MX2012009632A - Genes delta-endotoxinicos axmi221z, axmi222z, axmi223z, axmi224z, axmi225z y metodos para su uso. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Se proporcionan composiciones que comprenden una secuencia codificante para un polipéptido de toxina. Las secuencias codificantes se pueden usar en constructos de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en plantas y bacterias. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos, y semillas transformados. En particular, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos de toxina aisladas. Adicionalmente, están englobadas las secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos, y anticuerpos que se unen específicamente a esas secuencias de aminoácidos. En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 21-32, o la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1-20, así como variantes y fragmentos de estas.

Description

GENES DELTA-ENDOTOXÍNICOS AXMI221z. AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z, Y AXMI225z Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican son útiles para preparar formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgenicas resistentes a plagas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo grampositiva formadora de esporas caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero son inofensivas para plantas y otros organismos contra los que no se dirige. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas se pueden usar como insecticidas medioambientalmente aceptables para controlar plagas de insectos agrícolas o vectores de insectos para una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristalinas (Cry) (delta-endotoxinas) procedentes del Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida contra larvas predominantemente de lepidópteros, hemípteros, dípteros, y coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra órdenes de plagas de Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, y Acari, así como otros órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhehninthes, y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.). Estas proteínas se clasificaron originalmente como Cryl a CryV basándose principalmente en su actividad insecticida. Las principales clases fueron específica de Lepidoptera (I), específica de Lepidoptera y Díptera (II), específica de Coleóptera (III), específica de Díptera (IV), y específica de nematodos (V) y (VI). Las proteínas además se clasificaron en subfamilias; a las proteínas más altamente relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras divisionales, tales como CryIA, CryIB, CryIC, etc. A las proteínas incluso más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les dieron nombres tales como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Recientemente se describió una nueva nomenclatura para los genes Cry basándose en la homología de secuencias de aminoácidos en vez de en la especificidad del insecto diana (Crickmore ef al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre único que incorpora un rango primario (un número arábigo), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula), y un rango cuaternario (otro número arábigo). En la nueva clasificación, los números romanos han sido substituidos por números arábigos en el rango primario. Las proteínas con menos de 45% de identidad de secuencia tienen diferentes rangos primarios, y los criterios para los rangos secundarios y terciarios son 78% y 95%, respectivamente.

La proteína cristalina no muestra actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por las proteasas en el tubo digestivo del insecto a una molécula tóxica activa. (Hofte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores del borde ciliado apical en el intestino medio de la larva diana y se inserta en la membrana apical creando canales iónicos o poros, lo cual provoca la muerte de la larva.

Las delta-endotoxinas tienen generalmente cinco dominios de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd eí al. (2001 ) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa, y está implicado en la inserción de la membrana y formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega; y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de "rollo de mermelada" (de Maagd ef al. 2001 , más arriba). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor, y por lo tanto se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir y la mejora en el rendimiento al controlar plagas de insectos, existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de toxinas plaguicidas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácidos nucleicos que codifican secuencias para polipéptidos plaguicidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácidos nucleicos, y células hospedantes que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias polipeptídicas plaguicidas, y anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias nucleotídicas se pueden usar en constructos de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias nucleotídicas o de aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para la expresión en un organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformados.

En particular, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican una proteína plaguicida. Adicionalmente, están englobadas las secuencias de aminoácidos que corresponden a la proteina plaguicida. En particular, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 21-32, o una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1-5, así como variantes y fragmentos de estas. También están englobadas las secuencias nucleotídicas que son complementarias a una secuencia nucleotídica de la invención o que se hibridan a una secuencia de la invención. También se exponen en SEC ID NO:6-20 las secuencias nucleotídicas sintéticas que codifican los polipéptidos descritos aquí.

Se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención y para usar esos polipéptidos para controlar o exterminar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos, o dípteros. También se incluyen métodos y kits para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con una resistencia o tolerancia mejorada frente a plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas o ácidos nucleicos plaguicidas en productos u organismos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia o tolerancia a plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Por "resistencia" se quiere decir que la plaga (por ejemplo, insecto) es exterminada al ingerir o mediante otro contacto con los polipéptidos de la invención. Por "tolerancia" se quiere decir una alteración o reducción en el movimiento, alimentación, reproducción, u otras funciones de la plaga. Los métodos implican transformar organismos con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína plaguicida de la invención. En particular, las secuencias nucleotídicas de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. De este modo, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas plaguicidas de Bacillus u otras especies. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación subsiguiente en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de proteínas plaguicidas alteradas mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el intercambio de dominios o el barajado de ADN, por ejemplo, con los miembros de las familias de endotoxinas Cry1 , Cry2, y Cry9. Las proteínas encuentran uso para controlar o exterminar poblaciones de plagas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros, y nematodos, y para producir composiciones con actividad plaguicida.

Por "toxina plaguicida" o "proteína plaguicida" se quiere decir una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, pero sin limitarse a, miembros de las órdenes Lepidoptera, Díptera, y Coleóptera, o el filum Nematoda, o una proteína que tiene homología con tal proteína. Las proteínas plaguicidas se han aislado a partir de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas plaguicidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias nucleotídicas de longitud completa descritas aquí, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de partida en dirección 3' alterno, o debido a procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento se puede producir en el organismo en el que se expresa la proteína o en la plaga después de la ingestión de la proteína.

Las proteínas plaguicidas engloban delta-endotoxinas. Las delta-endotoxinas incluyen proteínas identificadas como cryl a cry43, cytl y cyt2, y toxina similar a Cyt. Existen actualmente alrededor de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con un amplio intervalo de especificidades y toxicidades. Para consultar una lista extensa, véase Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y para consultar actualizaciones regulares véase Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclatura", en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

De este modo, se proporcionan aquí nuevas secuencias nucleotídicas aisladas que confieren actividad plaguicida. Estas secuencias nucleotídicas aisladas codifican polipéptidos que tienen homología con delta-endotoxinas o toxinas binarias conocidas. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas plaguicidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite a las células controlar o exterminar plagas que la ingieren.

Moléculas de Ácidos Nucleicos Aisladas y Variantes y Fragmentos de estas Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas o recombinantes que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican proteínas y polipéptidos plaguicidas o porciones biológicamente activas de estos, así como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas con regiones de homología de secuencia. Como se usa aquí, la expresión "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos nucleotidicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

Una secuencia de ácido nucleico (o ADN) "aislada" o "recombinante" se usa aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en una célula hospedante bacteriana o vegetal in vitro o recombinante. En algunas realizaciones, un ácido nucleico aislado o recombinante está libre de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican una proteína) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual deriva el ácido nucleico. Para los fines de la invención, "aislado", cuando se usa para referirse a moléculas de ácidos nucleicos, excluye los cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica delta-endotoxina aislada puede contener menos de alrededor de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias nucleotídicas que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual deriva el ácido nucleico. En diversas realizaciones, una proteína delta-endotoxínica que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de alrededor de 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína no delta-endotoxínica (también denominada aquí como una "proteína contaminante").

Las secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1-20, y variantes, fragmentos y complementos de las mismas. Por "complemento" se quiere decir una secuencia nucleotídica que es suficientemente complementaria a una secuencia nucieotídica dada, de forma que se puede hibridar a la secuencia nucieotídica dada para formar de ese modo un dúplex estable. La secuencia de aminoácidos correspondiente para la proteína plaguicida codificada por esta secuencia nucieotídica se expone en SEC ID NO: 21 -32.

También están englobadas por la presente invención las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de estas secuencias nucleotídicas que codifican proteínas plaguicidas. Por "fragmento" se quiere decir una porción de la secuencia nucieotídica que codifica una proteína plaguicida. Un fragmento de una secuencia nucieotídica puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación o cebador de PCR usando métodos descritos más abajo. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia nucieotídica que codifica una proteína plaguicida comprenden al menos alrededor de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia nucieotídica de longitud completa que codifica una proteína plaguicida descrita aquí, dependiendo del uso pretendido. Por nucleótidos "contiguos" se quiere decir restos nucleotídicos que están inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias nucleotídicas de la presente invención codificarán fragmentos proteicos que retienen la actividad biológica de la proteína plaguicida y, por tanto, retienen actividad plaguicida. Por "retienen actividad" se quiere decir que el fragmento tendrá al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad plaguicida de la proteína plaguicida. En una realización, la actividad plaguicida es actividad coleoptericida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad lepidoptericida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad nematocida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad diptericida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad hemiptericida. En la técnica se conocen bien métodos para medir la actividad plaguicida. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente U.S. n° 5.743.477, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Un fragmento de una secuencia nucieotídica que codifica una proteína plaguicida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos alrededor de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína plaguicida de longitud completa de la invención. En algunas realizaciones, el fragmento es un fragmento de escisión proteoKtica. Por ejemplo, el fragmento de escisión proteolítica puede tener un truncamiento N-terminal o C-terminal de al menos alrededor de 100 aminoácidos, alrededor de 120, alrededor de 130, alrededor de 140, alrededor de 150, o alrededor de 160 aminoácidos con relación a SEC ID NO:21-32. En algunas realizaciones, los fragmentos englobados aquí resultan de la eliminación del dominio de cristalización C-terminal, p.ej., mediante proteolisis o mediante inserción de un codón de parada en la secuencia codificante. Véanse, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos truncadas expuestas en SEC ID NO:22, 23, 25, 26, y 32. Se entenderá que el sitio de truncamiento puede variar en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, o más aminoácidos en cualquier lado del sitio de truncamiento representado por el término de SEC ID NO:22, 23, 25, 26, y 32 (en comparación con la secuencia de longitud completa correspondiente).

Las proteínas plaguicidas preferidas de la presente invención son codificadas por una secuencia nucleotídica suficientemente idéntica a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1-20. Por "suficientemente idéntica" se quiere decir una secuencia de aminoácidos o nucleotídica que tiene al menos alrededor de 60% o 65% de identidad de secuencia, alrededor de 70% o 75% de identidad de secuencia, alrededor de 80% u 85% de identidad de secuencia, alrededor de 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineamiento descritos aquí, usando parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias nucleotídicas teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de aminoácidos, la posición del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones que se solapan) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra realización, el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de toda la secuencia de referencia (es decir, la secuencia descrita aquí como cualquiera de SEC ID NO: 1-20). El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas más abajo, permitiendo o sin permitir espacios vacíos. Al calcular el porcentaje de identidad, típicamente se cuentan los emparejamientos exactos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y AltschuI (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y AltschuI (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de AltschuI et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias nucleotídicas homologas a moléculas de ácidos nucleicos de la invención similares a plaguicidas. Las búsquedas de proteínas de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de proteínas plaguicidas de la invención. Para obtener alineamientos con espacios vacíos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en AltschuI ef al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede usar PSI-Blast para llevar a cabo una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase AltschuI et al. (1997) más arriba. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). El alineamiento también se puede llevar a cabo manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, y de este modo puede proporcionar datos sobre la conservación de secuencias de toda la secuencia de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos comercialmente disponibles, tales como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrpgen Corporation, Carlsbad, CA). Tras el alineamiento de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de los alineamientos de ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud e identidad de aminoácidos (o de ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible de Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE.UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de restos de pesos PAM120, una penalización por longitud de espacio vacío de 12, y una penalización por espacio vacío de 4.

Excepto que se señale de otro modo, para determinar la identidad o similitud de secuencias, se usará GAP Versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleotídica usando un peso de GAP de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso de GAP de 8 y un peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden usar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene emparejamientos de restos nucleotídicos idénticos y un porcentaje de identidad de secuencias idéntico cuando se compara con el alineamiento correspondiente generado por GAP Versión 10.

La invención también engloba moléculas de ácidos nucleicos variantes. "Variantes" de las secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas plaguicidas incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas plaguicidas descritas aquí pero que difieren de forma conservativa debido a la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas como se explica anteriormente. Las variantes alélicas de origen natural se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como las técnicas de hibridación y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se esquematizan más abajo. Las secuencias nucleotídicas variantes también incluyen secuencias nucleotídicas derivadas sintéticamente que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que todavía codifican las proteínas plaguicidas descritas en la presente invención como se explica más abajo. Las proteínas variantes englobadas por la presente invención son biológicamente activas, esto es, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, actividad plaguicida. Por "retiene actividad" se quiere decir que la variante tendrá al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70%, o al menos alrededor de 80% de la actividad plaguicida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199- 206; arrone ef al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente U.S. n° 5.743.477, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

El experto apreciará además que se pueden introducir cambios mediante mutación de las secuencias nucleotídicas de la invención, provocando de ese modo cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas plaguicidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De este modo, se pueden crear moléculas de ácidos nucleicos aisladas variantes introduciendo una o más sustituciones, adiciones o supresiones nucleotídicas en la secuencia nucleotídica correspondiente descrita aquí, de forma que se introducen una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias nucleotídicas variantes también están englobadas por la presente invención.

Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más restos de aminoácidos no esenciales predichos. Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar de la secuencia de tipo natural de una proteína plaguicida sin alterar la actividad biológica, mientras que un resto de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de aagd et al. (2001 ) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa, y está implicado en la inserción de la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de "rollo de mermelada" (de Maagd et al. 2001 , más arriba). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor, y por lo tanto se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no se realizarían para restos de aminoácidos conservados, o para restos de aminoácidos que residen en un motivo conservado en el que tales restos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de restos que están conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, restos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (p. ej., restos que son idénticos en un alineamiento de proteínas homologas). Los ejemplos de restos que están conservados pero que pueden permitir sustituciones conservativas de aminoácidos y todavía retienen actividad incluyen, por ejemplo, restos que tienen sólo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, restos que tienen sólo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en las proteínas homologas del alineamiento). Sin embargo, un experto en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones conservadas o no conservadas minoritarias en los restos conservados.

Como alternativa, se pueden obtener secuencias nucleotídicas variantes introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar en función de su capacidad para conferir actividad plaguicida para identificar mutantes que retienen la actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar recombinantemente, y la actividad de la proteína se puede determinar usando técnicas de ensayo estándar.

Usando métodos tales como PCR, hibridación, y similares, se pueden identificar secuencias plaguicidas correspondientes, teniendo tales secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véanse, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), e Innis, eí al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, se puede usar toda o parte de la secuencia nucleotídica plaguicida para identificar recopilaciones de ADNc o genotecas. Los métodos para la construcción de tales recopilaciones de ADNc y genotecas son generalmente conocidos en la técnica y se describen eri Sambrook y Russell, 2001 , más arriba. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación se pueden obtener marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia nucleotidica conocida descrita aquí que codifica la proteína plaguicida. Adicionalmente se pueden usar cebadores degenerados, diseñados en función de los nucleótidos conservados o restos de aminoácidos en la secuencia nucleotidica o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda comprende típicamente una región de secuencia nucleotidica que se híbrida en condiciones restrictivas a al menos alrededor de 12, al menos alrededor de 25, al menos alrededor de 50, 75, 100, 125, 150, 175, ó 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotidica que codifica una proteína plaguicida de la invención, o un fragmento o variante de la misma. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación son generalmente conocidos en la técnica y se describen en Sambrook y Russell, 2001 , más arriba, incorporado aquí como referencia.

Por ejemplo, se puede usar una secuencia de proteína plaguicida completa descrita aquí, o una o más porciones de la misma, como una sonda capaz de hibridarse específicamente a las secuencias similares a proteínas plaguicidas correspondientes y a ARN mensajeros. Para lograr la hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen preferiblemente al menos alrededor de 10 nucleótidos de longitud, o al menos alrededor de 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas se pueden usar para amplificar mediante PCR secuencias plaguicidas correspondientes a partir de un organismo elegido. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la identificación mediante hibridación de recopilaciones de ADN cultivadas en placas de cultivo (ya sea placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York)).

La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo en condiciones restrictivas. Por "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" se quiere decir condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará a su secuencia diana hasta un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al inicial). Las condiciones restrictivas son dependientes de las secuencias y serán diferentes en circunstancias diferentes. Controlando la restricción de las condiciones de hibridación y/o de lavado, se pueden identificar secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Como alternativa, las condiciones de restricción se pueden ajustar para permitir cierto desemparejamiento en las secuencias, de forma que se detectan grados menores de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de alrededor de 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las que la concentración salina es menor que alrededor de 1 ,5 M de ion Na, típicamente alrededor de 0,01 a 1 ,0 M de la concentración del ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es al menos alrededor de 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Las condiciones de baja restricción ejemplares incluyen la hibridación con una disolución tampón de 30 a 35% de formamida, 1 de NaCI, 1 % de SDS (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCI/0,3 M de citrato trisódico) a 50 a 55 °C. Las condiciones de restricción moderadas ejemplares incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, 1 ,0 M de NaCI, 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones de elevada restricción ejemplares incluyen hibridación en 50% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0, 1 X SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender alrededor de 0,1 % a alrededor de 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor que alrededor de 24 horas, habitualmente alrededor de 4 a alrededor de 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados tras la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución final de lavado. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; en la que M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la disolución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (en fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria se híbrida a una sonda perfectamente emparejada. Tm se reduce en alrededor de 1 °C por cada 1 % de desemparejamiento; de este modo, la Tm, la hibridación, y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para la hibridación a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad > 90%, la Tm se puede reducir 10 °C. Generalmente, se seleccionan condiciones restrictivas para que sean alrededor de 5 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3 ó 4 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones moderadamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10 °C menor que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de baja restricción pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos de pericia normal entenderán que se describen inherentemente variaciones en la restricción de las disoluciones de hibridación y/o de lavado. Si el grado deseado de desemparejamiento da como resultado una Tm menor que 45 °C (disolución acuosa) o 32 °C (disolución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de forma que se pueda usar una mayor temperatura. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York), y en Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nueva York), se encuentra una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos. Véase Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteínas Aisladas v Variantes y Fragmentos de estas Las proteínas plaguicidas también están englobadas dentro de la presente invención. Por "proteína plaguicida" se quiere decir una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 21 -32. También se proporcionan fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de estos, y se pueden usar para la práctica de los métodos de la presente invención. Un "proteína aislada" se usa para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en una célula hospedante bacteriana o vegetal in vitro o recombinante. Una "proteína aislada" o una "proteína recombinante" se usa para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en una célula hospedante bacteriana o vegetal in vitro o recombinante.

"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos polipeptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 21 -32, y que muestran actividad plaguicida. Una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas se pueden preparar mediante técnicas recombinantes, y se pueden evaluar para determinar su actividad plaguicida. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews ef al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; arrone eí al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente U.S. n° 5.743.477, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Como se usa aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEC ID NO: 21-32. Sin embargo, la invención engloba otros fragmentos, tales como cualquier fragmento en la proteína mayor de alrededor de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, ó 300 aminoácidos.

Por "variantes" se quiere decir proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 60%, 65%, alrededor de 70%, 75%, alrededor de 80%, 85%, alrededor de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO:21-32. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se híbrida a la molécula de ácido nucleico de SEC ID NO: 1 -20, o un complemento de esta, en condiciones restrictivas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes englobadas por la presente invención son biológicamente activas, esto es, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, retienen actividad plaguicida. En algunas realizaciones, las variantes tienen actividad mejorada con relación a la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews eí al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente U.S. n° 5.743.477, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de esta invención, poseen bastante a menudo múltiples codones de iniciación de metionina próximos al comienzo del marco de lectura abierto. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de partida provocará la generación de una proteína funcional. Estos codones de partida pueden incluir codones de ATG. Sin embargo, las bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como codón de partida, y las proteínas que inician la traducción en los codones de GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en los sistemas bacterianos se puede iniciar en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, a menudo no se determina a priori cuáles de estos codones se usan naturalmente en la bacteria. De este modo, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede provocar la generación de proteínas plaguicidas. Véanse, por ejemplo, el sitio de comienzo alternativo para la proteína AXMI223z expuesta en SEC ID NO: 28, y el sitio de comienzo alternativo para la proteína AXMI224z expuesta en SEC ID NO: 30. Estas proteínas plaguicidas están englobadas en la presente invención y se pueden usar en los métodos de la presente invención. Se entenderá que, cuando se expresan en plantas, será necesario alterar el codón de partida alternativo a ATG para la traducción apropiada.

También están englobados los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o contra variantes o fragmentos de estos. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente U.S. n° 4.196.265).

Variantes Alteradas o Mejoradas Se reconoce que las secuencias de ADN de una proteína plaguicida se pueden alterar mediante diversos métodos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes de aquellas codificadas por una proteína plaguicida de la presente invención. Esta proteína se puede alterar de diversas maneras, incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de SEC ID NO:21-32, incluyendo hasta alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, alrededor de 6, alrededor de 7, alrededor de 8, alrededor de 9, alrededor de 10, alrededor de 15 alrededor de 20, alrededor de 25, alrededor de 30, alrededor de 35, alrededor de 40, alrededor de 45, alrededor de 50, alrededor de 55, alrededor de 60, alrededor de 65, alrededor de 70, alrededor de 75, alrededor de 80, alrededor de 85, alrededor de 90, alrededor de 100, alrededor de 105, alrededor de 110, alrededor de 115, alrededor de 120, alrededor de 125, alrededor de 130, alrededor de 135, alrededor de 140, alrededor de 145, alrededor de 150, alrededor de 155, o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína plaguicida se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Esto se puede lograr también mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína plaguicida para conferir actividad plaguicida se puede mejorar mediante el uso de tales técnicas en las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se puede expresar una proteína plaguicida en células hospedantes que muestran tasas elevadas de falta de incorporación de bases durante la replicación del ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Tras la propagación en tales cepas, se puede aislar el ADN (por ejemplo, preparando ADN plasmídico, o amplificando mediante PCR y clonando en un vector el fragmento de PCR resultante), cultivar las mutaciones de la proteína plaguicida en una cepa no mutagénica, e identificar genes mutados con actividad plaguicida, por ejemplo llevando a cabo un ensayo para determinar la actividad plaguicida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone ef al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o provocar la muerte de las plagas. En Schnepf eí al. (1998) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 62:775-806 se encuentran ejemplos de mutaciones que dan como resultado una toxicidad incrementada.

Como alternativa, se pueden realizar alteraciones a la secuencia proteica de muchas proteínas en el término amíno o carboxi sin afectar sustancialmente la actividad. Esto puede incluir inserciones, supresiones o alteraciones introducidas mediante métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones por PCR que alteran o extienden la secuencia codificante de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias codificantes de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Como alternativa, las secuencias proteicas añadidas pueden incluir secuencias completas codificantes de proteínas, tales como las usadas habitualmente en la técnica para generar fusiones proteicas. Tales proteínas de fusión a menudo se usan para (1 ) incrementar la expresión de una proteína de interés,. (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar la purificación de la proteína, la detección de la proteína, u otros usos experimentales conocidos en la técnica, (3) para dirigir la secreción o traducción de una proteína hacia un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de bacterias gramnegativas, o el retículo endoplásmico de células eucariotas, esto último da como resultado a menudo la glucosilación de la proteína.

Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos variantes de la presente invención también engloban secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como el barajado de ADN. Con tal procedimiento se puede usar una o más regiones codificantes de la proteína plaguicida diferentes para crear una nueva proteína plaguicida que posee las propiedades deseadas. De esta manera, se generan recopilaciones de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, los motivos de las secuencias que codifican un dominio de interés se pueden barajar entre un gen plaguicida de la invención y otros genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una actividad insecticida incrementada. Las estrategias para tal barajado de ADN son conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore ef al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang ef al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes U.S. nos 5.605.793 y 5.837.458.

El intercambio de dominios o el barajado es otro mecanismo para generar proteínas plaguicidas alteradas. Los dominios se pueden intercambiar entre proteínas plaguicidas, dando como resultado toxinas híbridas o quiméricas con actividad plaguicida mejorada o un espectro diana. Los métodos para generar proteínas recombinantes y para estudiarlas para determinar la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Naimov ef al. (2001 ) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991 ) 1 Biol. Chem. 266: 17954-17958; Schnepf ef al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang ef al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores Se puede proporcionar una secuencia plaguicida de la invención en un cásete de expresión para la expresión en una planta de interés. Por "cásete de expresión vegetal" se quiere decir un constructo de ADN que es capaz de dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Típicamente, estos contienen un promotor y una secuencia codificante. A menudo, tales constructos también contendrán una región no traducida en 3'. Tales constructos pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido hacia ciertas estructuras intracelulares, tales como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplásmico o aparato de Golgi.

Por "secuencia señal" se quiere decir una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado el transporte peptídico cotraduccional o postraduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto implica típicamente la secreción en el aparato de Golgi, con cierta glucosilación resultante. Las toxinas insecticidas de bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que son activadas proteol ¡ticamente en el intestino de la plaga diana (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia señal está localizada en la secuencia nativa, o puede derivar de una secuencia de la invención. Por "secuencia líder" se quiere decir cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para poner en marcha el transporte cotraduccional de la cadena peptídica hacia un orgánulo subcelular. De este modo, esto incluye secuencias líder dirigidas al transporte y/o glucosilación mediante el paso al retículo endoplásmico, el paso a vacuolas, plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondrias, y similares.

Por "vector de transformación vegetal" se quiere decir una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficaz de una célula vegetal. Tal molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión vegetal y se puede organizar en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetal que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones requeridas que actúan en cis y trans para la transformación de células vegetales (Hellens y ullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). "Vector" se refiere a un constructo de ácido nucleico diseñado para la transferencia entre diferentes células hospedantes. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos en una célula extraña. El cásete incluirá secuencias reguladoras en 5' y 3' ligadas operablemente a una secuencia de la invención. Por "ligadas operablemente" se quiere decir una ligación funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, ligado operablemente significa que las secuencias de ácidos nucleicos que están ligadas son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de la proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Como alternativa, el gen o genes adicionales se pueden proporcionar sobre múltiples casetes de expresión.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante en dirección 3'. El promotor, junto con otras secuencias de ácidos nucleicos reguladoras transcripcionales y traduccionales (también denominadas "secuencias de control"), es necesario para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia plaguicida para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El cásete de expresión incluirá, en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación traduccional y transcripcional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, al hospedante vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o, como alternativa, una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" al hospedante vegetal, se quiere decir que el promotor se encuentra en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se quiere decir que el promotor no es el promotor nativo o de origen natural para la secuencia de ADN ligada operablemente de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN operablemente ligada de interés, puede ser nativa con el hospedante vegetal, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, a la secuencia de ADN de interés, al hospedante vegetal, o a cualquier combinación de estos). Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintetasa y nopalina sintetasa. Véanse también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell ' 2:1261-1272·, Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el gen o genes se pueden optimizar para incrementar la expresión en la célula hospedante transformada. Esto es, los genes se pueden sintetizar usando codones preferidos por células hospedantes para la expresión mejorada, o se pueden sintetizar usando codones a una frecuencia de uso de codones preferidos por hospedantes. Generalmente, el contenido de GC del gen se incrementará. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para consultar una discusión del uso de codones preferidos por hospedantes. Se dispone de métodos en la técnica para la síntesis de genes preferidos por las plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.380.831 y 5.436.391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados aquí como referencia.

En una realización, la proteína plaguicida se dirige al cloroplasto para la expresión. De esta manera, cuando la proteína plaguicida no se inserta directamente en el cloroplasto, el cásete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína plaguicida hacia los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104- 126; Clark ef al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shan ef al. (1986) Science 233:478-481.

El gen plaguicida que será dirigido hacia el cloroplasto se puede optimizar para la expresión en el cloroplasto para dar cuenta de las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés se pueden sintetizar usando codones preferidos por los cloroplastos. Véase, por ejemplo, la patente U.S. n° 5.380.831 , incorporada aquí como referencia.

Transformación de Plantas Los métodos de la invención implican introducir un constructo nucleotídico en una planta. Por "introducir" se quiere decir presentar a la planta el constructo nucleotídico de tal manera que el constructo tenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir un constructo nucleotídico en una planta; sólo es necesario que el constructo nucleotídico tenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir constructos nucleotídicos en plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Por "planta" se quiere decir plantas completas, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de estos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen).

"Plantas transgenicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "establemente transformados" se refiere a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como aquellas que pueden ser endógenas, o estar presentes en la célula vegetal no transformada. "Heteróloga" se refiere generalmente a las secuencias de ácidos nucleicos que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y se han añadido a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o métodos similares.

Las plantas transgenicas de la invención expresan una o más de las nuevas secuencias de la toxina descritas aquí. En diversas realizaciones, la planta transgenica comprende además uno o más genes adicionales para resistencia a insectos (p. ej., Cry1, tales como miembros de las familias CryIA, CryI B, CryIC, CryI D, CryI E, y CryI F; Cry2, tales como miembros de la familia Cry2A; Cry9, tales como miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, y Cry9F; etc.). La persona de pericia en la técnica entenderá que la planta transgenica puede comprender cualquier gen que dote de un rasgo agronómico de interés.

La transformación de células vegetales se puede lograr mediante una o varias técnicas conocidas en la materia. El gen plaguicida de la invención se puede modificar para obtener o potenciar la expresión en células vegetales. Típicamente, un constructo que exprese tal proteína contendrá un promotor para conducir la transcripción del gen, así como una región no traducida en 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales constructos es bien conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil manipular el gen de forma que se segregue el péptido resultante, o de otro modo se busque como diana dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen se puede manipular para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferible manipular el cásete de expresión vegetal para que contenga un intrón, de forma que el procesamiento del ARNm del intrón es necesario para la expresión.

Típicamente, este "cásete de expresión vegetal" se insertará en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede comprender uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, es una práctica habitual en la técnica utilizar vectores de transformación vegetal que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se denominan a menudo en la técnica "vectores binarios". Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se usan muy a menudo para la transformación mediada por Agrobacterium, en la que el tamaño y complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficaz es bastante grande, y es ventajoso separar funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios contienen típicamente un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia de ADN-T (tal como la frontera izquierda y la frontera derecha), un marcador seleccionable que se manipula para que sea capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen manipulado para que sea capaz de expresarse en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgenicas). También están presentes en este vector plasmídico secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis están dispuestas de una manera que permite la transferencia eficaz en células vegetales y la expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen plaguicida están localizados entre las fronteras izquierda y derecha. A menudo un segundo vector plasmídico contiene los factores que actúan en trans y que median la transferencia de ADN-T desde Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN mediante escisión en secuencias frontera y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). Para la transformación vegetal, se pueden usar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101 , EHA101 , EHA105, etc.). El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación vegetal implican transferir ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas a partir de un grupo de masa celular no transformada. Los explantes se transfieren típicamente a un suministro reciente del mismo medio, y se cultivan de la manera habitual. Subsiguientemente, las células transformadas se diferencian en brotes tras colocarlas en un medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes se transfieren entonces a un medio de enraizado selectivo, para recuperar el brote o plántula enraizada. La plántula transgenica crece entonces hasta una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes se transfieren típicamente a un suministro reciente del mismo medio, y se cultivan de la manera habitual. En Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239, y en Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120 se encuentra una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgenicas. Puesto que el material transformado contiene muchas células, las células tanto transformadas como no transformadas están presentes en cualquier trozo de callo o tejido o grupo de células diana. La capacidad para exterminar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad para eliminar células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación con éxito de plantas transgenicas.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias nucleotídicas en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, seleccionada como diana para la transformación. La generación de plantas transgenicas se puede llevar a cabo mediante uno de varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo mediante Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas balísticas, transformación con haces de aerosol (Solicitud Publicada U.S. n° 20010026941 ; patente U.S. n° 4.945.050; Publicación Internacional n° WO 91/00915; Solicitud Publicada U.S. n° 2002015066), transformación de Lec1 , y otros diversos métodos para transferir ADN no mediados directamente por partículas.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Svab ef al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro, mediante una pistola de partículas, de ADN que contiene un marcador selecciona ble, y en dirigir el ADN al genoma del plástido a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación de plástidos se puede lograr mediante transactivación de un transgen silencioso portado por plástidos mediante expresión preferida por tejidos de una ARN polimerasa codificada nuclearmente y dirigida a plástidos. Tal sistema se ha dado a conocer en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305.

Tras la integración del ADN extraño heterólogo en células vegetales, se aplica un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio, para exterminar las células no transformadas y separar y proiiferar las células putativamente transformadas que sobreviven a partir de este tratamiento de selección mediante la transferencia de forma regular a un medio reciente. Mediante el paso continuo y la exposición a la selección apropiada, se identifican y se hacen proiiferar las células que son transformadas con el vector plasmídico. Entonces se pueden usar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgenica.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas según formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick eí al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden cultivar entonces, se polinizan con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y se identifica el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda, y entonces se cosechan semillas para asegurarse de que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona una semilla transformada (también denominada "semilla transgenica") que tiene un constructo nucleotídico de la invención, por ejemplo un cásete de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma.

Evaluación de la Transformación Vegetal Tras la introducción del ADN extraño heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos métodos, tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis mediante PCR es un método rápido para identificar células, tejido o brotes transformados para determinar la presencia del gen incorporado en la etapa temprana antes de transplantar en el suelo (Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo usando cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de interés o contexto de vector de Agrobacterium, etc.

La transformación vegetal se puede confirmar mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001 , más arriba). En general, se extrae ADN total del transformante, se digiere con las enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o de nailon. La membrana o "transferencia" se sonda entonces con, por ejemplo, un fragmento de ADN diana radiomarcado con 3 P, para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta según técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001 , más arriba).

En el análisis de la transferencia Northern, se aisla ARN de tejidos específicos de transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehido y se transfiere sobre un filtro de nailon según procedimientos estándar que se usan de forma habitual en la técnica (Sambrook y Russell, 2001 , más arriba). La expresión del ARN codificado por el gen plaguicida se ensaya entonces hibridando el filtro a una sonda radioactiva derivada de un gen plaguicida, mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001 , más arriba).

La transferencia Western, los ensayos bioquímicos, y similares, se pueden llevar a cabo en las plantas transgenicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen plaguicida mediante procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001 , más arriba) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína plaguicida.

Actividad Plaguicida en Plantas En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgenicas que expresan una proteína plaguicida que tiene actividad plaguicida. Se pueden utilizar los métodos descritos anteriormente a título de ejemplo para generar plantas transgenicas, pero la manera en la que se generan las células vegetales transgenicas no es crítica para esta invención. Se pueden usar a discreción del experimentador métodos conocidos o descritos en la técnica, tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, y métodos no mediados por partículas. Las plantas que expresan una proteína plaguicida se pueden aislar mediante métodos habituales descritos en la técnica, por ejemplo mediante transformación de callo, selección de callo transformado, y regeneración de plantas fértiles a partir de tal callo transgenico. En tal proceso, se puede usar cualquier gen como marcador seleccionable, en tanto que su expresión en células vegetales confiera la capacidad para identificar o seleccionar células transformadas.

Se ha desarrollado un número de marcadores para uso con células vegetales, tales como resistencia a cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. También se pueden usar como marcadores seleccionables otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo de cloroplastos. Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a herbicidas de plantas, tales como glifosato, bromoxinilo o imidazolinona, pueden tener un uso particular. Tales genes se han dado a conocer en Stalker ef al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo); y Sathasivan ef al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a imidazolinona que inhibe la AHAS). Adicionalmente, los genes descritos aquí son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgen en una planta, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie del mismo son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgen se detecta ensayando la actividad plaguicida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína plaguicida se pueden ensayar en busca de actividad plaguicida, y las plantas que muestran actividad óptima se pueden seleccionar para una reproducción posterior. Hay métodos disponibles en la técnica para evaluar la actividad plaguicida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención se puede usar para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (Zea mays), sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, haba de soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, boniato, casabe, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, anacardo, nuez de macadamia, almendra, avena, vegetales, ornamentales, y coniferas.

Los vegetales incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, alubias, guisantes y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón cantalupo y melón galia. Las ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, poinsettia y crisantemo. Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cosechas (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, haba de soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en el control plaguicida Los métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia nucleotídica de la invención, o una variante de la misma, en el control plaguicida o en la manipulación de otros organismos como agentes plaguicidas son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la patente U.S. n° 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia nucleotídica de la invención, o una variante de esta, o los microorganismos que se han alterado genéticamente para contener un gen y una proteína plaguicidas, se pueden usar para proteger de las plagas a cosechas y productos agrícolas. En un aspecto de la invención, células completas, es decir, no lisadas, de un organismo productor de la toxina (plaguicida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al medio ambiente de la plaga o plagas diana.

Como alternativa, el plaguicida se produce introduciendo un gen plaguicida en un hospedante celular. La expresión del gen plaguicida da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. En un aspecto de esta invención, estas células se tratan entonces en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al medio ambiente de la plaga o plagas diana. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos plaguicidas encapsulados naturalmente se pueden formular entonces de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación al medio ambiente que hospeda una plaga diana, por ejemplo suelo, agua, y follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319, y las referencias citadas en él. Como alternativa, se pueden formular las células que expresan un gen de esta invención para permitir la aplicación del material resultante como un plaguicida.

Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en forma de composiciones, y se pueden aplicar a la planta o área de la cosecha a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, agentes tensoactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites inactivos, polímeros, y/o formulaciones portadoras de liberación en el tiempo o biodegradables que permiten una dosificación a largo plazo de un área diana tras una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, viricidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros vehículos agrícolamente aceptables, agentes tensoactivos o adyuvantes que promueven la aplicación empleados habitualmente en la técnica de formulación. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y pueden corresponder a las sustancias empleadas habitualmente en la tecnología de formulación, por ejemplo sustancias minerales regeneradas o naturales, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. Igualmente, las formulaciones se pueden preparar en "cebos" comestibles o en forma de "trampas" de plagas para permitir la alimentación o ingestión por una plaga diana de la formulación plaguicida.

Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas plaguicidas producida por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen la aplicación en hojas, revestimiento de semillas y la aplicación en el suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La composición se puede formular como un polvo, polvo fino, pellet, gránulo, pulverización, emulsión, coloide, disolución, o similar, y se puede preparar por medios convencionales tales como deshidratación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas esas composiciones que contienen al menos uno de tales polipéptidos plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración desde alrededor de 1 % hasta alrededor de 99% en peso.

Las plagas de lepidópteros, hemípteros, dípteros o coleópteros se pueden exterminar o reducir en número, en un área determinada, por los métodos de la invención, o se pueden aplicar profilácticamente a un área medioambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad eficaz como plaguicida del polipétido. Por "cantidad eficaz como plaguicida" se entiende una cantidad del plaguicida que es capaz de provocar la muerte a al menos una plaga, o reducir notablemente el crecimiento, alimentación, o desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas diana específicas a controlar, el medio ambiente específico, localización, planta, cosecha, o sitio agrícola a tratar, las condiciones medioambientales, y el método, tasa, concentración, estabilidad, y cantidad de aplicación de la composición del polipéptido eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones medioambientales, y/o frecuencia de aplicación y/o severidad de infestación de plagas.

Las composiciones plaguicidas descritas se pueden obtener formulando la suspensión de células bacterianas, cristal y/o de esporas, o el componente de la proteína aislado con el vehículo agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, secado por congelación, deshidratado, o en un vehículo acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como disolución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un polvo fino o material granular, en una suspensión en aceite (vegetal o mineral), en emulsiones de agua o de aceite/agua, como un polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material que actúe como vehículo, adecuado para aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y son bien conocidos en la técnica. El término "vehículo agrícolamente aceptable" abarca todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, agentes tensoactivos, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc., que se usan habitualmente en la tecnología de la formulación de plaguicidas; estos son bien conocidos por los expertos en la formulación de plaguicidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y se pueden preparar por diversos medios, por ejemplo mezclando homogéneamente, amasando y/o moliendo la composición plaguicida con adyuvantes adecuados usando técnicas convencionales de formulación. Las formulaciones y métodos de aplicación adecuados se describen en la patente U.S. n° 6.468.523, incorporada aquí como referencia.

"Plaga" incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleóptera, Lepidoptera y Díptera.

El orden Coleóptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostríchoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinídae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphyiinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Díptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera, y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodídae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomídae, Simulíidae, Bibionidae y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae, y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, y Tineidae.

Las plagas de insectos de la invención para las principales cosechas incluyen: Maíz: Ostririia nubilalis, barrenador del maíz Europeo; Agrotis Ípsilon, gusano negro; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea grandiosella, gusano barrenador del maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Diatraea saccharalis, gusano minador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz del oeste; Diabrotica longicornis barben, tortuguilla de la raíz; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, raedor enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, raedor enmascarado del sur (gusano flanco); Popillia japónica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón verde del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, mosca de la semilla; Agromyza parvicornis, minador de las hojas del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Feltia subterránea, gusano trozador; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos de alambre; Oulema melanopus, criocero de los cereales; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón verde del maíz; Sipha flava, pulgón de la caña de azúcar amarillo; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano militar común; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Agrotis orthogonia, oruga podadera del oeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Oulema melanopus, criocero de los cereales; Hypera punctata, gorgojo del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Sitodíplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, mosca del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca gris del trigo; Frankliniella fusca, piojillo del tabaco; Cephus cinctus, cefo del trigo; Acería tulipae, ácaro blanco del bulbo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de la yema del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla del girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano bellotero del algodón; Helicoverpa zea, oruga del algodón; Spodoptera exigua, gardama de la remolacha; Pectinophora gossypiella, oruga rosada del algodón; Anthonomus grandis, picudo del algodonero; Aphis gossypii, piojo del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulguilla del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosquita blanca; Lygus lineolaris, chinche ligus; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, piojillo del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar, Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, salta hojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Soja: Pseudoplusia includens, orugas medidoras de la soja; Anticarsia gemmatalis, langosta del maní; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo; Agrotis Ípsilon, gusano negro; Spodoptera exigua, gardama de la remolacha; Heliothis virescens, gusano bellotero del algodón; Helicoverpa zea, oruga del algodón; Epilachna varivestis, conchuela del fríjol; Myzus persicae, pulgón verde del duraznero; Empoasca fabae, salta hojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, mosca de la semilla; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, arañuela roja de la fresa; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Cebada: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo; Agrotis Ípsilon, gusano negro; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Euschistus servus, chinche marrón apestosa; Delia platura, mosca de la semilla; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro marrón del trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgón del repollo; Phyllotreta cruciferae, pulguilla; Mamestra configurata, gusano de las cruciferas; Plutella xylostella, polilla de dorso de diamante; Delia ssp., gusano de la semilla.

Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como nematodos del nodulo de la raíz, de quistes y de lesiones, que incluyen Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos de quistes, que incluyen, pero no se limitan a, Heterodera glycines (heterodera de la soja); Heterodera schachtii (heterodera de la remolacha); Heterodera avenae (heterodera del cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodo del quiste de la patata). Los nematodos de lesiones incluyen Pratylenchus spp.

Métodos para incrementar el rendimiento vegetal Se proporcionan métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden proporcionar una planta o célula vegetal que expresa un polinucleótido que codifica la secuencia del polipéptido plaguicida descrita aquí, y cultivar la planta o una semilla de esta en un campo infestado con una plaga frente a la cual dicho polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad plaguicida frente a una plaga lepidóptera, coleóptera, díptera, hemíptera, o nematoda, y dicho campo está infestado con una plaga lepidóptera, coleóptera, díptera, hemíptera, o nematoda. Como se define aquí, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se quiere decir cualquier producto vegetal medido. Un incremento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El incremento del rendimiento vegetal tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el incremento de la biomasa de las hojas de las plantas puede incrementar el rendimiento de vegetales con hojas para consumo humano o animal. Adicionalmente, el incremento de la biomasa de hojas se puede usar para incrementar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un incremento del rendimiento puede comprender cualquier incremento estadísticamente significativo, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos un incremento de 1%, al menos un incremento de 3%, al menos un incremento de 5%, al menos un incremento de 10%, al menos un incremento de 20%, al menos un incremento de 30%, al menos un incremento de 50%, al menos un incremento de 70%, al menos un incremento de 100% o más en el rendimiento, en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida.

Las plantas también se pueden tratar con una o más composiciones químicas, incluyendo uno o más herbicidas, insecticidas, o fungicidas. Las composiciones químicas ejemplares incluyen: Herbicidas de Frutas/Vegetales: Atrazina, Bromacilop, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Sethoxydim, Butafenacilo, Halosulfuron, Indaziflam; Insecticidas de Frutas/Vegetales: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbarilo, Carbofuran, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrina, Acequinocilo, Bifenazateo, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, Spirodiclofeno, Gamma-cihalotrina, Spiromesifeno, Spinosad, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinoteram, Triflumuron.Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprid, Clotianidina, Tiamethoxam, Spinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, benzoato de emamectina, Indoxacarb, Foztiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Óxido de Fenbutatina, Hexthiazox, Metomilo, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; Fungicidas de Frutas/Vegetales: Carbendazim, Clorothalonil, EBDCs, Azufre, Tiofanato-metilo, Azoxistrobina, Cimoxanilo, Fluazinam, Fosetilo, Iprodiona, Kresoxim-metilo, Metalaxilo/mefenoxam, Trifloxistrobina, Ethaboxam, Iprovalícarb, Trifloxistrobina, Fenhexamid, Oxpoconazol fumarato, Ciazofamid, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobiña, Ciflufenamida, Boscalid; Herbicidas de Cereales: Isoproturon, Bromoxinilo, loxinilo, Fenoxies, Clorsulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluroxipir, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, Yodosulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafeno, Mesosulfuron, Beflubutamid, Pinoxaden, Amidosulfuron, Thífensulfuron, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfosulfuron, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralkoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas de Cereales: Carbendazim, Clorotalonilo, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinilo, Fenpropimorph, Epoxiconazol, Kresoxim-metilo, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Insecticidas de Cereales: Dimetoato, Lambda-cihaltrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, ß-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Clorfirifos, Metamidofos, Oxidemeton-metilo, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas del Maíz: Atrazina, Alachlor, Bromoxinilo, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-) Dimetenamid, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacilo, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Insecticidas del Maíz: Carbofuran, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronilo, Imidacloprid, Lambda-Cihalotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Spiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rynaxypyr, Deltametrina, Tiodicarb, ß-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirimfos, Etiprol, Cyazypyr, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Avermectina, Metiocarb, Spirodiclofeno, Spirotetramat; Fungicidas del Maíz: Fenitropan, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas del Arroz: Butachlor, Propanilo, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cihalofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulam, Bispyribac, Oxadiargilo, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Insecticidas del Arroz: Diazinon, Fenitrotion, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefuran, Fipronilo, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rynaxypyr, Deltametrina, Acetamiprid, Tiamethoxam, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, Emamectin-Benzoato, Cipermetrina, Clorpyrifos, Cartap, Methamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Carbofuran, Benfuracarb; Fungicidas del Arroz: Thiofanato-metilo. Azoxistrobina, Carpropamid, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquílon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocymet, Fenoxanilo, Simeconazol, Tiadinilo; Herbicidas del Arroz: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butilo, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Pirithiobac-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron: Insecticidas del Algodón: Acetato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abanríectina, Acetamiprid, Emamectina Benzoato, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-Cihalotrina, Spinosad, Tiodicarb, Gamma-Cihalotrina, Spiromesifeno, Piridalilo, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumuron, Rynaxypyr, Beta-Ciflutrina, Spirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, gamma Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalilo, Spiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endosulfan; Fungicidas del Algodón: Etridiazol, Metalaxilo, Quintozeno; Herbicidas del Haba de Soja: Alachlor, Bentazona, Trifluralin, Clorimuron-Etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Insecticidas de la Haba de Soja: Lambda-cihalotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, Emamectina-Benzoato, Fipronilo, Etiprol, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Spirotetramat, Spinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrin; Fungicidas de la Haba de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de la Remolacha: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedipham, Triallato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacilo, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas de la Remolacha: Imidacloprid, Clotianidina, Tiamethoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma/lambda Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rynaxypyr, Cyaxypyr, Fipronilo, Carbofuran; Herbicidas de la Colza: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina, Ethametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Clethodim, Tepraloxydim; Fungicidas de la Colza: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonilo, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Insecticidas de la Colza: Carbofuran, Organofosfatos, Piretroides, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofuran, ß-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Spinosad, Spinotoram, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a título ilustrativo y no a título limitativo.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES Ejemplo 1. Descubrimiento de nuevos genes plaguicidas a partir de Bacillus thurinqiensis Se identificaron nuevos genes plaguicidas a partir de la cepa bacteriana Zj22 usando las siguientes etapas: • Preparación de ADN extracromosómico a partir de la cepa. El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes: plásmidos de diverso tamaño; cromosomas fágicos; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas sin caracterizar.

• Cizallamiento mecánico o enzimático del ADN extracromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaños.

• Secuenciación del ADN fragmentado por métodos de pirosecuenciación de alto rendimiento.

• Identificación de genes de toxina putativos mediante análisis de homología y/u otros análisis computacionales.

• Cuando sea necesario, acabar la secuencia del gen de interés mediante una de varias estrategias de clonación o PCR (p.ej. TAIL-PCR).

Tabla 1. Nuevos genes identificados a partir de la cepa Zj22 El gen de la toxina descrito aquí se amplifica mediante PCR a partir de pAX980, y el producto de la PCR se clona en el vector de expresión de Bacillus pAX916, u otro vector adecuado, por métodos bien conocidos en la técnica. La cepa de Bacillus resultante, que contiene el vector con el gen axmi, se cultiva en un medio de crecimiento convencional, tal como el medio CYS (10 g/l de bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/l de KH2P04; 14 g/l de K2HP04; 0,5 mM de MgS04; 0,05 mM de MnCI2; 0,05 mM de FeS04), hasta que la esporulación resulta evidente mediante examen microscópico. Se prepararon muestras y se analizaron para detectar la actividad en bioensayos.

Ejemplo 2. Ensayos para Determinar la Actividad Plaguicida Las secuencias nucleotídicas de la invención se pueden ensayar para determinar su capacidad para producir proteínas plaguicidas. La capacidad de una proteina plaguicida para actuar como un plaguicida sobre una plaga se evalúa a menudo de diferentes maneras. Una manera bien conocida en la técnica es llevar a cabo un ensayo de alimentación. En tal ensayo de alimentación, se expone la plaga a una muestra que contiene compuestos a ensayar, o muestras de control. A menudo esto se lleva a cabo colocando el material a ensayar, o una dilución adecuada de tal material, sobre un material que ingerirá la plaga, tal como una dieta artificial. El material a ensayar puede estar compuesto de un líquido, sólido o una suspensión. El material a ensayar se puede colocar sobre la superficie y después se puede dejar secar. Como alternativa, el material a ensayar se puede mezclar con una dieta artificial fundida, y después se dispensa en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una copa, un plato, o un pocilio de una placa de microtitulación.

Los ensayos para plagas succionadoras (por ejemplo áfidos) pueden implicar separar el material de ensayo del insecto mediante una partición, idealmente una porción que puede ser perforada por las partes bucales succionadoras del insecto succionador, para permitir la ingestión del material de ensayo. A menudo, el material de ensayo se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de ensayo.

Otros tipos de ensayos pueden incluir microinyección del material de ensayo en la boca o intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgenicas, seguido del ensayo de la capacidad de la plaga para alimentarse con la planta transgenica. El ensayo con plantas puede implicar el aislamiento de partes de la planta normalmente consumidas, por ejemplo pequeñas jaulas unidas a una hoja, o el aislamiento de plantas completas en jaulas que contienen insectos.

Otros métodos y enfoques para evaluar plagas son conocidos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Ratón, FL. Como alternativa, los ensayos se describen de forma habitual en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology, o mediante discusión con miembros de la Entomological Society of America (ESA).

En algunas realizaciones, las regiones de ADN que codifican los dominios de toxina de delta-endotoxinas descritas aquí se clonan en el vector de expresión de E. coli pM AL-C4x detrás del gen malE que codifica la proteína de unión a maltosa ( BP). Estas fusiones en el marco dan como resultado la expresión de proteínas de fusión BP-Axmi en E. coli.

Para la expresión en E. coli, BL21*DE3 se transforman con plásmidos individuales. Se inoculan colonias individuales en LB suplementado con carbenicilina y glucosa, y se cultivan toda la noche a 37 °C. Al día siguiente, se inocula medio reciente con 1% de cultivo nocturno, y se cultiva a 37 °C hasta la fase logarítmica. Subsiguientemente, los cultivos se inducen con 0,3 mM de IPTG toda la noche a 20 °C. Cada pellet celular se suspende en 20 mM de tampón Tris-CI, pH 7,4 + 200 mM de NaCI + 1 mM dé DTT + inhibidores de proteasa, y se sometió a ultrasonidos. Se puede usar el análisis mediante SDS-PAGE para confirmar la expresión de las proteínas de fusión.

Extractos libres de células totales se hacen pasar entonces sobre una columna de amilosa unida a cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para la purificación por afinidad de proteínas de fusión MBP-axmi. Las proteínas de fusión unidas se eluyen de la resina con disolución de maltosa 10 mM. Las proteínas de fusión purificadas se escinden entonces con Factor Xa o tripsina para eliminar el marcador de MBP amino terminal de la proteína Axmi. La escisión y solubilidad de las proteínas se pueden determinar mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 3. Expresión y purificación de genes axmiz Se clonaron versiones truncadas de axmi221z y axmi222z en el vector de expresión de la proteína de unión a maltosa (MBP), lo cual dio como resultado pAX5092 y pAX5093, respectivamente. La expresión de la proteína de fusión resultante se indujo mediante IPTG. A continuación, la proteína se purificó en una columna de maltosa y se escindió con el factor proteasa Xa para generar la proteína purificada y no marcada. Las proteínas 6-his axmi221z y axmi222z truncadas también se purificaron en una columna de cobalto y se sometieron a bioanálisis.

Se clonaron versiones de longitud completa y truncadas de algunos genes en el vector pRSF-1 b como se muestra en la Tabla 2. En virtud de la clonación en este vector, la proteína expresada resultante contiene seis restos de istidina N-terminales adicionales.

Las regiones de ADN que codifican los dominios de la toxina de algunos genes se clonaron por separado en un vector de expresión de E. coli pMAL-C4x detrás del gen malE que codifica la proteina de unión a maltosa (MBP) como se muestra en la Tabla 2. Estas fusiones en el marco dieron como resultado la expresión de proteínas de fusión MBP-AXMI en E. coli. Cada una de las proteínas producidas a partir de los constructos anteriores se estudió en bioensayos como un pellet concentrado 10x.

Tabla 2: Constructos de Axmiz Para la expresión de la proteína en E. coli, BL2TDE3 se transformó con plásmidos individuales. Se inoculó una colonia individual en medio LB suplementado con carbenicilina y glucosa, y se cultivó toda la noche a 37 °C. Al día siguiente, se inoculó medio reciente con 1% de cultivo nocturno, y se cultivó a 37 °C hasta la fase logarítmica. Subsiguientemente, los cultivos se indujeron con 0,3 mM de IPTG toda la noche a 20 °C. Cada pellet celular se suspendió en 20 mM de tampón Tris-CI, pH 7,4 + 200 mM de NaCI + 1 mM de DTT + inhibidores de proteasa, y se sometió a ultrasonidos. El análisis mediante SDS-PAGE confirmó la expresión de las proteínas de fusión.

Se cargaron extractos libres de células totales sobre una FPLC equipada con una columna de amilosa, y las proteínas de fusión MBP-AXMI se purificaron mediante cromatografía de afinidad. Las proteínas de fusión unidas se eluyeron de la resina con disolución de maltosa 10 mM. Las proteínas de fusión purificadas se escindieron entonces con Factor Xa o tripsina para eliminar el marcador de MBP amino terminal de la proteína AXMIz. La escisión y solubilidad de las proteínas se determinó mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 4. Actividad de proteínas expresadas a partir de genes axmiz en Bioensavos El bioensayo de los genes Axmiz expresados dio como resultado la detección de las siguientes actividades en las plagas de insectos: Tabla 3. Actividad de Proteínas Expresadas en el Bioensayo Tabla 4. Actividad de Proteínas Expresadas en el Bioensayo BCW: Gusano negro CPB: Escarabajo de la patata DB : Polilla de dorso de diamante ECB: Barrenador del maíz europeo FAW: Gusano cogollero Hv: Helitothis virescens Hz: Heliothis zea SCB: Gusano barrenador del maíz del sur SWCB: Gusano barrenador del maíz del sudoeste VBC: Oruga de las leguminosas Ejemplo 5. Vectorización de Genes para la Expresión en Plantas Las regiones codificantes de la invención están conectadas con secuencias promotoras y terminadoras apropiadas para la expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en la técnica, y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis o el promotor 35S del CaMV para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o Pinll. Las técnicas para producir y confirmar constructos de promotor-gen-terminador también son bien conocidas en la técnica.

En un aspecto de la invención, se diseñan y generan secuencias de ADN sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia nucleotídica alterada con relación a la secuencia parental, pero codifican proteínas que son esencialmente idénticas a la secuencia parental. Véase, por ejemplo, la Tabla 4.

Tabla 4. Genes sintéticos que codifican proteínas AXMIz En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de los genes sintéticos, de forma que el péptido resultante se dirige a un orgánulo vegetal, tal como el retículo endoplásmico o el apoplasto.

Las secuencias peptídicas que se sabe que dan como resultado la dirección de las proteínas de fusión hacia orgánulos vegetales son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de la fosfatasa acida procedente del altramuz blanco Lupinus albus (GENBANK® ID Gl:14276838, Miller et al. (2001 ) P/anf Physiology 127: 594-606) es conocida en la técnica por provocar que proteínas heterólogas se dirijan hacia el retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención del retículo endoplásmico que comprende el péptido término N-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEC ID NO:33)) en el término C, la proteína de fusión se dirigirá al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia que la dirija hacia el retículo endoplásmico en el término C, la proteína se dirigirá hacia el retículo endoplásmico, pero finalmente será secuestrada en el apoplasto.

De este modo, este gen codifica una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos N-terminales del gen de la fosfatasa ácida procedente del altramuz blanco Lupinus albus (GENBANK® ID GM4276838, Miller ef al., 2001 , más arriba) fusionados al término N de la secuencia de aminoácidos de la invención, así como la secuencia KDEL en el término C. De este modo, se predice que la proteína resultante se dirigirá hacia el retículo endoplásmico de la planta con la expresión en una célula vegetal.

Los casetes de expresión vegetal descritos anteriormente se combinan con un marcador seleccionare vegetal apropiado, para ayudar a la selección de células y tejidos transformados, y se ligan en vectores de transformación de plantas. Estos pueden incluir vectores binarios procedentes de la transformación mediada por Agrobacterium o vectores plasmídicos simples para la transformación biolística.

Ejemplo 6. Transformación de Células de Maíz con los Genes de la Proteína Plaguicida Descritos en la Presente Es preferible recoger las espigas de maíz 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislan de las espigas, y se prefieren los embriones de un tamaño de 0,8-1 ,5 mm para uso en la transformación. Los embriones se colocan en placas con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como un medio DN62A5S (3,98 g/l de sales N6; 1 ml/l (de una disolución madre 1000x) de vitaminas N6; 800 mg/l de L-asparagina; 100 mg/l de mioinositol; 1 ,4 g/l de L-prolina; 100 mg/l de casaminoácidos; 50 g/l de sacarosa; 1 ml/l (de una disolución madre 1 mg/ml) de 2,4-D). Sin embargo, son adecuados medios y sales distintos de DN62A5S, y son conocidos en la técnica. Los embriones se incuban toda la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones toda la noche.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren sobre medio osmótico durante alrededor de 30-45 minutos y después se transfieren a una placa productora de haces (véanse, por ejemplo, la Publicación PCT n° WO/0138514 y la Patente U.S. n° 5.240.842).

Los constructos de ADN diseñados para los genes de la invención en células vegetales son acelerados en el tejido vegetal usando un acelerador de haces de aerosol, en condiciones esencialmente como las que se describen en la Publicación PCT n° WO/0138514. Tras dispararles con los haces, los embriones se incuban durante alrededor de 30 minutos en medio osmótico, y se colocan sobre medio de incubación toda la noche a 25 °C en la oscuridad. Para evitar dañar innecesariamente a los explantes disparados con los haces, se incuban durante al menos 24 horas antes de transferirlos a medio de recuperación. Los embriones se extienden entonces sobre medio del período de recuperación, durante alrededor de 5 días, a 25 °C en la oscuridad, y después se transfieren a medio de selección. Los explantes se incuban en medio de selección durante un período de hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Tras el período de selección, el callo resultante se transfiere a un medio de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se exponen entonces a poca luz, y se inicia el proceso de regeneración por métodos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se dejan enraizar en medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas para su crecimiento y se propagan como plantas transgenicas.

Materiales Medio DN62A5S El pH de la disolución se ajusta hasta pH 5,8 con 1 N de KOH/1 N de KCI, se añade Gelrite (Sigma) a una concentración de hasta 3 g/l, y el medio se somete a autoclave. Tras enfriar hasta 50 °C, se añaden 2 ml/l de una disolución madre 5 mg/ml de nitrato de plata (Phytotechnology Labs).

Ejemplo 7. Transformación de los genes de la invención en Células Vegetales mediante Transformación Mediada por Aarobacterium Las espigas se recogen preferentemente 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislan de las espigas, y se prefieren aquellos embriones de un tamaño de 0,8-1 ,5 mm para uso en la transformación. Los embriones se colocan en placas con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, y se incuban toda la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones toda la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para la transferencia mediada por el plásmido Ti, durante alrededor de 5-10 minutos, y después se cultivan en placas sobre medio de co-cultivo durante alrededor de 3 días (25 °C en la oscuridad). Tras el co-cultivo, los explantes se transfieren a medio de período de recuperación durante alrededor de cinco días (a 25 °C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medio de selección durante un tiempo de hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Tras el período de selección, el callo resultante se transfiere a un medio de maduración de embriones hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se exponen entonces a poca luz, y se inicia el proceso de regeneración como es conocido en la técnica.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de pericia de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan aquí como referencia en el mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicase específica e individualmente para ser incorporada como referencia.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a título ilustrativo y de ejemplo con fines de claridad de comprensión, será obvio que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia nucleotidica se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia nucleotidica expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 1-20; b) una secuencia nucleotidica que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32; c) una secuencia nucleotidica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21, 22 y 24-32.

2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 , en la que dicha secuencia nucleotidica es una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta.

3. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 , en la que dicha secuencia nucleotidica está ligada operablemente a un promotor que dirige la expresión de dicha secuencia nucleotidica en una célula vegetal.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1.

5. El vector de la reivindicación 4, que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

6. Una célula hospedante que contiene el vector de la reivindicación 4.

7. La célula hospedante de la reivindicación 6, que es una célula hospedante bacteriana.

8. La célula hospedante de la reivindicación 6, que es una célula vegetal.

9. Una planta transgenica que comprende la célula hospedante de la reivindicación 8.

10. La planta transgenica de la reivindicación 9, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, haba de soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza.

11. Una semilla transgenica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

12. Un polipéptido recombinante con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32; y b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32.

13. El polipéptido de la reivindicación 12, que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

14. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 12.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, polvo fino, pellet, gránulo, pulverización, emulsión, coloide, y disolución.

16. La composición de la reivindicación 14, en la que dicha composición se prepara mediante deshidratación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas.

17. La composición de la reivindicación 14, que comprende desde alrededor de 1% hasta alrededor de 99% en peso de dicho polipétido.

18. Un método para controlar una población de una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros, que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipétido de la reivindicación 12.

19. Un método para exterminar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos, o dípteros, que comprende poner en contacto dicha plaga, o alimentar a dicha plaga, con una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipétido de la reivindicación 12.

20. Un método para producir un polipétido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 6 en condiciones en las cuales se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipétido.

21. Una planta que tiene incorporado de forma estable en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia nucleotídica se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia nucleotídica expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 1-20; b) una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32; y c) una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32.

22. La planta de la reivindicación 21 , en la que dicha planta es una célula vegetal.

23. Un método para proteger una planta de una plaga, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido plaguicida, en el que dicha secuencia nucleotídica se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia nucleotídica expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 1-20; b) una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32; y c) una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida frente a una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos, o dípteros.

25. Un método para incrementar el rendimiento en una planta, que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de la misma que tiene incorporado de forma estable en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, en el que dicha secuencia nucleotídica se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia nucleotídica expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 1-20; b) una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32; y c) una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 23, 21 , 22 y 24-32; en el que dicho campo está infestado con una plaga frente a la cual dicho polipéptido tiene actividad plaguicida.