BR112012020705B1 - molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira microbiana, polipeptídeo recombinante com atividade pesticida, composição, bem como métodos para o controle de uma população de pragas de lepidópteros, para matar uma praga de lepidóptero, para a produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, para a proteção de uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta - Google Patents

Abstract

AXMI221z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z E AXMI225z GENES DE DELTA-ENDOTOXINA E MÉTODOS PARA SUA UTILIZAÇÃO. A presente invenção refere-se a composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes. São proporcionadas composições que compreendem uma sequência que codifica para um polipeptídeo de toxina. As sequências codificantes podem ser utilizadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para a transformação e a expressão em plantas e bactérias. As composições também compreendem bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes transformadas. Em particular, proporcionam-se moléculas de ácido nucleico de toxina isoladas. Adicionalmente, estão abrangidas sequências de aminoácidos correspondentes aos polinucleotídeos e anticorpos que se ligam especificamente àquelas sequências de aminoácidos. Em particular, a presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem sequências nucleotídicas que codificam para a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NO: 21-32, ou a sequência nucleotídica apresentada em qualquer de SEQ ID NO: 1-20, bem como suas variantes e fragmentos.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE COM ATIVIDADE PESTICIDA, COMPOSIÇÃO, BEM COMO MÉTODOS PARA O CONTROLE DE UMA POPULAÇÃO DE PRAGAS DE LEPIDÓPTEROS, PARA MATAR UMA PRAGA DE LEPIDÓPTERO, PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE PESTICIDA, PARA A PROTEÇÃO DE UMA PLANTA DE UMA PRAGA, E PARA AUMENTAR O RENDIMENTO EM UMA PLANTA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] Esse pedido de patente reivindica o benefício do Requerimento Provisório U.S. N° de Série 61/305,802, depositado em 18 de fevereiro de 2010, cujo conteúdo é aqui dado como integralmente incorporado por citação.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[0002] A cópia oficial da lista de sequências é submetida eletronicamente via a EFS-Web como uma lista de sequências no formato ASCII com o nome de arquivo "APA069US01SEQLIST.txt", criado em 10 de janeiro de 2011, com tamanho de arquivo de 132 kilobytes e depositado ao mesmo tempo que a memória descritiva. A lista de sequências contida nesse documento em formato ASCII faz parte da memória descritiva e é aqui dada como integralmente incorporada por citação.

CAMPIO DA INVENÇÃO

[0003] Essa invenção se refere ao campo da biologia molecular. Proporcionam-se novos genes que codificam para proteínas pesticidas. Essas proteínas e as sequências de ácidos nucleicos que para elas codificam são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a pragas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva de solo, formadora de esporos, caraterizada pela sua capacidade de formar inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de insetos, mas que são inofensivas para plantas e outros organismos que não são alvo. Por esta razão, composições incluindo cepas de Bacillus thuringiensis ou as suas proteínas inseticidas podem ser utilizadas como inseticidas ambientalmente aceitáveis para controlar insetos que são pragas agrícolas ou insetos vetores para uma variedade de doenças humanas ou animais.

[0005] As proteínas cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis têm uma potente atividade inseticida contra predominantemente larvas de Lepidópteros, Hemípteros, Dípteros e Coleópteros. Estas proteínas também apresentaram atividade contra pragas das ordens Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, e Acari, assim como outras ordens de invertebrados tais como Nemathelminthes, Platyhelminthes, e Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. Em Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I.). Estas proteínas foram originalmente classificadas como CryI a CryV com base principalmente na sua atividade inseticida. As classes principais foram Lepidoptera-específicas (I), Lepidoptera- e Diptera-específicas (II), Coleoptera-específicas (III), Diptera-específicas (IV), e nematódeo-específicas (V) e (VI). Estas proteínas foram adicionalmente classificadas em subfamílias; às proteínas mais relacionadas dentro de cada família foram atribuídas letras de divisão como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. As proteínas ainda mais próximas dentro de cada divisão foram atribuídos nomes tais como Cry1C1, Cry1C2, etc.

[0006] Uma nova nomenclatura foi recentemente descrita para os genes Cry com base na homologia na sequência de aminoácidos em vez de especificidade do inseto alvo (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). Na nova classificação, a cada toxina é atribuído um nome único que incorpora uma primeira classificação (um número árabe), uma segunda classificação (uma letra maiúscula), uma terceira classificação (uma letra minúscula) e uma quarta classificação (outro número árabe). Na nova classificação, os números romanos foram substituídos pelos números árabes na primeira classificação. Proteínas com menos de 45% de identidade de sequência têm primeiras classificações diferentes, e os critérios para a segunda e terceira classificação são, respectivamente, de 78% e 95%.

[0007] A proteína cristal não apresenta atividade inseticida até ter sido ingerida ou solubilizada no mesentério do inseto. A pró-toxina ingerida é hidrolisada pelas proteases no trato digestivo do inseto formando uma molécula tóxica (Höfte e Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina liga-se a receptores da borda em escova apical no mesentério das larvas alvo e introduz-se na membrana apical criando canais iônicos ou poros, resultando na morte da larva.

[0008] As delta-endotoxinas têm geralmente cinco domínios de sequência conservados, e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices alfa e está envolvido na inserção na membrana e formação de poros. O domínio II consiste em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave grega, e o domínio III consiste em duas folhas beta antiparalelas em uma formação superenrolada (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II e III estão envolvidos no reconhecimento e na ligação ao receptor, e são como tal considerados determinantes para a especificidade da toxina.

[0009] Devido à devastação que insetos podem conferir e a melhoria no rendimento através do controle de pragas de insetos, existe uma necessidade contínua de descobrir novas formas de toxinas pesticidas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00010] Proporcionam-se composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes. As composições incluem sequências de moléculas de ácidos nucleicos que codificam para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores compreendendo aquelas moléculas de ácidos nucleicos, e células hospedeiras compreendendo os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos e anticorpos contra aqueles polipeptídeos. As sequências nucleotídicas podem ser utilizadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para a transformação e a expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram desenhadas para expressão em um organismo incluindo, mas sem limitação a, um microrganismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes transformadas.

[00011] Em particular, proporcionam-se moléculas de ácidos nucleicos que codificam para uma proteína pesticida. Adicionalmente, estão abrangidas sequências de aminoácidos correspondentes à proteína pesticida. Em particular, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:21-32, ou uma sequência nucleotídica apresentada em SEQ ID NO:1-5, bem como suas variantes e fragmentos. Estão também abrangidas sequências de nucleotídeos que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da invenção, ou que hibridizam com uma sequência da invenção. Sequências nucleotídicas sintéticas que codificam os polipeptídeos divulgados aqui também são apresentadas em SEQ ID NO:6-20.

[00012] São proporcionados métodos para a produção dos polipeptídeos da invenção, e para a utilização daqueles polipeptídeos para o controle ou morte de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematoides ou dípteros. São também incluídos métodos e kits para a detecção de ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra.

[00013] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com maior resistência ou tolerância a pragas. Estes organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para fins agrícolas. As composições da invenção são também úteis para gerar proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida, ou para a detecção da presença de proteínas ou ácidos nucleicos pesticidas em produtos ou organismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00014] A presente invenção refere-se a composições e métodos para a regulação da resistência ou tolerância a pragas em organismos, particularmente plantas ou células de plantas. Por "resistência" entende-se que a praga (por exemplo, um inseto) é morta pela ingestão ou outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por "tolerância" entende-se uma limitação ou uma redução no movimento, alimentação, reprodução, ou outras funções da praga. Os métodos envolvem a transformação de organismos com uma sequência nucleotídica que codifica para uma proteína pesticida da invenção. Em particular, as sequências nucleotídicas da invenção são úteis para a preparação de plantas e de microrganismos que possuem atividade pesticida. Assim, proporcionam-se bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de plantas e sementes transformados. As composições consistem em ácidos nucleicos e proteínas pesticidas derivados de Bacillus ou de outra espécie. As sequências têm utilização na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos), e para gerar proteínas pesticidas alteradas por métodos conhecidos na técnica, tais como troca de domínios ou rearranjo de DNA ("DNA shuffling"), por exemplo, com membros das famílias de endotoxinas Cry1, Cry2, e Cry9. As proteínas são utilizadas no controle ou na morte de populações de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros e nematoides e para a produção de composições com atividade pesticida.

[00015] Por "toxina pesticida" ou "proteína pesticida" entende-se uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação a, membros das ordens Lepidoptera, Diptera e Coleoptera, ou o filo Nematoda, ou uma proteína que tem homologia com tal proteína. As proteínas pesticidas foram isoladas de organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. As proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências nucleotídicas completas aqui divulgadas, e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências completas, seja devido à utilização de um sítio de iniciação a jusante alternativo, ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta com atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa, ou na praga após ingestão da proteína.

[00016] As proteínas pesticidas abrangem delta-endotoxinas. As delta-endotoxinas incluem proteínas identificadas como cry1 até cry43, cyt1 e cyt2, e toxina do tipo Cyt. Existem atualmente mais de 250 espécies conhecidas de delta-endotoxinas com uma larga gama de especificidades e toxicidades. Para uma lista exaustiva ver Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, e para atualizações regulares ver Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," em www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

[00017] Assim, proporcionam-se aqui novas sequências nucleotídicas isoladas que conferem atividade pesticida. Estas sequências nucleotídicas isoladas codificam para polipeptídeos com homologia para delta-endotoxinas ou toxinas binárias conhecidas. Também se proporcionam as sequências de aminoácidos das proteínas pesticidas. A proteína resultante da tradução deste gene permite às células controlar ou matar as pragas que a ingerem.

Moléculas de Ácido Nucleico Isoladas, e Suas Variantes e Fragmentos

[00018] Um aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes compreendendo sequências nucleotídicas que codificam para proteínas e polipeptídeos pesticidas ou suas porções biologicamente ativas, assim como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para utilizar como sondas de hibridização para identificar ácidos nucleicos que codificam para proteínas com regiões de homologia de sequência. Tal como aqui utilizado, pelo termo "molécula de ácido nucleico" entende-se como incluindo moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, DNAc ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, RNAm) e análogos do DNA ou RNA gerado utilizando análogos nucleotídicos. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas é preferentemente DNA de cadeia dupla.

[00019] Uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) "isolada" ou "recombinante" é aqui utilizada para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira recombinante bacteriana ou de planta. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou recombinante está livre de sequências (preferentemente sequências que codificam para proteínas) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (ou seja, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para os objetivos da invenção, "isolado" quando utilizado para se referir a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica para a delta-endotoxina isolada pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequências nucleotídicas que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual é derivado o ácido nucleico. Em várias modalidades, a proteína delta-endotoxina que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína com menos de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteína não delta-endotoxina (também aqui referida como "proteína recombinante").

[00020] As sequências nucleotídicas que codificam para as proteínas da presente invenção incluem a sequência apresentada em SEQ ID NO:1-20, e suas variantes, fragmentos e complementos. Por "complemento" entende-se uma sequência nucleotídica que é suficientemente complementar a uma dada sequência nucleotídica de tal modo que pode hibridizar com a dada sequência nucleotídica para assim formar um duplex estável. As sequências de aminoácidos correspondentes para a proteína pesticida para a qual esta sequência nucleotídica codifica são apresentadas em SEQ ID NO:21-32.

[00021] Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos destas sequências nucleotídicas que codificam para proteínas pesticidas são também abrangidas pela presente invenção. Por "fragmento" entende-se uma porção da sequência nucleotídica que codifica para uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência nucleotídica pode codificar para uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou pode ser um fragmento que pode ser utilizado como uma sonda de hibridização ou um iniciador de PCR utilizando métodos divulgados abaixo. Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência nucleotídica que codifica para uma proteína pesticida compreendem pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência nucleotídica completa que codifica para uma proteína pesticida aqui divulgada, dependendo da utilização pretendida. Por nucleotídeos "contíguos" entendem-se resíduos nucleotídicos que são imediatamente adjacentes uns aos outros. Fragmentos de sequências nucleotídicas da presente invenção irão codificar para fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína pesticida e, assim, retêm atividade pesticida. Por "reter atividade" entende-se que o fragmento terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína pesticida. Em uma modalidade, a atividade pesticida é atividade coleoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade lepidoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade nematocida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade diptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade hemiptericida. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J.of Economic Entomology 78:290-293; e a patente U.S. N° 5.743.477, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00022] Um fragmento de uma sequência nucleotídica que codifica para uma proteína pesticida que codifica para uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção irá codificar para pelo menos 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína pesticida completa da invenção. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de clivagem proteolítica. Por exemplo, o fragmento de clivagem proteolítica pode ter uma truncagem N-terminal ou C-terminal de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, ou cerca de 160 aminoácidos relativamente às SEQ ID NO:21-32. Em algumas modalidades, os fragmentos abrangidos aqui resultam da remoção do domínio de cristalização C-terminal, por exemplo, por meio de proteólise ou por meio de inserção de um códon de terminação na sequência codificante. Ver, por exemplo, as sequências de aminoácidos truncadas apresentadas em SEQ ID NO:22, 23, 25, 26, e 32. Será entendido que o sítio da truncagem pode variar por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais aminoácidos em qualquer um dos lados do sítio da truncagem representado pelo terminal de SEQ ID NO:22, 23, 25, 26, e 32 (comparado com a sequência completa correspondente).

[00023] Prefere-se que as proteínas pesticidas da presente invenção sejam codificadas por uma sequência nucleotídica suficientemente idêntica à sequência nucleotídica de SEQ ID NO:1-20. Por "suficientemente idêntica" entende-se uma sequência de aminoácidos ou nucleotídica que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência utilizando um dos programas de alinhamento aqui descritos utilizando parâmetros convencionais. Um perito na técnica reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências nucleotídicas tendo em conta a degenerescência de códons, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento da fase de leitura, e semelhantes aspectos.

[00024] Para se determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para efeitos de comparação ótima. A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (ou seja, porcentagem de identidade = número de posições idênticas/número de posições totais (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a percentagem de identidade é calculada ao longo da totalidade da sequência de referência (isto é, a sequência aqui apresentada como qualquer de SEQ ID NO:1-20). A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas semelhantes àquelas descritas abaixo, permitindo ou não lacunas. No cálculo da porcentagem de identidade, tipicamente contam-se correspondências exatas.

[00025] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser conseguida utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado de acordo com Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5873-5877. Um algoritmo desse tipo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento da palavra = 12, para obter sequências nucleotídicas homólogas a moléculas de ácido nucleico do tipo pesticida da invenção. As buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento da palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína pesticida da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para efeitos de comparação, pode-se utilizar o Gapped BLAST (em BLAST 2.0) tal como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, pode se utilizar PSIBlast para realizar uma procura iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, podem ser utilizados os parâmetros padrão dos programas respectivos (por exemplo, BLASTX e BLASTN). O alinhamento pode também ser realizado manualmente por inspeção.

[00026] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). O ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou de DNA, e pode assim proporcionar dados sobre a conservação de sequência da totalidade da sequência de aminoácidos. O algoritmo ClustalW é utilizado em vários pacotes de programas informáticos de análise de DNA/aminoácidos comercialmente disponíveis, tais como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, pode ser determinada a porcentagem de identidade de aminoácidos. Um exemplo não limitativo de um programa informático útil para a análise de alinhamentos ClustalW é GENEDOC®. GENEDOC® (Karl Nicholas) permite a avaliação da similaridade e identidade de aminoácidos (ou de DNA) entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Um algoritmo desse tipo é incorporado no programa ALIGN (versão 2,0), que faz parte do pacote de informática GCG Wisconsin Genetics, versão 10 (disponibilizado pela Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EUA). Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, pode-se utilizar uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade para lacunas de 4.

[00027] A menos que seja especificado em contrário, será utilizado GAP versão 10, que incorpora o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453 para determinar a identidade ou similaridade de sequências utilizando os seguintes parâmetros: % identidade e % semelhança para uma sequência de nucleotídeos utilizando um peso de GAP de 50 e um peso de Comprimento de 3 e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos utilizando um peso de GAP de 8 e um peso de comprimento de 2, e o programa de pontuação BLOSUM62. Podem também ser utilizados programas equivalentes. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento com correspondências de resíduos nucleotídicos idênticas e uma porcentagem de identidade de sequência idêntica quando comparada com o alinhamento correspondente gerado pelo GAP versão 10.

[00028] A invenção também abrange moléculas de ácido nucleico variantes. "Variantes" das sequências nucleotídicas que codificam para proteína pesticida incluem aquelas sequências que codificam para as proteínas pesticidas aqui apresentadas mas que diferem de forma conservativa devido à degenerescência do código genético assim como aquelas que são suficientemente idênticas tal como discutido acima. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com a utilização de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização tal como apresentado abaixo. Sequências nucleotídicas variantes também incluem sequências nucleotídicas derivadas sinteticamente que foram geradas, por exemplo, utilizando mutagênese dirigida, mas que ainda codificam para as proteínas pesticidas divulgadas na presente invenção tal como discutido abaixo. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, retendo atividade pesticida. Por "reter atividade" entende-se que a variante terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína nativa. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199206; Marrone et al. (1985) J.of Economic Entomology 78:290-293; e a patente U.S. N° 5.743.477, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00029] Qualquer pessoa competente na técnica apreciará que podem ser introduzidas alterações por mutação das sequências nucleotídicas da invenção conduzindo assim a alterações na sequência de aminoácidos das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Assim, podem ser criadas moléculas de ácido nucleico isoladas variantes através da introdução de uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeo na sequência nucleotídica correspondente aqui divulgada, de tal modo que são introduzidas uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos na proteína codificada. Podem ser introduzidas mutações por intermédio de técnicas convencionais, tais como mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências nucleotídicas variantes são também abrangidas pela presente invenção.

[00030] Por exemplo, podem ser realizadas substituições de aminoácidos conservativas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. Um aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado da sequência nativa de uma proteína pesticida sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido com uma cadeia lateral similar. Foram definidas na técnica famílias de resíduos aminoácidos com cadeias laterais similares. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[00031] As delta-endotoxinas têm geralmente cinco domínios de sequência conservados, e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices alfa e está envolvido na inserção na membrana e formação de poros. O domínio II consiste em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave grega, e o domínio III consiste em duas folhas beta antiparalelas em uma formação superenrolada (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II e III estão envolvidos no reconhecimento e na ligação ao receptor, e são como tal considerados determinantes para a especificidade da toxina.

[00032] As substituições dos aminoácidos podem ser realizadas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não seriam realizadas para resíduos aminoácidos conservados, ou para resíduos aminoácidos residindo no interior de um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas em relação às sequências da invenção (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que permitem substituições de aminoácidos conservativas e ainda retêm atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas da invenção (por exemplo, resíduos que apenas contêm substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento de proteínas homólogas). No entanto, um perito na técnica entenderá que variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

[00033] Alternativamente, podem ser produzidas sequências nucleotídicas variantes através da introdução aleatória de mutações ao longo da totalidade ou de parte da sequência codificante, tal como por mutagênese de saturação, e as mutantes resultantes podem ser rastreadas pela sua capacidade de conferir atividade pesticida para identificar mutantes que retêm atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa por via recombinante, e a atividade da proteína pode ser determinada utilizando técnicas de teste convencionais.

[00034] Utilizando métodos tais como PCR, hibridização, e semelhantes, podem ser identificadas sequências pesticidas correspondentes, tais como sequências com identidade substancial em relação às sequências da invenção. Ver, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NI).

[00035] Em um método de hibridização, a totalidade ou parte da sequência nucleotídica pesticida pode ser utilizada para fazer o rastreio de bibliotecas de DNAc ou genômicas. Os métodos para a construção de tais bibliotecas de cDNA ou genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são apresentados em Sambrook e Russel, 2001, supra. As denominadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcados com um grupo detectável tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável, tais como outros radioisótopos, um composto fluorescente, um enzima ou um cofator de enzima. As sondas de hibridização podem ser preparadas através da marcação de oligonucleotídeos sintéticos baseados na sequência conhecida de nucleotídeos que codifica para a proteína pesticida aqui divulgada. Podem ser adicionalmente utilizados iniciadores degenerados desenhados com base nos nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácidos na sequência nucleotídica ou na sequência de aminoácidos codificada. A sonda tipicamente compreende uma região de sequência nucleotídica que hibridiza sob condições estringentes com pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, ou 200 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos que codifica para a proteína pesticida da invenção ou um fragmento ou variante da mesma. Métodos para a preparação de sondas para a hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são apresentados em Sambrook e Russell, 2001, supra aqui incorporada por referência.

[00036] Por exemplo, uma sequência completa de proteína pesticida aqui divulgada, ou uma ou mais porções daquela, pode ser utilizada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com sequências do tipo proteína pesticida correspondentes e RNAs mensageiros. Para conseguir uma hibridização específica sob diversas condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm preferentemente pelo menos um comprimento de 10 nucleotídeos, ou pelo menos um comprimento de 20 nucleotídeos. Tais sondas podem ser utilizadas para amplificar por PCR sequências pesticidas correspondentes de um organismo escolhido. Esta técnica pode ser utilizada para isolar sequências codificantes adicionais de um organismo desejado ou como teste de diagnóstico para determinar a presença de sequências codificantes em um organismo. As técnicas de hibridização incluem o rastreio por hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (sejam placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00037] A hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" entendem-se condições sob as quais uma sonda hibridizará com sua sequência alvo em um grau que seja possível detectar ser mais elevado do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao sinal de fundo). As condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes dependendo das circunstâncias. Controlando a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, podem ser identificadas sequências alvo que são 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma divergência nas sequências de modo que sejam detectados baixos graus de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem um comprimento inferior a cerca de 1000 nucleotídeos, preferentemente um comprimento de menos de 500 nucleotídeos.

[00038] Tipicamente, serão escolhidas condições estringentes nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M do íon de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração do íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos 30 °C para sondas curtas (por exemplo 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos 60 °C para sondas mais compridas (por exemplo, superiores a 50 nucleotídeos). Podem também ser conseguidas condições estringentes com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Condições de baixa estringência exemplificativas incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl a 1 M, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37 °C, e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) a 50 a 55 °C. Condições exemplificativas de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, NaCl a 1,0 M, 1% de SDS a 37 °C e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 a 60 °C. Condições exemplares de estringência elevada incluem hibridização em 50% de formamida, NaCl a 1 M, 1% de SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,1X de SSC a 60 até 65 °C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente inferior a cerca de 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[00039] A especificidade é tipicamente função de lavagens de pós-hibridização, sendo fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. O Tm reduz-se em cerca de 1 °C para cada 1% de discrepância; assim, o Tm, a hibridização, e/ou as condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar sequências de identidade desejada. Por exemplo, se forem procuradas sequências com uma identidade ≥ 90%, o Tm pode ser diminuída 10 °C. Geralmente são selecionadas condições estringentes a cerca de 5 °C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e o seu complemento a valores de força iônica e pH definidos. No entanto, condições extremamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4 °C inferior do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente estringentes pode utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10 °C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20 °C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm). Utilizando a equação, as composições de hibridização e lavagem, e o Tm desejado, os peritos na técnica entenderão que variações na estringência das soluções de hibridização e/ou de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de divergência resulta em um Tm inferior a 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), prefere-se aumentar a concentração de SSC de modo que possa ser utilizada uma temperatura mais elevada. Um guia exaustivo para a hibridização de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

Proteínas Isoladas e Suas Variantes e Fragmentos

[00040] As proteínas pesticidas são também abrangidas no âmbito da presente invenção. Por "proteína pesticida" entende-se uma proteína contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:21-32. Fragmentos, porções biologicamente ativas e suas variantes são também proporcionados e podem ser utilizados para realizar os métodos da presente invenção. Uma "proteína isolada" é utilizada para se referir a uma proteína que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira recombinante bacteriana ou de planta. Uma "proteína isolada" ou uma "proteína recombinante" é utilizada para se referir a uma proteína que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira recombinante bacteriana ou de planta.

[00041] "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" inclui fragmentos polipeptídicos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:21-32 e que apresentam atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser um polipeptídeo que tem um comprimento de, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas através de técnicas recombinantes e avaliadas relativamente à sua atividade pesticida. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J.of Economic Entomology 78:290-293; e a patente U.S. N° 5.743.477, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Conforme usado aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos das SEQ ID NO:21-32. No entanto, a invenção abrange outros fragmentos, como qualquer fragmento da proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, ou 300 aminoácidos.

[00042] Por "variantes" entendem-se proteínas ou polipeptídeos contendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer de SEQ ID NO:21-32. Variantes incluem, ainda, polipeptídeos codificados por uma molécula de ácidos nucleicos que hibridiza com a moléculas de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:1-20, ou seu complemento, sob condições estringentes. Variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos devido à mutagênese. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja, continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, retendo atividade pesticida. Em algumas modalidades, as variantes têm atividade melhorada relativamente à proteína nativa. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J.of Economic Entomology 78:290-293; e a patente U.S. N° 5.743.477, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00043] Genes bacterianos, tais como os genes axmi desta invenção, possuem muito frequentemente múltiplos códons de iniciação metionina na proximidade do início da grelha de leitura aberta. Frequentemente, a iniciação da tradução em um ou mais destes códons de iniciação conduzirá à geração de uma proteína funcional. Estes códons de iniciação podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como códon de iniciação, e proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, através deste evento o TTG codifica para uma metionina. Além disso, não é frequentemente determinado a priori quais destes códons são usados naturalmente na bactéria. Assim, entende-se que a utilização de um dos códons alternativos da metionina pode também conduzir à geração de proteínas pesticidas. Ver, por exemplo, o sítio de iniciação alternativo para a proteína AXMI223z apresentada em SEQ ID NO: 28 e o sítio de iniciação alternativo para a proteína AXMI224z apresentada em SEQ ID NO:30. Estas proteínas pesticidas são abrangidas na presente invenção e podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção. Deverá ser entendido que, quando expressa em plantas, será necessário alterar o códon alternativo de iniciação para ATG para uma tradução apropriada.

[00044] Anticorpos contra os polipeptídeos da presente invenção, ou contra suas variantes ou fragmentos, são também abrangidos. Métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NI; Patente U.S. N° 4.196.265).

Variantes Alteradas ou Melhoradas

[00045] Reconhece-se que as sequências de DNA de uma proteína pesticida podem ser alteradas através de vários métodos, e que estas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam para sequências de aminoácidos diferentes do que aquelas codificadas por uma proteína pesticida da presente invenção. Esta proteína pode ser alterada em vários modos incluindo substituições de aminoácidos, deleções, truncagens, e inserções de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO:21-32 incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155, ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Métodos para essas manipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, sequências de aminoácidos variantes de uma proteína pesticida podem ser preparadas através de mutações no DNA. Isto pode também ser conseguido por uma de várias formas de mutagênese e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade inseticida. No entanto, entende-se que a capacidade de uma proteína pesticida em conferir atividade pesticida pode ser melhorada pela utilização de tais técnicas nas composições desta invenção. Por exemplo, pode-se expressar a proteína pesticida em células hospedeiras que apresentam elevadas taxas de incorporação incorreta de bases durante a replicação de DNA, tais como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após propagação em tais estirpes, pode-se isolar o DNA de (por exemplo, através da preparação de DNA plasmídico, ou pela amplificação por PCR e clonagem do fragmento de PCR resultante em um vetor), cultura das mutações da proteína pesticida em uma estirpe não mutagênica, e identificação dos genes mutados com atividade pesticida, por exemplo através da modalidade de um teste para atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e utilizada em ensaios de ingestão. Ver, por exemplo, Marrone et al. (1985) J.of Economic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir colocar as plantas em contato com um ou mais pragas e determinar a capacidade da planta em sobreviver e/ou causar a morte das pragas. Exemplos de mutações que resultam no aumento da toxicidade são encontradas em Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

[00046] Alternativamente, podem ser realizadas alterações à sequência proteica de várias proteínas na extremidade amino- ou carbóxi-terminal sem afetar substancialmente a atividade. Estas podem incluir inserções, deleções, ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações por PCR que alteram ou estendem a sequência que codifica para a proteína em virtude da inclusão de sequências que codificam para aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências completas que codificam para proteínas, tais como aquelas utilizadas normalmente na técnica para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são frequentemente utilizadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática, ou epítopo para facilitar ou a purificação da proteína, ou a detecção da proteína, ou outras utilizações experimentais conhecidas na técnica, (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas, ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, o que neste último caso resulta frequentemente na glicosilação da proteína.

[00047] Sequências nucleotídicas e de aminoácidos variantes da presente invenção também abrangem sequências derivadas de procedimentos de mutagênese e recombinação tais como "arranjo de DNA". Com tal procedimento, podem ser utilizadas uma ou mais regiões que codificam para a proteína pesticida para criar uma nova proteína pesticida possuindo as propriedades desejadas. Deste modo, são geradas bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada compreendendo regiões de sequência que têm uma identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de forma homóloga in vitro ou in vivo. Por exemplo, utilizando esta abordagem, motivos de sequência que codificam para um domínio de interesse podem ser distribuídos aleatoriamente entre um gene pesticida da invenção e outros genes pesticidas conhecidos para obter um novo gene que codifique para uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para esse rearranjo de DNA são conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747- 10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336347; Zhanget al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; e Patente U.S. N° 5.605.793 e 5.837.458.

[00048] A troca ou a distribuição aleatória de domínios é outro mecanismo para a geração de proteínas de delta-endotoxina alteradas. Domínios podem ser permutados entre proteínas pesticidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com uma atividade pesticida ou espectro-alvo melhorado. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testá-las para atividade inseticida são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:2092320930; Rang et al. (91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vetores

[00049] Uma sequência pesticida da invenção pode ser proporcionada em um cassete de expressão para a expressão em uma planta de interesse. Por "cassete de expressão de planta" entende-se uma construção de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína a partir de uma fase de leitura aberta em uma célula de planta. Tipicamente estes contêm um promotor e uma sequência codificante. Frequentemente2, tais construções também irão conter uma região 3' não traduzida. Tais construções podem conter uma "sequência sinal" ou uma "sequência líder" para facilitar o direcionamento durante a tradução ou pós-tradução do peptídeo para certas estruturas intracelulares tais como o cloroplasto (ou outros plastídios), retículo endoplasmático, ou aparelho de Golgi.

[00050] Por "sequência sinal" entende-se uma sequência que é conhecida ou suspeita de resultar no transporte durante a tradução ou pós-tradução do peptídeo através da membrana celular. Em eucariotos, isto tipicamente envolve a secreção para o interior do aparelho de Golgi, com alguns resultando em glicosilação. Toxinas inseticidas de bactéria são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas, as quais são proteoliticamente ativadas no intestino da praga-alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência sinal está localizada na sequência nativa, ou pode ser derivada da uma sequência da invenção. Por "sequência líder" entende-se qualquer sequência que quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para despoletar o transporte cotradução da cadeia peptídica para uma organela subcelular. Assim, isso inclui sequências líder direcionadas ao transporte e/ou à glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídios incluindo cloroplastos, mitocôndrias, e semelhantes.

[00051] Por "vetor de transformação de plantas" entende-se uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula de planta. Tal molécula pode consistir de uma ou mais cassetes de expressão de plantas, e pode ser organizada em mais do que uma molécula de DNA "vetor". Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de plantas que utilizam dois vetores de DNA não contíguos que codificam todas as funções cis-atuantes e trans-atuantes necessárias para a transformação de células de plantas (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vetor" refere-se a uma construção de ácido nucleico desenhado para a transferência entre células hospedeiras diferentes. "Vetor de expressão" refere-se a um vetor que tem a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências ou fragmentos de DNA heterólogos em uma célula estranha. O cassete incluirá sequências regulatórias 5' e 3' operavelmente ligadas a uma sequência da invenção. Por "operavelmente ligada" entende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondendo à segunda sequência. Geralmente, operavelmente ligada significa que as sequências de ácidos nucleicos a serem ligadas são contíguas e, quando necessário para juntar duas regiões que codificam para a proteína, contíguas e na mesma fase de leitura aberta. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicionais podem ser fornecidos em cassetes de expressão múltipla.

[00052] "Promotor" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que funciona para direcionar a transcrição de uma sequência codificante a jusante. O promotor em conjunto com outras sequências de ácidos nucleicos de regulação da transcrição e da tradução (também denominadas "sequências de controle") são necessários para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

[00053] Tal cassete de expressão é proporcionada com uma pluralidade de sítios de restrição para a inserção da sequência pesticida a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

[00054] O cassete de expressão incluirá na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação da transcrição e da tradução (ou seja, um promotor), uma sequência de DNA da invenção e uma região de terminação da transcrição e da tradução (ou seja, região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo, ou análogo, ou estranho ou heterólogo, em relação à planta hospedeira e/ou à sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Quando o promotor é "nativo" ou "homólogo" relativamente à planta hospedeira, pretende-se que o promotor seja obtido na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é "estranho" ou "heterólogo" relativamente à sequência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja o promotor nativo ou que ocorre naturalmente para a sequência de DNA operavelmente ligada da invenção.

[00055] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA operavelmente ligada de interesse, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga para o promotor, a sequência de DNA de interesse, a planta hospedeira, ou qualquer combinação destes). Estão disponíveis regiões de terminação convenientes a partir do plasmídeo Ti de A.tumefaciens, tais como as regiões de terminação da sintase octopina e da sintase nopalina. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:12611272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[00056] Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para expressão acrescida na célula hospedeira transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferidos pela célula hospedeira para uma expressão melhorada, ou podem ser sintetizados utilizando códons a uma frequência de utilização de códons preferida da célula hospedeira. Geralmente, o conteúdo GC do gene será aumentado. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão da utilização de códons preferidos pelo hospedeiro. Estão disponíveis métodos na técnica para a síntese de genes preferidos por plantas. Ver, por exemplo, Patentes U.S. N° 5.380.831 e 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados por referência.

[00057] Em uma modalidade, a proteína pesticida é direcionada para o cloroplasto para expressão. Deste modo, nos casos em que a proteína pesticida não está inserida diretamente no cloroplasto, a cassete de expressão irá conter adicionalmente um ácido nucleico que codifica para um peptídeo de transporte para direcionar a proteína pesticida para os cloroplastos. Esses peptídeos transportadores são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[00058] O gene pesticida a ser direcionado para o cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto para ter em conta diferenças na utilização de códons entre o núcleo da planta e esta organela. Deste modo, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados utilizando códons preferidos por cloroplastos. Ver por exemplo, a patente U.S. N° 5.380.831, aqui incorporada por referência.

Transformação de Plantas

[00059] Os métodos da invenção envolvem a introdução de uma construção nucleotídica em uma planta. Por "introdução" entende-se apresentar à planta a construção nucleotídica de tal modo que a construção ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que um método particular para a introdução de uma construção nucleotídica seja utilizado, apenas que a construção nucleotídica ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para a introdução de construções nucleotídicas em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.

[00060] Por "planta" entendem-se plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e progênie das mesmas. As células de plantas podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calos, células em cultura em suspensão, protoplastos, células de folhas, células de raízes, células de floema, pólen).

[00061] "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ou plantas ou células ou tecidos "estavelmente transformados" referem-se a plantas que têm incorporadas ou integradas sequências de ácidos nucleicos ou fragmentos de DNA exógenos na célula de plantas. Estas sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas que são exógenas, ou não presentes na célula de planta não transformada, assim como aquelas que podem ser endógenas, ou presentes na célula de planta não transformada. "Heterólogo" geralmente refere-se a sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas à célula ou a parte do genoma nativo na qual estão presentes, e foram adicionadas à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou semelhantes.

[00062] As plantas transgênicas da invenção expressam uma ou mais das novas sequências de toxinas aqui divulgadas. Em várias modalidades, a planta transgênica também compreende um ou mais genes adicionais para resistência a insetos (por exemplo, Cry1, como membros das famílias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, e Cry1F; Cry2, como membros da família Cry2A; Cry9, como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, e Cry9F; etc.). Um perito na técnica entenderá que a planta transgênica pode conter qualquer gene que confira uma característica agronômica de interesse.

[00063] A transformação de células de plantas pode ser realizada por uma de várias técnicas conhecidas no estado da técnica. O gene pesticida da invenção pode ser modificado de modo a promover ou aumentar a expressão em células de plantas. Tipicamente, uma construção que expressa tal proteína iria conter um promotor para conduzir a transcrição do gene, assim como uma região 3' não traduzida para permitir a terminação da transcrição e poliadenilação. A organização de tais construções é bem conhecida no estado da técnica. Em alguns casos, pode ser útil modificar o gene de tal modo que o peptídeo resultante seja secretado, ou de outro modo direcionado dentro da célula de planta. Por exemplo, o gene pode ser modificado para conter um peptídeo sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Pode também ser preferível modificar o cassete de expressão de planta para conter um íntron, de tal modo que processamento do RNAm do íntron seja necessário para expressão.

[00064] Tipicamente, esse "cassete de expressão de planta" será introduzido em um "vetor de transformação de plantas". Este vetor de transformação de plantas poderá ser compreendido por um ou mais vetores de DNA necessários para conseguir a transformação de plantas. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de plantas que são compreendidos por mais do que um segmento de DNA contíguo. Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como "vetores binários". Vetores binários assim como vetores com plasmídeos auxiliares são frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para se conseguir a transformação eficiente são significativamente elevados, e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmídico que contém as sequências cis-atuantes necessárias para a transferência de T-DNA (tais como margem esquerda e margem direita), um marcador de seleção que é modificado para ser capaz de expressão em uma célula de planta, e um "gene de interesse" (um gene modificado para ser capaz de expressão em uma célula de planta para a qual se deseja a geração de plantas transgênicas). Também estão presentes neste vetor plasmídico sequências necessárias para a replicação bacteriana. As sequências cis-atuantes são distribuídas de modo a permitir a transferência eficiente para o interior de células de plantas e a expressão nas mesmas. Por exemplo, o marcador genético que pode ser selecionado e o gene pesticida são localizados entre as margens esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmídico contém os fatores trans-atuantes que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de planta. Este plasmídeo contém frequentemente funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção células de plantas por Agrobacterium, e a transferência de DNA por clivagem em sequências flanqueadoras e transferência de DNA mediada por vir, tal como é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vários tipos de cepas Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser utilizados para a transformação de plantas. O segundo vetor plasmídico não é necessário para transformar as plantas por outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

[00065] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem a transferência de DNA heterólogo em células de plantas alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguindo-se a aplicação de um nível limite máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador de seleção) para recuperar as células de planta transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Os explantes são tipicamente transferidos para um fornecimento fresco do mesmo meio e cultivados de forma rotineira. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em rebentos após serem colocadas em meio de regeneração suplementado com um nível limite máximo de agente de seleção. Os rebentos são então transferidos para um meio seletivo de enraizamento para a recuperação de rebentos com enraizamento ou plântulas. A plântula transgênica então cresce até se tornar uma planta madura e produzir sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um fornecimento fresco do mesmo meio e cultivados de forma rotineira. Uma descrição geral das técnicas e dos métodos para gerar plantas transgênicas pode ser encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. O material transformado contém muitas células; tanto células transformadas quanto células não transformadas estão presentes em qualquer peça de calo ou tecido ou grupo de células alvo sujeitos. A capacidade de matar células não transformadas e permitir a proliferação de células transformadas resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade de remover células não transformadas é uma limitação para a recuperação rápida de células de plantas transformadas e a geração de plantas transgênicas com sucesso.

[00066] Os protocolos de transformação assim como os protocolos para a introdução de sequências nucleotídicas em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, que é o alvo da transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos, incluindo, mas sem limitação, a microinjeção, a eletroporação, a transferência genética direta, a introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células de plantas (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células de plantas com DNA estranho heterólogo aderido a partículas, aceleração balística de partículas, transformação por feixe de aerossol (Requerimento Publicado U.S. N° 20010026941; Patente U.S. N° 4.945.050; Publicação Internacional N° WO 91/00915; Requerimento Publicado U.S. N° 2002015066), transformação com Lec1, e vários outros métodos de mediação direta sem partículas para transferir DNA.

[00067] Métodos para a transformação de cloroplastos são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método baseia-se na entrega de DNA contendo um marcador de seleção com uma arma de partículas e direcionamento do DNA ao genoma plastídico por recombinação homóloga. Além disso, a transformação do plastídio pode ser realizada por transativação de um transgene inativo do plastídio por expressão preferencial em um tecido de uma RNA polimerase direcionada ao plastídio e codificada por genes nucleares. Tal sistema foi apresentado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:7301-7305.

[00068] Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é então necessário aplicar um nível limite máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células putativamente transformadas que sobrevivem a este tratamento de seleção transferindo regularmente para um meio fresco. Através de passagem contínua e teste com a seleção apropriada, são identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmídico. Podem então ser utilizados métodos moleculares e bioquímicos para confirmar a presença do gene heterólogo de interesse integrado no genoma da planta transgênica.

[00069] As células que foram transformadas podem ser crescidas para originar plantas de acordo com métodos convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem ser então crescidas, e ou polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e o híbrido resultante com expressão constitutiva da característica fenotípica desejada pode ser identificado. Podem ser crescidas duas ou mais gerações para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada é mantida com estabilidade e herdada e depois as sementes recolhidas para assegurar que foi conseguida a expressão da característica fenotípica desejada. Deste modo, a presente invenção proporciona sementes transformadas (também referidas como "sementes transgênicas") com uma construção nucleotídica da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporada no seu genoma.

Avaliação da Transformação da Planta

[00070] Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma das plantas é confirmada por vários métodos tais como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.

[00071] A análise por PCR é um método rápido para rastrear células, tecidos, ou rebentos transformados relativamente à presença de um gene incorporado em uma fase precoce antes de transplantar para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI). A reação de PCR é realizada utilizando-se iniciadores oligonucleotídicos específicos para o gene de interesse ou uma região do vetor Agrobacterium, etc.

[00072] A transformação de plantas pode ser confirmada por análise de "Southern blot" de DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, resolvido em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou "blot" é então sondada com, por exemplo, um fragmento de DNA alvo marcado radioativamente com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[00073] Na análise por "Northern blot", o RNA é isolado de tecidos específicos de um transformante, fraccionado em um gel de agarose e formaldeído, e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos convencionais que são rotineiramente utilizados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificado pelo gene pesticida é então testada através da hibridização do filtro a uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida, por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[00074] Podem ser realizados "western blot", ensaios bioquímicos e afins das plantas transgênicas para confirmar a presença da proteína codificada pelo gene pesticida por procedimentos convencionais (Sambrook e Russell, 2001, supra) utilizando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína pesticida.

Atividade Pesticida em Plantas

[00075] Em outro aspeto da invenção, podem-se gerar plantas transgênicas que expressam uma proteína pesticida que tem atividade pesticida. Podem ser utilizados a título de exemplo os métodos descritos acima para gerar plantas transgênicas, mas o modo com o qual são geradas plantas transgênicas não é crítico para esta invenção. Métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, e métodos não mediados por partícula podem ser utilizados à discrição do experimentador. As plantas que expressam uma proteína pesticida podem ser isoladas através de métodos convencionais descritos na técnica, por exemplo, por transformação de calos, seleção dos calos transformados, e regeneração de plantas férteis a partir de tais calos transgênicos. Em tal processo, pode ser utilizado qualquer gene como um marcador de seleção desde que a sua expressão nas células de plantas confira a capacidade de identificar ou selecionar células transformadas.

[00076] Foram desenvolvidos diversos marcadores para utilização com células de plantas tais como a resistência ao cloramfenicol, ao aminoglicosídeo G418, à higromicina, ou outros semelhantes. Outros genes que codificam para um produto envolvido no metabolismo de cloroplastos podem também ser utilizados como marcadores de seleção. Por exemplo, genes que proporcionam resistência a herbicidas de plantas tais como glifosato, bromoxinil, ou imidazolinona podem ser particularmente úteis. Tais genes foram relatados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene da nitrilase de resistência ao bromoxinil); e Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gene de resistência a imidazolinona AHAS). Adicionalmente, os genes aqui divulgados são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou de plantas. Os métodos para a detecção da presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), semente, célula de planta, propágulo, embrião ou progênie da mesma são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada através do teste da sua atividade pesticida.

[00077] Plantas férteis que expressam uma delta-endotoxina podem ser testadas para atividade pesticida, e as plantas que apresentam uma atividade ótima selecionadas para melhoramento suplementar. Estão disponíveis na técnica métodos para testar a atividade de pragas. Geralmente, a proteína é misturada e utilizada em ensaios de ingestão. Ver, por exemplo, Marrone et al. (1985) J.of Economic Entomology 78:290-293.

[00078] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas sem limitação a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não se limitam a, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentos, batatas, algodão, arroz, soja, beterraba, cana de açúcar, tabaco, cevada e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, milho miúdo, açafrão, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, ananás, citrinos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, legumes e hortaliças, plantas ornamentais, e coníferas.

[00079] Legumes e hortaliças incluem, mas não se limitam a, tomates, alface, feijão verde, feijão de lima, ervilhas e membros do gênero Curcumistais como pepino, melão cantaloupe e melão de casca de carvalho. Plantas ornamentais incluem, mas não se limitam a, azaleias, hortênsias, hibiscos, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, poinsétias, e crisântemos. Preferentemente, plantas da presente invenção são plantas cultivadas (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentos, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza, etc.).

Utilização em Controle Pesticida

[00080] São conhecidos na técnica métodos gerais para a utilização de cepas que compreendem uma sequência nucleotídica da presente invenção, ou uma variante desta, no controle pesticida ou na modificação de outros organismos como agentes pesticidas. Ver, por exemplo, a patente U.S. N° 5.039.523 e EP 0480762A2.

[00081] As cepas de Bacillus contendo uma sequência nucleotídica da presente invenção, ou uma variante desta, ou os microrganismos que foram geneticamente alterados para conter um gene e proteína pesticida podem ser utilizados para proteger cultivos e produtos agrícolas de pragas. Em um aspeto da invenção, células inteiras, ou seja não lisadas, de um organismo produtor de uma toxina (pesticida) são tratadas com reagentes para prolongar a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente do(s) inseto(s) alvo.

[00082] Alternativamente, o pesticida é produzido através da introdução de um gene pesticida em um hospedeiro celular. A expressão do gene pesticida resulta, direta ou indiretamente, em uma produção intracelular e manutenção do pesticida. Em um aspeto desta invenção, estas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente do(s) inseto(s) alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Estes pesticidas naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para aplicação ao ambiente que alberga a praga-alvo, por exemplo, solo, água, e folhagem de plantas. Ver, por exemplo, EPA 0192319, e as referências aí citadas. Alternativamente, podem-se formular as células que expressam um gene desta invenção para, por exemplo, permitir a aplicação do material resultante como um pesticida.

[00083] Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados à área do cultivo ou à planta a ser tratada, em simultâneo ou em sequência, com outros compostos. Estes compostos podem ser fertilizantes, herbicidas, crioprotetores, surfactantes, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros e/ou formulações de veículo de liberação controlada ou biodegradáveis que permitem o doseamento prolongado da área alvo após uma única aplicação da formulação. Podem também ser herbicidas, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bacteriocidas, nematocidas, moluscicidas seletivos ou misturas de várias destas preparações, se desejado, em conjunto com mais veículos aceitáveis em agricultura, surfactantes ou adjuvantes que promovem a aplicação normalmente empregues na técnica da formulação. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalmente utilizadas em tecnologia de formulações, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes molhantes, agentes promotores da adesividade, aglutinantes ou fertilizantes. Igualmente, as formulações podem ser preparadas em "iscas" comestíveis ou processadas em "armadilhas" para pragas para permitir a alimentação ou ingestão por uma praga-alvo da formulação pesticida.

[00084] Os métodos para a aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que contém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacterianas da presente invenção incluem a aplicação em folhas, revestimento de sementes e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[00085] A composição pode ser formulada na forma de um pó, poeira, grãos, grânulos, spray, emulsão, coloide, solução ou semelhante, e pode ser preparada por métodos convencionais tais como dissecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas estas composições que contêm pelo menos um destes polipeptídeos pesticidas, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[00086] Pragas de lepidópteros, hemípteros, dípteros, ou coleópteros podem ser mortas ou os seus números reduzidos em uma dada área pelos métodos da invenção, ou podem ser aplicados profilaticamente a uma área ambiental para prevenir a infestação por uma praga susceptível. Preferentemente, a praga ingere, ou entra em contato com, uma quantidade pesticida eficaz do polipeptídeo. Por "quantidade pesticida eficaz" entende-se uma quantidade de pesticida que é capaz de causar a morte a pelo menos uma praga, ou de reduzir significativamente o crescimento da praga, a sua alimentação, ou o seu desenvolvimento fisiológico normal. Esta quantidade irá variar dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, a localização, a planta, o cultivo, ou o local agrícola a ser tratado, as condições ambientais, e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição polipeptídica com atividade pesticida eficaz. As formulações podem também variar relativamente às condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou gravidade da infestação pela praga.

[00087] As composições pesticidas descritas podem ser preparadas através da formulação ou das células bacterianas, suspensão de cristais e/ou esporos, ou do componente proteico isolado com o veículo aceitável em agricultura desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração por um meio apropriado tal como liofilizadas, dessecadas, ou em um veículo, meio ou diluente adequado aquoso, tal como solução salina ou outro tampão. As composições formuladas podem ser na forma de um pó ou de um material granular, ou uma suspensão em um óleo (vegetal ou mineral), ou água ou emulsões óleo/água, ou na forma de um pó molhável, ou em combinação com qualquer outro material veículo adequado para aplicação agrícola. Veículos adequados para aplicação agrícola podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo "veículo aceitável para aplicação agrícola" cobre todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, agentes promotores de adesividade, aglutinantes, etc. que são normalmente utilizados em tecnologia de formulação de pesticidas; estes são bem conhecidos daqueles peritos em formulação pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparados por diversos meios, por exemplo, misturando, combinando e/ou moendo a composição pesticida com adjuvantes adequados utilizando técnicas de formulação convencionais. Formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na patente U.S. N° 6.468.523, aqui incorporada por referência.

[00088] "Praga" inclui, mas não se limita a, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos, e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera e Diptera.

[00089] A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. A subordem Adephaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, enquanto a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae e Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A superfamília Staphylinoidea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae. A superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias Elateridae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambycidae. A superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e Scolytidae.

[00090] A ordem Diptera inclui as subordens Nematocera, Brachycera, e Cyclorrhapha. A subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae e Cecidomyiidae. A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae e Dolichopodidae. A subordem Cyclorrhapha inclui as divisões Aschiza e Aschiza. A divisão Aschiza inclui as famílias Phoridae, Syrphidae e Conopidae. A divisão Aschiza inclui as seções Acalyptratae e Calyptratae. A seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae e Drosophilidae. A seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae e Sarcophagidae.

[00091] A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae e Tineidae.

[00092] Pragas de insetos da invenção para os cultivos principais incluem: Milho: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeia; Agrotis ipsilon, agrótis preto; Helicoverpa zea, górdio do milho; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Diatraea grandiosella, broca do milho do sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, broca da cana do milho; Diatraea saccharalis, broca da cana de açúcar; Diabrotica virgifera, larva alfinete do oeste; Diabrotica longicornis barberi, larva alfinete do norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, larva alfinete do sul; Melanotus spp., larva de elaterídeo; Cyclocephala borealis, besouro do norte (larva branca); Cyclocephala immaculata, besouro do sul (larva branca); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, besourinho do milho; Sphenophorus maidis, gorgulho do milho; Rhopalosiphum maidis, pulgão da folha do milho; Anuraphis maidiradicis, pulgão da raíz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramíneas; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, larvas da mosca da semente do milho; Agromyza parvicornis, mosca minadora do milho; Anaphothrips obscrurus, tripes das ervas; Solenopsis milesta, formiga ladra; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Sorgo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Helicoverpa zea, górdio do milho; Elasmopalpus lignosellus, broca da cana do milho; Feltia subterranea, rosca; Phyllophaga crinita, coró; Eleodes, Conoderus e Aeolus spp., larvas de elaterídeo; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Chaetocnema pulicaria, besourinho do milho; Sphenophorus maidis, gorgulho do milho; Rhopalosiphum maidis; pulgão da folha do milho; Sipha flava, pulgão amarelo; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramíneas; Contarinia sorghicola, mosca do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta militar; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer; Agrotis orthogonia, western cutworm; Elasmopalpus lignosellus, broca da cana do milho; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Hypera punctata, gorgulho da folha de treco; Diabrotica undecimpunctata howardi, larva alfinete do sul; pulgão russo do trigo; Schizaphis graminum, pulgão verde; Macrosiphum avenae, pulgão da espiga; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca de Hessian; Sitodiplosis mosellana, mosquito do trigo; Meromyza americana, larva do caule de trigo; Hylemya coarctata, mosca do bolbo do trigo; Frankliniella fusca, tripes do tabaco; Cephus cinctus, vespão do caule de trigo; Aceria tulipae, Ácaro-do-chochamento; Girassol: Suleima helianthana, traça do rebento de girassol; Homoeosoma electellum, traça do girassol; Zygogramma exclamationis, besouro do girassol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito da semente de girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta da maçã; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada do algodão; Anthonomus grandis, bicudo do algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão do algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulga do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, percevejo; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripes da cebola; Franklinkiella fusca, tripes do tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana de açúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta militar; Helicoverpa zea, górdio do milho; Colaspis brunnea, besouro da uva; Lissorhoptrus oryzophilus, bicheira da raiz norte americana; Sitophilus oryzae, gorgulho do arroz; Nephotettix nigropictus, cigarrinha do arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramíneas; Acrosternum hilare, percevejo verde; Soja: Pseudoplusia includens, lagarta falsa medideira; Anticarsia gemmatalis, lagarta da soja; Plathypena scabra, larva verde do trevo; Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho; Heliothis virescens, lagarta da maçã; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Epilachna varivestis, besouro mexicano do feijão; Myzus persicae, pulgão verde claro; Empoasca fabae, inseto sugador da batata; Acrosternum hilare, percevejo verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, larvas da mosca da semente do milho; Sericothrips variabilis, tripes da soja; Thrips tabaci, tripes da cebola; Tetranychus turkestani, ácaro do morango; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, agrótis preto; Schizaphis graminum, pulgão verde; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramíneas; Acrosternum hilare, percevejo verde; Euschistus servus, percevejo marrom neártico; Delia platura, larvas da mosca da semente do milho; Mayetiola destructor, mosca de Hessian; Petrobia latens, traça marrom do trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgão do repolho; Phyllotreta cruciferae, besouro; Mamestra configurata, lagarta de Bertha; Plutella xylostella, traça das crucíferas; Delia ssp., larvas das raízes.

[00093] Os nematódeos incluem nematódeos parasitas tais como nematódeos dos nódulos das raízes, de cisto e de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos de cisto, incluindo, mas sem estarem limitados a, Heterodera glycines (nematódeo de cisto da soja); Heterodera schachtii (nematódeo de cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo de cisto de cereal); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeo de cisto da batata). Nematoides de lesão incluem Pratylenchus spp.

Métodos para aumentar o rendimento da planta

[00094] São proporcionados métodos para aumentar o rendimento da planta. Os métodos compreendem proporcionar uma planta ou célula de planta que expressa um polinucleotídeo que codifica para a sequência polipeptídica pesticida aqui divulgada, e crescer a planta ou sua semente em um campo infestado por uma praga contra a qual o dito polipeptídeo possui atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo possui atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros ou nematódeos, e o dito campo é infestado por uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros ou nematódeos. Tal como aqui definido, o "rendimento" da planta refere-se à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por "biomassa" entende-se qualquer produto da planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto da planta medido. O aumento do rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa da folha da planta pode aumentar o rendimento dos vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Além disso, o aumento da biomassa da folha pode ser utilizado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados da planta. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um aumento de 30%, de pelo menos 50%, de pelo menos 70%, de pelo menos de 100% ou superior no rendimento em comparação com uma planta que não expressa a sequência pesticida.

[00095] As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas, ou fungicidas. Exemplos de composições químicas incluem: Herbicidas para Frutos/Legumes e Hortaliças: Atrazina, Bromacil, Diurão, Glifosato, Linurão, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halosulfurão Gowan, Paraquato, Propizamida, Setoxidime, Butafenacil, Halosulfurão, Indaziflame; Inseticidas para Frutos/Legumes e Hortaliças: Aldicarbe, Bacillus thuringiensis, Carbaril, Carbofurão, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinão, Malatião, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novalurão, Cromafenozida, Tiaclopride, Dinotefurão, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofena, Gama-cialotrina, Espiromesifena, Espinosade, Rinaxipir, Ciazipir, Spinoteram, Triflumurão, Espirotetramate, Imidaclopride, Flubendiamida, Tiodicarbe, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofena, Cianopirafena, Imidaclopride, Clotianidina, Tiamethoxame, Espinotorame, Tiodicarbe, Flonicamida, Metiocarbe, Benzoato de Emamectina, Indoxacarbe, Foztiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Óxido de fenbutatina, Hextiazox, Metomil, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; Fungicidas para Frutos/Legumes e Hortaliças:

[00096] Carbendazima, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato-metil, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluaziname, Fosetil, Iprodiona, Cresoxima-metil, Metalaxil/mefenoxame, Trifloxistrobina, Etaboxame, Iprovalicarbe, Trifloxistrobina, Fenhexamida, Fumarato de oxpoconazole, Ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas para Cereais: Isoproturão, Bromoxinil, Ioxinil, Fenoxis, Clorsulfurão, Clodinafope, Diclofope, Diflufenicano, Fenoxaprope, Florasulame, Fluroxipir, Metsulfurão, Triasulfurão, Flucarbazona, Iodosulfurão, Propoxicarbazone, Picolinafen, Mesosulfurão, Beflubutamida, Pinoxaden, Amidosulfurão, Tifensulfurão, Tribenurão, Flupirsulfurão, Sulfosulfurão, Pirasulfotole, Piroxsulame, Flufenacete, Tralcoxidima, Piroxasulfona; Fungicidas para Cereais: Carbendazima, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazole, Ciprodinil, Fenpropimorfe, Epoxiconazole, Cresoxima-metil, Quinoxifena, Tebuconazole, Trifloxistrobina, Simeconazole, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazole, Fluoxastrobina; Inseticidas para Cereais: Dimetoato, Lambda-cialtrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurão, Clorfirifos, Metamidofos, Oxidemetão-metil, Pirimicarbe, Metiocarbe; Herbicidas para Milho: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Gliphosato, Isoxaflutole, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfurão, Primisulfurão, Rimsulfurão, Sulcotriona, Foramsulfurão, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacete, Piroxasulfona; Inseticidas para Milho: Carbofurão, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidaclopride, Lambda-Ci-halotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxame, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurão, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenurão, Triflumorão, Teflutrina, Tebupirimfos, Etiprole, Ciazipir, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarbe, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas para Milho: Fenitropano, Tirame, Protioconazole, Tebuconazole, Trifloxistrobina; Herbicidas para Arroz: Butacloro, Propanilo, Azimsulfurão, Bensulfurão, Cialofope, Daimurão, Fentrazamida, Imazosulfurão, Mefenacete, Oxaziclomefona, Pirazosulfurão, Piributicarbe, Quincloraque, Tiobencarbe, Indanofane, Flufenacete, Fentrazamida, Halosulfurão, Oxaziclomefona, Benzobiciclona, Piriftalide, Penoxsulame, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfurão, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprope, Pirimisulfano; Inseticidas para Arroz: Diazinão, Fenitrotiona, Fenobucarbe, Monocrotofos, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidaclopride, Isoprocarbe, Tiaclopride, Cromafenozide, Tiaclopride, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprole, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamipride, Tiametoxame, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartape, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoroetil)amino]furan-2(5H)-ona, Carbofurão, Benfuracarbe; Fungicidas para Arroz: Tiofanato-metil, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolana, Pencicurão, Probenazole, Piroquilona, Triciclazole, Trifloxistrobina, Diclocimete, Fenoxanil, Simeconazole, Tiadinil; Herbicidas para Algodão: Diurão, Fluometurão, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodime, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazona, Pendimetalina, Piritiobac-sódio, Trifloxisulfurão, Tepraloxidime, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurão; Inseticidas para Algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malationa, Monocrotofos, Abamectina, Acetamipride, Benzoato de Emamectina, Imidaclopride, Indoxacarbe, Lambda-Cialotrina, Espinosade, Tiocarbe, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumurão, Rinaxipir, beta-ciflutrina, Espirotetramate,

[00097] Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, gamma Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoroetil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiocarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endosulfano; Fungicidas para algodão: Etridiazole, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas para Soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimurão-Etil, Cloransulame-Metil, Fenoxaprope, Fomesafeno, Fluazifope, Glifosato, Imazamox, Imazaquina, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidima, Glufosinato; Insecticidas para soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paratião, Tiocarbe, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramate, Espinodiclofeno, Triflumurão, Flonicamida, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas para Soja: Azoxistrobina, Ciproconazole, Epoxiconazole, Flutriafole, Piraclostrobina, Tebuconazole, Trifloxistrobina, Protioconazole, Tetraconazole; Herbicidas de Beterraba: Cloridazona, Desmedifame, Etofumesato, Fenmedifame, Trialato, Clopiralida, Fluazifope, Lenacil, Metamitrão, Quinmeraque, Cicloxidime, Triflusulfurão, Tepraloxidime, Quizalofope; Inseticidas de Beterraba: Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma/lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurão; Herbicidas para Canola: Clopiralid, Diclofope, Fluazifope, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina Etametsulfurão, Quinmeraque, Quizalofope, Cletodime, Tepraloxidime; Fungicidas para Canola: Azoxistrobina, Carbendazime, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas para Canola:

[00098] Carbofurano, Organofosfatos, Piretroides, Tiaclopride, Deltametrina, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Acetamipride, Dinetofurano, ß-Ciflutrina, gamma e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprole, Espinosade, Espinotorame, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

[00099] Os seguintes exemplos são apresentados para efeitos de ilustração e não como modo de limitação.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS Exemplo 1. Descoberta de novos genes pesticidas de Bacillus thuringiensis

[000100] Genes pesticidas novos foram identificados a partir da cepa bacteriana Zj22 por meio das seguintes etapas:

• • Preparação de DNA extracromossômico da estirpe. DNA extracromossômico contém uma mistura de alguns ou todos os seguintes: plasmídeos de vários tamanhos; cromossomos fágicos; fragmentos de DNA genômico não separados pelo protocolo de purificação; outras moléculas extracromossômicas não caraterizadas.
• • Corte mecânico ou enzimático do DNA extracromossômico para gerar fragmentos com uma distribuição de comprimentos.
• • Sequenciação do DNA fragmentado por métodos de pirossequenciação de elevado rendimento.
• • Identificação de genes de toxina putativos através de homologia e/ou outras análises computacionais.
• • Quando necessário, acabamento das sequências do gene de interesse por uma de várias estratégias de PCR ou de clonagem (por exemplo, TAIL-PCR).

[000101] O gene de toxina aqui divulgado é amplificado por PCR a partir de pAX980 e o produto da reação de PCR é clonado no vetor de expressão em Bacillus pAX916, ou outro vetor apropriado, por métodos bem conhecidos na técnica. A cepa Bacillus resultante, que contém o vetor com o gene axmi, é cultivada em um meio de crescimento convencional, tal como meio CYS (10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extrato de levedura; 6 g/l de KH2PO4; 14 g/l de K2HPO4; MgSO4 0,5 mM; MnCl2 0,05 mM; FeSO4 0,05 mM) até que a formação de esporos seja evidente por análise ao microscópio. Amostras são preparadas e testadas para atividade em bioensaios.

Exemplo 2. Ensaios de atividade pesticida

[000102] As sequencias nucleotídicas da invenção podem ser testadas para a sua capacidade de produzir proteínas pesticidas. A capacidade de uma proteína pesticida atuar como pesticida em uma praga é muitas vezes avaliada de vários modos. Um modo bem conhecido na técnica é realizar um teste de ingestão. Em um destes testes de ingestão, a praga é exposta a uma amostra contendo ou compostos a serem testados, ou amostras controle. Isto é frequentemente realizado colocando o material a ser testado, ou uma diluição adequada de tal material em um material que a praga irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode estar na forma de um líquido, um sólido ou uma suspensão. O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e depois deixar-se secar. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial derretida, e depois servido na câmara de teste. A câmara de teste pode ser, por exemplo, uma taça, um prato, ou um poço de uma microplaca.

[000103] Testes para pragas sugadoras (por exemplo, afídeos) podem envolver a separação do material a testar do inseto por intermédio de uma partição, idealmente uma porção que pode ser perfurada pelas partes sugadoras da boca do inseto sugador, para permitir a ingestão do material a testar. O material a testar é frequentemente misturado com um estimulador da ingestão, tal como sacarose, para promover a ingestão do composto a testar.

[000104] Outros tipos de ensaios podem incluir a microinjeção do material a testar na boca, ou no intestino da praga, assim como o desenvolvimento de plantas transgênicas, seguindo-se um teste para a capacidade da praga em se alimentar da planta transgênica. O teste da planta pode envolver o isolamento das partes das plantas normalmente consumidas, por exemplo, pequenas gaiolas presas a uma folha, ou o isolamento de plantas inteiras em gaiolas contendo insetos.

[000105] Outros métodos e abordagens para testar pragas são conhecidos na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson, J. L. & H. K. Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods.CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, são descritos de forma comum testes nas revistas Arthropod Management Tests e Journal of Economic Entomology ou em discussão com membros da Entomological Society of America (ESA).

[000106] Em algumas modalidades, as regiões de DNA que codificam para os domínios da toxina de delta-endotoxinas divulgadas aqui são clonadas no vetor de expressão em E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE que codifica para a proteína ligante de maltose (MBP). Estas fusões, que estão na mesma fase de leitura, resultam na expressão de proteínas de fusão MBP-Axmi em E. coli.

[000107] Para a expressão em E.coli, transformam-se BL21*DE3 com plasmídeos individuais. Inoculam-se colônias isoladas em LB suplementado com carbenicilina e glicose, e cresceu-se durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, inocula-se meio fresco com 1% da cultura crescida durante a noite e cresce-se a 37 °C até atingir a fase logarítmica. Subsequentemente, as culturas são induzidas com IPTG 0,3 mM durante a noite a 20°C. Cada pélete de células é suspendido em tampão Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 + NaCl 200 mM + DTT 1 mM + inibidores de protease, e sonicado. Análise por meio de SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a expressão das proteínas de fusão.

[000108] Extratos totais livres de células são passados por uma coluna de amilose ligada à cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) para purificação por afinidade das proteínas de fusão MBP-axmi. As proteínas de fusão ligadas à resina são eluídas com solução de maltose 10 mM. As proteínas de fusão purificadas são então clivadas com fator Xa ou tripsina para remover o marcador amino terminal MBP da proteína Axmi. A clivagem e solubilidade das proteínas podem ser determinadas por SDS-PAGE.

Exemplo 3. Expressão e purificação de genes axmiz

[000109] Versões truncadas de axmi221z e axmi222z foram clonadas no vetor de expressão da proteína ligante de maltose (MBP), resultando em pAX5092 e pAX5093, respectivamente. A expressão da proteína de fusão resultante foi induzida por meio de IPTG. A proteína foi então purificada em uma coluna de maltose e foi clivada com Fator Xa de proteases para gerar a proteína purificada não marcada. As proteínas 6-his axmi221z e axmi222z truncadas também foram purificadas em uma coluna de cobalto e submetidas a bioensaios.

[000110] Versões completas e truncadas de alguns genes foram clonadas no vetor pRSF-1b como mostrado na Tabela 2. Em virtude da clonagem em esse vetor, a proteína expressa resultante contém seis resíduos histidina N-terminais adicionais.

[000111] As regiões de DNA que codificam para os domínios da toxina de alguns genes foram clonadas separadamente em um vetor de expressão em E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE que codifica para a proteína ligante de maltose (MBP) como mostrado na Tabela 2. Estas fusões, que estão na mesma fase de leitura, resultaram na expressão de proteínas de fusão MBP-AXMI em E. coli. Cada uma das proteínas produzidas a partir das construções acima foi testada em bioensaios na forma de um pélete concentrado 10x.

[000112] Para a expressão da proteína em E.coli, transformou-se BL21*DE3 com plasmídeos individuais. Inoculou-se uma colônia isolada em meio LB suplementado com carbenicilina e glicose, e cresceu-se durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, inoculou-se meio fresco com 1% da cultura crescida durante a noite e cresceu-se a 37 °C até atingir a fase logarítmica. Subsequentemente, as culturas foram induzidas com IPTG 0,3 mM durante a noite a 20°C. Cada pélete de células foi suspendido em tampão Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 + NaCl 200 mM + DTT 1 mM + inibidores de proteases, e sonicado. Uma análise por SDS-PAGE confirmou a expressão de proteínas de fusão.

[000113] Extratos livres de células totais foram carregados em uma FPLC equipada com uma coluna de amilose, e as proteínas de fusão MBP-AXMI foram purificadas por cromatografia de afinidade. A proteína de fusão ligada à resina foi eluida com solução de maltose 10 mM. As proteínas de fusão purificadas foram então clivadas com fator Xa ou tripsina para remover o marcador amino terminal MBP da proteína AXMIz. A clivagem e solubilidade das proteínas foram determinadas por SDS-PAGE.

Exemplo 4. Atividade de proteínas expressas a partir de genes de axmiz em Bioensaios

[000114] O bioensaio dos genes Axmiz expressos resultou em observação das seguintes atividades em pragas de insetos:

BCW: Lagarta-rosca
CPB: Besouro da batata
DBM: Traça-das-crucíferas
ECB: Broca Europeia do Milho
FAW: Lagarta-do cartucho do milho
Hv: Lagarta-da-maçã
Hz: Lagarta-da-espiga-do-milho
SCB: Broca do milho do sul
SWCB: Broca do Milho do Sudoeste
VBC: Lagarta da Soja

Exemplo 5. Colocação dos Genes em um Vetor para Expressão em Plantas

[000115] As regiões codificantes da invenção estão ligadas com sequências promotoras e terminadoras apropriadas para expressão em plantas. Tais sequências são bem conhecidas na técnica e podem incluir o promotor da actina do arroz ou o promotor da ubiquitina do milho para expressão em monocotiledôneas, o promotor UBQ3 ou o promotor CaMV 35S de Arabidopsis para expressão em dicotiledôneas, e os terminadores nos ou PinII. Técnicas para a produção e a confirmação de construtos promotor - gene - terminador são também bem conhecidas na técnica.

[000116] Em um aspeto da invenção, são desenhadas e geradas sequências de DNA sintéticas. Essas sequências sintéticas têm uma sequência nucleotídica alterada relativamente à sequência paterna, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à sequência paterna. Ver, por exemplo, a Tabela 4.

[000117] Em outro aspeto da invenção, versões modificadas dos genes sintéticos são desenhadas de tal modo que o peptídeo resultante está direcionado para uma organela de planta, tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto. Sequências peptídicas que sabidamente resultam em direcionamento de proteínas de fusão a organelas de planta são conhecidas na técnica. Por exemplo, a região N-terminal do gene da fosfatase ácida de Tremoço Branco Lupinus albus (Genebank® ID GI:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) é conhecida na técnica por resultar no direcionamento de proteínas heterólogas para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção no retículo endoplasmático compreendendo o peptídeo de extremidade N lisina-ácido aspártico-ácido glutâmico-leucina (ou seja, o motivo "KDEL", SEQ ID NO: 33) na extremidade C, a proteína de fusão será direcionada para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão não possui uma sequência para direcionamento ao retículo endoplasmático na extremidade C-terminal, a proteína será direcionada para o retículo endoplasmático, mas acabará por ser sequestrada no apoplasto.

[000118] Assim, este gene codifica para uma proteína de fusão que contém os trinta e um aminoácidos de extremidade N do gene da fosfatase ácida do Tremoço Branco Lupinus albus (GENBANK® ID GI: 14276838, Miller et al., 2001, supra) fundida com a sequência de aminoácido da extremidade N da invenção, assim como a sequência KDEL da extremidade C. Assim, prevê-se que a proteína resultante se direciona para o retículo endoplasmático da planta aquando da expressão em uma célula de planta.

[000119] Os cassetes de expressão de plantas descritos acima são combinados com um marcador de seleção apropriado para ajudar na seleção de células transformadas e tecidos, e ligados em vetores de transformação de plantas. Estes podem incluir vetores binários de transformação mediados por Agrobacterium ou vetores plasmídicos simples para transformação por aerossol ou biolística.

Exemplo 6. Transformação de Células de Milho com os genes de proteína pesticida aqui descritos

[000120] São recolhidas espigas 8-12 dias após a polinização. São isolados embriões das espigas, e estes embriões com um tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para utilização para transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo virado para cima em um meio de incubação adequado, tal como meio DN62A5S (3,98 g/L Sais N6; 1 mL/L (de 1000x Solução mãe) Vitaminas N6; 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Mio-inositol; 1,4 g/L L-Prolina; 100 mg/L Casaminoácidos; 50 g/L sacarose; 1 mL/L (de 1 mg/mL Solução mãe) 2,4-D). No entanto, meios e sais diferentes de DN62A5S são adequados e são conhecidos na técnica. Embriões são incubados durante a noite a 25°C no escuro. No entanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite.

[000121] Os explantes resultantes são transferidos para quadrados de uma rede (30-40 por placa), transferidos para meio osmótico durante 30-45 minutos, depois transferidos para uma placa de bombardeamento (ver, por exemplo, PCT Publicação No. WO/0138514 e Patente U.S. No. 5,240,842).

[000122] Construções de DNA concebidas para os genes da invenção em células de plantas são aceleradas em tecido de planta usando um acelerador com bombardeamento de aerossol, usando condições essencialmente como descritas na Publicação PCT N° WO/0138514. Após o bombardeamento, os embriões são incubados por cerca de 30 minutos em meio osmótico, e são colocados sobre meio de incubação durante a noite a 25°C no escuro. Para evitar explantes bombardeados indevidamente danificados, são incubados durante pelo menos 24 horas antes da transferência para meio de recuperação. Os embriões são então espalhados em um meio de período de recuperação, durante 5 dias, 25°C no escuro, depois transferidos para um meio de seleção. Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até se observar a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz de baixa intensidade, e o processo de regeneração é iniciado como conhecido na técnica. Permite-se que os rebentos resultantes criem raízes no meio de enraizamento, e as plantas resultantes são transferidas para vasos de viveiro e propagadas como plantas transgênicas.
Materiais
Meio DN62A5S

[000123] Ajustar o pH da solução a pH 5,8 com 1N KOH/1N KCl, adicionar Gelrite (Sigma) a 3 g/L, e autoclavar. Após arrefecer a 50°C, adicionar 2 mL/L de uma solução mãe a 5 mg/mL de nitrato de prata (Phytotechnology Labs).

Exemplo 7. Transformação de genes da invenção em Células de Plantas por Transformação Mediada por Agrobacterium

[000124] São recolhidas espigas 8-12 dias após a polinização. São isolados embriões das espigas, e estes embriões com um tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para utilização para transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo virado para cima em um meio de incubação adequado, e são incubados durante a noite a 25 °C no escuro. No entanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite. Os embriões são contatados com uma estirpe Agrobacterium contendo os vetores apropriados para transferência mediada pelo plasmídeo Ti durante 5-10 min, e depois plaqueados em meio de co-cultivo durante 3 dias (25°C no escuro). Após co-cultivo, transferem-se os explantes para um meio de período de recuperação durante 5 dias (25°C no escuro). Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até se observar a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz de baixa intensidade, e o processo de regeneração é iniciado como conhecido na técnica.

[000125] Todas as publicações e requerimentos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de técnica dos peritos na técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações e requerimentos de patente são aqui incorporadas por referência na mesma abrangência como se cada publicação ou requerimento de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[000126] Apesar da invenção anterior ter sido descrita em algum detalhe por intermédio de ilustração e exemplo para efeitos de clareza de compreensão, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos com atividade pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é apresentada em qualquer de SEQ ID NO: 8, 13 ou 18, ou as sequências degeneradas das mesmas que codificam o mesmo polipeptídeo que SEQ ID NO: 27 ou 28, em que a sequência nucleotídica é uma sequência sintética que foi projetada para expressão numa planta,
   em que a referida sequência nucleotídica é operacionalmente ligada a um promotor capaz de direcionar a expressão da referida sequência nucleotídica em uma célula de planta.
2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está inserida no genoma de uma planta, célula de planta ou semente.
3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.
4. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.
5. Célula hospedeira microbiana, caracterizada pelo fato de que contém o vetor como definido na reivindicação 3.
6. Método para o controle de uma população de pragas de lepidópteros, ou para matar uma praga de lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida população ou peste com uma quantidade eficaz como pesticida de um polipeptídeo possuindo atividade pesticida, em que o referido polipeptídeo é a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 28, em que a referida praga de lepidópteros é selecionada dentre lagarta-rosca, besouro da batata, traça-das-crucíferas, broca Europeia do milho, lagarta-do-cartucho do milho, lagarta-da-maçã, lagarta-da-espiga-do-milho, broca do milho do sul, broca do milho do sudoeste, e lagarta da soja.
7. Método para a produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 5, sob condições nas quais a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo seja expressa.
8. Método para a proteção de uma planta de uma praga, caracterizada pelo fato de que compreende expressar em uma planta ou em uma célula desta uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é apresentada em qualquer de SEQ ID NO: 8, 13 ou 18, ou as sequências degeneradas das mesmas que codificam o mesmo polipeptídeo que SEQ ID NO: 27 ou 28, em que a sequência nucleotídica é uma sequência sintética que foi projetada para expressão numa planta; em que a referida planta produz um polipeptídeo com atividade pesticida contra uma praga de lepidóptero, em que a referida praga de lepidópteros é selecionada dentre lagarta-rosca, besouro da batata, traça-das-crucíferas, broca Europeia do milho, lagarta-do-cartucho do milho, lagarta-da-maçã, lagarta-da-espiga-do-milho, broca do milho do sul, broca do milho do sudoeste, e lagarta da soja.
9. Método para aumentar o rendimento em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende crescer em um campo uma planta ou uma semente desta que tem incorporada de forma estável no seu genoma um construto de DNA, que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é apresentada em qualquer de SEQ ID NO: 8, 13 ou 18, ou as sequências degeneradas das mesmas que codificam o mesmo polipeptídeo que SEQ ID NO: 27 ou 28, em que a sequência nucleotídica é uma sequência sintética que foi projetada para expressão numa planta; e
   em que o referido campo está infestado por uma praga contra a qual o referido polipeptídeo possui atividade pesticida, em que a referida praga é selecionada dentre lagarta-rosca, besouro da batata, traça-das-crucíferas, broca Europeia do milho, lagarta-do-cartucho do milho, lagarta-da-maçã, lagarta-da-espiga-do-milho, broca do milho do sul, broca do milho do sudoeste, e lagarta da soja.