En otra realización, la actividad pesticida es actividad lepidoptericida. En otra realización, la actividad pesticida es actividad nematocida. En otra realización, la actividad pesticida es actividad diptericida. Se conocen bien en la técnica métodos para medir la actividad pesticida. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985)

J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense n.º 5.743.477.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pesticida que codifica para una parte biológicamente activa de una proteína de la invención codificará para al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o 600 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína pesticida de longitud completa de la invención. En algunas realizaciones, el fragmento es un truncamiento N-terminal o C-terminal de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 aminoácidos o más con relación a SEQ ID NO:2, 3 ó 4. En algunas realizaciones, los fragmentos abarcados en el presente documento resultan de la eliminación de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 aminoácidos C-terminales o más, por ejemplo, mediante proteólisis o mediante inserción de un codón de terminación en la secuencia codificante.

Proteínas pesticidas preferidas de la presente invención están codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1. Por “suficientemente idéntica” se entiende una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en el presente documento usando parámetros convencionales. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la situación del marco de lectura, y similares.

Para determinar la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de una comparación óptima. La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad en porcentaje = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra realización, la comparación es a través de la totalidad de la secuencia de referencia (por ejemplo, a través de la totalidad de la SEQ ID NO:1, o a través de la totalidad de una de SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8). La identidad en porcentaje entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas a continuación, con o sin permitir huecos. Al calcular la identidad en porcentaje, normalmente se cuentan las coincidencias exactas.

La determinación de la identidad en porcentaje entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos en BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico de tipo pesticida de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas en BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína pesticidas de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2,0) tal como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) citado anteriormente. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). También puede realizarse la alineación manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN, y por tanto puede proporcionar datos sobre la conservación de secuencia de toda la secuencia de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles comercialmente, tales como el módulo ALIGNX del conjunto de programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede evaluarse la identidad de aminoácidos en porcentaje. Un ejemplo no limitativo de un programa de software útil

para el análisis de alineaciones en ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de GCG Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible de Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE.UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos con peso PAM120, una penalización por extensión de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4.

A menos que se establezca de otro modo, se usará GAP versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando un peso de hueco de 50 y un peso de extensión de 3, y la matriz de puntuación nwsgapADN.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso de hueco de 8 y un peso de extensión de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También pueden usarse programas equivalentes. Por “programa equivalente” se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias en cuestión cualesquiera, genera una alineación que tiene coincidencias de residuos de residuo idénticos y una identidad de secuencia en porcentaje idéntica en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP versión 10.

La invención también abarca moléculas de ácido nucleico variantes. Tales “variantes” codificarán para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida. Secuencias de nucleótidos que codifican para “variantes” de la proteína pesticida incluyen las secuencias que codifican para las proteínas pesticidas dadas a conocer en el presente documento pero que difieren de manera conservativa debido a la degeneración del código genético así como las que son suficientemente idénticas tal como se comentó anteriormente. Pueden identificarse variantes alélicas que se producen de manera natural con el uso de técnicas de la biología molecular bien conocidas, tales como técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación tal como se expone a continuación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas de manera sintética que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio pero que codifican todavía para las proteínas pesticidas dada a conocer en la presente invención tal como se comenta a continuación. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir siguen presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservan la actividad pesticida. Por “conserva la actividad” se entiende que la variante tendrá al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70% o al menos aproximadamente el 80% de la actividad pesticida de la proteína nativa. Se conocen bien en la técnica métodos para medir la actividad pesticida. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 24802485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense n.º 5.743.477.

El experto en la técnica apreciará además que pueden introducirse cambios mediante mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención conduciendo de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas pesticidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por tanto, pueden crearse moléculas de ácido nucleico aisladas variantes introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondiente dada a conocer en el presente documento, de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias de nucleótidos variantes también están abarcadas por la presente invención.

Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácido conservativas en uno o más residuos de aminoácido no esenciales, predichos. Un residuo de aminoácido “no esencial” es un residuo que puede alterarse con respecto a la secuencia de tipo natural de una proteína pesticida sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de aminoácido “esencial” para la actividad biológica. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales polares con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Pueden realizarse sustituciones de aminoácido en regiones no conservadas que conservan la función. En general, tales sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácido conservados, o para residuos de aminoácido que residen dentro de un motivo conservado, en el que tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de residuos que están conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína

incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos en una alineación de proteínas homólogas). Los ejemplos de residuos que están conservados pero que pueden permitir sustituciones de aminoácido conservativas y conservar todavía la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que sólo tienen sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que sólo tienen sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en la alineación proteínas homólogas). Sin embargo, un experto en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones conservadas o no conservadas menores en los residuos conservados.

Alternativamente, pueden producirse secuencias de nucleótidos variantes introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis por saturación, y pueden examinarse los mutantes resultantes para determinar su capacidad para conferir actividad pesticida para identificar mutantes que conservan la actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de manera recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de ensayo convencionales.

Usando métodos tales como PCR, hibridación, y similares pueden identificarse secuencias pesticidas correspondientes, teniendo tales secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véanse, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y Innis, et al. (1990) PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos pesticida puede usarse para examinar bibliotecas de ADNc o genómicas. Se conocen generalmente en la técnica métodos para la construcción de tales bibliotecas de ADNc y genómicas y se dan a conocer en Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Pueden prepararse sondas para hibridación mediante el marcaje de oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos que codifica para proteína pesticida conocida dada a conocer en el presente documento. Pueden usarse adicionalmente cebadores degenerados diseñados basándose en residuos de nucleótidos o de aminoácido conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda comprende normalmente una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175 ó 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pesticida de la invención o un fragmento o variante de la misma. Se conocen generalmente en la técnica métodos para la preparación de sondas para hibridación y se dan a conocer en Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente en el presente documento incorporado como referencia.

Por ejemplo, puede usarse toda una secuencia de proteína pesticida dada a conocer en el presente documento, o una o más partes de la misma, como sonda que puede hibridar específicamente con secuencias de tipo proteína pesticida y ARN mensajeros correspondientes. Para lograr una hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias pesticidas correspondientes de un organismo elegido mediante PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen examen por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (o bien placas de lisis o bien colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones rigurosas. Por “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” se entienden condiciones en las que se hibridará una sonda con su secuencia diana en un grado mayor de manera detectable que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse secuencias diana que son complementarias al 100% a la sonda (detección con sonda homóloga). Alternativamente, pueden ajustarse condiciones de rigurosidad para permitir cierto apareamiento erróneo en las secuencias de modo que se detecten menores grados de similitud (detección con sonda heteróloga). Generalmente, un sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Normalmente, condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal de iones de Na es menos de aproximadamente 1,5 M, normalmente concentración de iones de Na (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos).

También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad a modo de ejemplo incluyen hibridación con una disolución tampón de formamida a del 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1% a 37ºC, y un lavado en SSC de 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato de trisodio 3,0 M) a de 50 a 55ºC. Las condiciones de rigurosidad moderada a modo de ejemplo incluyen hibridación en formamida a del 40 al 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en SSC de 0,5X a 1X a de 55 a 60ºC. Las condiciones de alta rigurosidad a modo de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en SSC 0,1X a de 60 a 65ºC. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender SDS de aproximadamente al 0,1% a aproximadamente al 1%. La duración de hibridación es generalmente de menos de aproximadamente 24 horas, habitualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es normalmente la función de lavados tras la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, la Tf puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tf = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) 0,61 (% de forma) -500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la disolución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tf es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente apareada. Tf se reduce en aproximadamente 1ºC por cada 1% de apareamiento erróneo; por tanto, pueden ajustarse las condiciones de Tf, hibridación y/o lavado para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad ≥90%, la Tf puede disminuirse 10ºC. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 5ºC menos que el punto de fusión térmica (Tf) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, condiciones intensamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 ó 4ºC menos que el punto de fusión térmica (Tf); condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10ºC menos que el punto de fusión térmica (Tf); condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20ºC menos que el punto de fusión térmica (Tf). Usando la ecuación, composiciones de hibridación y lavado y la Tf deseada, los expertos habituales entenderán que se describen intrínsecamente variaciones en la rigurosidad de disoluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de apareamiento erróneo deseado da como resultado una Tf de menos de 45ºC (disolución acuosa) o 32ºC (disolución en formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que pueda usarse una mayor temperatura. Se encuentra una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Las proteínas pesticidas también están abarcadas dentro de la presente invención. Por “proteína pesticida” se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, 3 ó 4. También se proporcionan fragmentos, partes biológicamente activas y variantes de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO:5, 6, 7 y 8), y pueden usarse para poner en práctica los métodos de la presente invención. Tales fragmentos, partes biológicamente activas y variantes de la misma comprenderán una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida. Una “proteína aislada” se usa para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante.

“Fragmentos” o “partes biológicamente activas” incluyen fragmentos de polipéptido que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, 3 ó 4, y que muestran actividad pesticida. Una parte biológicamente activa de una proteína pesticida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 aminoácidos o más de longitud. Tales partes biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar su actividad pesticida. Se conocen bien en la técnica métodos para medir la actividad pesticida. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense n.º 5.743.477. Tal como se usa en el presente documento, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2, 3 ó 4. La invención abarca otros fragmentos, sin embargo, tal como cualquier fragmento en la proteína más de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 aminoácidos o más.

En algunas realizaciones, el fragmento es un truncamiento N-terminal o C-terminal de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 aminoácidos o más con relación a SEQ ID NO:2, 3 ó 4 (por ejemplo, SEQ ID NO:7 u 8). En algunas realizaciones, los fragmentos abarcados en el presente documento resultan de la eliminación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 aminoácidos C

terminales o más, por ejemplo, mediante proteólisis o mediante inserción de un codón de terminación en la secuencia codificante. Por “variantes” se entiende proteínas o polipéptidos que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90%, el 91%, 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. Variantes también incluyen polipéptidos codificadas por una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas siempre que tengan una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir siguen presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservan la actividad pesticida. En algunas realizaciones, las variantes tienen actividad mejorada. Se conocen bien en la técnica métodos para medir la actividad pesticida. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense n.º 5.743.477.

En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido variante comprende una o más sustituciones en las posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones 307, 315, 317, 349, 351, 353, 355, 395, 399, 407, 419, 435, 443, 465, 467, 483, 487, 495, 497, 499, 509 y 513 con relación a SEQ ID NO:2. En realizaciones específicas, la sustitución es una alanina para el aminoácido nativo en la(s) posición/posiciones citada(s). También están abarcadas la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) para la proteína o el polipéptido variante.

Genes bacterianos, tales como los genes axmi de esta invención, bastante a menudo presentan múltiples codones de iniciación de metionina en las proximidades del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de iniciación conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de iniciación pueden incluir codones ATG. Por ejemplo, SEQ ID NO:3 y 4 representan proteínas de sitio de iniciación alterno codificadas por SEQ ID NO:1. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como codón de iniciación, y proteínas que inician la traducción en codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica para una metionina. Además, a menudo no se determina a priori cuál de estos codones se usa de manera natural en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternos también puede conducir a la generación de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas están abarcadas en la presente invención y pueden usarse en los métodos de la presente invención. Se entenderá que, cuando se expresan en plantas, será necesario alterar el codón de iniciación alterno a ATG para una traducción apropiada.

También están abarcados anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o contra variantes o fragmentos de los mismos. Se conocen bien en la técnica métodos para producir anticuerpos (véanse, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; la patente estadounidense n.º 4.196.265).

Variantes alteradas o mejoradas

Se reconoce que pueden alterarse secuencias de ADN de una proteína pesticida mediante diversos métodos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican para proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes de las codificadas por una proteína pesticida de la presente invención. Tales variantes comprenderán una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida. Esta proteína puede alterarse de diversos modos incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO:2, 3 ó 4, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Se conocen generalmente en la técnica métodos para tales manipulaciones. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de una proteína pesticida mediante mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Tales variantes presentarán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína pesticida para conferir actividad pesticida puede mejorarse mediante el uso de tales técnicas con las composiciones de esta invención. Por ejemplo, puede expresarse una proteína pesticida en células huésped que muestran altas tasas de incorporación incorrecta de bases durante la replicación de ADN, tales como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en tales cepas, puede aislarse el ADN (por ejemplo mediante la preparación de ADN de plásmido, o mediante amplificación por PCR y clonación del fragmento de PCR resultante en un vector), cultivo de las mutaciones de proteína pesticida en una cepa no mutagénica, e identificación de genes mutados con actividad pesticida, por ejemplo mediante la realización de un ensayo para someter a prueba la

actividad pesticida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o producir la muerte de las plagas. Se encuentran ejemplos de mutaciones que dan como resultado un aumento de la toxicidad en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, pueden realizarse alteraciones en la secuencia de proteína de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi-terminal sin afectar sustancialmente a la actividad. Estas pueden incluir inserciones, deleciones o alteraciones introducidas mediante métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones por PCR que alteran o amplían la secuencia codificante de proteína en virtud de la inclusión de secuencias que codifican para aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteína añadidas pueden incluir secuencias codificantes de proteína enteras, tales como las usadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteína. Tales proteínas de fusión se usan a menudo para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar

o bien la purificación de proteínas, detección de proteínas, u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) la secreción o traducción diana de una proteína en un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplasmático de bacterias Gram-negativas, o el retículo endoplasmático de células eucariotas, dando esto último a menudo como resultado glicosilación de la proteína.

Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos variantes de la presente invención también abarcan secuencias derivadas procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como intercambio de ADN. Con un procedimiento de este tipo, pueden usarse una o más regiones codificantes de proteína pesticida diferentes para crear una nueva proteína pesticida que presenta las propiedades deseadas. De esta manera, bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de manera homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, pueden intercambiarse motivos de secuencia que codifican para un dominio de interés entre un gen pesticida de la invención y otros genes pesticidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como un aumento de la actividad insecticida. Se conocen en la técnica estrategias para tal intercambio de ADN. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes estadounidenses n.os

5.605.793 y 5.837.458.

El entrecruzamiento o intercambio de dominios es otro mecanismo para generar proteínas pesticidas alteradas. Pueden entrecruzarse dominios entre proteínas pesticidas, dando como resultado toxinas híbridas o quiméricas con actividad pesticida o espectro diana mejorados. Se conocen bien en la técnica métodos para generar proteínas recombinantes y someterlas a prueba para determinar su actividad pesticida (véanse, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores

Una secuencia pesticida de la invención puede proporcionarse en un casete de expresión para la expresión en una planta de interés. Por “casete de expresión de planta” se entiende un constructo de ADN que puede dar como resultado la expresión de una proteína desde un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Normalmente estos contienen un promotor y una secuencia codificante. A menudo, tales constructos también contendrán una región no traducida en 3’. Tales constructos pueden contener una “secuencia señal” o “secuencia líder” para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a determinadas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plastidio), retículo endoplasmático o aparato de Golgi.

Por “secuencia señal” se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado el transporte de péptido cotraduccional o postraduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto implica normalmente la secreción en el aparato de Golgi, con cierta glicosilación resultante. A menudo se sintetizan toxinas insecticidas de bacterias como protoxinas, que se activan protolíticamente en el intestino de la plaga diana (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia señal está ubicada en la secuencia nativa, o puede derivarse de una secuencia de la invención. Por “secuencia líder” se entiende cualquier secuencia que cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por tanto, esto incluye secuencias líder que seleccionan como diana el transporte y/o la glicosilación mediante el paso al retículo endoplasmático, el paso a vacuolas, plastidios incluyendo cloroplastos, mitocondrias, y similares.

Por “vector de transformación de planta” se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficaz de una célula vegetal. Una molécula de este tipo puede consistir en uno o más casetes de expresión de

planta, y puede organizarse en más de una molécula de ADN de “vector”. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de planta que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar para todas las funciones de acción en cis y trans requeridas para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). “Vector” se refiere a un constructo de ácido nucleico diseñado para la transferencia entre diferentes células huésped. “Vector de expresión” se refiere a un vector que tiene la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos en una célula foránea. El casete incluirá secuencias reguladoras en 5’ y 3’ operativamente unidas a una secuencia de la invención. Por “operativamente unida” se entiende un ligamiento funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la secuencia promotora inicia y media en la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, operativamente unidas significa que las secuencias de ácido nucleico que se ligan son continuas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para cotransformarse en el organismo. Alternativamente, el/los gen(es) adicional(es) puede(n) proporcionarse en múltiples casetes de expresión.

“Promotor” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante en el sentido de 3’. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción (también denominadas “secuencias de control”) son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Un casete de expresión de este tipo se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia pesticida para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en el sentido de transcripción 5’-3’, una región de iniciación de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación de la transcripción y la traducción (es decir, región de terminación) funcionales en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o foráneo o heterólogo, con respecto al huésped vegetal y/o con respecto a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es “nativo” u “homólogo” con respecto al huésped vegetal, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es “foráneo” o “heterólogo” con respecto a la secuencia de ADN de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o que se produce de manera natural para la secuencia de ADN operativamente unida de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente unida de interés, puede ser nativa con el huésped vegetal, o puede derivarse de otra fuente (es decir, foránea o heteróloga con respecto al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped vegetal, o cualquier combinación de los mismos). Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véanse también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el/los gen(es) puede(n) optimizarse para un aumento de la expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse usando codones preferidos por la célula huésped para una expresión mejorada, o pueden sintetizarse usando codones a una frecuencia de uso de codones preferida por el huésped. Generalmente, aumentará el contenido de GC del gen. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para un análisis de uso de codones preferido por el huésped. Están disponibles métodos en la técnica para sintetizar genes preferidos por plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os

5.380.831 y 5.436.391, y Murray et al. (1989) Natcleic Ácidos Res. 17:477-498.

En una realización, la proteína pesticida se dirige al cloroplasto para la expresión. De esta manera, cuando la proteína pesticida no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica para un péptido de tránsito para dirigir la proteína pesticida a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biocherm. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen pesticida que va a dirigirse al cloroplasto puede optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse usando codones preferidos por el cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5,380,831.

Transformación de planta

Los métodos de la invención implican introducir un constructo de nucleótidos en una planta. Por “introducir” se

entiende presentar a la planta el constructo de nucleótidos de tal manera que el constructo obtiene acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir un constructo de nucleótidos en una planta, sólo que el constructo de nucleótidos obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Se conocen en la técnica métodos para introducir constructos de nucleótidos en plantas incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Por “planta” se entiende plantas completas, órganos de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas

o no diferenciadas (por ejemplo callo, células en cultivo en suspensión, protoplastos, células de las hojas, células de las raíces, células del floema, polen).

“Plantas transgénicas” o “plantas transformadas” o plantas o células o tejidos “transformados de manera estable” se refiere a plantas que tienen secuencias de ácido nucleico exógenas incorporadas o integradas o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen las que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como las que pueden ser endógenas, o están presentes en la célula vegetal no transformada. “Heterólogo” generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas con respecto a la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y se han añadido a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similar.

Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las secuencias pesticidas dadas a conocer en el presente documento. En diversas realizaciones, la planta transgénica comprende además uno o más genes adicionales para resistencia a insectos, por ejemplo, uno o más genes adicionales para controlar plagas de coleópteros, lepidópteros, heterópteros o nematodos. Un experto en la técnica entenderá que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que confiera un rasgo agronómico de interés.

La transformación de células vegetales puede lograrse mediante una de varias técnicas conocidas en la técnica. El gen pesticida de la invención puede modificarse para obtener o potenciar la expresión en células vegetales. Normalmente, un constructo que expresa una proteína de este tipo contendría un promotor para dirigir la transcripción del gen, así como una región no traducida en 3’ para permitir la terminación de la transcripción y poliadenilación. La organización de tales constructos se conoce bien en la técnica. En algunos casos, puede ser útil modificar por ingeniería el gen de tal manera que el péptido resultante se secrete, o se seleccione como diana de otro modo dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede modificarse por ingeniería para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. También puede preferirse modificar por ingeniería el casete de expresión de planta para que contenga un intrón, de tal manera que se requiere el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.

Normalmente, esta “casete de expresión de planta” se insertará en un “vector de transformación de planta”. Este vector de transformación de planta puede componerse de uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de planta que se componen de más un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se denominan a menudo en la técnica como “vectores binarios”. Los vectores binarios así como vectores con plásmidos auxiliares se usan con la mayor frecuencia para la transformación medida por Agrobacterium, en la que el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficaz son bastante grandes, y resulta ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN independientes. Los vectores binarios contienen normalmente un vector de plásmido que contiene las secuencias de acción en cis requeridas para la transferencia de ADN-T (tales como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que se modifica por ingeniería para que produzca expresión en una célula vegetal, y un “gen de interés” (un gen modificado por ingeniería para que produzca expresión en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector de plásmido secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias de acción en cis están dispuestas de modo que se permite la transferencia eficaz a células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen pesticida están ubicados en los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector de plásmido contiene los factores de acción en trans que median en la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a células vegetales. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN mediante escisión en secuencias de borde y transferencia de ADN mediada por vir, tal como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Pueden usarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de planta. El segundo vector de plásmido no es necesario para transformar las plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, métodos de transformación de planta implican transferir ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc.), seguido por aplicar un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Normalmente, se

transfieren los explantes a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de manera rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian para dar brotes después de ponerlos en medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes se transfieren entonces a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar brote enraizado o plántula. La plántula transgénica se hace crecer entonces en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei et al. (1994) Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Normalmente, se transfieren los explantes a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de manera rutinaria. Se encuentra una descripción general de las técnicas y los métodos para generar plantas transgénicas en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células; están presentes células tanto transformadas como no transformadas en cualquier trozo de callo o tejido o grupo de células diana sometido. La capacidad para destruir células no transformadas y permitir que proliferen las células transformadas da como resultado cultivos de planta transformada. A menudo, la capacidad para retirar células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación satisfactoria de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, seleccionado como diana para la transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse mediante uno de varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia génica directa, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN foráneo heterólogo adherido a partículas, aceleración balística de partículas, transformación con haz de aerosol (solicitud estadounidense publicada n.º 20010026941; patente estadounidense n.º 4,945,050; publicación internacional n.º WO 91/00915; solicitud estadounidense publicada n.º 2002015066), transformación con Lec1, y diversos otros métodos mediados de manera directa sin partículas para transferir ADN.

Se conocen en la técnica métodos para la transformación de cloroplastos. Véanse, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la inserción con pistola genética de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma plastídico a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, puede lograrse la transformación plastídica mediante transactivación de un transgén portado por plastidio silencioso mediante expresión preferida de tejido de una ARN polimerasa dirigida por plastidio y codificada de manera nuclear. Se ha notificado un sistema de este tipo en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Tras la integración de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, entonces se aplica un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio para destruir las células no transformadas y separar y hacer proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección transfiriéndolas regularmente a un medio nuevo. Por el paso y la exposición continuos con selección apropiada, se identifican y se hacen proliferar las células que se transforman con el vector de plásmido. Pueden usarse entonces métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que se han transformado pueden hacerse crecer en plantas según modos convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden hacerse crecer luego, y polinizarse o bien con la misma cepa transformada o bien con diferentes cepas, e identificarse el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden hacerse crecer dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de manera estable y se hereda y luego recogerse las semillas para garantizar que se ha obtenido la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también denominada “semilla transgénica”) que tiene un constructo de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

Evaluación de la transformación de planta

Tras la introducción de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, se confirma la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta mediante diversos métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por PCR es un método rápido para examinar células, tejido o brotes transformados para determinar la presencia de gen incorporado en una fase anterior al trasplante al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo usando cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de interés o fondo de vector de Agrobacterium, etc.

Puede confirmarse la transformación de planta mediante análisis por transferencia de tipo Southern de ADN

genómico (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente). En general, se extrae el ADN total del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o “transferencia” se examina con sonda con, por ejemplo, fragmento de ADN diana con 32P radiomarcado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta según técnicas convencionales (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente).

En el análisis por transferencia de tipo Northern, se aísla ARN de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de formaldehído-agarosa, y se transfiere sobre un filtro de nailon según procedimientos convencionales que se usan de manera rutinaria en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente). Entonces se somete a prueba la expresión de ARN codificado por el gen pesticida mediante hibridación del filtro con una sonda radiactiva derivada de un gen pesticida, mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente).

Pueden llevarse a cabo inmunotransferencia de tipo Western, ensayos bioquímicos y similares con las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen pesticida mediante procedimientos convencionales (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína pesticida.

Actividad pesticida en plantas

En otro aspecto de la invención, pueden generarse plantas transgénicas que expresan una proteína pesticida que tiene actividad pesticida. Pueden utilizarse los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo para generar plantas transgénicas, pero la manera en que se generan las células vegetales transgénicas no es crítica para esta invención. Pueden utilizarse los métodos conocidos o descritos en la técnica tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística y métodos mediados sin partículas a discreción del experimentador. Pueden aislarse plantas que expresan una proteína pesticida mediante métodos comunes descrito en la técnica, por ejemplo mediante transformación de callo, selección de callo transformado y regeneración de plantas fértiles a partir de tal callo transgénico. En tales procedimientos, puede usarse cualquier gen como marcador seleccionable siempre que su expresión en células vegetales confiera capacidad para identificar o seleccionar células transformadas.

Se han desarrollado varios marcadores para su uso con células vegetales, tales como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina, o similar. También pueden usarse otros genes que codifican para un producto implicado en el metabolismo de cloroplastos como marcadores seleccionables. Por ejemplo, pueden encontrar un uso particular genes que proporcionan resistencia a herbicidas para plantas tales como glifosato, bromoxinil o imidazolinona. Tales genes se han notificado (Stalquer et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa de resistencia a bromoxinil); y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a imidazolinona AHAS). Adicionalmente, los genes dados a conocer en el presente documento son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de los mismos. En una realización, la presencia del transgén se detecta mediante pruebas para determinar la actividad pesticida.

Pueden someterse a prueba plantas fértiles que expresan una proteína pesticida para determinar la actividad pesticida, y seleccionarse las plantas que muestran actividad óptima para reproducción adicional. Están disponibles métodos en la técnica para someter a ensayo la actividad de plagas. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, boniato, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avenas, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las hortalizas incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, judías de Lima, guisantes, y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón cantalupo y melón común. Las plantas ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, flor de Pascua y crisantemo. Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza., etc.).

Uso en control pesticida

Se conocen en la técnica métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de

la presente invención, o una variante de las mismas, en el control pesticida o en la modificación por ingeniería de otros organismos como agentes pesticidas. Véanse, por ejemplo la patente estadounidense n.º 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.

Pueden usarse las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que se han alterado genéticamente para contener un gen y proteína pesticida para proteger cultivos y productos agrícolas frente a plagas. En un aspecto de la invención, células completas, es decir, no lisadas de un organismo productor de toxina (pesticida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando se aplica la célula al entorno de plaga(s) diana.

Alternativamente, el pesticida se produce introduciendo un gen pesticida en un huésped celular. La expresión del gen pesticida da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. En un aspecto de esta invención, estas células se tratan entonces en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando se aplica la célula al entorno de plaga(s) diana. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas encapsulados de manera natural pueden formularse entonces según técnicas convencionales para la aplicación al entorno que alberga una plaga diana, por ejemplo, suelo, agua y follaje de plantas. Véase, por ejemplo el documento EPA 0192319, y las referencias citadas en el mismo. Alternativamente, pueden formularse las células expresar un gen de esta invención tal como para permitir la aplicación del material resultante como pesticida.

Composiciones pesticidas

Los componentes activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse a la zona de cultivo o planta que va a tratarse, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones pesticidas, aceites inactivos, polímeros, y/o formulaciones portadores biodegradables o de liberación a lo largo del tiempo que permiten la dosificación a largo plazo de una zona diana tras una única aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virulicidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros portadores aceptables en agricultura, tensioactivos o adyuvantes de fomento de la aplicación empleados habitualmente en la técnica de formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados puede ser sólidos o líquidos y corresponder a las sustancias empleadas habitualmente en la tecnología de formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de adhesividad, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones pueden prepararse en “cebos” comestibles o confeccionarse en “trampas” para plagas para permitir la alimentación o la ingestión por una plaga diana de la formulación pesticida.

Los métodos de aplicación de un componente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de infestación por la plaga correspondiente.

La composición puede formularse como un polvo, polvo fino, microgránulo, gránulo, una pulverización, emulsión, un coloide, una disolución, o similar, y puede prepararse mediante medios convencionales tales como desecación, liofilización, homogenación, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas de tales composiciones que contienen al menos un polipéptido pesticida de este tipo, el polipéptido puede estar presentes en una concentración de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 99% en peso.

Pueden destruirse plagas de lepidópteros, dípteros, heterópteros, nematodos o coleópteros o reducirse su número en una zona dada mediante los métodos de la invención, o pueden aplicarse de manera profiláctica a una zona del entorno para impedir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente la plaga ingiere, o está en contacto con, una cantidad eficaz como pesticida del polipéptido. Por “cantidad eficaz como pesticida” se entiende una cantidad del pesticida que puede provocar la muerte a al menos una plaga, o reducir perceptiblemente el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas diana específicas que van a controlarse, el entorno, la ubicación, la planta, el cultivo o el sitio agrícola específico que va a tratarse, las condiciones del entorno y el método, la tasa, concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición de polipéptido eficaz como pesticida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales y/o la frecuencia de aplicación y/o intensidad de infestación de la plaga.

Las composiciones pesticidas descritas pueden prepararse formulando o bien la célula bacteriana, suspensión cristalina y/o de esporas o bien el componente de proteína aislada con el portador aceptable en agricultura adecuado. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en medios apropiados tales como liofilizados, secados por congelación, desecados, o en un portador acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un polvo fino o material

granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o emulsiones en agua o aceite/agua, o como polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y se conocen bien en la técnica. El término “portador aceptable en agricultura” cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes de adhesividad, aglutinantes, etc. que se usan habitualmente en la tecnología de formulación de pesticidas; estos los conocen bien los expertos en la formulación de pesticidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse mediante diversos medios, por ejemplo, mediante mezclado, combinación y/o molienda de manera homogénea de la composición pesticida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Se describen formulaciones y métodos de aplicación adecuados en la patente estadounidense n.º 6.468.523.

Las plantas también pueden tratarse con una o más composiciones químicas, incluyendo uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas. Las composiciones químicas a modo de ejemplo incluyen: herbicidas para frutas/hortalizas: atrazina, bromacil, diuron, glifosato, linuron, metribuzin, simazina, trifluralina, fluazifop, glufosinato, halosulfuron Gowan, paraquat, propizamida, setoxidim, butafenacil, halosulfuron, indaziflam; insecticidas para frutas/hortalizas: aldicarb, Bacillus thuriengiensis, carbarilo, carbofurano, clorpirifós, cipermetrina, deltametrina, diazinón, malatión, abamectina, ciflutrina/beta-ciflutrina, esfenvalerato, lambda-cihalotrina, acequinocilo, bifenazato, metoxifenozida, novaluron, cromafenozida, tiacloprid, dinotefurano, fluacripirim, tolfenpirad, clotianidina, espirodiclofeno, gammacihalotrina, espiromesifeno, espinosad, rinaxipir, ciazipir, espinoteram, triflumuron, espirotetramat, imidacloprid, flubendiamida, tiodicarb, metaflumizona, sulfoxaflor, ciflumetofeno, cianopirafeno, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, espinotoram, tiodicarb, flonicamida, metiocarb, emamectina-benzoato, indoxacarb, foztiazato, fenamifós, cadusafós, piriproxifeno, óxido de fenbutatina, hextiazox, metomil, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; fungicidas para frutas/hortalizas: carbendazima, clorotalonil, EBDC, azufre, tiofanato-metilo, azoxistrobina, cimoxanil, fluazinam, fosetil, iprodiona, kresoxim-metilo, metalaxil/mefenoxam, trifloxistrobina, etaboxam, iprovalicarbo, trifloxistrobina, fenhexamida, fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, picoxistrobina, piraclostrobina, ciflufenamida, boscalid; herbicidas para cereales: isoproturon, bromoxinil, ioxinil, fenoxis, clorsulfuron, clodinafop, diclofop, diflufenican, fenoxaprop, florasulam, fluroxipir, metsulfuron, triasulfuron, flucarbazona, yodosulfuron, propoxicarbazona, picolinafeno, mesosulfuron, beflubutamida, pinoxaden, amidosulfuron, tifensulfuron, tribenuron, flupirsulfuron, sulfosulfuron, pirasulfotol, piroxsulam, flufenacet, tralcoxidim, piroxasulfon; fungicidas para cereales: carbendazima, clorotalonil, azoxistrobina, ciproconazol, ciprodinil, fenpropimorph, epoxiconazol, kresoxim-metilo, quinoxifeno, tebuconazol, trifloxistrobina, simeconazol, picoxistrobina, piraclostrobina, dimoxistrobina, protioconazol, fluoxastrobina; insecticidas para cereales: dimetoato, lambdacihaltrina, deltametrina, alfa-cipermetrina, 13-ciflutrina, bifentrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, clorpirifós, metamidofós, oxidemeton-metilo, pirimicarb, metiocarb; herbicidas para maíz: atrazina, alaclor, bromoxinil, acetoclor, dicamba, clopiralid, (s-)dimetenamida, glufosinato, glifosato, isoxaflutol, (s)metolaclor, mesotriona, nicosulfuron, primisulfuron, rimsulfuron, sulcotriona, foramsulfuron, topramezona, tembotriona, saflufenacil, thiencarbazona, flufenacet, piroxasulfon; insecticidas para maíz: carbofurano, clorpirifós, bifentrina, fipronil, imidacloprid, lambda-cihalotrina, teflutrina, terbufós, tiametoxam, clotianidina, espiromesifeno, flubendiamida, triflumuron, rinaxipir, deltametrina, tiodicarb, β-ciflutrina, cipermetrina, bifentrina, lufenuron, triflumoron, teflutrina, tebupirimfós, etiprol, ciazipir, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, avermectina, metiocarb, espirodiclofeno, espirotetramat; fungicidas para maíz: fenitropan, tiram, protioconazol, tebuconazol, trifloxistrobina; herbicidas para arroz: butaclor, propanil, azimsulfuron, bensulfuron, cihalofop, daimuron, fentrazamida, imazosulfuron, mefenacet, oxaziclomefona, pirazosulfuron, piributicarb, quinclorac, tiobencarb, indanofan, flufenacet, fentrazamida, halosulfuron, oxaziclomefona, benzobiciclon, piriftalida, penoxsulam, bispiribaco, oxadiargilo, etoxisulfuron, pretilaclor, mesotriona, tefuriltriona, oxadiazona, fenoxaprop, pirimisulfan; insecticidas para arroz: diazinón, fenitrotión, fenobucarb, monocrotofós, benfuracarb, buprofezina, dinotefurano, fipronil, imidacloprid, isoprocarb, tiacloprid, cromafenozida, tiacloprid, dinotefurano, clotianidina, etiprol, flubendiamida, rinaxipir, deltametrina, acetamiprid, tiametoxam, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-benzoato, cipermetrina, clorpirifós, cartap, metamidofós, etofenprox, triazofós, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)ona, carbofurano, benfuracarb; fungicidas para arroz: tiofanato-metilo, azoxistrobina, carpropamida, edifenfós, ferimzona, isondanfós, isoprotiolano, pencicuron, sondanazol, piroquilon, triciclazol, trifloxistrobina, diclocimet, fenoxanil, simeconazol, tiadinil; herbicidas para algodón: diuron, fluometuron, MSMA, oxifluorfeno, prometrina, trifluralina, carfentrazona, cletodim, fluazifop-butilo, glifosato, norflurazon, pendimetalina, piritiobaco-sodio, trifloxisulfuron, tepraloxidim, glufosinato, flumioxazina, tidiazuron; insecticidas para algodón: acefato, aldicarb, clorpirifós, cipermetrina, deltametrina, malatión, monocrotofós, abamectina, acetamiprid, emamectina-benzoato, imidacloprid, indoxacarb, lambda-cihalotrina, espinosad, tiodicarb, gamma-cihalotrina, espiromesifeno, piridalilo, flonicamida, flubendiamida, triflumuron, rinaxipir, beta-ciflutrina, espirotetramat, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, dinetofurano, flubendiamida, ciazipir, espinosad, espinotoram, gamma-cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, tiodicarb, avermectina, flonicamida, piridalilo, espiromesifeno, sulfoxaflor, profenofós, triazofós, endosulfan; fungicidas para algodón: etridiazol, metalaxilo, quintozeno; herbicidas para soja: alaclor, bentazona, trifluralina, clorimuron-etilo, cloransulam-metilo, fenoxaprop, fomesafeno, fluazifop, glifosato, imazamox, imazaquin, imazetapir, (S-)metolaclor, metribuzin, pendimetalina, tepraloxidim, glufosinato; insecticidas para soja: lambda-cihalotrina, metomil, paratión, tiocarb, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-benzoato, fipronil, etiprol, deltametrina, β-ciflutrina, gamma y lambda-cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan

2(5H)-ona, espirotetramat, espinodiclofeno, triflumuron, flonicamida, tiodicarb, beta-ciflutrina; fungicidas para soja: azoxistrobina, ciproconazol, epoxiconazol, flutriafol, piraclostrobina, tebuconazol, trifloxistrobina, protioconazol, tetraconazol; herbicidas para remolacha azucarera: cloridazon, desmedifam, etofumesato, fenmedifam, trialato, clopiralid, fluazifop, lenacil, metamitron, quinmerac, cicloxidim, triflusulfuron, tepraloxidim, quizalofop; insecticidas para remolacha azucarera: imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, deltametrina, β-ciflutrina, gamma/lambda-cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, teflutrina, rinaxipir, ciaxipir, fipronil, carbofurano; herbicidas para canola: clopiralid, diclofop, fluazifop, glufosinato, glifosato, metazaclor, trifluralina etametsulfuron, quinmerac, quizalofop, cletodim, tepraloxidim; fungicidas para canola: azoxistrobina, carbendazima, fludioxonil, iprodiona, procloraz, vinclozolin; insecticidas para canola: carbofurano, organofosfatos, piretroides, tiacloprid, deltametrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, acetamiprid, dinetofurano, β-ciflutrina, gamma y lambda-cihalotrina, tau-fluvaleriato, etiprol, espinosad, espinotoram, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

“Plaga” incluye pero no se limita a, los insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas, y similares. Las plagas de insectos incluyen los insectos seleccionados de los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera y Diptera.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Diptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombiliidae y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphydae y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae y Tineidae.

Las plagas de insectos de la invención para los principales cultivos incluyen: maíz: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador grasiento; Helicoverpa zea, gusano de la cápsula de maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del suroeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz del oeste; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos alambre; Cyclocephala borealis, rozador enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, rozador enmascarado del sur (gusano blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de las hojas del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, mosca de las semillas; Agromyza parvicornis, minador de hojas de mancha de maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, arañuela roja; sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano de la cápsula de maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Feltia subterranea, gusano graneado; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., gusanos alambre; Oulema melanopus, crisomela de los cereales; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de las hojas del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, arañuela roja del clavel; Tetranychus urticae, arañuela roja; trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano cogollero; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental;

Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Oulema melanopus, crisomela de los cereales; Hypera punctata, gorgojo del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Macrosiphum avenae, pulgón inglés de las gramíneas; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sangatinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Sitodiplosis mosellana, mosquita del trigo; Meromyza americana, mosca del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca gris del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra del trigo; Aceria tulipae, ácaro blanco del trigo; girasol: Suleima helianthana, polilla de las yemas del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; Zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquita de las semillas de girasol; algodón: Helioesta virescens, gusano de las yemas del algodón; Helicoverpa zea, gusano de las cápsulas del algodón; Spodoptera exigua, gusano cogollero de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado del algodonero; Anthonomus grandis, picudo del algodonero; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulguilla del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de alas con franjas; Lygus lineolaris, chinche manchador; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, arañuela roja del clavel; Tetranychuss urticae, arañuela roja; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano de la cápsula de maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo acuático del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, chicharrita del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche hediondo verde; soja: Pseudoplusia includens, oruga agrimensora de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador grasiento; Spodoptera exigua, gusano cogollero de la remolacha; Helioesta virescens, gusano de las yemas del algodón; Helicoverpa zea, gusano de las cápsulas del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo del frijol mexicano; Myzus persicae, pulgón verde del melocotonero; Empoasca fabae, chicharrita de la patata; Acrosternum hilare, chinche hediondo verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, mosca de las semillas; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, arañuela de la fresa; Tetranychus urticae, arañuela roja; cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador grasiento; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche hediondo verde; Euschistus servus, chinche hediondo pardo; Delia platura, mosca de las semillas; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Petrobia latens, ácaro pardo del trigo; colza: Brevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta crucíferaae, pulguilla; Mamestra configurata, gusano soldado Bertha; Plutella xilostella, polilla de la cola; Delia ssp., mosquillas de la raíz.

Los nematodos incluyen nematodos parasitarios tales como nematodos de la raíz, heteroderas y nematodos de los prados, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los heteroderas, incluyendo, pero sin limitarse a, Heterodera glycines (heterodera de la soja); Heterodera schachtii (heterodera de la remolacha); Heterodera avenae (heterodera de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos dorados de la patata). Los nematodos de los prados incluyen Pratylenchus spp.

Métodos para aumentar el rendimiento vegetal

Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden proporcionar una planta

o célula vegetal que expresa un polinucleótido que codifica para la secuencia pesticida de polipéptido dada a conocer en el presente documento y hacer crecer la planta o a semilla de la misma en un campo infestado con una plaga frente a la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad pesticida frente a una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos, y dicho campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, dípteros o nematodos.

Tal como se define en el presente documento, el “rendimiento” de la planta se refiere a la cualidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por “biomasa” se entiende cualquier producto de planta medido. Un aumento de la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto de planta medido. El aumento del rendimiento vegetal tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de hojas de planta puede aumentar el rendimiento de hortalizas de hoja para consumo humano o animal. Adicionalmente, puede usarse el aumento de la biomasa de hojas para aumentar la producción de productos industriales o farmacéuticos derivados de plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo incluyendo, pero sin limitarse a, un aumento de al menos el 1%, un aumento de al menos el 3%, un aumento de al menos el 5%, un aumento de al menos el 10%, un aumento de al menos el 20%, de al menos el 30%, de al menos el 50%, de al menos el 70%, de al menos el 100% o un aumento mayor del rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia pesticida.

En métodos específicos, se aumenta el rendimiento vegetal como resultado de una resistencia a plagas mejorada de una planta que expresa una proteína pesticida dada a conocer en el presente documento. La expresión de la proteína pesticida da como resultado una capacidad reducida de una plaga para infestar o alimentarse con la planta, mejorando por tanto el rendimiento vegetal.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Parte experimental

Ejemplo 1. Identificación de una proteína activa frente al gusano de la raíz del maíz del oeste de la cepa ATX 2024.

Se identificó la proteína AXMI-205 activa del gusano de la raíz del maíz del oeste mediante una combinación de análisis bioquímico y genómico de la cepa ATX 2024.

Se identificó ATX2024 como cepa activa en bioensayo de Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz del oeste o WCRW, Western corn rootworm) que mostraba una actividad de sensibilidad al calor. Se realizaron el fraccionamiento y la purificación de proteínas en materiales de cultivo de ATX2024 de la siguiente manera:

Se hicieron crecer células de ATX2024 en medios adecuados (tales como medios C2 o medios CYS complementados con trehalosa; no siendo crítica la elección de medios para la invención) durante 3 días a 37ºC. También puede realizarse la incubación a 30ºC. Se recogieron los sedimentos celulares y se perturbaron las células en tampón A (acetato de sodio 20 mM/cloruro de sodio 5 mM, pH 5) usando una celda de alta presión de “prensa francesa”.

Se clarificaron los lisados mediante centrifugación y se dializaron frente a acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, pH 5,0. Entonces se cargó la muestra dializada sobre una columna de intercambio catiónico SP Sepharose™ de 20 ml (GE Healthcare). Se eluyeron las proteínas con un gradiente salino lineal en tampón A desde cloruro de sodio 50 mM hasta 1 M a lo largo de 20 volúmenes de columna. También puede realizarse la elución a lo largo de 10 volúmenes de columna.

Se reunieron las fracciones activas y se dializaron frente a tampón B (Tris-HCl 20 mM/NaCl 50 mM, pH 7 o pH 8). Entonces se cargaron las fracciones activas dializadas en una columna de intercambio aniónico Sepharose Q de 5 ml. Pueden usarse otras columnas de intercambio aniónico, por ejemplo, la columna de intercambio aniónico SOURCE™Q de 1,7 ml. Se eluyeron las proteínas con un gradiente salino lineal en tampón A desde NaCl 50 mM hasta 1 M. Se sometieron a prueba las fracciones recogidas para determinar la actividad sobre WCRW y se observaron fracciones con actividad sobre WCRW. Se identificó una banda de proteína de aproximadamente 52 kDa como que se correlacionaba con la actividad de las fracciones. Esta proteína se denomina en el presente documento banda de proteína n.º 10.

Entonces se reunieron las fracciones activas y se concentraron, y se sometieron a SDS-PAGE. Se aisló la parte del gel resultante correspondiente a la banda de proteína n.º 10, y se envió para análisis mediante análisis tanto de secuenciación N-terminal como de espectrometría de masas en tándem con tiempo de vuelo por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-TOF) tal como se conoce en la técnica.

La comparación de los datos de MALDI-TOF-TOF de la banda de proteína n.º 10 no mostró coincidencias en una base de datos de proteínas conocidas.

La secuenciación de aminoácidos del extremo N-terminal de la banda de proteína n.º 10 dio como resultado una secuencia peptídica N-terminal que no mostró coincidencias con secuencias de proteína conocidas cuando se comparó con una base de datos secuencias de proteína conocidas.

Ejemplo 2. Secuenciación genómica de ATX2024

Se identificó la secuencia génica completa de la cepa seleccionada de la siguiente manera:

El ADN total contiene una mezcla de algunos o de todos de los siguientes: ADN genómico, plásmidos de diverso tamaño; cromosomas de fago; otras moléculas extracromosómicas no caracterizadas.

Cizalladura mecánica o enzimática del ADN extracromosómico para generar fragmentos con distribución de tamaños.

Secuenciación del ADN fragmentado mediante métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo 3. Coincidencia de datos N-terminales y de MALDI-TOF-TOF con datos de secuencia genómica:

Se generó un conjunto de supuestos marcos de lectura abiertos (ORF) codificados por los datos de secuencia para ATX2024 mediante la extracción de todos los posibles ORF de las lecturas de secuencia generadas a partir de

ATX2024. Se compararon datos de secuenciación N-terminal de la banda de proteína n.º 10 (anteriormente) con el conjunto de ORF de ATX2024 usando el algoritmo BLAST. Se encontraron dos lecturas que codificaban para supuestos fragmentos de proteína con alta homología con los datos de secuencia N-terminal.

De manera similar, se compararon los datos de MALDI-TOF-TOF de la banda de proteína n.º 10 con el conjunto de ORF de ATX2024 usando el programa Mascot (www.matrixscience.com; Perkins et al. (1999) Electrophoresis 20(18):3551-67). Se encontró que siete lecturas codificaban para supuestos fragmentos de proteína que tienen coincidencias significativas con picos presentes en el conjunto de datos de MALDI-TOF-TOF.

Se reunieron las lecturas de secuencia de ADN identificadas a partir del análisis de datos N-terminales y de MALDI-TOF-TOF para proporcionar una secuencia génica preliminar.

Se usaron estrategias de TAIL-PCR para obtener la secuencia flanqueante adyacente a los datos de secuencia génica preliminar. Se reunieron conjuntamente las secuencias de los productos de PCR resultantes con los datos genómicos originales de ATX2024 para proporcionar una secuencia génica terminada para el marco de lectura abierto que codifica para la banda de proteína n.º 10. Este marco de lectura abierto se designa como Axmi205 (SEQ ID NO:1), y la proteína codificada por el marco de lectura abierto como AXMI-205 (SEQ ID NO:2, 3 ó 4).

Entonces se amplificó la región genómica que codifica para AXMI-205 a partir del genoma de ATX2024, se clonó y se obtuvo la secuencia de ADN de este clon. La secuencia de ADN de este clon en la región que abarca Axmi205 se proporciona como SEQ ID NO:12.

La comparación de AXMI-205 con bases de datos de secuencias de proteína conocidas muestra que AXMI-205 es una proteína única, que muestra muy poca homología (el 20% o menos) con proteínas conocidas.

De manera interesante, AXMI-205 sí que muestra baja homología, pero posiblemente significativa, con una amplia clase de proteínas vagamente relacionadas denominadas a menudo proteínas MACPF (Rosado et al, Cellular Microbiology (2008) 10(9), 1765-1774). Se ha propuesto que estas proteínas desempeñan papeles en procesos tales como respuesta inmunitaria y protección frente al ataque bacteriano. AXMI-205 es idéntica en el 20% a una proteína de Clavibacter michiganensis (SEQ ID NO:14; n.º de registro GENBANK YP_001223127, Gartemann et al,

J. Bacteriol. 190 (6), 2138-2149 (2008)) y una identidad del 13% con una proteína de Photorhabdus luminescens (SEQ ID NO:15; n.º de registro GENBANK 2QP2_A; Rosado, C.J., et al, Science 317 (5844), 1548-1551 (2007)). Aunque estas identidades en porcentaje son bajas, pueden identificarse bloques de conservación de aminoácidos entre estas proteínas a partir de la inspección de la figura 1.

Ejemplo 3. Expresión heteróloga de AXMI-205

Se clonó el marco de lectura abierto de Axmi205 en un vector de expresión de E. coli basado en (1) vector de fusión de unión a maltosa para producir pAX6911, y (2) un vector de expresión basado en pRSF1b para producir pAX7011.

Para la expresión en E. coli, se transformó BL21*DE3 con o bien pAX6911, o bien pAX7011 o bien plásmidos de control. Se inoculó una colonia individual transformada con el vector en LB complementado con kanamicina y se hizo crecer durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, se inoculó medio nuevo por duplicado con el 1% de cultivo durante la noche y se hizo crecer a 37ºC hasta la fase logarítmica. Posteriormente, se indujeron los cultivos con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37ºC o durante la noche a 20ºC. Se suspendió cada sedimento celular en tampón carbonato de sodio 50 mM, pH 10,5 complementado con DTT 1 mM y se sonicó. El análisis mediante SDS-PAGE detectó la expresión de una proteína correspondiente al tamaño predicho de AXMI-205. En el caso del vector de fusión de pMal, pAX6911, se observó mediante PAGE una proteína que concuerda con el tamaño predicho para la fusión pMAL-AXMI-205.

Ejemplo 4. Actividad pesticida de AXMI-205

Se purificó la proteína de fusión a partir de lisados de clones de E. coli tal como recomienda el proveedor (New England Biolabs), y se escindió o bien con factor Xa o bien con tripsina. Se confirmó mediante análisis de SDS-PAGE la escisión de la proteína de fusión purificada. Se sometieron a prueba la proteína purificada de pAX6911 que contenía AXMI-205 y o bien se escindió pAX6911 con factor Xa o tripsina, o bien la proteína no escindida en ensayos en insectos con controles apropiados en un tampón que se componía de Tris 20 mM, DTT 1 mM, NaCl 50 mM. También se sometieron a prueba extractos solubles de pAX7011 que expresaba AXMI-205 de esta manera. Después de dos días, las muestras que contenían AXMI-205 presentaron una fuerte actividad de retraso del crecimiento y confirieron mortalidad para el gusano de la raíz del maíz del oeste. La tabla 1 muestra una descripción de las asignaciones de puntuación usadas en el presente documento, y la tabla 2 resume las actividades observadas a partir de muestras de AXMI-205.

Tabla 1. Descripción del sistema de puntuación

Puntuación

Descripción

0

sin efecto observado

1

retraso del crecimiento no uniforme leve

2

retraso del crecimiento no uniforme moderado

3

retraso del crecimiento uniforme moderado a grave

4

mortalidad (<100%) con retraso del crecimiento uniforme

5

Mortalidad completa

Tabla 2. Actividad pesticida de muestras de AXMI-205

Muestra

Actividad sobre WCRW (2 días) Mortalidad en porcentaje

Fusión Axmi205-MBP (de pAX6911)

3,0 25%

Fusión Axmi205-MBP escindida con factor Xa

3,0 25%

Fusión Axmi205-MBP escindida con tripsina

3,0 25%

Axmi205 en extracto soluble de pAX7011

3,0 0%

Control de tampón

0 0%

Ejemplo 5. Ensayos adicionales para determinar la actividad pesticida

Pueden someterse a prueba las secuencias de nucleótidos de la invención para determinar su capacidad para producir proteínas pesticidas. La capacidad de una proteína pesticida para actuar como pesticida sobre una plaga se evalúa a menudo de varios modos. Un modo bien conocido en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. En un ensayo de alimentación de este tipo, se expone la plaga a una muestra que contiene o bien compuestos que van a someterse a prueba o bien muestras de control. A menudo esto se realiza poniendo el material que va a someterse a prueba, o una dilución adecuada de tal material, sobre un material que ingerirá la plaga, tal como una dieta artificial. El material que va a someterse a prueba puede componerse de un líquido, sólido o una suspensión. El material que va a someterse a prueba puede ponerse sobre la superficie y luego permitir que se seque. Alternativamente, el material que va a someterse a prueba puede mezclarse con una dieta artificial fundida, luego dispensarse a la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pocillo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para parásitos chupadores (por ejemplo, pulgones) pueden implicar separar el material de prueba del insecto mediante una división, de manera ideal una parte que pueden perforar las partes chupadoras de la boca del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo el material de prueba se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como sacarosa, para fomentar la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca, o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido por la prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse con la planta transgénica. Las pruebas en plantas pueden implicar el aislamiento de partes de la planta consumidas normalmente, por ejemplo, pequeñas jaulas unidas a una hoja, o el aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen los insectos.

Se conocen en la técnica otros métodos y enfoques para someter a ensayo plagas, y pueden hallarse, por ejemplo en Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropod, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, se describen comúnmente ensayos en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o mediante comentario con miembros de la Sociedad Americana de Entomología (ESA).

Ejemplo 6. Genes sintéticos.

Se diseñaron genes sintéticos que codifican para AXMI-205. Axmi205v01.02 se expone en SEQ ID NO:9. Axmi205v01.03 se expone en SEQ ID NO:10. Axmi205v01.04 se expone en SEQ ID NO:11.

Ejemplo 7. Variantes de AXMI-205.

Para identificar regiones y posiciones en la parte C-terminal de AXMI-205 que son funcionalmente importantes, se sometieron a ensayos mutantes de barrido de alanina en la región correspondiente a las posiciones de aminoácido 307-536 de SEQ ID NO:2. Se generaron los mutantes de alanina de manera sintética (Geneart, Burlingame, CA) y se organizaron en un vector de expresión derivado de pAX3577 para la expresión en E. coli (pAX3577 contiene Axmi205v01.03 en pRSF1b (Invitrogen)).

Partiendo del mutante S307A, se sustituyó cada segundo residuo por una alanina. El último mutante de alanina en esta serie fue K535A. En total, se reunieron 101 mutantes de alanina.

Se transformaron los mutantes de alanina reunidos, así como pAX3577, en células BL21*DE3 y se sembraron en placa sobre LB + kanamicina (100 µg/ml). Se cogieron colonias nuevas y se llevaron a 8 ml de medio líquido de LB + kanamicina (100 µg/ml) y se hicieron crecer en bloques de 24 pocillos profundos a 37ºC y 300 rpm hasta que se alcanzó una DO600 nm de 0,6. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM y se incubaron los cultivos durante unas 18 horas más a 20ºC. Se determinó la DO600 nm y se recogieron las células mediante centrifugación (10 minutos a 4000 rpm, 4ºC). Se resuspendieron los sedimentos celulares en Tris 20 mM/HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, DTT 1 mM a una densidad de 20 DO600/ml. Se perturbaron las células mediante batido con esferas y se obtuvieron extractos solubles después de centrifugación a 4500 rpm durante 15 minutos a 4ºC.

Se sometieron a ensayo los extractos para determinar la actividad frente a WCRW en cuatro réplicas por variante cada uno. Después de cinco y seis días, se determinaron las puntuaciones de toxicidad para el gusano de la raíz promediando las puntuaciones de las cuatro réplicas. Se examinaron 266 variantes en este examen primario, proporcionando una cobertura de 3 veces de la biblioteca. Se secuenciaron las variantes que puntuaron por encima y por debajo de la puntación de la secuencia de tipo natural de Axmi205.

Se encontró que los siguientes mutantes de alanina (con relación a SEQ ID NO:2) eran activos sobre WCRW: S307A, D315A, V317A, S349A, G351A, K353A, V355A, D395A, G399A, W407A, G419A, P355A, P435A, S443A, K465A, V467A, F483A, P487A, S495A, D497A, E499A, K509A, y I513A. El mutante de alanina E499A se designó como Axmi205(evo24) (SEQ ID NO:5) y el mutante de alanina V467A se designó como Axmi205(evo25) (SEQ ID NO:6).

Ejemplo 8. Actividad de truncamientos de axmi-205

Se construyeron varios truncamientos de axmi-205 y se sometieron a prueba para determinar la actividad sobre el gusano de la raíz del maíz. Se construyeron truncamientos C-terminales que eliminaron o bien 10, 20, 30, 34 o bien 71 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína AXMI-205 (SEQ ID NO:2).

El clon pAX7106 expresó una fusión de MBP que, después de escisión con factor Xa, produjo la proteína AXMI205(trunc10) (SEQ ID NO:7), que carece de 10 aminoácidos del extremo C-terminal con relación a AXMI-205. El clon pAX7106 expresó una proteína de fusión de MBP que, después de escisión con factor Xa, produjo la proteína AXMI-205(trunc20) (SEQ ID NO:8), que carece de 20 aminoácidos del extremo C-terminal con relación a AXMI-205. Tanto AXMI-205(trunc10) como AXMI-205(trunc20) demostraron actividad sobre WCRW, mientras que un truncamiento de 30 aminoácidos no lo hizo.

Ejemplo 9. Vectorización de genes para expresión en plantas

Las regiones codificantes de la invención se conectan con secuencias promotoras y terminadoras apropiadas para la expresión en plantas. Tales secuencias se conocen bien en la técnica y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis

o el promotor 35S del VMCo para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinII. También se conocen bien en la técnica técnicas para producir y confirmar constructos promotor -gen -terminador.

En un aspecto de la invención, se diseñan y generan secuencias de ADN sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de nucleótidos alterada con relación a la secuencia original, pero codifican para proteínas que son esencialmente idénticas a la proteína AXMI-205 original (por ejemplo, SEQ ID NO:9-12).

En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de los genes sintéticos de tal manera que el péptido resultante se dirige a un orgánulo vegetal, tal como el retículo endoplasmático o el apoplasto. Se conocen en la técnica secuencias peptídicas que se sabe que dan como resultado el direccionamiento de proteínas de fusión a orgánulos vegetales. Por ejemplo, se sabe en la técnica que la región N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco, Lupinus albus (GI ID de GENBANK®:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) da como resultado el direccionamiento al retículo endoplasmático de proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención en retículo endoplasmático que comprende el péptido extremo N-terminal-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo “KDEL”, SEQ ID NO:13) en el extremo C-terminal, la proteína de fusión se direccionará al retículo endoplasmático. Si la proteína de fusión carece de una secuencia de direccionamiento al retículo endoplasmático en el extremo C-terminal, la proteína se direccionará al retículo endoplasmático, pero en última instancia se verá secuestrada en el apoplasto.

Por tanto, este gen codifica para una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos N-terminales del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco, Lupinus albus (GI ID de GENBANK®:14276838, Miller et al., 2001, citado anteriormente) fusionada al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la invención, así como la secuencia KDEL en el extremo C-terminal. Por tanto, se predice que la proteína resultante se direcciona al retículo endoplasmático de la planta tras la expresión en una célula vegetal.

Los casetes de expresión de planta descritos anteriormente se combinan con un marcador seleccionable vegetal apropiado para ayudar en la selección de células y tejidos transformados, y ligados en vectores de transformación de planta. Estos pueden incluir vectores binarios de transformación mediada por Agrobacterium o simples vectores de plásmido para transformación en aerosol o biolística.

Ejemplo 10. Vectorización de genes para expresión en plantas

El ADN de región codificante de los genes de la invención se conecta operativamente con secuencias promotoras y terminadoras apropiadas para la expresión en plantas. Tales secuencias se conocen bien en la técnica y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis o el promotor 35S del VMCo para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinII. También se conocen bien en la técnica técnicas para producir y confirmar constructos promotor -gen terminador.

Los casetes de expresión de planta descritos anteriormente se combinan con un marcador seleccionable vegetal apropiado para ayudar en la selección de células y tejidos transformados, y ligados en vectores de transformación de planta. Estos pueden incluir vectores binarios de transformación mediada por Agrobacterium o simples vectores de plásmido para transformación en aerosol o biolística.

Ejemplo 11. Transformación de células de maíz con los genes de proteínas pesticidas descritos en el presente documento

Se recogen de la mejora manera espigas de maíz 8-12 días después de la polinización. Se aíslan los embriones de las espigas y se prefieren aquellos embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Se siembran en placa los embriones con el escutelo hacia arriba en medios de incubación adecuados, tales como medios DN62A5S (sales N6 3,98 g/l; vitaminas N61 ml/l (disolución madre 1000x); L-asparagina 800 mg/l; mioinositol100 mg/l; L-prolina 1,4 g/l; casaminoácidos 100 mg/l; sacarosa 50 g/l; 2,4-D 1 ml/l (disolución madre 1 mg/ml)). Sin embargo, son adecuados y se conocen en la técnica medios y sales distintos de DN62A5S. Se incuban los embriones durante la noche a 25ºC en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche.

Se transfieren los explantes resultantes a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren sobre medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos, luego se transfieren a una placa de irradiación (véanse, por ejemplo, la publicación PCT n.º WO/0138514 y la patente estadounidense n.º 5.240.842).

Se aceleran constructos de ADN diseñados con los genes de la invención en células vegetales en tejido vegetal usando un acelerador de haz de aerosol, usando condiciones esencialmente tal como se describe en la publicación PCT n.º WO/0138514. Después de la irradiación, se incuban los embriones durante aproximadamente 30 min en medios osmóticos, y se ponen en medios de incubación durante la noche a 25ºC en la oscuridad. Para evitar dañar indebidamente los explantes irradiados, se incuban durante al menos 24 horas antes de la transferencia a medios de recuperación. Entonces se extienden los embriones sobre medios de periodo de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25ºC en la oscuridad, luego se transfieren a medios de selección. Se incuban los explantes en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, se transfiere el callo resultante a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Entonces se ponen los embriones somáticos maduros resultantes con baja luz, y se inicia el proceso de regeneración mediante métodos conocidos en la técnica. Se permite que enraícen los brotes resultantes en medios de enraízado, y se transfieren las plantas resultantes a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

Medios DN62A5S

Componentes

Por litro Fuente

Mezcla de sales basales N6 de Chu (n.º de prod. C 416)

3,98 g/l Phytotechnology Labs

Disolución de vitaminas N6 de Chu (n.º de prod. C 149)

1 ml/l (de disolución madre 1000x) Phytotechnology Labs

L-Asparagina

800 mg/l Phytotechnology Labs

Mio-inositol

100 mg/l Sigma

L-Prolina

1,4 g/l Phytotechnology Labs

Casaminoácidos

100 mg/l Fisher Scientific

Sacarosa

50 g/l Phytotechnology Labs

2,4-D (n.º de prod. D-7299)

1 ml/l (de disolución madre 1 mg/ml) Sigma

Se ajusta el pH de la disolución a pH 5,8 con KOH 1 N/KCl 1 N, se añade Gelrite (Sigma) a una concentración de hasta 3g/l, y se esterilizan en autoclave los medios. Después de enfriar hasta 50ºC, se añaden 2 ml/l de una disolución madre 5 mg/ml de nitrato de plata (Phytotechnology Labs).

Ejemplo 12. Transformación de genes de la invención en células vegetales mediante transformación mediada por Agrobacterium

Se recogen de la mejor manera espigas de maíz 8-12 días después de la polinización. Se aíslan los embriones de las espigas y se prefieren aquellos embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Se siembran en placa los embriones con el escutelo hacia arriba en medios de incubación adecuados, y se incuban durante la noche a 25ºC en la oscuridad Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Se ponen en contacto los embriones con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para la transferencia mediada por el plásmido Ti durante aproximadamente 5-10 min, y luego se siembran en placa sobre medios de cocultivo durante aproximadamente 3 días (25ºC en la oscuridad). Después del cocultivo, se transfieren los explantes a medios de periodo de recuperación durante aproximadamente cinco días (a 25ºC en la oscuridad). Se incuban los explantes en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, se transfiere el callo resultante a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Entonces se ponen los embriones somáticos maduros resultantes con baja luz, y se inicia el proceso de regeneración tal como se conoce en la técnica.

Ejemplo 13. Protección de plantas transgénicas que expresan Axmi205 frente al daño de la raíz tras la infestación con gusano de la raíz del maíz

Se obtuvieron plantas de maíz transgénicas transformadas con cualquiera de dos versiones de Axmi205 (Axmi205 (SEQ ID NO:1) o Axmi205v01.03 (SEQ ID NO:10)) mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se seleccionaron las plantas que mostraron mediante análisis por PCR que contenían el constructo de Axmi205 apropiado, y se transfirieron a recipientes guía de raíces.

Para plantas que contenían Axmi205 o Axmi205v01.03 se trasplantaron a recipientes guía de raíces y se propagaron durante aproximadamente tres semanas. Entonces se infestó cada planta individual con ∼125 huevos del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera) sin diapausa. Se observó que más del 90% de los huecos habían eclosionado en un plazo de 24 horas desde la infestación. Se analizaron las plantas para determinar la expresión de la proteína AXMI-205 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-AXMI-205. Se seleccionaron las plantas que expresaron cantidades detectables de AXMI-205 para el análisis. Después de quince días, se evaluó la cantidad de daño de la raíz en cada planta usando la escala 1 de lesiones de nudos del Estado de Iowa (Oleson, J.D., Y. Park, T.M. Nowatzki, y J.J. Tollefson. 2005. J. Econ Entomol. 98(1): 1-8). La tabla 3 muestra que ambas formas de AXMI-205 dieron como resultado menor daño de la raíz que las plantas control infestadas de la misma manera. En experimentos similares, las plantas que contenían o bien Axmi205v01.02 o bien Axmi205v01.04 demostraron clasificaciones de raíces mejoradas en comparación con los controles no transformados (no mostrados).

Tabla 3. Daño de la raíz de maíz transgénico que expresa Axmi-205

Transgén

Número de plantas Puntuación de raíz promedio Varianza

Plantas de control (sin transgén)

35 2,44 0,23

Axmi205

16 1,11 0,5

Axmi205v01.03

12 0,81 0,43

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan al presente documento como referencia en la misma extensión que si se indicara específica e individualmente que se incorpora como referencia cada publicación o solicitud de patente individual.

Aunque se ha descrito la invención anterior en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los fines de claridad de comprensión, resultará obvio que pueden ponerse en práctica determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Lista de secuencias

<110> Desai, Nalini Hinson, Jill Balusubramanian, Deepa

5 Sampson, Kimberly S. Tomso, Daniel J. Lehtinen, Duane Alan Duck, Nicholas B.

<120> GEN PESTICIDA AXMI-205 Y MÉTODOS PARA SU USO

10 <130> APA066US01

<150> Documento 61/222.778

<151>

<160> 15

<170> PatentIn versión 3.5

15 <210> 1

<211> 1608

<212> ADN

<213> Chromobacterium sp.

<400> 1

<210> 2

<211> 536

<212> PRT

<213> Chromobacterium sp.

<400> 2

<210> 3

<211> 518

<212> PRT

<213> Chromobacterium sp.

<400> 3

<210> 4

<211> 516

<212> PRT

<213> Chromobacterium sp.

<400> 4

<210> 5

<211> 536

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AXMI-205(evo24)

<400> 5

<210> 6

<211> 536

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AXMI-205(evo25)

<400> 6

<210> 7

<211> 526

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AXMI-205(trun10)

<400> 7

<210> 8

<211> 516

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AXMI-205(trun20)

<400> 8

<210> 9

<211> 1608

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia sintética que codifica para AXMI-205

<400> 9

10 <210> 10

<211> 1608

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia sintética que codifica para AXMI-205

<400> 10

<210> 11

<211> 1608

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia sintética que codifica para AXMI-205

<400> 11

5 <210> 12

<211> 6403

<212> ADN

<213> Chromobacterium sp.

<220> 10 <221> CDS

<222> (1352)..(2959)

<400> 12

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> péptido de direccionamiento al retículo endoplasmático

<400> 13

<210> 14 10 <211> 510

<212> PRT

<213> Photorhabdus luminescens

<400>14

<210> 15

<211> 470

<212> PRT

<213> Clavibacter michiganensis

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

   a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un complemento de la misma;

   b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y

   c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida.
2. 2. Molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos es:

   (a)

   una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta preferiblemente en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 10 u 11; o

   (b)

   operativamente unida a un promotor que puede dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal, preferiblemente que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido heterólogo.

3. 3.

   Célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 2(b), preferiblemente que es una célula huésped bacteriana o es una célula vegetal.

4. 4.

   Planta transgénica que comprende la célula huésped vegetal según la reivindicación 3, preferiblemente en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

5. 5.

   Polipéptido recombinante con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en:

   a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8;

   b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida; y

   c) un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

6. 6.

   Anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido según la reivindicación 5.

7. 7.

   Composición que comprende el polipéptido según la reivindicación 5.

8. 8.

   Composición según la reivindicación 7, en la que

   (a)

   dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, polvo fino, microgránulo, gránulo, pulverización, emulsión, coloide y disolución;

   (b)

   dicha composición se prepara mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis.

   (c)

   la composición comprende desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 99% en peso de dicho polipéptido.

9. 9.

   Método para controlar una población de plaga de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como pesticida del polipéptido según la reivindicación 5.

10. 10.

    Método para destruir una plaga de lepidópteros o coleópteros, que comprende poner en contacto dicha plaga, o alimentar a dicha plaga, con una cantidad eficaz como pesticida del polipéptido según la reivindicación 5.

11. 11.

    Método para producir un polipéptido con actividad pesticida, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 3 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido.

12. 12.

    Planta que tiene incorporado de manera estable en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene actividad pesticida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

    a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 9, 10, 11 ó 12;

    b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y

    c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida; en la que dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.
13. 13. Planta según la reivindicación 12, en la que dicha planta es una célula vegetal, preferiblemente en la que dicha semilla comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

    a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, 9, 10, 11 ó 12;

    b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y

    c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida.
14. 14. Método para proteger a una planta frente a una plaga de insectos, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido pesticida, en el que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

    a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 9, 10, 11 ó 12;

    b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y

    c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en la que dicha secuencia de aminoácidos tiene actividad pesticida, preferiblemente en la que dicha planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida frente a una plaga de lepidópteros o coleópteros.