BR112014022166B1

BR112014022166B1 - Molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo recombinante delta-endotoxina axmi345, vetor, célula hospedeira, composição, e métodos para matar uma praga, produzir um polipeptídeo e proteger uma planta de uma praga

Info

Publication number: BR112014022166B1
Application number: BR112014022166-9A
Authority: BR
Inventors: Kimberly S. Sampson; Rebecca Thayer; Duane A. Lehtinen
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2022-08-30
Also published as: CN104302663B; UY34663A; EP2822962A1; US9725735B2; MX2014010595A; BR112014022166A8; CA2866241A1; WO2013134535A1; CA2866241C; MX362999B; BR112014022166A2; US20140373195A1; UA115236C2; AR090275A1; CN104302663A

Abstract

DA DELTA-ENDOTOXINA AXMI345 E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO. A presente invenção refere- se a composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. São conferidas composições compreendendo uma sequência codificadora para um polipeptídeo de toxina. As sequências codificadoras podem ser usadas em construções de DNA ou em cassetes de expressão para a transformação e expressão em plantas e bactérias. As composições também compreendem bactérias transformadas, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. Em particular, são conferidas moléculas de ácido nucleico de toxinas isoladas. Adicionalmente, são abrangidas as sequências de aminoácidos correspondentes aos polinucleótidos, e anticorpos que se ligam especificamente a estas sequências de aminoácidos. Em particular, a presente invenção confere moléculas de ácidos nucleicos isoladas compreendendo sequências de nucleótidos que codificam a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 2, ou a sequência de nucleótidos descrita na SEQ ID NO: 1 ou 3, bem como variantes e fragmentos das mesmas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. N° 61/608.317, depositado sob Título 35, Artigo 111(b) do U.S.C. em 8 de março, 2012, o qual é incorporado por referência aqui na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular. São conferidos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Estas proteínas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes às pragas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva formadora de esporos do solo caraterizada pela sua capacidade de produzir inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de insetos, mas que são inofensivas para as plantas e outros organismos não alvo. Por este motivo, as composições incluindo as estirpes de Bacillus thuringiensis ou as suas proteínas inseticidas podem ser utilizadas como inseticidas ambientais aceitáveis de forma a controlar as pragas de insetos agrícolas, ou os vetores de inseto para uma variedade de doenças humanas ou animais.

[004] As proteínas cristalinas (Cry) (delta-endotoxinas) originárias da Bacillus thuringiensis têm forte atividade inseticida predominantemente contra as larvas de Lepidópteros, Hemípteros, Dípteros e Coleópteros. Estas proteínas também têm mostrado atividade contra as pragas das ordens Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, e Acari, bem como outras ordens de invertebrados, tais como Nemathelminthes, Platyhelminthes, e Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. Em Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I.) Estas proteínas foram originalmente classificadas como Cryl a CryV com base principalmente na sua atividade inseticida. As classes principais foram específicas de Lepidoptera (I), específicas de Lepidoptera e de Diptera (II), específicas de Coleoptera (III), específicas de Diptera (IV), e específicas de nematódeo (V) e (VI). As proteínas foram ainda classificadas em subfamílias; às proteínas mais altamente relacionadas dentro de cada família foram atribuídas letras de divisão, tais como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. As proteínas ainda mais estreitamente relacionadas dentro de cada divisão receberam nomes tais como Cry1C1, Cry1C2, etc.

[005] Uma nova nomenclatura foi recentemente descrita para os genes Cry com base na homologia da sequência de aminoácidos, em vez da especificidade do inseto alvo (Crickmore e outros. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). Na nova classificação, a cada toxina é atribuído um único nome incorporando uma classificação primária (um número árabe), uma classificação secundária (uma letra maiúscula), uma classificação terciária (letra minúscula), e uma classificação quaternária (outro número árabe). Na nova classificação os números romanos foram trocados por números árabes na classificação primária. As proteínas com menos de 45% de identidade de sequência têm classificações primárias diferentes, e os critérios para as classificações secundárias e terciárias são 78% e 95%, respectivamente.

[006] A proteína cristalina não apresenta atividade inseticida até que tenha sido ingerida e solubilizada no intestino médio do inseto. A pró-toxina ingerida é hidrolisada pelas proteases no trato digestivo do inseto para uma molécula tóxica ativa. (Hofte e Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se liga aos receptores da borda em escova apical do intestino médio das larvas alvo e se insere na membrana apical criando canais de íons ou poros, resultando na morte das larvas.

[007] As delta-endotoxinas, geralmente, têm cinco domínios de sequências conservados, e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd e outros. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices alfa e está envolvido na inserção na membrana e formação dos poros. O domínio II consiste em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave Grega, e o domínio III consiste em duas folhas beta antiparalelas em formação "de torta" (de Maagd e outros., 2001, supra). Os domínios II e III estão envolvidos no reconhecimento e ligação do receptor, e, por isso, são considerados determinantes da especificidade da toxina.

[008] Devido à devastação que os insetos podem conferir, e à melhoria no rendimento no controle das pragas de insetos, existe uma necessidade contínua para encontrar novas formas de toxinas pesticidas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] São conferidas composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. As composições incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam sequências de polipeptídeos de pesticidas e inseticidas, vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras compreendendo os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos pesticidas e os anticorpos para estes polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construções de DNA ou em cassetes de expressão para a transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos podem ser sequências sintéticas, que foram concebidas para expressão em um organismo, incluindo, mas não limitado a, um microrganismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos da invenção.

[010] Em particular, são conferidas moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que codificam uma proteína pesticida. Adicionalmente, estão incluídas as sequências de aminoácidos correspondentes à proteína pesticida. Em particular, a presente invenção confere para uma molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO:2 ou uma sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID NO:1 ou 3, bem como variantes e fragmentos biologicamente ativos das mesmas. As sequências de nucleotídeos que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da invenção, ou que se hibridam com uma sequência da invenção ou com um complemento da mesma, também estão incluídas. Também são conferidos vetores, células hospedeiras, plantas e sementes compreendendo as sequências de nucleotídeos da invenção, ou sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos da invenção, bem como as variantes e fragmentos biologicamente ativos dos mesmos.

[011] São conferidos métodos para a produção dos polipeptídeos da invenção, e para a utilização desses polipeptídeos para o controle ou exterminação de uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematódeos, ou dípteros. Também estão incluídos os métodos e conjuntos para a detecção dos ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra.

[012] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com uma melhorada resistência ou tolerância às pragas. Estes organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para finalidades agrícolas. As composições da invenção também são úteis para geração de proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida, ou para a detecção da presença de proteínas pesticidas ou de ácidos nucleicos em produtos ou organismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[013] A presente invenção se destina a composições e métodos para regulação da resistência ou tolerância da praga em organismos, particularmente plantas ou células vegetais. Por "resistência" se entende que a praga (por exemplo, insetos) é exterminada depois da ingestão ou o contato com os polipeptídeos da invenção. Por "tolerância" se intende uma diminuição ou redução no movimento, alimentação, reprodução, ou outras funções da praga. Os métodos envolvem a transformação de organismos com uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína pesticida da invenção. Em particular, as sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para a preparação de plantas e microrganismos que possuem atividade pesticida. Desse modo, são conferidas bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformados. As composições são os ácidos nucleicos e proteínas pesticidas de Bacillus ou outras espécies. As sequências podem ser utilizadas na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, tais como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos), e para a geração de proteínas pesticidas alteradas por métodos conhecidos na técnica, tais como a troca de domínio ou mistura de DNA, por exemplo, com membros das famílias de endotoxinas Cry1, Cry2 e Cry9. As proteínas podem ser utilizadas no controle e exterminação das populações de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros, e nematódeos e para a produção de composições com atividade pesticida.

[014] Por "toxina pesticida", ou "proteína pesticida" se entende uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas não se limitando a, membros das ordens Lepidoptera, Doptera, e Coleoptera, ou o filo Nematoda, ou uma proteína que tem homologia com essa proteína. Têm sido isoladas proteínas pesticidas a partir de organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. As proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências de nucleotídeos de comprimento total descritas neste documento, e as sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento total, tanto devido à utilização de um local de início alternativo a jusante, como ao processamento que produz uma proteína mais curta tendo atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo no qual a proteína é expressa, ou na praga após a ingestão da proteína.

[015] As proteínas pesticidas incluem as delta-endotoxinas. As delta-endotoxinas incluem proteínas identificadas como cry1 até cry43, cyt1 e cyt2, e toxinas do tipo Cyt. Existem atualmente mais de 250 espécies de delta-endotoxinas conhecidas com uma vasta gama de especificidades e toxicidades. Para uma lista exaustiva, ver Crickmore e outros. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, e para atualizações regulares ver Crickmore e outros. (2003) “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature,” em www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

[016] Desse modo, neste documento são conferidas novas sequências de nucleotídeos isoladas ou recombinantes que conferem atividade pesticida. Estas sequências de nucleotídeos codificam polipeptídeos com homologia para delta-endotoxinas conhecidas ou toxinas binárias. Também são conferidas as sequências de aminoácidos das proteínas pesticidas. A proteína resultante da tradução deste gene permite que as células controlem ou exterminem as pragas que a ingerem. Moléculas de Ácido Nucleico Isoladas, e Variantes e Fragmentos das Mesmas

[017] Um aspecto da invenção se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes, compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam proteínas pesticidas e polipeptídeos ou partes biologicamente ativas dos mesmos, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para utilização como sondas de hibridização de forma a identificar as moléculas de ácidos nucleicos que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Também estão incluídas neste documento as sequências de nucleotídeos capazes de hibridizar com as sequências de nucleotídeos da invenção, sob condições rigorosas, como definido noutra localização deste documento. Conforme utilizado neste documento, o termo "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA ou RNA gerados utilizando análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas preferencialmente é DNA de cadeia dupla.

[018] Uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) "isolada" ou "recombinante" é utilizada neste documento de forma a se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma bactéria recombinante ou célula vegetal hospedeira. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou recombinante está livre de sequências (preferencialmente, sequências de codificação de proteínas), que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para os fins da invenção, quando usado, o termo "isolado" para se referir a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomas isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a delta- endotoxina isolada que codifica a molécula de ácido nucleico pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb das sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. Em várias modalidades, uma proteína delta- endotoxina que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteína não delta-endotoxina (também referida neste documento como uma "proteína contaminante").

[019] As sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas da presente invenção incluem a sequência descrita na SEQ ID NO: 1 ou 3 e variantes, fragmentos e complementos da mesma. Por "complemento" se entende uma sequência de nucleotídeos que é suficientemente complementar a uma determinada sequência de nucleotídeos de tal modo que pode hibridar com a referida sequência de nucleotídeos para desse modo formar uma ligação dupla estável. As sequências de aminoácidos correspondentes para as proteínas pesticidas codificadas por estas sequências de nucleotídeos são as descritas nas SEQ ID NO: 2.

[020] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos destas sequências de nucleotídeos que codificam proteínas pesticidas também estão abrangidas pela presente invenção. Por "fragmento" se entende uma porção da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos pode codificar uma parte biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou pode ser um fragmento que pode ser utilizado como uma sonda de hibridização ou um iniciador de PCR utilizando os métodos descritos abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida compreendem pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleotídeos contíguos, ou até ao número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos de comprimento total codificando uma proteína pesticida divulgada neste documento, dependendo do uso desejado. Por nucleotídeos "contíguos" se entende os resíduos de nucleotídeos que estão imediatamente adjacentes um ao outro. Os fragmentos das sequências de nucleotídeos da presente invenção irão codificar fragmentos de proteínas que conservam a atividade biológica da proteína pesticida e, desse modo, retêm a atividade pesticida. Desse modo, os fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos divulgados neste documento também estão incluídos. Por "retém a atividade" se entende que o fragmento terá, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína pesticida. Em uma modalidade, a atividade pesticida é atividade coleoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade lepidoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade nematocida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade diptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade hemiptericida. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na área. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews e outros. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone e outros. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5.743.477, a totalidade da qual é incorporada neste documento para referência na sua totalidade.

[021] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína pesticida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção irá codificar, pelo menos, cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contíguos, ou até ao número total de aminoácidos presentes em uma proteína pesticida de comprimento total da invenção. Em modalidades, o fragmento é um fragmento de clivagem proteolítica. Por exemplo, o fragmento de clivagem proteolítica pode ter uma truncagem no terminal N ou no terminal C de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, ou cerca de 160 aminoácidos em relação às SEQ ID NO: 2.

[022] As proteínas pesticidas preferidas da presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou 3, ou as proteínas pesticidas são suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos descritas nas SEQ ID NO: 2. Por "suficientemente idêntica" se entende uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência comparativamente com uma sequência de referência, utilizando um dos programas de alinhamento descritos neste documento utilizando parâmetros convencionais. Um perito na técnica vai reconhecer que estes valores podem ser adequadamente ajustados de forma a determinar a identidade correspondente das proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos, tendo em conta a degeneração dos códons, a semelhança dos aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura, e semelhantes.

[023] De modo a determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, percentagem de identidade = número de posições idênticas / número total de posições (por exemplo, posições que se sobrepõem) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a percentagem de identidade é calculada ao longo da totalidade da sequência de referência (isto é, a sequência divulgada neste documento como qualquer de SEQ ID NO: 1 a 3). A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas semelhantes àquelas abaixo descritas, permitindo, ou não, falhas. No cálculo da percentagem de identidade, tipicamente são contadas correspondências exatas. Uma falha, isto é, uma posição em um alinhamento quando está presente um resíduo em uma sequência, mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos.

[024] A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 90:5873-5877. Um tal algoritmo está incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul e outros. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, valor = 100, comprimento de palavra = 12, de forma a obter sequências de nucleotídeos homólogas, de forma a se obter sequências de nucleotídeos homólogas para as moléculas de ácido nucleico do tipo pesticida da invenção. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, valor=50, comprimento da palavra=3, de forma a obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas da proteína pesticida da invenção. De forma a obter alinhamentos com falhas para propósitos de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST (em BLAST 2.0) conforme descrito em Altschul e outros. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, pode ser usado PSI-Blast para realizar uma procura iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul e outros. (1997), supra. Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, podem ser usados os parâmetros padrão dos respetivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN). O alinhamento também pode ser efetuado manualmente, por inspeção.

[025] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins e outros. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou de DNA, e desse modo, pode fornecer dados sobre a conservação da sequência da totalidade sequência de aminoácidos. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácido disponíveis no mercado, tal como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, pode ser avaliada a percentagem de identidade de aminoácidos. Um exemplo não limitativo de um programa de software útil para a análise dos alinhamentos ClustalW é o GENEDOC™. O GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação da similaridade e identidade de aminoácidos (ou DNA) entre várias proteínas. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Um tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que faz parte do Pacote de Software GCG da Wisconsin Genetics, Versão 10 (disponível a partir de Accelrys Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EUA). Quando se utiliza o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácidos, podem ser utilizadas uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de falha de 12 e uma penalidade de falha de 4.

[026] A menos que indicado de outra forma, vai ser utilizado GAP Versão 10, que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, de forma a determinar a identidade ou semelhança de sequência usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos utilizando Peso GAP de 50 e Peso Comprimento de 3, e a matriz de classificação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para a sequência de aminoácidos utilizando peso GAP de 8 e peso comprimento de 2, e o programa de classificação BLOSUM62. Também podem ser usados programas equivalentes. Por “programa equivalente” se entende qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo idênticas correspondências de resíduos de nucleótido e uma percentagem idêntica de identidade de sequência quando comparada com o correspondente alinhamento gerado por GAP Versão 10.

[027] A invenção também inclui moléculas de ácido nucleico variante. "Variantes" das sequências de nucleotídeos que codificam a proteína pesticida incluem as sequências que codificam as proteínas pesticidas divulgadas neste documento, mas que diferem de forma conservadora por causa da degenerescência do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas, conforme acima discutido. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme abaixo descrito. Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas que tenham sido geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese dirigida ao local, mas que ainda codificam as proteínas pesticidas descritas na presente invenção, conforme discutido abaixo. Proteínas variantes incluídas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, continuam a possuir a desejada atividade biológica da proteína nativa, ou seja, atividade pesticida. Por "retém a atividade" se entende que a variante terá, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína nativa. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na área. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews e outros. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone e outros. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5.743.477, a totalidade da qual é incorporada neste documento para referência na sua totalidade.

[028] O perito na técnica também irá apreciar que podem ser introduzidas alterações por mutação das sequências de nucleotídeos da invenção, conduzindo desse modo a alterações na sequência de aminoácidos das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Deste modo, podem ser criadas moléculas variantes de ácido nucleico isolado através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos na correspondente sequência de nucleotídeos divulgada neste documento, de tal modo que são introduzidas substituições, adições ou eliminações de um ou mais aminoácidos, na proteína codificada. Podem ser introduzidas mutações por técnicas comuns, como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeos variantes também são incluídas pela presente invenção.

[029] Por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos podem ser efetuadas em um ou mais resíduos de aminoácidos, preditos, não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem de uma proteína pesticida sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[030] As delta-endotoxinas, geralmente, têm cinco domínios de sequências conservados, e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd e outros. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices alfa e está envolvido na inserção na membrana e formação dos poros. O domínio II consiste em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave Grega, e o domínio III consiste em duas folhas beta antiparalelas em formação "de torta" (de Maagd e outros., 2001, supra). Os domínios II e III estão envolvidos no reconhecimento e ligação do receptor, e, por isso, são considerados determinantes da especificidade da toxina.

[031] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm a função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos que residam em um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências da invenção (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Exemplos de resíduos que são conservados mas que podem permitir as substituições do aminoácido e mesmo assim manter a atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências da invenção (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas nas proteínas homólogas de alinhamento). No entanto, um perito na técnica entenderá que as variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

[032] Alternativamente, as sequências de nucleotídeos variantes podem ser feitas através da introdução aleatória de mutações ao longo da totalidade ou parte da sequência de codificação, tal como, por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para a capacidade de conferir atividade pesticida para identificar mutantes que mantêm atividade. Depois da mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de forma recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada utilizando técnicas de ensaio convencionais.

[033] Usando métodos tais como PCR, hibridização, e, as sequências de pesticidas semelhantes correspondentes podem ser identificadas, tendo essas sequências uma identidade substancial com as sequências da invenção. Ver, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI) e Innis, e outros. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NI).

[034] Em um método de hibridização, pode ser utilizada a totalidade ou parte da sequência de nucleotídeos pesticida de forma a rastrear bibliotecas de cDNA ou genômicas. Os métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidas na técnica e são divulgadas em Sambrook e Russell, 2001, supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. As sondas para hibridização podem ser efetuadas através da marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base na conhecida sequência de nucleotídeos de codificação da proteína pesticida divulgada neste documento. Adicionalmente, podem ser utilizados os iniciadores degenerados concebidos com base nos nucleotídeos conservados ou nos resíduos de aminoácidos na sequência de nucleotídeos, ou na sequência de aminoácidos codificada. A sonda compreende normalmente uma região de sequência de nucleotídeos que hibrida sob condições rigorosas com, pelo menos, cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, ou 200 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos que codificam uma proteína pesticida da invenção ou um fragmento ou variante da mesma. Os métodos para a preparação das sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook e Russell, 2001, supra incorporado neste documento para referência.

[035] Por exemplo, uma sequência de pesticida total divulgada neste documento, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser utilizada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com sequências do tipo de proteínas pesticidas correspondentes, e RNAs mensageiros. De modo a conseguir hibridização específica em uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm, preferencialmente, pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas de modo a amplificar as correspondentes sequências de pesticida a partir de um organismo escolhido por PCR. Esta técnica pode ser usada de modo a isolar as sequências de codificação adicionais a partir de um organismo desejado, ou como um ensaio de diagnóstico de forma a determinar a presença de sequências de codificação de um organismo. As técnicas de hibridização incluem triagem de hibridização de bibliotecas de DNA em placas (tanto placas ou colônias, ver, por exemplo, Sambrook e outros. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[036] Assim, a presente invenção inclui as sondas de hibridização, bem como sequências de nucleotídeos capazes de hibridizar com a totalidade ou uma porção de uma sequência de nucleotídeos da invenção (por exemplo, pelo menos cerca de 300 nucleotídeos, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, 1.000, 1.200, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, ou até ao comprimento total de uma sequência de nucleotídeos divulgada neste documento). A hibridização de tais sequências pode ser efetuada sob condições rigorosas. Por “condições rigorosas” ou “condições de hibridização rigorosas” se entendem as condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com a sua sequência alvo em um grau detectavelmente maior que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições rigorosas são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Através do controle das condições rigorosas de hibridação e/ou lavagem, podem ser identificadas as sequências alvo que são 100% complementares da sonda (sondagem homóloga). Em alternativa, as condições rigorosas podem ser ajustadas de forma a permitirem algumas inadequações nas sequências de modo a que graus mais baixos de semelhança sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente menor do que 500 nucleotídeos de comprimento.

[037] Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior do que cerca de 1,5 M íons de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons de Na (ou outros sais) a pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Exemplos de condições de baixo rigor incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X de SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0,3 M de citrato trissódico), de 50 a 55°C. Exemplos de condições de rigor moderado incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5 X a 1X de SSC, a 55 a 60°C. Exemplos de condições de elevado rigor incluem hibridização em formamida a 50%, 1 M NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1 X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração de hibridização é geralmente inferior a cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[038] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% forma) - 500/L; em que M é a molaridade dos cátions monovalentes, % de GC é a percentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % forma é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência de complementária se hibrida com uma sonda perfeitamente compatível. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de incompatibilidade; por consequência, a Tm, a hibridização, e/ou as condições de lavagem podem ser ajustadas de modo a hibridarem com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se são procuradas sequências com >90% de identidade, a Tm pode ser reduzida 10°C. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas de forma a serem cerca de 5°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento, a uma força iônica e pH definidos. No entanto, várias condições severamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C mais baixos do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C mais baixos do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições de baixo rigor podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20°C mais baixos do que o ponto térmico de fusão (Tm). Utilizando a equação, as composições de hibridização e de lavagem, e a Tm desejada, os peritos entenderão que variações no rigor de hibridização e/ou nas soluções de lavagem estão inerentemente descritas. Se o desejado grau de incompatibilidade resulta em uma Tm inferior a 45°C (solução aquosa) ou a 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que possa ser usada uma temperatura mais alta. Um guia extenso para a hibridização dos ácidos nucleicos se encontra em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e eds Ausubel e outros. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova Iorque). Ver Sambrook e outros. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Proteínas Isoladas e Variantes e Fragmentos das Mesmas

[039] As proteínas pesticidas também estão incluídas no âmbito da presente invenção. Por "proteína pesticida" se entende uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e variantes das mesmas também são conferidos, e podem ser usados para a prática dos métodos da presente invenção. Uma "proteína isolada" ou uma "proteína recombinante" é utilizada de forma a se referir a uma proteína que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma bactéria recombinante ou célula vegetal hospedeira.

[040] "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, e que apresentam atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto à atividade pesticida. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na área. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews e outros. (1988) Biochem. J. 252:199206; Marrone e outros. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5.743.477, a totalidade da qual é incorporada neste documento para referência na sua totalidade. Conforme utilizado neste documento, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 2. A invenção inclui outros fragmentos, no entanto, tal como qualquer fragmento na proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 ou mais aminoácidos de comprimento.

[041] Por "variantes" se entendem as proteínas ou polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 2. As variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que hibrida com a molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou 3, ou um complemento da mesma, sob condições rigorosas. As variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos, devido à mutagênese. Proteínas variantes incluídas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, continuam a possuir a desejada atividade biológica da proteína nativa, ou seja, retêm a atividade pesticida. Em algumas modalidades, as variantes têm atividade melhorada em relação à proteína nativa. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na área. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews e outros. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone e outros. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5.743.477, a totalidade da qual é incorporada neste documento para referência na sua totalidade.

[042] Genes bacterianos, tais como os genes axmi desta invenção, muitas vezes possuem vários códons de iniciação da metionina na proximidade do início da estrutura de leitura aberta. Muitas vezes, a iniciação da tradução de um ou mais destes códons de iniciação conduzirá à geração de uma proteína funcional. Estes códons de início podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como o códon de iniciação, e as proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, embora neste caso o TTG codifique uma metionina. Além disso, não é muitas vezes determinado a priori quais destes codões são naturalmente utilizados na bactéria. Assim, é entendido que o uso de um dos codões de metionina alternativos também podem conduzir à geração de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas são incluídas na presente invenção e podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção. Será entendido que, quando expresso em plantas, será necessário alterar o códon de iniciação alternativo para ATG para tradução adequada.

[043] Em várias modalidades da presente invenção, as proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências de nucleotídeos de comprimento total descritas neste documento, e as sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento total devido à utilização de um local de início alternativo a jusante. Assim, a sequência de nucleotídeos da invenção e/ou vetores, células hospedeiras, e plantas compreendendo a sequência de nucleotídeos da invenção (e métodos de fabricação e uso da sequência de nucleotídeos da invenção) podem compreender uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos 42 a 649 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos 102 a 649 da SEQ ID NO: 2.

[044] Os anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção, ou para as variantes ou fragmentos dos mesmos, também estão incluídos. Os métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NI; Patente dos E.U.A. No. 4.196.265).

[045] Desse modo, um aspecto da presente invenção diz respeito a anticorpos, moléculas de ligação de antigênios de cadeia única, ou outras proteínas que se ligam especificamente a uma ou mais das moléculas de proteínas ou peptídeos da invenção e aos seus homólogos, fusões ou fragmentos. Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma. Em outra modalidade particularmente preferida, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína de fusão compreendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma.

[046] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar quantitativamente ou qualitativamente as moléculas de proteínas ou peptídeos da invenção, ou para detectar as modificações pós-traducionais das proteínas. Conforme utilizado neste documento, um anticorpo ou peptídeo é referido como se "ligando especificamente" a uma molécula de proteína ou peptídeo da invenção, se tal ligação não for competitivamente inibida pela presença de moléculas não relacionadas. Variantes Alteradas ou Melhoradas

[047] Reconhece-se que as sequências de DNA de uma proteína pesticida podem ser alteradas por vários métodos, e que estas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes do que aquelas codificadas por uma proteína pesticida da presente invenção. Esta proteína pode ser alterada de diversas formas incluindo substituições, eliminações, truncagens e inserções de aminoácidos de um ou mais aminoácidos das SEQ ID NO: 2, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155, ou mais substituições de aminoácidos, eliminações ou inserções. Os métodos para essas manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos de uma proteína pesticida podem ser preparadas por mutações no DNA. Isto também pode ser conseguido por uma de várias formas de mutagênese e/ou na evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetará substancialmente a função da proteína. Tais variantes irão possuir a desejada atividade pesticida. No entanto, é entendido que a capacidade de uma proteína pesticida para conferir atividade pesticida pode ser melhorada através do uso de tais técnicas sobre as composições desta invenção. Por exemplo, se pode expressar uma proteína pesticida em células hospedeiras que exibem elevadas taxas de incorreta incorporação de base durante a replicação do DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após a propagação de tais estirpes, se pode isolar o DNA (por exemplo por preparação de DNA plasmídeo, ou por amplificação por PCR e clonando o fragmento de PCR resultante em um vetor), fazer cultura das mutações da proteína pesticida em uma estirpe não mutagênica, e identificar os genes mutados com atividade pesticida, por exemplo através da realização de um teste de forma a testar a atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e utilizada em testes de alimentação. Ver, por exemplo Marrone e outros. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir o contato de plantas com uma ou mais pragas e determinar a capacidade da planta para sobreviver e/ou provocar a exterminação das pragas. Exemplos de mutações que resultam em uma toxicidade aumentada são encontrados em Schnepf e outros. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

[048] Em alternativa, as alterações podem ser feitas para a sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carboxi, sem afetar substancialmente a atividade. Isto pode incluir inserções, eliminações ou alterações introduzidas por modernos métodos moleculares, tais como PCR, incluindo amplificações por PCR que alteram ou prolongam a sequência de codificação da proteína em virtude da inclusão de sequências de codificação de aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionais podem incluir sequências inteiras de codificação de proteínas, tais como aquelas normalmente usadas na técnica de forma a gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são muitas vezes usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática, ou epítopo de forma a facilitar tanto a purificação das proteínas, a detecção das proteínas, ou para outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) secreção ou tradução alvo de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático das bactérias Gram-negativas, ou o retículo endoplasmático das células eucariotas, o último dos quais resulta muitas vezes na glicosilação da proteína.

[049] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da presente invenção também incluem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tais como mistura de DNA. Com um tal procedimento, podem ser usadas uma ou mais diferentes regiões codificadoras de proteínas pesticidas, de forma a criar uma nova proteína pesticida possuindo as propriedades desejadas. Desta forma, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequências relacionadas compreendendo regiões de sequências que têm identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, utilizando esta abordagem, os motivos de sequências que codificam um domínio de interesse podem ser misturados entre o gene pesticida da invenção e outros genes pesticidas conhecidos de forma a se obter um novo gene codificando para uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para esta mistura de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 91:1074710751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri e outros. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore e outros. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang e outros. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 94:4504-4509; Crameri e outros. (1998) Nature 391:288-291; e as Patentes dos E.U.A. Nos 5.605.793 e 5.837.458.

[050] A troca ou mistura de domínio é outro mecanismo para geração de proteínas pesticidas alteradas. Os domínios podem ser trocados entre as proteínas pesticidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com melhor atividade pesticida ou espetro alvo. Os métodos para geração de proteínas recombinantes e teste das mesmas quanto à atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Naimov e outros. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:53285330; de Maagd e outros. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:15371543; Ge e outros. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf e outros. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang e outros. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vetores

[051] Uma sequência de pesticida da invenção pode ser conferida em um cassete de expressão para a expressão em uma planta de interesse. Por "cassete de expressão vegetal" se entende uma construção de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína a partir de uma estrutura de leitura aberta em uma célula vegetal. Tipicamente, estes contêm um promotor e uma sequência de codificação. Frequentemente, estas construções também irão conter uma região 3' não traduzida. Tais construções podem conter uma "sequencia de sinal" ou "sequência líder" de forma a facilitar o transporte cotranslacional ou pós-transducional do peptídeo para certas estruturas intracelulares tal como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático, ou no aparelho de Golgi.

[052] Por "sequência de sinal" se entende uma sequência que se sabe ou se suspeita que resulte no transporte cotranslacional ou pós- transducional do peptídeo através da membrana celular. Nos eucariotas, isto envolve tipicamente a secreção para o aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. As toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas que são protoliticamente ativadas no intestino da praga alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa, ou pode ser derivada a partir de uma sequência da invenção. Por "sequência líder" se entende qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte cotranslacional da cadeia de peptídeo para uma organela subcelular[. Desse modo, isto inclui as sequências líderes que desencadeiam o transporte e/ou a glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, a passagem para vacúolos, plastídios incluindo cloroplastos, mitocôndrias, e semelhantes.

[053] Por "vetor de transformação vegetal" se entende uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula vegetal. Tal molécula pode ser constituída por um ou mais cassetes de expressão vegetal, e pode ser organizada em mais do que um "vetor" de molécula de DNA. Por exemplo, os vetores binários são vetores de transformação vegetais que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificarem todas as funções de atuação cis e trans requeridas para a transformação de células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vetor" se refere a uma construção de ácido nucleico concebida para transferência entre diferentes células hospedeiras. "Vetor de expressão" se refere a um vetor que tem a capacidade para incorporar, integrar e expressar sequências ou fragmentos de DNA heterólogo de uma célula estranha. O cassete irá incluir sequências reguladoras 5' e/ou 3' ligadas de modo operacional a uma sequência da invenção. Por "ligado de modo operacional" se entende uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Geralmente, ligado de modo operacional significa que as sequências de ácidos nucleicos a serem ligadas são contíguas e, quando necessário unem duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e na mesma estrutura de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional para ser cotransformado dentro do organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser conferido(s) em vários cassetes de expressão.

[054] Em várias modalidades, a sequência de nucleotídeos da invenção está ligada de modo operacional a um promotor, por exemplo, um promotor vegetal. "Promotor" se refere a uma sequência de ácido nucleico que funciona de forma a dirigir a transcrição de uma sequência de codificação a jusante. O promotor, conjuntamente com outras sequências reguladoras da transcrição e tradução do ácido nucleico (também denominadas "sequências de controle"), são necessários para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

[055] Tal cassete de expressão é conferido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de pesticida de modo a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

[056] O cassete de expressão irá incluir, na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação da transcrição e da tradução (isto é, um promotor), uma sequência do DNA da invenção, e uma região de terminação da tradução e da transcrição (isto é, a região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Quando o promotor é "nativo" ou "homólogo" para o hospedeiro vegetal, se entende que o promotor se encontra na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é "externo" ou "heterólogo" à sequência de DNA da invenção, se entende que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência de DNA ligada de modo operacional da invenção.

[057] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga relativamente ao promotor, à sequência de DNA de interesse, à planta hospedeira, ou qualquer combinação destas). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina sintetase e nopalina sintetase. Ver também Guerineau e outros. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon e outros. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen e outros. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe e outros. (1990) Gene 91:151-158; Ballas e outros. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi e outros. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[058] Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser optimizado(s) para expressão aumentada na célula hospedeira transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferidos da célula hospedeira para expressão melhorada, ou podem ser sintetizados utilizando códons a uma frequência de utilização dos códons preferidos do hospedeiro. Geralmente, o conteúdo em GC do gene será aumentado. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão do uso dos códons preferidos para os hospedeiros. Estão disponíveis métodos na técnica para a síntese de genes preferidos pelas plantas. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. Nos 5.380.831, e 5.436.391, o Pedido de Patente dos E.U.A. No. 20090137409 e Murray e outros. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporado neste documento para referência.

[059] Em uma modalidade, a proteína pesticida é acionada para o cloroplasto para expressão. Desta forma, onde a proteína pesticida não está diretamente inserida no cloroplasto, o cassete de expressão irá conter, adicionalmente, um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de forma a dirigir a proteína pesticida para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo Von Heijne e outros. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark e outros. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa e outros. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer e outros. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah e outros. (1986) Science 233:478-481.

[060] O gene pesticida a ser direcionado para o cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto, para ter em consideração as diferenças na utilização de códons entre o núcleo da planta e esta organela. Desse modo, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos por cloroplastos. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. No. 5.380.831, incorporada neste documento para referência.

Transformação Vegetal

[061] Os métodos da invenção envolvem a introdução de uma construção de nucleotídeos em uma planta. Por "introdução" se pretende apresentar à planta a construção de nucleotídeos de tal maneira que a construção ganha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que seja utilizado um método em particular para a introdução de uma construção de um nucleótido em uma planta, mas apenas que a construção ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introdução de construções de nucleotídeos em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação transitória, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.

[062] Por "planta" se entende plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e progenitura das mesmas. Células vegetais podem ser diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, caules, células de cultura de suspensão, protoplastos, células da folha, células da raiz, células do floema, pólen).

[063] "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ou plantas "transformadas de forma estável" ou células ou tecidos se referem a plantas que tenham incorporado ou integrado sequências de ácidos nucleicos exógenos ou fragmentos de DNA na célula vegetal. Estas sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas que são exógenas, ou não estão presentes na célula da planta não transformada, bem como aquelas que podem ser endógenas, ou presentes na célula vegetal não transformada. "Heterólogo" geralmente se refere a sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas da célula ou da parte do genoma nativo na qual estão presentes, e foram adicionadas à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou semelhante.

[064] As plantas transgênicas da invenção expressam uma ou mais das novas sequências de toxina divulgadas neste documento. Em várias modalidades, a planta transgênica também compreende um ou mais genes adicionais para resistência a insetos (por exemplo, Cry1, tais como membros das famílias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, e Cry1F; Cry2, tais como membros da família Cry2A; Cry9, tais como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, e Cry9F; etc.) Será entendido por um perito na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que confira uma caraterística agronômica de interesse.

[065] A transformação de células vegetais pode ser efetuada por uma de várias técnicas conhecidas na técnica. O gene pesticida da invenção pode ser modificado de modo a se obter ou aumentar a expressão em células vegetais. Tipicamente, uma construção que expressa tal proteína irá conter um promotor para conduzir a transcrição do gene, bem como uma região não traduzida 3' de modo a permitir a terminação da transcrição e a poliadenilação. A organização de tais construções é bem conhecida na técnica. Em alguns casos, pode ser útil projetar o gene de tal modo que é segregado o peptídeo resultante, ou de outro modo atingido dentro da célula vegetal. Por exemplo, o gene pode ser modificado de forma a conter um peptídeo sinal a fim de facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Também pode ser preferível projetar o cassete de expressão da planta de forma a conter um íntron, de tal modo que é necessário o processamento do mRNA do íntron para a expressão.

[066] Tipicamente este "cassete de expressão vegetal" será inserido em um "vetor de transformação vegetal". Este vetor de transformação vegetal pode ser composto por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação vegetal. Por exemplo, é uma prática comum na técnica a utilização de vetores de transformação vegetal que são compostos por mais do que um segmento de DNA contíguos. Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como "vetores binários". Os vetores binários, bem como os vetores com plasmídeos auxiliares, são mais frequentemente utilizados para a transformação mediada por Agrobacterium, em que é bastante grande a necessidade da dimensão e complexidade dos segmentos de DNA de atingirem transformação eficiente, e isto é vantajoso de forma a separar as funções para as moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor de plasmídeo que contém as necessárias sequências de atuação cis para a transferência do T-DNA (tais como limite esquerdo e limite direito), um marcador selecionável que é concebido de modo a capaz da expressão em uma célula vegetal e um "gene de interesse" (um gene concebido de modo ser capaz da expressão em uma célula vegetal para a qual é desejada a geração de plantas transgênicas). Também estão presentes neste vetor de plasmídeo as sequências necessárias para a replicação bacteriana. As sequências cis-atuantes são dispostas de uma forma de modo a permitirem a eficiente transferência em células vegetais e de expressão das mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida estão localizados entre os limites esquerdo e direito. Muitas vezes um segundo vetor plasmídeo contém os fatores trans- atuantes que medeiam a transferência do T-DNA da Agrobacterium para células vegetais. Este plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção das células vegetais por Agrobacterium, e a transferência de DNA por clivagem em sequências de limite e transferência de DNA mediado por vir, conforme entendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446451). Podem ser usados vários tipos de estirpes de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para a transformação vegetal. O segundo vetor plasmídeo não é necessário para a transformação vegetal através de outros métodos, tais como microprojecção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

[067] Em geral, os métodos de transformação vegetal envolvem a transferência de DNA heterólogo para células da planta alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguido pela aplicação de um nível limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) de forma a recuperar as células vegetais transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Os explantes são tipicamente transferidos para um novo fornecimento do mesmo meio e cultivados de forma rotineira. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em rebentos após a colocação em meio de regeneração suplementado com um nível limiar máximo de agente de seleção. Os rebentos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo de modo a recuperar rebentos ou plântulas enraizadas. A plântula transgênica então se desenvolve em uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei e outros. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida e outros. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um novo fornecimento do mesmo meio e cultivados de forma rotineira. Uma descrição geral das técnicas e métodos para a geração de plantas transgênicas são encontrados em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células; tanto as células transformadas como não transformadas, estão presentes em qualquer parte do calo ou tecido alvo ou grupo de células em causa. A capacidade para exterminar células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas vegetais transformadas. Muitas vezes, a capacidade de remover as células não transformadas é uma limitação para a rápida recuperação das células vegetais transformadas e para a geração com sucesso de plantas transgênicas.

[068] Os protocolos de transformação bem como os protocolos para introdução de sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula vegetal, i. e., monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionadas para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser efetuada por um de vários métodos, incluindo, mas não limitado a, microinjeção, eletroporação, transferência gênica direta, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium nas células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células vegetais com DNA heterólogo estranho aderido às partículas, aceleração de partículas balísticas, transformação por feixe de aerossol (Pedido Publicado dos E.U.A. No. 20010026941; Patente dos E.U.A. No. 4.945.050; Publicação Internacional No. WO 91/00915; Pedido Publicado dos E.U.A. No. 2002015066), transformação Lec1, e vários outros métodos de mediação -direção de não partículas para a transferência de DNA.

[069] Os métodos para a transformação dos cloroplastos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Svab e outros. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601606. O método se apoia na entrega por uma arma de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e desencadeamento do DNA para o genoma do plastídio através da recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação dos plastídios pode ser efetuada por transativação de um transgene silencioso transportado por plastídio através da expressão preferível do tecido, de uma polimerase de RNA codificada no núcleo e direcionada para o plastídio. Esse sistema foi relatado em McBride e outros. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 91:7301-7305.

[070] Após a integração do DNA heterólogo estranho nas células vegetais, de seguida, se aplica um nível limiar máximo de adequada seleção ao meio para exterminar as células não transformadas e separar e proliferar as células putativamente transformadas que sobrevivem deste tratamento de seleção através da transferência regular para um meio fresco. Através da passagem contínua e desafio com a seleção apropriada, se identificam e proliferam as células que são transformadas com o vetor de plasmídeo. Podem então ser usados métodos moleculares e bioquímicos de modo a confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

[071] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com formas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick e outros. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas, e também polinizadas com a mesma estirpe transformada ou com diferentes estirpes, e tendo o híbrido resultante a expressão constitutiva da identificada caraterística fenotípica desejada. Podem ser cultivadas duas ou mais gerações para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada é estavelmente mantida e herdada e depois as sementes colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Deste modo, a presente invenção confere semente transformada (também referida como "semente transgênica") tendo uma construção de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporada de forma estável no seu genoma.

Avaliação da Transformação Vegetal

[072] Após a introdução do DNA heterólogo estranho nas células vegetais, a transformação ou a integração do gene heterólogo no genoma vegetal é confirmada através de vários métodos, tais como a análise dos ácidos nucleicos, proteínas e metabolitos associados com o gene integrado.

[073] A análise de PCR é um método rápido para pesquisa, nas células transformadas, tecidos ou rebentos, da presença do gene incorporado na fase anterior antes do transplante para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI). A PCR é efetuada utilizando iniciadores oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou vetor de fundo de Agrobacterium, etc.

[074] A transformação vegetal pode ser confirmada por análise da transferência de Southern do DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído a partir do transformante, digerido com as apropriadas enzimas de restrição, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. A membrana ou "transferência" é então sondada com, por exemplo, fragmento de DNA alvo com 32P radioativamente marcado de modo a confirmar a integração do gene introduzido no genoma vegetal de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[075] Na análise de transferência de Northern, o RNA é isolado a partir dos tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose formaldeído, e transferido para um filtro de nylon de acordo com os procedimentos padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificado pelo gene pesticida é então testada por hibridização do filtro com uma sonda radioativa derivada a partir de um gene pesticida, por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[076] A transferência de Western, os ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser efetuados em plantas transgênicas de forma a confirmar a presença da proteína codificada pelo gene pesticida através de procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína pesticida.

Atividade Pesticida em Plantas

[077] Em outro aspecto da invenção, se podem gerar plantas transgênicas que expressam uma proteína pesticida, que tem atividade pesticida. Os métodos acima descritos por meio de exemplo podem ser utilizados de modo a gerar plantas transgênicas, mas a maneira na qual as células vegetais transgênicas são geradas não é crítica para esta invenção. Métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como a transformação mediada por Agrobacterium, a transformação biolística, e os métodos mediados por não partículas podem ser utilizados ao gosto do experimentador. As plantas que expressam uma proteína pesticida podem ser isoladas por meio de métodos comuns descritos na técnica, por exemplo por transformação do calo, seleção de calo transformado, e regeneração de plantas férteis a partir desse calo transgênico. Em tal processo, se pode usar qualquer gene como marcador selecionável, desde que a sua expressão em células vegetais confira a capacidade de identificar ou selecionar as células transformadas.

[078] Foi desenvolvido um número de marcadores para utilização com células vegetais, tais como resistência a cloranfenicol, o aminoglicosídeo G418, higromicina ou semelhantes. Outros genes que codificam um produto envolvido no metabolismo dos cloroplastos também podem ser utilizados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, genes que conferem resistência a herbicidas vegetais tais como glifosato, bromoxinil ou imidazolinona podem encontrar utilização particular. Tais genes foram relatados (Stalker e outros. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene nitrilase da resistência a bromoxinil); e Sathasivan e outros. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gene da resistência a AHAS imidazolinona). Adicionalmente, os genes divulgados neste documento são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais. Os métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão vegetal (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, célula vegetal, propágulo, embrião ou progenitura do mesmo são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada por meio de testes de atividade pesticida.

[079] Plantas férteis expressando uma proteína pesticida podem ser testadas quanto à atividade pesticida, e as plantas apresentando uma atividade ótima selecionadas para reprodução. Na técnica estão disponíveis métodos para testar a atividade das pragas. Geralmente, a proteína é misturada e utilizada em testes de alimentação. Ver, por exemplo Marrone e outros. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

[080] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie vegetal, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitadas a, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, cártamo, amendoim, batata-doce, mandioca, café, coco, abacaxi, citrinos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, legumes, ornamentais, e coníferas.

[081] Os legumes incluem, mas não estão limitados a, tomate, alface, feijão verde, feijão, ervilhas, e membros do gênero Curcumis tais como pepino, melão e meloa. As ornamentais incluem, mas não estão limitadas a, azálea, hortênsia, hibiscos, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, poinséttia, e crisântemo. Preferencialmente, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza, etc.).

Uso no Controle Pesticida

[082] Os métodos gerais para utilização das estirpes compreendendo uma sequência de nucleotídeos da presente invenção, ou uma variante da mesma, no controle de pragas ou no desenvolvimento de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. No. 5.039.523 e EP 0480762A2.

[083] As estirpes de Bacillus contendo uma sequência de nucleotídeos da presente invenção, ou uma variante da mesma, ou os microrganismos que foram geneticamente alterados de modo a conterem o gene pesticida da invenção e a proteína podem ser usados de modo a protegerem as culturas agrícolas e os produtos das pragas. Em um aspecto da invenção, a totalidade, ou seja, as células não lisadas de um organismo produtor de toxina (pesticida), são tratadas com reagentes que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente das praga(s) alvo.

[084] Alternativamente, o pesticida é produzido através da introdução de um gene pesticida em um hospedeiro celular. A expressão do gene pesticida resulta, direta ou indiretamente, na produção e manutenção do pesticida intracelular. Em um aspecto desta invenção, estas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Estes pesticidas naturalmente encapsulados podem ser formulados de acordo com as técnicas convencionais para aplicação no ambiente hospedeiro de uma praga alvo, por exemplo, solo, água, e folhagem das plantas. Ver, por exemplo, EPA 0192319, e as referências citadas no mesmo. Alternativamente, se pode formular as células expressando um gene desta invenção, de tal modo a permitir a aplicação do material resultante, como um pesticida.

[085] Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados à área da cultura ou à planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Estes compostos podem ser fertilizantes, herbicidas, crioprotetores, surfatantes, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros, e/ou formulações de transportadores de liberação ao longo do tempo biodegradáveis que permitam a administração a longo prazo de uma área de alvo seguida de uma única aplicação da formulação. Estes também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de várias destas preparações, se desejado, em conjunto com outros veículos agricolamente aceitáveis, surfatantes ou adjuvantes promotores da aplicação habitualmente empregues na técnica da formulação. Adjuvantes e transportadores adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias comumente empregadas na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais regeneradas ou naturais, solventes, dispersantes, agentes umidificadores, agentes de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. Da mesma forma, as formulações podem ser preparadas em "iscas" comestíveis ou preparadas em "armadilhas" de pragas de forma a permitirem a alimentação ou a ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[086] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção, que contém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidos pelas estirpes bacterianas da presente invenção, incluem a aplicação nas folhas, o revestimento da semente e a aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[087] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, spray, emulsão, coloide, solução, ou semelhantes, e pode ser preparada por meios convencionais tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas estas composições que contêm, pelo menos, um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração desde cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[088] As pragas de lepidópteros, hemípteros, dípteros, ou coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em número em uma determinada área através dos métodos da invenção, ou podem ser profilaticamente aplicados a uma área do meio ambiente de modo a evitar a infestação de uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere, ou é colocada em contato com, uma quantidade eficaz de modo pesticida do polipeptídeo. Por "quantidade eficaz de modo pesticida" se entende uma quantidade de pesticida que é capaz de provocar a morte de pelo menos uma das pragas, ou de reduzir visivelmente o crescimento, alimentação, ou desenvolvimento fisiológico normal das pragas. Esta quantidade irá variar dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, localização, planta, culturas, ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais, e o método, taxa, concentração, estabilidade, e quantidade da aplicação da composição de polipeptídeo eficaz de modo pesticida. As formulações também podem variar em relação às condições climáticas, considerações ambientais, e/ou frequência de aplicação e/ou a gravidade da infestação das pragas.

[089] As composições pesticidas descritas podem ser feitas através da formulação quer das células bacterianas, do cristal e/ou da suspensão de esporos, ou do componente isolado da proteína com o desejado transportador agricolamente aceitável. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados como liofilizados, secos por congelação, dessecados, ou em um transportador aquoso, meio ou diluente adequado, tal como soro fisiológico ou outro tampão. As composições formuladas podem ser na forma de uma poeira ou material granuloso, ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral), ou água ou emulsões de óleo/água, ou como um pó umectante, ou em combinação com qualquer outro material transportador adequado para aplicação agrícola. Os transportadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo "transportador agricolamente aceitável" cobre todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfatantes, agentes de pegajosidade, aglutinantes, etc., que são normalmente usados na tecnologia da formulação de pesticidas; estes são bem conhecidos dos peritos na formulação pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, misturando homogeneamente, mesclando e/ou moendo a composição pesticida com adjuvantes adequados usando técnicas de formulação convencionais. As formulações adequadas e os métodos de aplicação são descritos na Patente dos E.U.A. No. 6.468.523, incorporada neste documento para referência.

[090] "Praga" inclui, mas não está limitada a, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos, e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos das ordens Coleoptera, Diptera, Himenoptera, Lepidoptera, Malofaga, Homoptera, Hemiptera, Ortroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera, e Diptera.

[091] A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. A subordem Adephaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, enquanto a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrofiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilioidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae, e Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyirinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A superfamília Staphlinoidea inclui as famílias Silphidae e Stphylinidae. A superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias Elateridae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Cocinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambycidae. A superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e Scolytidae.

[092] A ordem Diptera inclui as subordens Nematocera, Brachycera, e Cyclorrhapha. A subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, e Cecidomyiidae. A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, e Dolichopodidae. A subordem Cyclorrhapha inclui as Divisões Aschiza e Aschiza. A divisão Aschiza inclui as famílias Phoridae, Syrphidae, e Conopidae. A divisão Aschiza inclui as famílias Acalyptratae e Calyptratae. A seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, e Drosophilidae. A seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, e Sarcophagidae.

[093] A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Limantriidae, Sesiidae, e Tineidae.

[094] As pragas de insetos da invenção para as culturas principais incluem: Milho: Ostrinia nubilalis, Praga Quarentenária; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Diatraea grandiosella, broca grande da cana-de-açúcar; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Diatraea saccharalis, broca-do-colmo; Diabrotica virgifera, verme da raiz do milho ocidental; Diabrotica longicornis barberi, verme da raiz do milho do norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sul; Melanotus spp., larva-arame; Cyclocephala borealis, besouro mascarado do norte (besouro branco); Cyclocephala immaculata, besouro mascarado do sul (besouro branco); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, pulginha do milho e do arroz; Sphenophorus maidis, gorgulho-da-cana; Rhopalosiphum maidis, pulgão do milho; Anuraphis maidiradicis, pulgão da raiz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramíneas; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, mosca das leguminosas; Agromyza parvicornis, mineiros das folhas do milho; Anaphothrips obscrurus, tripes da grama; Solenopsis milesta, formiga ladrão; Tetranychus urticae, Ácaro rajado; Sorgo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Feltia subterranea, lagarta “rosca” do fumo; Phyllophaga crinita, escaravelho branco; Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., besouros; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Chaetocnema pulicaria, pulginha do milho e do arroz; Sphenophorus maidis, gorgulho-da-cana; Rhopalosiphum maidis; pulgão do milho; Sipha flava, pulgão amarelo da cana; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramíneas; Contarinia sorghicola, mosca do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, aranhiço-vermelho-comum; Tetranychus urticae, Ácaro rajado; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta militar; Spodoptera frugiperda, lagarta- do-cartucho; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Agrotis orthogonia, lagarta rosca do oeste; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Hypera punctata, gorgulho do trevo; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sul; pulgão russo do trigo; Schizaphis graminum, pulgão-verde-dos-cereais; Macrosiphum avenae, Pulgão-da- espiga; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, Gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, Mosca de Hessian; Sitodiplosis mosellana, mosquito do trigo; Meromyza americana, verme do caule do trigo; Hylemya coarctata, mosca do bolbo do trigo; Frankliniella fusca, tripes do tabaco; Cephus cinctus, mosca do caule do trigo; Aceria tulipae, ácaro do chochamento do alho; Girassol: Suleima helianthana, traça broto de girassol; Homoeosoma electellum, traça do girassol; zygogramma exclamationis, souro de girassol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosca da semente do girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta da maçã; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Spodoptera exigua, Borboleta Noturna; Pectinophora gossypiella, Lagarta-rosada; Anthonomus grandis, Bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, Pulgão-do- algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulgão do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, Percevejo Lygus; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, Gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Frankliniella fusca, tripes do tabaco; Tetranychus cinnabarinus, aranhiço-vermelho-comum; Tetranychus urticae, Ácaro rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana-do-acçúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Colaspis brunnea, Colaspis do arroz; Lissorhoptrus oryzophilus, bicheira-da-raiz- norte-americana; Sitophilus oryzae, gorgulho do arroz; Nephotettix nigropictus, cigarrinha do arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramíneas; Acrosternum hilare, Percevejo-acrosterno; Soja: Pseudoplusia includens, lagarta falsa-medideira; Anticarsia gemmatalis, lagarta-da-soja; Plathypena scabra, cloverworm verde; Ostrinia nubilalis, Praga Quarentenária; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Spodoptera exigua, borboleta noturna; Heliothis virescens, lagarta da maçã; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Epilachna varivestis, Besouro do feijão mexicano; Myzus persicae, pulgão-verde-do- pessegueiro; Empoasca fabae, cigarrinha da batata; Acrosternum hilare, percevejo-acrosterno; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, mosca das leguminosas; Sericothrips variabilis, tripes da soja; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Tetranychus turkestani, ácaro dos morangos; Tetranychus urticae, Ácaro rajado; Cevada: Ostrinia nubilalis, Praga Quarentenária; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Schizaphis graminum, pulgão-verde-dos-cereais; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramíneas; Acrosternum hilare, percevejo-acrosterno; Euschistus servus, percevejo marrom neártico; Delia platura, mosca das sementes; Mayetiola destructor, Mosca de Hessian; Petrobia latens, ácaro marron do trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, piolho-da-couve; Phyllotreta cruciferae, besouro-pulga; Mamestra configurata, lagarta; Plutella xylostella, traça das crucíferas; Delia ssp., larva das raízes.

[095] Os nematódeos incluem nematódeos parasitas tais como os nematódeos dos nódulos radiculares, do cisto, e das lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos do cisto, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematódeo de cisto da soja.); Heterodera schachtii (nematódeo dourado da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo do cisto dos cereais); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeo do cisto da batata). Nematodeos das lesões incluem Pratylenchus spp. Métodos para Aumentar o Rendimento da Planta

[096] São conferidos métodos para aumentar o rendimento da planta. Os métodos compreendem o conferir de uma planta ou célula vegetal expressando um polinucleótido codificando a sequência de polipeptídeo pesticida divulgada neste documento, e crescer a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado (ou suscetível de ser infestado) por uma praga contra a qual o referido polipeptídeo possui atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo possui atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros ou nematódeos, e o dito campo é infestado por uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros ou nematódeos. Tal como definido neste documento, o "rendimento" da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por "biomassa" se entende qualquer produto da planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto da planta medido. O aumento do rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa da folha da planta pode aumentar o rendimento dos vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Além disso, o aumento da biomassa da folha pode ser utilizado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados da planta. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um aumento de 30%, de pelo menos 50%, de pelo menos 70%, de pelo menos de 100% ou superior no rendimento em comparação com uma planta que não expressa a sequência pesticida. Em métodos específicos, o rendimento da planta é aumentado como resultado de uma melhoria na resistência a pragas da planta que expressa uma proteína pesticida aqui divulgada. A expressão da proteína pesticida resulta numa capacidade reduzida de uma praga em infestar ou se alimentar.

[097] As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas, ou fungicidas. Exemplos de composições químicas incluem: Herbicidas para Frutos/Legumes e Hortaliças: Atrazina, Bromacil, Diurona, Glifosato, Linurona, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halosulfurona Gowan, Paraquato, Propizamida, Setoxidime, Butafenacil, Halosulfurão, Indaziflame; Inseticidas para Frutos/Legumes e Hortaliças: Aldicarbe, Bacillus thuringiensis, Carbaril, Carbofurona, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novalurona, Cromafenozida, Tiaclopride, Dinotefurona, Fluacripirim, Espirodiclofena, Gama-cialotrina, Espiromesifena, Espinosade, Rinaxipir, Ciazipir, Triflumurona, Espirotetramate, Imidaclopride, Flubendiamida, Tiodicarbe, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofena, Cianopirafena, Clotianidina, Tiamethoxame, Espinotorame, Tiodicarbe, Flonicamida, Metiocarbe, Benzoato de emamectina, Indoxacarbe, Fenamifos, Piriproxifeno, Óxido de fenbutatina; Fungicidas para Frutos/Legumes e Hortaliças: Ametotradina, Azoxistrobina, Bentiavalicarb, Boscalid, Captano, Carbendazima, Clorotalonil, Cobre, Ciazofamida, Ciflufenamida, Cimoxanil, Ciproconazol, Ciprodinil, Difenoconazol, Dimetomorfe, Ditianona, Fenamidona, Fenexamida, Fluaziname, Fludioxonil, Fluopicolide, Fluopirame, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Folpet, Fosetil, Iprodiona, Iprovalicarbe, Isopirazam, Cresoxima-metil, Mancozebe, Mandipropamida, Metalaxil/mefenoxame, Metirame, Metrafenone, Miclobutanil, Penconazole, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propamocarbe, Propiconazole, Propinebe, Proquinazida, Protioconazol, Piraclostrobina, Pirimetanil, Quinoxifena, Spiroxamina, Enxofre, Tebuconazole, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina; Herbicidas para Cereais:

[098] 2.4-D, Amidosulfurona, Bromoxinil, Carfentrazona-E, Clorotolurina, Clorsulfurona, Clodinafope-P, Clopiralida, Dicamba, Diclofope-M, Diflufenicano, Fenoxaprope, Florasulame, Flucarbazona- NA, Flufenacete, Flupirosulfurona-M, Fluroxipire, Flurtamona, Glifosato, Iodosulfurona, Ioxinil, Isoproturão, MCPA, Mesosulfurão, Metsulfurona, Pendimetalina, Pinoxadeno, Propoxicarbazone, Prosulfocarbe, Piroxsulame, Sulfosulfurona, Tifensulfurona, Tralcoxidima, Triasulfurona, Tribenurona, Trifluralin, Tritosulfurona; Fungicidas para Cereais: Azoxistrobina, Bixafeno, Boscalide, Carbendazime, Clorotalonil, Ciflufenamida, Ciproconazole, Ciprodinil, Dimoxistrobina, Epoxiconazole, Fenpropidina, Fluoxastrobina, Fluquinconazole, Cresoxima-metil, Metconazole, Picoxistrobina, Procloraze, Protioconazole, Piraclostrobina, Tebuconazole, Tiofanate-metil, Cereais: Dimetoato, Lambda-cialtrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurona, Clorfirifos, Pirimicarbe, Metiocarbe, Sulfoxaflore; Herbicidas para Milho: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Gliphosato, Isoxaflutole, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfurona, Primisulfurona, Rimsulfurona, Sulcotriona, Foramsulfurona, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacete, Piroxasulfona; Inseticidas para Milho: Carbofurona, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidaclopride, Lambda-Ci- halotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxame, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurona, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenurona, Tebupirimfos, Etiprole, Ciazipir, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Avermectina; Fungicidas para Milho: Azoxistrobina, Bixafenr, Boscalida, Ciproconazole, Dimoxistrobina, Epoxiconazole, Fenitropano, Fluopirame, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Isopirazame, Metconazole, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propiconazole, Protioconazole, Piraclostrobina, Tebuconazole, Trifloxistrobina; Herbicidas para Arroz: Butacloro, Propanilo, Azimsulfurona, Bensulfurona, Cialofope, Daimurona, Fentrazamida, Imazosulfurona, Mefenacete, Oxaziclomefona, Pirazosulfurona, Piributicarbe, Quincloraque, Tiobencarbe, Indanofane, Flufenacete, Fentrazamida, Halosulfurona, Oxaziclomefona, Benzobiciclona, Piriftalide, Penoxsulame, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfurona, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprope, Pirimisulfano; Inseticidas para Arroz: Diazinona, Fenobucarbe, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurane, Fipronil, Imidaclopride, Isoprocarbe, Tiaclopride, Cromafenozide, Clotianidina, Etiprole, Flubendiamide, Rinaxipire, Deltametrina, Acetamipride, Tiametoxame, Ciazipire, Espinosade, Espinotorame, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Etofenprox, Carbofurano, Benfuracarbe, Sulfoxaflor; Fungicidas para Arroz: Azoxistrobina, Carbendazime, Carpropamide, Diclocimete, Difenoconazole, Edifenfos, Ferimzone, Gentamicina, Hexaconazole, Himexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolane, Isotianil, Casugamicina, Mancozebe, Metominostrobina, Orisastrobina, Pencicurona, Probenazole, Propiconazole, Propinebe, Piroquilona, Tebuconazole, Tiofanato-metil, Tiadinil, Triciclazole, Trifloxistrobina, Validamicina; Herbicidas para Algodão: Diurona, Fluometurona, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodime, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazona, Pendimetalina, Piritiobac-sódio, Trifloxisulfurona, Tepraloxidime, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurão; Inseticidas para Algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamipride, Benzoato de Emamectina, Imidaclopride, Indoxacarbe, Lambda-Cialotrina, Espinosade, Tiocarbe, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumurona, Rinaxipir, Beta-ciflutrina, Espirotetramate, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, Cialotrina gama, 4-[[(6- Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoroetil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiocarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor; Fungicidas para Algodão: Azoxystrobina, Bixafeno, Boscalide, Carbendazime, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazole, Difenoconazole, Dimoxistrobina, Epoxiconazole, Fenamidone, Fluaziname, Fluopirame, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Iprodione, Isopirazame, Isotianil, Mancozebe, Manebe, Metominostrobina, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propinebe, Protioconazole, Piraclostrobina, Quintozeno, Tebuconazole, Tetraconazole, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina; Herbicidas para Soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimurona-Etil, Cloransulame-Metil, Fenoxaprope, Fomesafeno, Fluazifope, Glifosato, Imazamox, Imazaquina, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidima, Glufosinato; Insecticidas para Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, β-Ciflutrina, Cialotrina gama e lambda, 4-[[(6-Cloropiridin- 3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramate, Espinodiclofeno, Triflumurão, Flonicamida, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas para Soja: Azoxistrobina, Bixafeno, Boscalide, Carbendazime, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazole, Difenoconazole, Dimoxistrobina, Epoxiconazole, Fluaziname, Fluopirame, Fluoxastrobina, Flutriafol, Fluxapiroxade, Isopirazame, Iprodiona, Isotianil, Mancozebe, Manebe, Metconazole, Metominostrobina, Miclobutanil, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propiconazole, Propinebe, Protioconazole, Piraclostrobina, Tebuconazole, Tetraconazole, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina; Herbicidas para Beterraba sacarina: Cloridazona, Desmedifame, Etofumesato, Fenmedifame, Trialato, Clopiralida, Fluazifope, Lenacil, Metamitrão, Quinmeraque, Cicloxidime, Triflusulfurona, Tepraloxidime, Quizalofope; Inseticidas para Beterraba sacarina: Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Deltametrina, β-Ciflutrina, Cialotrina gama/lambda, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan- 2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurona; Herbicidas para Canola: Clopiralid, Diclofope, Fluazifope, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina Etametsulfurona, Quinmeraque, Quizalofope, Cletodime, Tepraloxidime; Fungicidas para Canola: Azoxistrobina, Bixafena, Boscalide, Carbendazime, Ciproconazole, Difenoconazole, Dimoxistrobina, Epoxiconazole, Fluaziname, Fluopirame, Fluoxastrobina, Flusilazole, Fluxapiroxade, Iprodione, Iprodiona, Isopirazam, Cloreto de mepiquato, Metconazole, Metominostrobina, Paclobutrazole, Pentiopirade, Picoxistrobina, Procloraze, Protioconazole, Piraclostrobina, Tebuconazole, Tiiofanato- metil, Trifloxistrobina, Vinclozolina; Inseticidas para Canola: Carbofurano, Tiaclopride, Deltametrina, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Acetamipride, Dinetofurano, β-Ciflutrina, Cialotrina gama e lambda, tau-Fluvaleriato, Etiprole, Espinosade, Espinotorame, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

[099] Os seguintes exemplos são apresentados para efeitos de ilustração e não como modo de limitação. EXEMPLOS EXPERIMENTAIS Exemplo 1. Descoberta de novos genes pesticidas de Bacillus thuringiensis

[0100] Novos genes pesticidas foram identificados a partir da estirpe bacteriana ATX66723 usando os seguintes passos:

[0101] Preparação de DNA total a partir da estirpe. O DNA total contém DNA genômico e DNA extracromossômico. O DNA cromossômico contém uma mistura de alguns ou todos os seguintes: plasmídeos de vário tamanho; cromossomas fágicos; outras moléculas extracromossômicas não caracterizadas.

[0102] Sequenciação do DNA. O DNA total é sequenciado através de métodos de Sequenciação da Próxima Geração.

[0103] Identificação de genes da toxina putativos através de análises de homologia e/ou outras computacionais.

[0104] Quando requerido, finalização da sequência do gene de interesse por uma de várias estratégias de PCR ou clonagem (por exemplo TAIL-PCR).

[0105] A estirpe ATX66723 foi isolada de uma amostra ambiental em Mindanao do Norte, nas Filipinas. Tabela 1. Novo gene identificado a partir da estirpe ATX66723

[0106] Axmi345 foi amplificado por PCR a partir de pAX980, e o produto de PCR foi clonado no vetor de expressão do Bacillus pAX916 por métodos bem conhecidos na técnica. A estirpe de Bacillus resultante, contendo o vetor com Axmi345, foi cultivada em um meio de crescimento convencional, tal como o meio CYS (10 g/L de Bato- casitona, 3 g/L de extrato de levedura; 6 g/L KH2PO4; 14 g/L K2HPO4; 0,5 mM MgSO4; 0,05 mM MnCl2; 0,05 mM FeSO4), até que a esporulação fosse evidente por exame microscópico. Amostras foram preparadas e testadas para atividade em bioensaios. Exemplo 2. Ensaios de Atividade Pesticida

[0107] As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser testadas para a sua capacidade de produzir proteínas pesticidas. A capacidade de uma proteína pesticida atuar como pesticida numa praga é muitas vezes avaliada de vários modos. Um modo bem conhecido na técnica é realizar um teste de ingestão. Num destes testes de ingestão, a praga é exposta a uma amostra contendo ou compostos a serem testados, ou amostras de controle. Isto é frequentemente realizado colocando o material a ser testado, ou uma diluição adequada de tal material num material que a praga irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode ser composto por um líquido, um sólido ou uma suspensão. O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e depois permitir que seque. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial derretida, e depois dispensado para a câmara de teste. A câmara de teste pode ser, por exemplo, uma taça, um prato, ou um poço de uma microplaca.

[0108] Testes para pragas sugadoras (por exemplo, afídeos) podem envolver a separação do material a testar do inseto por intermédio de uma partição, idealmente uma porção que pode ser perfurada pelas partes sugadoras da boca do inseto sugador, para permitir a ingestão do material a testar. O material a testar é frequentemente misturado com um estimulador da ingestão, tal como sacarose, para promover a ingestão do composto a testar.

[0109] Outros tipos de ensaios podem incluir a microinjeção do material a testar na boca, ou no intestino da praga, bem como o desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido por um teste para a capacidade da praga em se alimentar da planta transgênica. O teste da planta pode envolver o isolamento das partes das plantas normalmente consumidas, por exemplo, pequenas gaiolas presas a uma folha, ou o isolamento de plantas inteiras em gaiolas contendo insetos.

[0110] Outros métodos e abordagens para testar pragas são conhecidos na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson e Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, os ensaios são comumente descritos nas revistas Arthropod Management Tests e Journal of Economic Entomology ou discutidos por membros da Entomological Society of America (ESA).

[0111] Em algumas modalidades, as regiões de DNA codificando a região da toxina das proteínas pesticidas divulgadas neste documento são clonadas no vetor de expressão E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE que codifica para a Proteína de ligação à maltose (MBP). Estas fusões, que estão na mesma fase de leitura, resultam na expressão de proteínas de fusão MBP-Axmi em E. coli.

[0112] Para a expressão em E.coli, BL21*DE3 são transformados com plasmídeos individuais. Colônias isoladas são inoculadas em LB suplementado com carbenicilina e glicose, e crescidas durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, se inocula meio fresco com 1% da cultura crescida durante a noite e cresce a 37 °C até atingir a fase logarítmica. Subsequentemente, as culturas são induzidas com IPTG 0,3 mM durante a noite a 20°C. Cada pélete de células é suspenso em tampão Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 + NaCl 200 mM + DTT 1 mM + inibidores de protease, e sonicado. A análise por meio de SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a expressão das proteínas de fusão.

[0113] Os extratos totais livres de células são passados por uma coluna de amilose ligada a cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) para purificação por afinidade das proteínas de fusão MBP- axmi. As proteínas de fusão ligadas à resina são eluídas com solução de maltose 10 mM. As proteínas de fusão purificadas são então clivadas com Fator Xa ou tripsina para remover o marcador amino terminal MBP da proteína Axmi. A clivagem e solubilidade das proteínas podem ser determinadas por SDS-PAGE. Exemplo 3. Expressão e Purificação

[0114] Axmi345 (SEQ ID NO: 1 ou 3) foi clonado no vetor de expressão em E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE que codifica para a Proteína de ligação à maltose (MBP). Estas fusões, que estão na mesma fase de leitura, resultaram na expressão da proteína de fusão MBP-Axmi345 em E. coli.

[0115] Para a expressão em E. coli, BL21*DE3 foram transformadas com plasmídeos individuais. Colônias isoladas foram inoculadas em LB suplementado com carbenicilina e glicose, e crescidas durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, meio fresco foi inoculado com 1% da cultura crescida durante a noite e a cultura cultivada a 37 °C até atingir a fase logarítmica. Subsequentemente, as culturas foram induzidas com IPTG 0,3 mM durante a noite a 20°C. Cada pélete de células foi suspenso em tampão Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 + NaCl 200 mM + DTT 1 mM + inibidores de protease, e sonicado. A análise por meio de SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a expressão das proteínas de fusão.

[0116] Os extratos totais livres de células foram passados por uma coluna de amilose ligada a cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) para purificação por afinidade das proteínas de fusão MBP- axmi. A proteína de fusão ligada à resina foi eluída com solução de maltose 10 mM. A proteína de fusão purificada foi então clivada com Fator Xa ou tripsina para remover o marcador amino terminal MBP da proteína Axmi. A clivagem e solubilidade das proteínas podem ser determinadas por SDS-PAGE. Tabela 2. Atividade de proteínas expressas em bioensaio

DBM: Traça das crucíferas (“Diamond Black Moth”) ECB: Broca europeia do milho (“European corn borer”) SCB: Broca da cana-de-açúcar (“Sugarcane borer”) SWCB: Broca de milho do sudoeste (“Southwestern Cornborer”) SBL: Lagarta falsa medideira da soja (“Soybean looper”) VBC: Lagarta-da-soja (“Velvetbean caterpillar” Exemplo 5. Colocação dos Genes num Vetor para Expressão em Plantas

[0117] As regiões codificantes da invenção estão ligadas com sequências promotoras e terminadoras apropriadas para expressão em plantas. Tais sequências são bem conhecidas na técnica e podem incluir o promotor da actina do arroz ou o promotor da ubiquitina do milho para expressão em monocotiledôneas, o promotor UBQ3 ou o promotor CaMV 35S de Arabidopsis para expressão em dicotiledôneas, e os terminadores nos ou PinII. Técnicas para a produção e a confirmação de construções promotor-gene-terminador também são bem conhecidas na técnica.

[0118] Em um aspecto da invenção, são desenhadas e geradas sequências de DNA sintéticas. Essas sequências sintéticas têm uma sequência de nucleotídeos alterada relativamente à sequência paterna, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à sequência paterna.

[0119] Em outro aspecto da invenção, são desenhadas versões modificadas dos genes sintéticos de tal modo que o peptídeo resultante é direcionado para uma organela de planta, tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto. As sequências de peptídeos que se sabe resultarem no direcionamento das proteínas de fusão para organelos de plantas são conhecidas na técnica. Por exemplo, a região do terminal N do gene da fosfatase ácida a partir do Tremoço Branco Lupinus albus (GENBANK® ID GI:14276838, Miller e outros. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) é conhecida na técnica por resultar no direcionamento de proteínas heterólogas para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção no retículo endoplasmático compreendendo o peptídeo de terminal N lisina-ácido aspártico-ácido glutâmico-leucina (ou seja, o motivo "KDEL", SEQ ID NO: 3) no terminal C, a proteína de fusão será direcionada para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão não possui uma sequência para direcionamento ao retículo endoplasmático no terminal C, a proteína será direcionada para o retículo endoplasmático, mas acabará por ser sequestrada no apoplasto.

[0120] Assim, este gene codifica para uma proteína de fusão que contém os trinta e um aminoácidos de terminal N do gene da fosfatase ácida do Tremoço Branco Lupinus albus (GENBANK® ID GI: 14276838 , Miller e outros., 2001, supra) fundidos com o terminal N da sequência de aminoácidos da invenção, bem como a sequência KDEL no terminal C. Assim, se prevê que a proteína resultante se direcione para o retículo endoplasmático da planta aquando da expressão numa célula de planta.

[0121] Os cassetes de expressão vegetais acima descritos são combinados com um marcador vegetal de seleção apropriado para ajudar na seleção de células transformadas e tecidos, e ligados em vetores de transformação de vegetais. Estes podem incluir vetores binários de transformação mediados por Agrobacterium ou vetores plasmídicos simples para transformação por aerossol ou biolística. Exemplo 6. Transformação de Células de Milho com os genes de proteína pesticida descritos neste documento

[0122] 8-12 dias após a polinização são recolhidas espigas de milho. São isolados embriões das espigas, e esses embriões com um tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para utilização para transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo virado para cima num meio de incubação adequado, tal como meio DN62A5S (3,98 g/L Sais N6; 1 mL/L (de 1000x Solução mãe) Vitaminas N6; 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Mio-inositol; 1,4 g/L L-Prolina; 100 mg/L Casaminoácidos; 50 g/L sacarose; 1 mL/L (de 1 mg/mL Solução mãe) 2,4-D). No entanto, os meios e os sais diferentes de DN62A5S são adequados e são conhecidos na técnica. Os embriões são incubados durante a noite a 25°C no escuro. No entanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite.

[0123] Os explantes resultantes são transferidos para quadrados de uma rede (30-40 por placa), transferidos para meio osmótico durante 30-45 minutos, depois transferidos para uma placa de bombardeamento (ver, por exemplo, PCT Publicação No. WO/0138514 e a Patente dos E.U.A. No. 5.240.842).

[0124] As construções de DNA concebidas para os genes da invenção em células vegetais são aceleradas para o tecido vegetal utilizando um acelerador de feixes de aerossol, utilizando condições essencialmente conforme descrito na Publicação PT No. WO/0138514. Após irradiação, os embriões foram incubados durante cerca de 30 min em meio osmótico, e colocados no meio de incubação durante a noite a 25°C no escuro. Para evitar danificar indevidamente explantes bombardeados, são incubados durante pelo menos 24 horas antes da transferência para meio de recuperação. Os embriões são então espalhados num meio de período de recuperação, durante 5 dias, a 25 °C no escuro, e depois transferidos para um meio de seleção. Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até se observar a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz de baixa intensidade, e o processo de regeneração é iniciado através de métodos conhecidos na técnica. Permite-se que os brotos resultantes enraízem em meio de enraizamento, e as plantas resultantes são transferidas para potes de viveiros e propagadas como plantas transgênicas. Materiais Meio DN62A5S

[0125] O pH da solução é ajustado a pH 5,8 com 1N KOH/1N KCl, é adicionado Gelrite (Sigma) a uma concentração de 3 g/L, e o meio é autoclavado. Após arrefecimento a 50 °C, são adicionados 2 mL/L de uma solução mãe a 5 mg/mL de nitrato de prata (Phytotechnology Labs). Exemplo 7. Transformação de genes da invenção em Células de Plantas por Transformação Mediada por Agrobacterium

[0126] São recolhidas espigas 8-12 dias após a polinização. São isolados embriões das espigas, e esses embriões com um tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para utilização para transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo virado para cima num meio de incubação adequado, e são incubados durante a noite a 25 °C no escuro. No entanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite. Os embriões são contatados com uma estirpe de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para transferência mediada pelo plasmídeo Ti durante 5-10 min, e depois plaqueados em meio de cocultivo durante 3 dias (25 °C no escuro). Após cocultivo, os explantes são transferidos para um meio de período de recuperação durante 5 dias (25 °C no escuro). Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até se observar a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz de baixa intensidade, e o processo de regeneração é iniciado conforme conhecido na técnica. Exemplo 8. Expressão e Atividade de Axmi345 em Z. mays

[0127] Uma construção compreendendo um ácido nucleico otimizado que codifica Axmi345 (que é mostrado no presente documento como SEQ ID NO: 3) sob o controle do promotor PScubi4- N1, bem como um gene de tolerância a herbicida sob o controle do promotor PScubi4-N1, foi transformada em milho usando o protocolo de transformação mediada por Agrobacterium descrito no presente documento. Amostras de disco de folha foram obtidas de plantas maduras que eram positivas para a expressão de Axmi335 conforme medida por Western blot e análise de RT-PCR. Permitiu-se que as pragas-alvo se alimentassem dos discos de folha durante 2 dias. Os discos de folha foram então avaliados de acordo com a quantidade de danos causados ao disco após o período de alimentação. Os controles (tecido de folha HiII não transgênica) apresentaram grau elevado de danos causados por todos os insetos no painel, e sem mortalidade. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Hz: Helicoverpa zea ECB: Broca europeia do milho (“European corn borer”) FAW: Lagarta do cartucho do milho (“fall armyworm”) BCW: Lagarta-rosca preta (“black cutworm”)

[0128] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de técnica dos entendidos na técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[0129] Apesar de a invenção anterior ter sido descrita em algum detalhe a título ilustrativo e exemplificativo, por motivos de clareza do entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas no âmbito das reivindicações anexas.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com atividade pesticida operacionalmente ligada a um promotor heterólogo, em que a referida sequência de nucleotídeos é a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 3.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos é uma sequência sintética que foi projetada para expressão em uma planta.

3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.

4. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que contém o ácido nucleico recombinante como definido na reivindicação 1, em que a célula hospedeira é uma célula de levedura ou célula bacteriana.

5. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é uma célula hospedeira bacteriana.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida composição: (a) é selecionada do grupo que consiste em pó, poeira, granulado, grânulo, spray, emulsão, colóide e solução; (b) preparado por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas; ou (c) compreende de cerca de 1% a cerca de 99% em peso do referido polipeptídeo.

8. Método para matar uma praga de lepidópteros, ou para controlar uma população de pragas de lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende o contato ou a alimentação da referida praga ou população com uma quantidade pesticidamente eficaz do polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a referida praga de lepidópteros é selecionada do grupo que consiste em: traça das crucíferas (DBM - “Diamond Black Moth”), broca da cana-de-açúcar (SCB - “Sugarcane borer”) e Helicoverpa zea (Hz).

9. Método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 4 em condições em que a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é expressa.

10. Método para proteger uma planta de uma praga, caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma planta ou célula uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pesticida, em que a referida sequência de nucleotídeos é a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3, preferencialmente em que a referida planta produz um polipeptídeo pesticida com atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, em que a referida praga de lepidópteros é selecionada do grupo consistindo em: traça das crucíferas (DBM - “Diamond Black Moth”), broca da cana-de-açúcar (SCB - “Sugarcane borer”) e Helicoverpa zea (Hz).