ES2647595T3 - Genes delta-endotoxina AXMI221Z, AXMI222Z, AXMI223Z, AXMI224Z, y AXMI225Z y métodos para su uso - Google Patents

Genes delta-endotoxina AXMI221Z, AXMI222Z, AXMI223Z, AXMI224Z, y AXMI225Z y métodos para su uso Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 8, 13 o 18; b) una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27 o 28; y c) una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 o 28.

Description

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hibridación y L es la longitud el híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (en la concentración iónica y el pH definidos) en el que se hibrida un 50 % de la secuencia diana complementaria con una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de mal apareamiento; por tanto, las condiciones de Tm, hibridación y/o lavado pueden ajustarse para la hibridación con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con un ≥90 % de identidad, la Tm puede disminuirse 10 ºC. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C menos que el punto de fusión térmico Tm de la secuencia específica y su complemento a una concentración iónica y un pH definidos. Sin embargo, unas condiciones muy rigurosas pueden emplear una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C más bajos que el punto de fusión térmico Tm; las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C menos que el punto de fusión térmico Tm; las condiciones de poca rigurosidad pueden utilizar un hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20 °C menos que el punto de fusión térmico Tm. Al aplicar la ecuación, las condiciones de hibridación y lavado y el Tm deseado, las personas especializadas en la técnica entenderán que las variaciones de la rigurosidad de hibridación y/o la solución de lavado están descritas inherentemente. Si el grado de mal apareamiento deseado tiene como resultado un Tm de menos de 45 ºC (solución acuosa) o 32 ºC (solución de formamida), es preferente aumentar la concentración SSC para que se pueda emplear una temperatura más alta. Se puede encontrar una extensa guía de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridación with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York)
Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas
La presente invención abarca también proteínas plaguicidas. Se entiende por “proteína plaguicida" una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuestos en las SEQ ID NO: 27 o 28. Se proporcionan también los fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de los mismos y se pueden utilizar para poner en práctica los métodos de la presente invención, siempre y cuando tengan al menos 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 27 o 28 y tengan actividad plaguicida. Por tanto, la presente invención proporciona a polipéptido recombinante con actividad plaguicida seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 27 o 28; y b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 27 o 28, preferentemente que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas. "Proteína aislada" se utiliza para referirse a una proteína que no es más larga que en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una bacteria recombinante o una célula huésped de la planta. Se utiliza una "proteína aislada" o una "proteína recombinante" para referirse a una proteína deja de estar en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una bacteria recombinante o una célula de la planta huésped.
"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptido que comprenden aminoácidos que tienen al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 27 o 28 y que presentan actividad plaguicida. Una poción biológicamente activa de una proteína plaguicida puede ser un polipéptido que por ejemplo, es de 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de longitud. Dichas porciones biológicamente activas se pueden preparar a través de técnicas de recombinación y evaluarse en cuanto a su actividad plaguicida. Los métodos para medir la actividad plaguicida son muy conocidos en la técnica. Véase por ejemplo Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente Estadounidense No. 5.743.477.
Se entiende por “variantes” proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27 o 28. Las variantes incluyen también polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con la molécula de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 27 o 28, o un complemento de la misma en condiciones rigurosas siempre y cuando tenga al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27 o 28 y que tiene actividad plaguicida. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las variantes de proteínas que abarca la presente invención son biológicamente activas, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, se retiene la actividad plaguicida. En algunas realizaciones, las variantes tienen una mejor actividad en relación con la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad plaguicida son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense No. 5.743.477.
Los genes bacterianos, como los genes axmi genes, de la presente invención, muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en proximidad con el inicio del marco de lectura abierto. Frecuentemente, la iniciación de la traducción en uno o más de dichos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Dichos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias como Bacillus sp reconocen también el codón GTG como codón de inicio y proteínas que inician la traducción en codones GTG
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Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y la patente estadounidense Nos. 5.605.793 y
5.837.458.
El intercambio o barajado de dominio es otro mecanismo para generar proteínas plagucidas alteradas. Se pueden intercambiar los dominios entre las proteínas plaguicidas, con el resultado de toxinas híbridas o quiméricas con mejor actividad plaguicida o espectro diana. Los métodos para generar proteínas recombinantes y someterlas a ensayo para determinar su actividad plaguicida son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).
Vectores
Se puede proporcionar una secuencia plaguicida de la invención en un casete de expresión para su expresión en una planta de interés. Se entiende por “casete de expresión en una planta” una construcción de ADN que es capaz de tener como resultado la expresión de una proteína desde un marco de lectura abierta en una célula de la planta. Normalmente, contienen un promotor y una secuencia codificante. Frecuentemente, dichas construcciones contendrán también una región sin traducir 3’. Dichas construcciones pueden contener una “secuencia de señal” o una “secuencia líder” para facilitar el transporte de co-traducción o post-traducción del péptido para ciertas estructuras intracelulares, como cloroplastos (u otros plásticos), retículo endoplástico o aparato de Golgi.
Se entiende por “señal de secuencia” una secuencia conocida o que supuestamente tiene como resultado el transporte del péptido de co-traducción o post-traducción a través de la membrana celular. En las eucariotas, esto implica normalmente la secreción en el aparato de Golgi, con cierta glucosilación resultante. Las toxinas insecticidas de la bacteria se sintetizan frecuentemente como protoxinas, que se activan proteolíticamente en el intestino de la plaga diana (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia de señal está localizada en la secuencia nativa o puede derivarse de una secuencia de la invención. Se entiende por “secuencia líder” cualquier secuencia que, cuando se traduce, tiene como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte de co-traducción de la cadena de péptido a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líder dirigidas al transporte y/o glucosilación a través de su paso al retículo endoplásmico, el paso a vacuolas, plástidos, incluyendo cloroplastos, mitocondrias y similares.
Se entiende por “vector de transformación de planta” una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula de la planta. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión en la planta y puede organizarse en más de una molécula de ADN “vector”. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas en los que se utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de activación cis-y trans-para la transformación de células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferirse entre células huésped diferentes. “Vector de expresión” se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña. El casete incluirá secuencias reguladoras 5’ y 3’ unidas operativamente a una secuencia de la invención. Se entiende por “operativamente unido” una unión funcional entre una secuencia promotora y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde una segunda secuencia. Generalmente, operativamente unido significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen están contiguas y, cuando es necesario juntar dos regiones que codifican proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener además al menos un gen adicional para so co-transformación en el microorganismo. Alternativamente, el (los) gen(es) adicional(es) puede(n) proporcionarse sobre casetes de expresión múltiple.
“Promotor” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación en dirección 3’. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción o traducción (también denominadas “secuencias de control”) son necesarias para la expresión de la secuencia de ADN de interés.
Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia plaguicida que está bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.
El casete de expresión incluirá en la dirección 5’-3’ de la transcripción una región de iniciación de la transcripción o traducción (es decir, promotor), una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación de la transcripción o traducción (es decir una región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo para el huésped de la planta y/o la secuencia de ADN de la invención. Asimismo, el promotor puede ser la secuencia natural o, alternativamente, una secuencia sintética. Cuando el promotor es “nativo” u “homólogo” para la planta huésped, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es “extraño” o “heterólogo” para la secuencia de ADN de la invención,
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se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN de la invención unida operativamente.
La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN unida operativamente de interés, puede ser nativa con el huésped de la planta o puede derivarse de otra fuente (es decir extraña o heteróloga para el promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped de la planta o una combinación de ellos). Las regiones de terminación convenientes están disponibles en el Ti-plásmido de A. tumefaciens, como por ejemplo las regiones de terminación octopina sintasa o nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Cuando sea apropiado, se puede optimizar el gen(es) para aumentar la expresión en la célula huésped transformada. Es decir, se pueden sintetizar los genes utilizando los codones preferentes para la célula huésped para una mejor expresión o se pueden sintetizar utilizando codones en la frecuencia de uso del codón preferente del huésped. Generalmente, el contenido en GC del gen aumentará. Véase por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 sobre una explicación del uso del codón preferente de huésped. En la técnica se dispone de métodos para sintetizar genes preferentes para plantas. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos.
5.380.831 y 5.436.391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
En una realización, la proteína plaguicida se dirige a cloroplasto para expresión. De esta manera, cuando no se inserta directamente la proteína plaguicida en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína plaguicida a los cloroplastos. Dichos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
El gen plaguicida que se dirige al cloroplasto se puede optimizar para la expresión en el cloroplasto para contabilizar las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y sus orgánulos. De esta manera, se pueden sintetizar los ácidos nucleicos de interés utilizando codones preferentes para cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.380.831.
Transformación de planta
Los métodos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótido en una planta. Se entiende por “introducir” presentar a la planta la construcción de nucleótido de manera que la construcción accede al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren el uso de un método en particular para introducir una construcción de nucleótido en una planta, únicamente que la construcción de nucleótido acceda al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótido en las plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.
Se entiende por “planta” plantas enteras, órganos de la planta (p.ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células de la planta, propágulos, embriones, células de la hoja, células de la raíz, células del floema, polen).
"Planta transgénica" o "plantas transformadas " o plantas o células o tejidos "establemente transformados” se refiere a plantas en las que se ha incorporado o integrado en la célula de la planta secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenos. Dichas secuencias de ácido nucleico incluyen las que son exógenas, o no están presentes en una célula de la planta sin transformar, así como aquellas que pueden ser endógenas o están presentes en la célula de la planta sin transformar. “Heterólogo” se refiere generalmente a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas para la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes y se ha añadido a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similar.
Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las nuevas secuencias de toxina divulgadas en el presente documento. En diversas realizaciones, la planta transgénica comprende además uno o más genes adicionales para resistencia a insectos (p.ej., cry1 como los miembros de las familias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E y Cry1F; Cry2, como los miembros de la familia cry2A; Cry9, como los miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; etc.). Las personas especializadas en la técnica podrán deducir que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que imparta una característica agronómica de interés.
La transformación de las células de la planta se puede llevar a cabo a través de una entre las distintas técnicas conocidas en la técnica. El gen plaguicida de la invención se puede modificar para obtener o potenciar la expresión en las células de la planta. Normalmente, la construcción que expresa dicha proteína contendrá un promotor para activar la transcripción del gen, así como una región sin traducir 3’ para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de dichas construcciones es muy conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil obtener por ingeniería genética el gen, de manera que el péptido resultante se segrega o se dirige de
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otra forma dentro de la célula de la planta. Por ejemplo, se puede obtener por ingeniería genética un gen para que contenga un péptido de señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. Puede ser asimismo preferente obtener por ingeniería genética el casete de expresión de la planta para que contenga un intrón, de manera que se requiera el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.
Normalmente, se insertará dicho “casete de expresión de la planta” en un “vector de transformación de la planta”. Dicho vector de transformación de la planta puede constar de uno o más vectores de ADN necesarios para conseguir la transformación de la planta. Por ejemplo, dentro de la práctica habitual de la técnica se suele utilizar vectores de transformación de la planta que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Dichos vectores suelen denominarse en la técnica “vectores binarios”. Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se utilizan sobre todo para la transformación mediada por Agrobacterium, en la que el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para conseguir una transformación eficiente son considerables y resulta ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios contienen normalmente un vector de plásmido que contiene las secuencias que actúan en cis-requeridas para la transferencia de ADN-T (como el borde de la izquierda y el borde de la derecha), un marcador genético que se obtiene por ingeniería genética para que sea capaz de expresión en una célula de la planta y un “gen de interés” (un gen obtenido por ingeniería genética para que sea capaz de la expresión en una célula de la planta para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en dicho vector de plásmido secuencias necesarias para replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis-están dispuestas de modo que permiten una transferencia eficiente en las células de la planta y la expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador genético y el gen plaguicida están localizados entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo el segundo vector de plásmido contiene factores que actúan en trans-que median la transferencia de ADN-T desde Agrobacterium a células de la planta. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium y la transferencia de ADN por escisión en secuencias del borde y la transferencia de ADN mediada por vir, tal como se entiende en la técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Se pueden utilizar varios tipos de cepas de Agrobacterium (p.ej. LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de la planta. El segundo vector de plásmido no es necesario para transportar las plantas a través de otros métodos como microproyección, microinyeccion, electroporacion, polietilen glicol, etc.
En general, los métodos de transformación de la planta implican la transferencia de ADN heterólogo a las células de la planta diana (p.ej., embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador genético) para recuperar las células de la planta transformadas de un grupo de masa celular sin transformar. Normalmente se transfieren explantes a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan según lo habitual. A continuación, se diferencian las células transformadas en los brotes después de colocarlos en medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. A continuación, se transfieren los brotes a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar el brote de la raíz o la plántula. A continuación, la plántula transgénica crece en una planta madura y produce semillas fértiles (p.ej. Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Normalmente, se transfieren los explantes a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan según lo habitual. En Ayres and Park (1994) critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120 se ofrece una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas. Dado que el material transformado contiene muchas células, tanto las células transformadas como no transformadas están presentes en cualquier pieza del callo o tejido o grupo de células diana sujetado. La capacidad para eliminar células no transformadas y permitir que proliferen las células transformadas tiene como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad para separar las células no transformadas limita la rápida recuperación de las células vegetales transformadas y la generación con éxito de plantas transgénicas.
Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir la secuencia de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de la planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, a la que se dirige la transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse a través de uno entre varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, microinjerto, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo a través de Agrobacterium en las células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de las células de la planta con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración balística de partículas, transformación de haz con aerosol (solicitud estadounidense publicada No. 20010026941; patente estadounidense No. 4,945,050; publicación internacional No. WO 91/00915; publicación estadounidense publicada No. 2002015066), transformación Lec1 y otros métodos de transferencia de ADN diversos sin la mediación directa de partículas.
Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro por pistola de partículas de ADN que contienen un marcador genético y dirigir el ADN al genoma del plástido por recombinación homóloga. Asimismo, se puede llevar a cabo la transformación del plástido por transactivación de un transgen soportado en un plástido silente por expresión preferente de tejido de una ARN polimerasa codificada por el núcleo dirigida a plástido. Dicho sistema ha sido notificado por McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
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uso en particular. Dichos genes han sido notificados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (bromoxynil resistance nitrilase gene); y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (AHAS imidazolinone resistance gene). Asimismo, los genes divulgados en el presente documento son útiles como marcadores para evaluar la transformación de bacterias o células vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgen en una planta, órgano de la planta (p.ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, célula de la planta, propágulo, embrión o progenie de la misma, son muy conocidos dentro de la técnica. En una realización, se detecta la presencia del transgen sometiendo a ensayo la actividad plaguicida.
Es posible someter a ensayo las plantas fértiles que expresan una proteína plaguicida para determinar su actividad plaguicida y seleccionarse las plantas que presentan una actividad óptima para seguir cultivándolas. En la técnica se dispone de métodos para determinar la actividad ante las plagas. Generalmente, se mezcla la proteína y se utiliza en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.
La presente invención se puede utilizar para transformar cualquier especie de planta, incluyendo, sin limitarse a ellas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Entre los ejemplos de plantas de interés se incluyen, sin limitarse a ellas, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuete, batata, mandioca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higos, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendra, nueces, verduras, ornamentales y coníferas.
Entre las verduras se incluyen, sin limitarse a ellas, tomates, lechuga, judías verdes, frijoles de lima, guisantes y miembros del género Curcumis como pepino, cantalupo y melón. Entre las ornamentales se incluyen, sin limitarse a ellas, azalea, hortensias, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, poinsetia y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, etc.).
Uso en el control plaguicida
Los métodos generales para emplear las cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención o una variante de la misma en el control plaguicida o la obtención por ingeniería genética de otros organismos como agentes plaguicidas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.039.523 y la patente europea EP 0480762A2.
Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido alterados genéticamente para contener un gen y una proteína plaguicida se pueden utilizar para proteger cultivos y productos agrícolas contra las plagas. En un aspecto de la invención, se tratan células enteras, es decir, sin lisar, de un organismo que produce toxina (plaguicida) con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando se aplica la célula en el entorno de la(s) plaga(s) diana.
Alternativamente, se produce el plaguicida introduciendo un gen plaguicida en un huésped celular. La expresión del gen plaguicida tiene como resultado de forma directa o indirecta la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. En un aspecto de la presente invención, estas células se tratan después en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando se aplica la célula en el entorno de la(s) plaga(s) diana. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos plaguicidas encapsulados de forma natural se pueden formular entonces de acuerdo con las técnicas convencionales para su aplicación en el entorno que alberga la plaga diana, p.ej. suelo, agua y follaje de las plantas. Véase por ejemplo la solicitud de patente europea EPA 0192319 y las referencias que se citan en ella. Alternativamente, es posible formular las células que expresan un gen de la presente invención para permitir la aplicación del material resultante como un plaguicida.
Los principios activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y se pueden aplicar sobre el área del cultivo o la planta que se va a tratar, simultáneamente o de forma sucesiva con otros compuestos. Dichos compuestos pueden ser fertilizantes, agentes de eliminación de malas hierbas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites inactivantes, polímeros y/o formulaciones vehículos de liberación en el tiempo o biodegradables que permiten la dosificación a largo plazo de un área diana tras una única aplicación de la formulación. Pueden ser asimismo herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bacteriocidas, nematocidas, moluscocidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, en combinación con otros vehículos, tensioactivos o adyuvantes promotores de la aplicación agrícolamente aceptables, empleados habitualmente en la técnica de la formulación. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos en correspondencia con las sustancias empleadas normalmente en la tecnología de la formulación, p.ej. sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes de humectación, agentes de pegajosidad, aglutinantes y fertilizantes. De igual modo, se pueden preparar las formulaciones en “cebos” comestibles o configurarlos como “trampas” para plagas que den cabida a que la plaga diana se alimente o digiera la formulación plaguicida.
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El orden de los Lepidoptera incluye las familias Papilionidae,
Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae,
Satyridae,
Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae y
Tineidae.
Las plagas de insectos de la invención para cultivos principales incluyen Maíz: Ostrinia nubilalis, taladro del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusanos grises; Helicoverpa zea, gusano elotero; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del suroester; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del maíz; Diatraea saccharalis, barrenador del tallo de la caña de azúcar; diabrotica virgifera, gusano alfilerillo del maíz; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos del alambre; Cyclocephala borealis, escarabajo roedor enmascarado del norte (escarabajo blanco); Cyclocephala immaculata, escarabajo roedor enmascarado del sur (escarabajo blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja del maíz; anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura, mosca de los sembrados; Agromyza parvicornis, laminador de la hoja del maíz; Anaphothrips obscrurus, mosquito relámpago; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano elotero; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del maíz; Feltia subterranea, gusano cortador de gránulo; Phyllophaga crinita, escarabajo blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., gusanos del alambre; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de la hoja de maíz; Sipha flava, pulgón de la caña de azúcar amarillo; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, arañita roja carmín; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Trigo: Pseudaletia unipunctata, oruga militar; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador del oeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del maíz; Oulema melanopus, babosilla del trigo; Hypera punctata, gorgojo de la alfalfa; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón del trigo ruso; Schizaphis graminum, pulgón verde; Macrosiphum avenae, pulgón del grano inglés; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differential, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, langosta migratotoria; Mayetiola destructor, mosca de Hessian; Sitodiplosis mosellana, mosquita del trigo; Meromyza americana, gusanos del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca de bombilla del trigo; Frankliniellafusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca sierra del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro de los bulbos; Girasol: Suleima helianthana, polilla del brote de girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla del girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano del brote del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Spodoptera exigua, oruga militar de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado; Anthonomus grandis, gorgojo del algodón; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomo scelis seriatus, pulga saltona del algodonero; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca; Lygus lineolaris, chinche Lygus; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamonete diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, arañita roja carmín; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano elotero; Colaspis brunnea, colapsis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo acuático del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, pulga saltona del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chiche apestosa verde; Soja: Pseudoplusia includens, falsa medidora; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde de la soja; Ostrinia nubilalis, barrenador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, oruga militar de la remolacha; Heliothis virescens, gusano del brote de algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo del frijol mejicano; Myzus persicae, pulgón del melocotón verde; Empoasca fabae, pulga saltadora de la patata; Acrosternum hilare, chinche hedionda verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, mosca de los sembrados; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña roja de las fresas; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Blissus leucopterus leucopterus, chinches; acrosternum hilare, chinches verdes comunes; Euschistus servus, chinche café apestosa; Delia platura, mosca de los sembrados; Mayetiola destructor, mosca de Hessian; Petrobia latens, ácaro tetraníquido; Colza oleaginosa: Brevicoryne brassicae, pulgón de la calabaza; Phyllotreta cruciferae, escarabajo pulga; Mamestra configurata, oruga militar de Bertha; Plutella xylostella, palomilla de dorso de diamante; delia ssp., gusanos de las raíces.
Los nematodos incluyen nematodos parásitos como nematodos de nódulo en la raíz, quísticos y de lesión, entre los que se incluyen Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; en particular miembros de los nematodos quísticos incluyendo, pero sin limitarse a ellos Heterodera glycines (nematodo quístico de la soja); Heterodera schachtii (nematodo quístico de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo quístico del cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos quísticos de la patata). Entre los nematodos de lesión se incluye Pratylenchus spp.
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Ejemplo 4. Actividad de proteínas expresadas desde genes axmiz en bioensayos. El bioensayo de los genes Axmiz expresados tuvo como resultado la observación de las siguientes actividades sobre las plagas de insectos: Tabla 3. Actividad de proteínas expresadas en bioensayo
Plásmidos
Gen BCW CPB DBM ECB FAW
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axmi221z longitud completa Detención fuerte, >75 % mortalidad
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axmi221z trun2 Detención fuerte >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad
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axmi221z trun2 Detención Detención fuerte, sin mortalidad
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axmi221z trun2 Detención fuerte, >75 % mortalidad
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axmi222z longitud completa
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axmi222z longitud completa Detención ligera, sin Mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad
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axmi222z trun2
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axmi222z trun2
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axmi222z trun2 Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, sin mortalidad
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axmi223z longitud completa Detención, sin mortalidad Detención fuerte Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, sin mortalidad
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axmi223z inicio alt Detención, sin mortalidad Detención fuerte Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, sin mortalidad
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axmi224z inicio alt Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, sin mortalidad
pAX6890
axmi224z inicio alt Detención ligera, <<5 sin mortalidad % mortalidad 5 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención, sin mortalidad
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axmi225z trun Detención ligera, sin mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención fuerte, >75 % mortalidad Detención, sin mortalidad
Tabla 4. Actividad de proteínas expresadas en bioensayo
Plásmido
Gen Hv Hz SCB SWCB VBC
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Axmi221z longitud completa Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, <25 % Mortalidad
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Axmi221z longitud completa Detención intensa, sin Mortalidad Detención intensa, <25 % Mortalidad
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Axmi221z trun2 Detención intensa, <25 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad
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Axmi221z trun2 Detención intensa, sin Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, <25 % Mortalidad
Plásmido
Gen Hv Hz SCB SWCB VBC
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Axmi221z trun2 Detención intensa, <25 % Mortalidad
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Axmi222z longitud completa Detención fuerte, >75 % Mortalidad
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Axmi222z longitud completa Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad
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Axmi222z trun2 Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad
pAX5096
Axmi222z trun2 Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad
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Axmi222z trun2 Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad
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axmi223z longitud completa Detención, sin mortalidad Detención, sin mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención intensa, sin Mortalidad
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axmi223z inicio alt Detención fuerte, <25 % Mortalidad Detención intensa, <75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención intensa, No Mortalidad
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Axmi224 inicio alt Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte, <25 % Mortalidad Detención intensa, sin Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad
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axmi224z inicio alt Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte, sin Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad
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axmi225z trun Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte, >75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad Detención fuerte,>75 % Mortalidad
BCW: gusano cortador negro CPB: escarabajo colorado de la patata
5 DBM: Palomilla de dorso de diamante ECB: barrenador del maíz europeo FAW: Cogollero del maíz Hv: Helitothis virescens Hz: Heliothis zea
10 SCB: barrenador del maíz del sur SWCB: barrenador del maíz del suroeste VBC: Oruga de las leguminosas
Ejemplo 5. Vectorización de genes para expresión en plantas
15 Se conectan las regiones codificantes de la invención con secuencias promotoras y de terminación adecuadas para la expresión en plantas. Dichas secuencias son muy conocidas dentro de la técnica y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis o el promotor CaMV 35S para la expresión en dicotiledóneas y los terminadores nos o PinII. Las
20 técnicas para producir y confirmar las construcciones promotor-gen-terminador son muy conocidas en la técnica.
En un aspecto de la invención, se designan y se generan las secuencias de ADN sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de nucleótidos alterada en relación con la secuencia parental, pero codifica proteínas que son esencialmente idénticas para la secuencia parental. Véase, por ejemplo, la Tabla 4.
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Claims (1)

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