CN104884625A - 增强cry内毒素的活性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于增强植物对植物害虫的抗性的方法和组合物。本发明提供了嵌合杀虫多肽和编码所述嵌合杀虫多肽的核酸分子。所述嵌合杀虫多肽包含有效连接到含有杀虫活性的多肽的溶解性增强多肽。所述核酸分子可用于表达盒以产生具有对植物害虫增强的抗性的转化植物。本发明还提供了转化植物、植物组织、植物细胞、其他宿主细胞和种子以及杀虫组合物。

Description

增强CRY内毒素的活性的方法和组合物
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2012年10月15日提交的美国临时申请No.61/713,844的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
创建于2013年9月17日、大小为158kb并与本说明书同时提交的文件名为“3113PCT_SequenceListing.txt”的作为ASCII格式序列表以电子方式提交的序列表的正式拷贝是本说明书的一部分并以引用方式并入本文，如同以全文示出一样。
技术领域
本发明整体涉及植物分子生物学和植物害虫防治，更具体地讲，涉及用于增强来自芽孢杆菌属(Bacillus spp.)的杀虫多肽的活性并保护植物免受植物害虫尤其是昆虫害虫损害的组合物和方法。
背景技术
害虫(例如昆虫害虫)是造成全世界农作物损失的主要因素。例如，玉米根虫和棉籽象鼻虫损害可以在经济上给农作物生产者带来毁灭性的打击。每年玉米根虫单独造成的与昆虫害虫相关的农作物损失已达到十亿美元。
传统上，防治昆虫害虫(例如玉米根虫)的主要方法是作物轮作和施用广谱、合成的化学杀虫剂。然而，消费者和政府监管者都越来越重视与化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。由于这些关注，监管者已禁止或者限制了一些危害比较大的化学杀虫剂的使用。因此，人们有极大的兴趣开发具有更低的污染风险和环境危害以及与化学杀虫剂的特征相比提供更高的靶标特异性的化学杀虫剂的替代方案。
芽孢杆菌属(Bacillus)中的某些种具有对多种昆虫害虫具有杀虫活性的多肽，这些昆虫害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目以及其他中的那些。例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和日本金龟芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今为止发现具有杀虫活性的最成功的物种。幼虫芽孢杆菌(Bacillus larvae)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的菌株也被指出具有这种杀虫活性。参见Biotechnology Handbook 2：Bacillus(Harwood ed.，PlenumPress 1989)(《生物技术手册2：芽孢杆菌》，Harwood编辑，Plenum出版社，1989年)；和国际专利申请公布No.WO 96/10083。
来自芽孢杆菌属的杀虫多肽包括结晶(Cry)内毒素、细胞溶解(Cyt)内毒素、植物性蛋白(VIP)等等。参见例如Bravo et al.(2007)Toxicon 49：423-435(Bravo等人，2007年，《毒素》，第49卷，第423-435页)。Cry内毒素(也称为δ-内毒素)是从苏云金芽孢杆菌的多种菌株中隔离出来的。Cry内毒素的共同特点是它们在生长的稳定期内表达，因为它们通常在母细胞区室中积累以形成可以占形成孢子的细胞干重23％-30％的结晶内含物。Cry内毒素最初以无活性原毒素形式产生，该形式通过昆虫肠道中蛋白酶的作用而蛋白水解转化为活性内毒素。一旦具有活性，内毒素就结合至肠道上皮细胞并形成阳离子选择性通道，造成细胞溶解并随后死亡。参见Carrollet al.(1997)J.Invertebr.Pathol.70：41-49(Carroll等人，1997年，《无脊椎动物病理学杂志》，第70卷，第41-49页)；Oppert(1999)Arch.InsectBiochem.Phys，42：1-12(Oppert，1999年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第42卷，第1-12页)；以及Rukmini et al.(2000)Biochimie 82：109-116(Rukmini等人，2000年，《生物化学》，第82卷，第109-116页)。
虽然Cry内毒素通常对于昆虫害虫高度有效，但是一些昆虫害虫不受它们的影响或表现出低易感性。同样，一些昆虫害虫已经产生对Cry内毒素的抗性，这对其有效性造成了威胁。解决这些问题的方法包括通过定点诱变、通过在内毒素的特定区域中引入裂解位点或通过使小片段从内毒素的氨基末端缺失，来增强或扩展Cry内毒素活性。参见例如Abdullah&Dean(2004)Appl.Environ.Microbiol.70：3769-3771(Abdullah和Dean，2004年，《应用与环境微生物学》，第70卷，第3769-3771页)；Pardo-Lópezet al.(2009)Peptides 30：589-595(Pardo-López等人，2009年，《肽》，第30卷，第589-595页)；Rajamohan et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14338-14343(Rajamohan等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第14338-14343页)；以及Wu et al.(2000)FEBS Lett.473 227-232(Wu等人，2000年，《欧洲生化学会联合会快报》，第473卷，第227-232页)。然而，这些方法可能耗时且不一定产生所需的结果。
出于上述原因，需要增强Cry内毒素的杀虫活性的组合物和方法。
发明内容
本发明提供了用于增强Cry内毒素的杀虫活性并用于保护植物免受植物害虫(诸如昆虫害虫)损害的组合物和方法。该组合物包含编码嵌合杀虫多肽的核酸分子、其变体和片段，以及嵌合杀虫多肽、其活性变体和片段。本发明的嵌合杀虫多肽包含融合到Cry内毒素或其生物活性片段的溶解性增强多肽。本发明还提供了包含编码本发明的嵌合杀虫多肽的核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，以及包含编码所述嵌合杀虫多肽的表达盒或多核苷酸构建体的细菌、植物、植物器官、植物组织、植物部分、植物细胞和种子。本发明还提供了包含至少一种本发明的嵌合杀虫多肽的杀虫组合物。
本发明提供了用于增强Cry内毒素的杀虫活性的方法。该方法涉及制备嵌合杀虫多肽，该嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素或其生物活性片段的氨基酸序列的溶解性增强多肽氨基酸序列。这种嵌合杀虫多肽可通过将溶解性增强多肽氨基酸序列融合到Cry内毒素或其生物活性片段的氨基酸序列而制备。作为另一种选择，该方法涉及制备包含编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列的多核苷酸构建体，并用该多核苷酸构建体转化所关注的生物体或非人类宿主细胞以表达所述嵌合杀虫多肽。编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列可通过例如将编码溶解性增强多肽的核苷酸序列有效连接到编码Cry内毒素或其生物活性片段的核苷酸序列而制备。通常，多核苷酸构建体还包含驱动生物体或宿主细胞中的表达的启动子，其中启动子有效连接到编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列。
因此，本发明提供了用于制备包含编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列的多核苷酸构建体的方法，该嵌合杀虫多肽包含融合到Cry内毒素或其生物活性片段的氨基酸序列的溶解性增强多肽氨基酸序列。该方法涉及将编码溶解性增强多肽的核苷酸序列有效连接到编码Cry内毒素或其生物活性片段的核苷酸序列。多核苷酸构建体还可以包含有效连接的启动子以在所关注的非人类宿主细胞尤其是植物细胞中表达嵌合杀虫多肽。这种多核苷酸构建体可例如用于在用其转化的植物中表达嵌合杀虫多肽。
本发明还提供了用于制备对至少一种害虫具有增强的抗性的植物的方法。该方法涉及用包含编码本发明的嵌合杀虫多肽的核苷酸序列的多核苷酸构建体转化植物或至少一个植物细胞。通常，编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列将有效连接到驱动植物细胞中的表达的启动子。该方法还可涉及使植物或至少一个植物细胞再生成转化的植物，其中再生的植物表达嵌合杀虫多肽。与对照植物的抗性相比，此类转化的植物包含对至少一种植物害虫尤其是昆虫害虫增强的抗性。
本发明还涉及通过例如喷雾、喷粉、撒播或种子涂覆将组合物(诸如包含嵌合杀虫多肽或其活性变体或片段的杀虫组合物)施用到昆虫害虫的环境中，尤其是在植物上或植物附近，以保护植物免受昆虫害虫损害。
本发明还提供了包含编码本发明的嵌合杀虫多肽的核苷酸序列的转化植物、植物细胞和其他宿主细胞，以及种子。
本发明涵盖以下实施例：
1.一种增强Cry内毒素的杀虫活性的方法，该方法包括将溶解性增强多肽的第一氨基酸序列有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列，从而制备嵌合杀虫多肽，该嵌合杀虫多肽包含有效连接到第二氨基酸序列的第一氨基酸序列。
2.实施例1所述的方法，其中溶解性增强多肽选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白、转录延伸因子NusA、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、mistic、小泛素相关修饰物(SUMO)、蛋白质二硫键异构酶DsbC和巯基：二硫键互换蛋白DsbD。
3.实施例1或实施例2所述的方法，其中溶解性增强多肽为MBP。
4.实施例3所述的方法，其中MBP选自具有表1所示登录号的MBP。
5.实施例1或实施例2所述的方法，其中溶解性增强蛋白为NusA。
6.实施例1或实施例2所述的方法，其中溶解性增强蛋白为硫氧还蛋白。
7.实施例1所述的方法，其中溶解性增强多肽包含选自SEQ IDNO：4、6、34、35和36所示氨基酸序列的氨基酸序列。
8.实施例1-实施例7中任一个所述的方法，其中Cry内毒素选自表2所示的Cry内毒素。
9.实施例1-实施例8中任一个所述的方法，其中Cry内毒素包含选自SEQ ID NO：8、10、12和14的氨基酸序列。
10.实施例1所述的方法，其中嵌合杀虫多肽包含选自SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27和33所示氨基酸序列的氨基酸序列。
11.实施例1所述的方法，其中嵌合杀虫多肽由包含SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26和32所示核苷酸序列的核苷酸序列编码。
12.实施例1-实施例11中任一个所述的方法，其中嵌合杀虫多肽包含位于第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的连接基氨基酸序列。
13.实施例1所述的方法，其中连接基氨基酸序列选自SEQ ID NO：28、29、30和31所示的氨基酸序列。
14.实施例1-实施例13中任一个所述的方法，还包括将连接基氨基酸序列有效连接到第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间，据此嵌合杀虫多肽以线性顺序包含第一氨基酸序列、连接基氨基酸序列和第二氨基酸序列。
15.实施例1-实施例15中任一个所述的方法，其中与Cry内毒素对至少一种害虫的杀虫活性相比，嵌合杀虫多肽包含对所述至少一种害虫增强的杀虫活性。
16.实施例15所述的方法，其中所述至少一种害虫为昆虫害虫。
17.实施例16所述的方法，其中昆虫害虫为来自鞘翅目或鳞翅目的昆虫害虫。
18.实施例16或实施例17所述的方法，其中昆虫害虫来自根萤叶甲属(Diabrotica)。
19.实施例16所述的方法，其中昆虫害虫为西方玉米根虫。
20.实施例16所述的方法，其中昆虫害虫为黑地蚕。
21.一种嵌合杀虫多肽，包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列。
22.实施例21所述的嵌合杀虫多肽，其中有效连接的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列；
(b)由SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；以及
(c)包含与SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽。
23.实施例21或实施例22所述的嵌合杀虫多肽，其中溶解性增强多肽为MBP。
24.实施例23所述的嵌合杀虫多肽，其中MBP选自具有表1所示登录号的MBP。
25.实施例21或实施例22所述的嵌合杀虫多肽，其中溶解性增强蛋白为NusA。
26.实施例21或实施例22所述的嵌合杀虫多肽，其中溶解性增强蛋白为硫氧还蛋白。
27.实施例21的嵌合杀虫多肽，其中第一氨基酸序列包含选自SEQID NO：4、6、34、35和36所示氨基酸序列的氨基酸序列。
28.实施例21-实施例27中任一个所述的嵌合杀虫多肽，其中Cry内毒素选自表2所示的Cry内毒素。
29.实施例21所述的嵌合杀虫多肽，其中Cry内毒素包含选自SEQID NO：8、10、12和14的氨基酸序列。
30.实施例21-实施例29中任一个所述的嵌合杀虫多肽，其中嵌合杀虫多肽还包含有效连接到第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的连接基氨基酸序列。
31.实施例30所述的嵌合杀虫多肽，其中连接基氨基酸序列选自SEQ ID NO：28、29、30和31所示的氨基酸序列。
32.实施例21-实施例31中任一个所述的嵌合杀虫多肽，其中与Cry内毒素对至少一种害虫的杀虫活性相比，嵌合杀虫多肽包含对所述至少一种害虫增强的杀虫活性。
33.实施例32所述的嵌合杀虫多肽，其中所述至少一种害虫为昆虫害虫。
34.实施例33所述的嵌合杀虫多肽，其中昆虫害虫为来自鞘翅目或鳞翅目的昆虫害虫。
35.实施例33所述的嵌合杀虫多肽，其中昆虫害虫来自根萤叶甲属。
36.实施例33所述的嵌合杀虫多肽，其中昆虫害虫为西方玉米根虫。
37.实施例33所述的嵌合杀虫多肽，其中昆虫害虫为黑地蚕。
38.一种包含编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列的核酸分子，该嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列。
39.实施例38所述的核酸分子，其中核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32具有至少80％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽；以及
(e)编码包含与SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽。
40.实施例38或实施例39所述的核酸分子，其中溶解性增强多肽为MBP。
41.实施例40所述的核酸分子，其中MBP选自具有表1所示登录号的MBP。
42.实施例38或实施例39所述的核酸分子，其中溶解性增强蛋白为NusA。
43.实施例38或实施例39所述的核酸分子，其中溶解性增强蛋白为硫氧还蛋白。
44.实施例38或实施例39所述的核酸分子，其中第一氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：4、6、34、35和36所示氨基酸序列的氨基酸序列。
45.实施例38-实施例44中任一个所述的核酸分子，其中Cry内毒素选自表2所示的Cry内毒素。
46.实施例38-实施例44中任一个所述的核酸分子，其中第二氨基酸序列编码选自表2所示Cry内毒素的Cry内毒素。
47.实施例38所述的核酸分子，其中第二氨基酸序列包含选自SEQID NO：8、10、12和14的氨基酸序列。
48.实施例38-实施例47中任一个所述的核酸分子，其中嵌合杀虫多肽还包含有效连接到第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的连接基氨基酸序列。
49.实施例48所述的核酸分子，其中连接基氨基酸序列选自SEQ IDNO：28、29、30和31所示的氨基酸序列。
50.实施例38-实施例49中任一个所述的核酸分子，其中与Cry内毒素对至少一种害虫的杀虫活性相比，嵌合杀虫多肽包含对所述至少一种害虫增强的杀虫活性。
51.实施例38-实施例50中任一个所述的核酸分子，其中所述至少一种害虫为昆虫害虫。
52.实施例51所述的核酸分子，其中昆虫害虫为来自鞘翅目或鳞翅目的昆虫害虫。
53.实施例51所述的核酸分子，其中昆虫害虫来自根萤叶甲属。
54.实施例51所述的核酸分子，其中昆虫害虫为西方玉米根虫。
55.实施例51所述的核酸分子，其中昆虫害虫为黑地蚕。
56.一种表达盒，包含有效连接到实施例38-实施例55中任一个所述的核酸分子的、驱动宿主细胞中的表达的启动子。
57.实施例56所述的表达盒，其中宿主细胞为植物细胞。
58.实施例57所述的表达盒，其中启动子选自化学诱导型启动子、组成型启动子、害虫诱导型启动子、组织特异性启动子和创伤诱导型启动子。
59.实施例58所述的表达盒，其中组织特异性启动子选自叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子、茎优选的启动子和维管组织优选的启动子。
60.一种载体，包含实施例56-实施例59中任一个所述的表达盒。
61.一种转化植物、植物部分、植物细胞或种子，在其基因组中包含实施例56-实施例60中任一个所述的表达盒。
62.实施例61所述的转化植物、植物部分或植物宿主细胞，其中核苷酸序列稳定结合到转化植物、植物部分、植物细胞或种子的基因组中。
63.一种杀虫组合物，包含有效量的实施例21-实施例37中任一个所述的嵌合杀虫多肽或其具有杀虫活性的活性变体或片段。
64.实施例63所述的杀虫组合物，还包含表达编码嵌合杀虫多肽或其生物活性片段或变体的核苷酸序列的细菌。
65.实施例63所述的杀虫组合物，还包含至少一种农业保护剂，该农业保护剂选自杀螨剂、杀菌剂、肥料或微量营养素供给体、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂和化学信息素。
66.实施例65所述的杀虫组合物，其中化学信息素选自异种信息素、引诱剂、取食信息素(feeding pheromone)、利它素、驱虫剂和刺激剂。
67.一种保护植物免受昆虫害虫损害的方法，该方法包括提供有效量的实施例63-实施例66中任一个所述的杀虫组合物以降低对植物的昆虫害虫相关损害。
68.实施例67所述的方法，其中杀虫组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子涂覆的方法施用。
69.实施例67或实施例68所述的方法，其中嵌合杀虫多肽具有对鞘翅目中的昆虫害虫、鳞翅目中的昆虫害虫或两者的杀虫活性。
70.实施例67-实施例69中任一个所述的方法，其中昆虫害虫选自根萤叶甲属中的种。
71.一种植物，包含稳定结合到其基因组中的多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包含有效连接到驱动植物中的表达的启动子的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列的嵌合杀虫多肽。
72.实施例71所述的植物，其中核苷酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32具有至少80％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽；以及
(e)编码包含与SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽。
73.实施例71或实施例72所述的植物，其中溶解性增强多肽为MBP。
74.实施例73所述的植物，其中MBP选自具有表1所示登录号的MBP。
75.实施例71或实施例72所述的植物，其中溶解性增强蛋白为NusA。
76.实施例71或实施例72所述的植物，其中溶解性增强蛋白为硫氧还蛋白。
77.实施例71所述的植物，其中第一氨基酸序列包含选自SEQ IDNO：4、6、34、35和36所示氨基酸序列的氨基酸序列。
78.实施例71-实施例77中任一个所述的植物，其中Cry内毒素选自表2所示的Cry内毒素。
79.实施例71-实施例78中任一个所述的植物，其中第二氨基酸序列编码选自表2所示Cry内毒素的Cry内毒素。
80.实施例71或实施例72所述的植物，其中第二氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：8、10、12和14的氨基酸序列。
81.实施例71-实施例80中任一个所述的植物，其中嵌合杀虫多肽还包含有效连接到第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的连接基氨基酸序列。
82.实施例81所述的核酸分子，其中连接基氨基酸序列选自SEQ IDNO：28、29、30和31所示的氨基酸序列。
83.实施例71-实施例82中任一个所述的植物，其中与Cry内毒素对至少一种害虫的杀虫活性相比，嵌合杀虫多肽包含对所述至少一种害虫增强的杀虫活性。
84.实施例83所述的植物，其中所述至少一种害虫为昆虫害虫。
85.实施例84所述的植物，其中昆虫害虫为来自鞘翅目或鳞翅目的昆虫害虫。
86.实施例84所述的植物，其中昆虫害虫来自根萤叶甲属。
87.实施例84所述的植物，其中昆虫害虫为西方玉米根虫。
88.实施例84所述的植物，其中昆虫害虫为黑地蚕。
89.实施例71-实施例88中任一个所述的植物，其中植物为单子叶植物。
90.实施例89所述的植物，其中单子叶植物为大麦、玉蜀黍、水稻、裸麦、高粱、甘蔗或小麦。
91.实施例71-实施例88中任一个所述的植物，其中植物为双子叶植物。
92.实施例91所述的植物，其中双子叶植物为苜蓿、芸苔、棉花、大豆或向日葵。
93.实施例71-实施例92中任一个所述的植物，其中植物为种子。
94.一种保护植物、植物部分或植物宿主细胞免受昆虫害虫损害的方法，该方法包括以下步骤：
(a)向植物、植物部分或植物宿主细胞中引入实施例56-实施例59中任一个所述的表达盒；以及
(b)使该植物、植物部分或植物宿主细胞再生成形态正常的可育植物，其中该植物或其部分包含嵌合杀虫多肽。
95.实施例94所述的方法，其中嵌合杀虫多肽具有对鞘翅目中的昆虫害虫、鳞翅目中的昆虫害虫或两者的杀虫活性。
96.实施例94所述的方法，其中昆虫害虫选自根萤叶甲属中的种。
97.一种增强植物对至少一种害虫的抗性的方法，该方法包括向植物或至少一个植物细胞中引入多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包含有效连接到驱动植物中的表达的启动子的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码嵌合杀虫多肽，该嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列。
98.实施例97所述的方法，其中核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示的核苷酸序列；
(b)编码包含SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32具有至少80％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽；以及
(e)编码包含与SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码具有杀虫活性的多肽。
99.实施例97或实施例98所述的方法，其中溶解性增强多肽为MBP。
100.实施例99所述的方法，其中MBP选自具有表1所示登录号的MBP。
101.实施例97或实施例98所述的方法，其中溶解性增强蛋白为NusA。
102.实施例97或实施例98所述的方法，其中溶解性增强蛋白为硫氧还蛋白。
103.实施例97所述的方法，其中第一氨基酸序列包含选自SEQ IDNO：4、6、34、35和36所示氨基酸序列的氨基酸序列。
104.实施例97-实施例103中任一个所述的方法，其中Cry内毒素选自表2所示的Cry内毒素。
105.实施例97-实施例104中任一个所述的方法，其中第二氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：8、10、12和14的氨基酸序列。
106.实施例97-实施例105中任一个所述的方法，其中嵌合杀虫多肽还包含有效连接到第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的连接基氨基酸序列。
107.实施例106所述的方法，其中连接基氨基酸序列选自SEQ IDNO：28、29、30和31所示的氨基酸序列。
108.实施例97-实施例107中任一个所述的方法，其中与Cry内毒素对至少一种害虫的杀虫活性相比，嵌合杀虫多肽包含对所述至少一种害虫增强的杀虫活性。
109.实施例97-实施例108中任一个所述的方法，还包括使包含多核苷酸构建体的植物再生。
110.实施例97-实施例109中任一个所述的方法，其中植物与不含多核苷酸构建体的对照植物相比具有对至少一种害虫的增强的抗性。
111.实施例110所述的方法，其中所述至少一种害虫为昆虫害虫。
112.实施例111所述的方法，其中昆虫害虫为来自鞘翅目或鳞翅目的昆虫害虫。
113.实施例111所述的方法，其中昆虫害虫来自根萤叶甲属。
114.实施例111所述的方法，其中昆虫害虫为西方玉米根虫。
115.实施例111所述的方法，其中昆虫害虫为黑地蚕。
116.实施例97-实施例115中任一个所述的方法，其中植物为单子叶植物。
117.实施例116所述的方法，其中单子叶植物为大麦、玉蜀黍、水稻、裸麦、高粱、甘蔗或小麦。
118.实施例97-实施例115中任一个所述的方法，其中植物为双子叶植物。
119.实施例118所述的方法，其中双子叶植物为苜蓿、芸苔、棉花、大豆或向日葵。
附图说明
在考虑到以下详细说明时将能够更好地理解本发明，并且除了上文所示的那些以外的特征、方面和优点将变得显而易见。这些详细说明参照以下附图，其中：
图1描绘了本发明的大肠杆菌(E.coli)麦芽糖结合蛋白(MBP)-Bt Cry蛋白融合体的结构。
具体实施方式
下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。事实上，这些发明可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导内容，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
本发明基于以下发现：Cry内毒素的杀虫活性可通过将诸如麦芽糖结合蛋白(MBP)的溶解性增强多肽有效连接到Cry内毒素或其杀昆虫活性片段而增强。此外，昆虫害虫抗性可通过本文所公开的方法将MBP有效连接到Cry内毒素而克服。本发明因此提供用于增强Cry内毒素活性、用于克服植物害虫抗性以及用于保护植物免受害虫尤其是昆虫害虫损害的组合物和方法。
虽然本发明不依赖于特定的生物机理，但是溶解性增强多肽与Cry内毒素或其杀昆虫活性片段的融合可起到提高Cry蛋白的溶解性尤其是在昆虫肠道环境中更具体地讲在鞘翅目昆虫的肠道环境中的溶解性的作用。也就是说，融合蛋白在略呈酸性的pH下具有比Cry蛋白在相同pH下更高的溶解性。在本发明的优选实施例中，用于制备本发明的融合蛋白的活化Cyr毒素具有约pH 7至约pH 8的等电点(pI)。已经认识到，在鳞翅目昆虫的消化系统中，pH相对高。在此类碱性条件下，活化的Bt Cry毒素通常可以溶解，但是在鞘翅目肠道环境(其中pH略呈酸性)的略呈酸性的pH下，活化的Bt Cry毒素的溶解性可以低得多。
本发明提供通过将溶解性增强蛋白有效连接到Cry内毒素而增强Cry内毒素的杀虫活性并保护植物免受昆虫害虫损害的组合物和方法。本文所公开的组合物和方法包括编码嵌合杀虫多肽的重组核酸分子，包含本文所述核酸分子的表达盒和其他核苷酸构建体，用本文所述的核酸分子转化的生物体，隔离的嵌合杀虫多肽，以及具有嵌合杀虫多肽的杀虫组合物及其使用方法。所述组合物和方法因此可用于增强杀虫蛋白的杀虫活性以及用于保护植物免受昆虫害虫损害。
如本文所用，“溶解性增强多肽”是当有效连接到Cry内毒素或其杀昆虫活性片段时，与在不存在有效连接的溶解性增强多肽的情况下相同Cry内毒素或其杀昆虫活性片段的杀虫活性相比，增强所述Cry内毒素或其杀昆虫活性片段对至少一种昆虫害虫(优选鞘翅目昆虫害虫)的杀虫活性的任何多肽。在某些实施例中，本发明的溶解性增强多肽能够提高有效连接的Cry内毒素或其杀昆虫活性片段在例如存在于鞘翅目昆虫的肠道环境中的略呈酸性的pH下的溶解性。优选地，本发明的嵌合杀虫多肽(其包含有效连接到Cry内毒素或其杀昆虫活性片段的本发明的溶解性增强多肽)与不含所述有效连接的溶解性增强多肽的相同Cry内毒素或其杀昆虫活性片段相比，在具有略呈酸性pH的环境(诸如鞘翅目昆虫的肠道环境)中含有增强的溶解性。
如本文所用，“害虫”或“植物害虫”意指干扰植物发育和/或生长或对其有害的生物体。此类植物害虫包括但不限于线虫、昆虫、病毒、类病毒、螨虫、真菌病原体、细菌和本文所公开的任何其他植物害虫。因此，本发明的多核苷酸和多肽可用于增强植物对植物害虫的抗性。然而，本领域的技术人员将会理解，并非所有多肽都对所有植物害虫同样有效。本文所述的嵌合杀虫多肽显示出对植物害虫诸如昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。因此，本文关注的是用于保护植物免受昆虫害虫损害的嵌合杀虫多肽。
如本文所用，“杀虫多肽”意指具有对昆虫害虫的生物活性的(即，为杀虫的)肽、多肽或蛋白。
如本文所用，“杀虫”或“杀虫活性”意指能够杀灭昆虫害虫。同样，“杀虫”或“杀虫活性”意指能够抑制昆虫生长。照此，本文所述的嵌合杀虫多肽能够抑制至少一种植物害虫尤其是至少一种昆虫害虫的生长或繁殖或将其杀灭。
所谓“杀昆虫活性”意指本发明的多肽或包含所述多肽(或其他药剂、化学品或组合物)的组合物抑制至少一种昆虫害虫的生长或抑制至少一种昆虫害虫所引起的对植物的损害的能力。
如本文所用，“增强”等等意指通过将杀虫多肽诸如Cry内毒素有效连接到溶解性增强多肽而提高所述Cry内毒素对特定害虫的活性/有效性，其中所得的嵌合杀虫多肽的活性/有效性与野生型Cry内毒素相比时提高约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％或约90％至约100％。作为另一种选择，嵌合杀虫多肽的活性/有效性与野生型Cry内毒素相比时提高约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。此外，“增强”可意指杀虫多肽的宿主害虫范围扩展到包括另外的害虫。
如本文所用，“约”意指诸如规定的浓度、长度、分子量、百分比、pH、时间范围、温度或体积的值的有统计学意义的范围。此类值或范围可以落在给定值或范围的一定数量级以内，通常在其20％以内，更通常在其10％以内，并甚至更通常在其5％以内。被“约”涵盖的允许偏差将取决于所研究的特定系统，并可以容易地被本领域的技术人员理解。
如本文所用，“嵌合多肽”或“嵌合杀虫多肽”意指具有以共价或非共价方式有效连接到衍生自第二来源的第二氨基酸序列的衍生自第一来源的第一氨基酸序列的多肽，其中第一来源和第二来源不同。不同的第一来源和第二来源可包括两种不同的生物体，或来自相同生物体的两种不同蛋白，或生物来源和合成来源，或甚至两种不同的合成来源。生物来源可包括任何以非合成方式制备的核苷酸或氨基酸序列(例如，基因组或cDNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒粒子或突变体或类似物)。合成来源可包括以化学方式而不是通过生物来源制备的核苷酸或氨基酸序列(例如，氨基酸序列的固相合成)。嵌合杀虫多肽可以通过表达编码具有至少两个部分的多肽的重组核酸分子而制备或可以通过合成方式制备。
本发明的嵌合杀虫多肽还可以包含例如位于第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的连接基分子(此处也称为“连接基”)。可用于本发明的方法的连接基的例子为分别具有SEQ ID NO：28、29、30和31所示氨基酸序列的NEB pMAL、SA、NusA和TrxA连接基。
本发明的溶解性增强多肽包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(例如，TrxA)、转录延伸因子NusA、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、mistic、小泛素相关修饰物(SUMO)、蛋白质二硫键异构酶DsbC和巯基：二硫键互换蛋白DsbD，及其变体和片段，它们在有效连接到Cry内毒素或其杀昆虫活性片段时，与不存在有效连接的溶解性增强多肽的情况下相同Cry内毒素或其杀昆虫活性片段的杀虫活性相比，增强有效连接的Cry内毒素或杀昆虫活性片段对至少一种昆虫害虫优选鞘翅目昆虫害虫的杀虫活性。
如本文所用，“麦芽糖结合蛋白”或“MBP”意指作为麦芽糖糊精运输系统的成员的多肽，所述系统以微摩尔的亲和力结合麦芽糖糊精(例如，麦芽糖、麦芽三糖和海藻糖)并且对于通过一些原核生物的细胞质膜进行麦芽糖糊精的能量依赖性异位必不可少。参见Boos&Shuman(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：204-229(Boos和Shuman，1998年，《微生物学与分子生物学综述》，第62卷，第204-229页)。例如，在大肠杆菌中，malE基因编码396个氨基酸残基的MBP前体，其随后经26个氨基酸的N端信号肽裂解而被加工成MBP。参见例如Duplay et al.(1984)J.Biol.Chem.259：10606-10613(Duplay等人，1984年，《生物化学杂志》，第259卷，第10606-10613页)。
在本发明的一个实施例中，嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的氨基酸序列的MBP氨基酸序列，包括例如，嵌合杀虫多肽包含SEQ IDNO：2、21、23、25、27和33所示的氨基酸序列并分别由SEQ ID NO：1、20、22、24、26和32所示的核苷酸序列编码。
在另一个实施例中，嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的氨基酸序列的NusA的氨基酸序列，包括例如，嵌合杀虫多肽包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列编码。
在又一个实施例中，嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素氨基酸序列的硫氧还蛋白氨基酸序列，包括例如，嵌合杀虫多肽包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列编码。
本发明包括使用当融合到Cry内毒素多肽时增强对至少一种害虫的杀虫活性的溶解性增强多肽，所述害虫优选地为昆虫害虫，更优选地为来自鞘翅目或鳞翅目的昆虫害虫，甚至更优选地为来自根萤叶甲属的昆虫害虫，最优选地为西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)。在某些实施例中，溶解性增强多肽选自MBP、NusA和TrxA。
本发明不依赖于使用特定的溶解性增强多肽。当融合到Cry内毒素多肽时能够增强Cry内毒素多肽对至少一种害虫的杀虫活性的任何溶解性增强多肽均可用于本文所公开的方法和组合物。此类溶解性增强多肽包括例如前体蛋白和成熟蛋白，及其变体和片段。在某些实施例中，溶解性增强多肽为MBP。本发明的MBP包括但不限于全长MBP(也称为“MBP前体”)、MBP的成熟形式、全长或成熟MBP的片段、或变体。除非本文明确规定或者说是从上下文显而易见，否则术语“麦芽糖结合蛋白”和“MBP”涵盖MBP的此类全长和成熟形式及其片段和变体。
已公开了多种MBP的氨基酸和/或核苷酸序列，它们可用于本发明的组合物和方法，包括但不限于具有表1所示的以下登录号的以下那些MBP。
表1
*表1中的登录号对应的氨基酸和相应核苷酸序列以引用方式并入本文。
在本发明的某些实施例中，MBP包含SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列或其片段或变体。编码SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列或其片段或变体的任何核苷酸序列均可用于本发明的方法和组合物。在本发明的一些实施例中，将对本发明的核苷酸序列进行优化以在所关注的宿主生物体或细胞(具体地讲植物，更具体地讲作物植物，最具体地讲玉蜀黍植物)中表达。
如本文所用，“Cry内毒素”意指由主要位于芽孢杆菌属成员中的大质粒上的cry(晶体蛋白)基因编码的δ-内毒素，但已报道了染色体编码的Cry内毒素。参见Ben-Dov et al.(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：3140-3145(Ben-Dov等人，1996年，《应用与环境微生物学》，第62卷，第3140-3145页)；Berry et al.(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：5082-5095(Berry等人，2002年，《应用与环境微生物学》，第68卷，第5082-5095页)；Gonzáles et al.(1981)Plasmid 5：351-365(Gonzáles等人，1981年，《质粒》，第5卷，第351-365页)；Lereclus et al.(1982)Mol.Gen.Genet.186：391-398(Lereclus等人，1982年，《分子遗传学与普通遗传学》，第186卷，第391-398页)；以及Trisrisook et al.(1990)Appl.Environ.Microbiol.56：1710-1716(Trisrisook等人，1990年，《应用与环境微生物学》，第56卷，第1710-1716页)。Cry内毒素不具有广谱活性，因此它们通常不会杀灭益虫。此外，Cry内毒素对哺乳动物(包括人类、家养动物和野生动物)是无毒的。
Cry内毒素通常具有五个保守的序列域和三个保守的结构域。参见例如de Maagd et al.(2001)Trends Genetics 17：193-199(de Maagd等人，2001年，《遗传学趋势》，第17卷，第193-199页)。第一保守结构域(域I)由七个α螺旋组成，并且参与膜插入和孔形成。第二保守结构域(域II)由排列成希腊钥匙(Greek key)构型的三个β-折叠片组成，并且第三保守结构域(域III)由呈“果冻卷(jelly-roll)”构造的两个反平行的β-折叠片组成。域II和III参与受体识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。
如本文所用，“昆虫害虫”意指干扰植物发育和/或生长或对其有害的节肢动物门的生物体，更具体地讲是指昆虫纲的生物体。昆虫纲可划分为两个群(历史上称作亚纲)：(1)无翅昆虫，称为无翅亚纲；和(2)有翅昆虫，称为有翅亚纲。昆虫害虫可以为成虫、幼虫或甚至卵细胞。用于测试杀虫活性的优选发育阶段为昆虫害虫的幼虫或其他不成熟形态。饲养昆虫幼虫和进行生物测定的方法在本领域中是熟知的。参见例如Czapla&Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485(Czapla和Lang，1990年，《经济昆虫学杂志》，第83卷，第2480-2485页)；Griffith&Smith(1977)J.Aust.Ent.Soc.16：366(Griffith和Smith，1977年，《澳大利亚昆虫学会杂志》，第16卷，第366页)；和Keiper&Foote(1996)Hydrobiologia 339：137-139(Keiper和Foote，1996年，《水生生物学》，第339卷，第137-139页)；以及美国专利No.5,351,643。例如，可将昆虫害虫在完全黑暗中在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度下饲养。
本发明还提供了包含编码嵌合杀虫多肽的核酸分子和嵌合杀虫多肽的组合物。该组合物包含含有融合到Cry内毒素或其生物活性片段的溶解性增强多肽的嵌合杀虫多肽。编码该嵌合杀虫多肽的核苷酸序列可衍生自嵌合杀虫多肽序列并使用本领域已知的任何方法制备。该组合物还包含编码嵌合杀虫多肽的核酸分子和嵌合杀虫多肽的变体和片段。可以使用隔离的、编码嵌合杀虫多肽的核酸分子来形成转基因生物体，诸如对易受杀虫多肽影响的昆虫害虫具有抗性的植物。
本发明所公开的方法和组合物提供具有改善的效力的嵌合杀虫多肽以及编码该嵌合杀虫多肽的核酸分子。该嵌合杀虫多肽包含融合到(即，有效连接到)Cry内毒素或其生物活性片段的溶解性增强多肽，并且与未融合到溶解性增强多肽的Cry内毒素或其生物活性片段的杀虫活性相比时，具有对至少一种植物害虫增强的杀虫活性。
如本文所用，“杀虫剂”、“杀虫多肽”或“杀虫蛋白”意指能够杀灭害虫或抑制其生长、取食或繁殖的多肽。本领域的技术人员应理解，并非所有物质或其混合物对所有害虫同样有效。“嵌合杀虫多肽”或“嵌合杀虫蛋白”是如本文所公开溶解性增强多肽已融合到其上的“杀虫多肽”或“杀虫蛋白”。本文特别关注的是用作杀昆虫剂并因而具有对昆虫害虫的生物活性的杀虫多肽和嵌合杀虫多肽。
如本文所用，“害虫”意指干扰植物发育和/或生长或对其有害的生物体。害虫的例子包括但不限于藻类、蛛形纲(如蜱螨，包括螨虫和蜱虫)、细菌(如植物病原体，包括黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)和假单胞菌属(Pseudomonas spp.))、甲壳纲(如，鼠妇和潮虫)；真菌(例如，子囊菌(Ascomycete)门或担子菌(Basidiomycete)门中的成员，以及真菌类生物体，包括卵菌纲(Oomycete)例如腐霉属物种(Pythium spp.)和疫霉属物种(Phytophthora spp.))、昆虫、软体动物(如，蜗牛和蛞蝓)、线虫(如，土壤传播的线虫，包括支睾属物种(Clonorchis spp.)、片吸虫属物种(Fasciola spp.)、异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、后睾吸虫属物种(Opisthorchis spp.)和并殖吸虫属物种(Paragonimus spp.))、原生动物(如，植生滴虫属物种(Phytomonasspp.))、病毒(如，豇豆花叶病毒属物种(Comovirus spp.)、黄瓜花叶病毒属物种(Cucumovirus spp.)、胞内水稻黄矮炮弹病毒属物种(Cytorhabdovirusspp.)、黄症病毒属物种(Luteovirus spp.)、线虫传多面体病毒属物种(Nepovirus spp.)、马铃薯Y病毒属物种(Potyvirus spp.)、烟草花叶病毒属物种(Tobamovirus spp.)、番茄丛矮病毒属物种(Tombusvirus spp.)和番茄斑萎病毒属物种(Tospovirus spp.))、类病毒、寄生植物以及野草。
本文特别关注的是昆虫害虫。如本文所用，“昆虫害虫”意指干扰植物发育和/或生长或对其有害的节肢动物门的生物体，更具体地讲是指昆虫纲的生物体。昆虫纲可划分为两个群(历史上称作亚纲)：(1)无翅昆虫，称为无翅亚纲；和(2)有翅昆虫，称为有翅亚纲。害虫的例子包括但不限于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、食毛目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目和缨尾目，尤其是鞘翅目和鳞翅目。虽然严格意义上并非昆虫，但节肢动物如蛛形纲，尤其是蜱螨亚纲，也包括在“昆虫害虫”中。昆虫害虫包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。
鳞翅目的昆虫包括但不限于行军虫、地蚕、尺蠖和夜蛾科(Noctuidae)的heliothine类Agrotis ipsilon Hufnagel(黑地蚕)；A.orthogonia Morrison(西部地蚕)；A.segetum Denis&Schiffermüller)(蔓青蛾)；A.subterranea Fabricius(粒肤地蚕)；Alabama argillacea Hübner(棉叶虫)；Anticarsia gemmatalis Hübner(黎豆毛虫)；Athetis mindara Barnesand McDunnough(粗皮地蚕)；Earias insulana Boisduval(多刺螟蛉)；E.vittella Fabricius(斑点螟蛉)；Egira(Xylomyges)curialis Grote(柑橘地蚕)；Euxoa messoria Harris(黑边地蚕)；Helicoverpa armigera Hübner(美洲螟蛉)；H.zea Boddie(玉米穗虫或玉米螟蛉)；Heliothis virescensFabricius(烟青虫)；Hypena scabra Fabricius(苜蓿绿叶蛾)；Hyponeumataltula Schaus；Mamestra configurata Walker(披肩粘虫)；M.brassicaeLinnaeus(甘蓝夜蛾)；Melanchra picta Harris(斑马纹夜蛾)；Mocislatipes Guenée(小毛胫夜蛾)；Pseudaletia unipuncta Haworth(行军虫)；Pseudoplusia includens Walker(大豆尺蠖)；Richia albicosta Smith(西方豆地蚕)；Spodoptera frugiperda JE Smith(秋夜蛾)；S.exigua Hübner(甜菜夜蛾)；S.litura Fabricius(烟草地蚕，簇毛虫)；Trichoplusia niHübner(卷心菜尺蠖)；来自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果蛾和雕叶虫，如Achroia grisella Fabricius(小蜡螟)；Amyelois transitella Walker(脐橙螟蛾)；Anagasta kuehniella Zeller(地中海粉蛾)；Cadra cautella Walker(杏仁蛾)；Chilo partellusSwinhoe(斑点茎秆钻心虫)；C.suppressalis Walker(条纹茎/水稻钻心虫)；C.terrenellus Pagenstecher(甘蔗茎钻心虫)；Corcyra cephalonicaStainton(米蛾)；Crambus caliginosellus Clemens(玉米根网虫)；C.teterrellus Zincken(蓝草网虫)；Cnaphalocrocis medinalis Guenée(稻卷叶虫)；Desmia funeralis Hübner(葡萄卷叶虫)；Diaphania hyalinataLinnaeus(甜瓜虫)；D.nitidalis Stoll(泡菜虫)；Diatraea flavipennellaBox；D.grandiosella Dyar(西南玉米钻心虫)、D.saccharalis Fabricius(甘蔗钻心虫)；Elasmopalpus lignosellus Zeller(小玉米茎钻心虫)；Eoreuma loftini Dyar(墨西哥水稻钻心虫)；Ephestia elutella Hübner(烟草(可可)蛾)；Galleria mellonella Linnaeus(大蜡蛾)；Hedylepta acceptaButler(甘蔗卷叶虫)；Herpetogramma licarsisalis Walker(草地网虫)；Homoeosoma electellum Hulst(向日葵蛾)；Loxostege sticticalis Linnaeus(甜菜网虫)；Maruca testulalis Geyer(豆荚钻心虫)；Orthaga thyrisalisWalker(茶树网蛾)；Ostrinia nubilalis Hübner(欧洲玉米钻心虫)；Plodia interpunctella Hübner(印度谷蛾)；Scirpophaga incertulas Walker(黄茎钻心虫)；Udea rubigalis Guenée(芹菜叶虫)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫Acleris gloveranaWalsingham(西部黑头蚜虫)；A.variana Fernald(东部黑头蚜虫)；Adoxophyes orana Fischer von(夏季果实卷叶蛾)；黄卷蛾属(Archips spp.)包括A.argyrospila Walker(果树卷叶虫)和A.rosanaLinnaeus(欧洲卷叶虫)；条卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.)；Bonagotasalubricola Meyrick(巴西苹果卷叶虫)；色卷蛾属(Choristoneura spp.)；Cochylis hospes Walsingham(向日葵带蛾)；Cydia latiferreana Walsingham(榛树虫)；C.pomonella Linnaeus(苹果蠹蛾)；Endopiza viteanaClemens(葡萄浆果蛾)；Eupoecilia ambiguella Hübner(葡萄树蛾)；Grapholita molesta Busck(东方果实蛾)；Lobesia botrana Denis&Schiffermüller(欧洲葡萄树蛾)；Platynota flavedana Clemens(杂色卷叶蛾)；P.stultana Walsingham(杂食卷叶虫)；Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller(苹果芽小卷叶蛾)；和Suleima helianthana Riley(向日葵蚜蛾)。
鳞翅目中选择的其他农艺学害虫包括但不限于Alsophila pometariaHarris(秋尺蠖)；Anarsia lineatella Zeller(桃树枝钻心虫)；Anisotasenatoria J.E.Smit(橙色条纹橡树虫)；Antheraea pernyi Guérin-Méneville(中国橡树丝蛾)；Bombyx mori Linnaeus(蚕)；Bucculatrix thurberiellaBusck(棉叶潜蛾)；Colias eurytheme Boisduval(苜蓿毛虫)；Datanaintegerrima Grote&Robinson)(核桃毛虫)；Dendrolimus sibiricusTschetwerikov(西伯利亚丝蛾)，Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺蠖)；Erannis tiliaria Harris(椴树尺蠖)；Erechthias flavistriataWalsingham(甘蔗蚜蛾)；Euproctis chrysorrhoea Linnaeus(褐尾蛾)；Harrisina americana Guérin-Méneville(葡萄叶雕叶虫)；Heliothis subflexaGuenée；Hemileuca oliviae Cockrell(牧场毛虫)；Hyphantria cunea Drury(秋天网虫)；Keiferia lycopersicella Walsingham(番茄蛲虫)；Lambdinafiscellaria fiscellaria Hulst(东部铁杉尺蠖)；L.fiscellaria lugubrosa Hulst(西部铁杉尺蠖)；Leucoma salicis Linnaeus(缎蛾)；Lymantria disparLinnaeus(舞毒蛾)；天幕毛虫属(Malacosoma spp.)；Manducaquinquemaculata Haworth(五斑天蛾，番茄天蛾幼虫)；M.sexta Haworth(番茄天蛾幼虫，烟草天蛾幼虫)；Operophtera brumata Linnaeus(冬蛾)；古毒蛾属(Orgyta spp.)；Paleacrita vernata Peck(春尺蠖)；Papiliocresphontes Cramer(巨燕尾蝶，桔凤蝶(orange dog))；Phryganidiacalifornica Packard(加州橡树虫)；Phyllocnistis citrella Stainton(柑橘潜叶虫)；Phyllonorycter blancardella Fabricius(斑点幕形潜叶虫)；Pierisbrassicae Linnaeus(大白蝴蝶)；P.rapae Linnaeus(小白蝴蝶)；P.napiLinnaeus(绿脉纹白蝴蝶)；Platyptilia carduidactyla Riley(朝鲜蓟羽蛾)；Plutella xylostella Linnaeus(菱纹背蛾)；Pectinophora gossypiellaSaunders(粉色螟蛉)；Pontia protodice Boisduval&Leconte)(Southerncabbageworm)；Sabulodes aegrotata Guenée(杂食尺蠖)；Schizuraconcinna J.E.Smith(红驼背毛虫)；Sitotroga cerealella Olivier(安古木瓦谷蛾)；Telchin licus Drury(大型蔗螟)；Thaumetopoea pityocampaSchiffermüller(松异带蛾)；Tineola bisselliella Hummel(结网衣蛾)；Tuta absoluta Meyrick(番茄潜叶虫)和Yponomeuta padella Linnaeus(巢蛾)。
值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：Anthonomus grandis Boheman(棉籽象鼻虫)；Cylindrocopturusadspersus LeConte(向日葵茎象鼻虫)；Diaprepes abbreviatus Linnaeus(蔗根象鼻虫)；Hypera punctata Fabricius(三叶草叶象)；Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel(稻水象鼻虫)；Metamasius hemipterus hemipterusLinnaeus(西印度蔗象鼻虫)；M.hemipterus sericeus Olivier(丝蔗象鼻虫)；Sitophilus granarius Linnaeus(谷象鼻虫)；S.oryzae Linnaeus(米象鼻虫)；Smicronyx fulvus LeConte(红向日葵籽象鼻虫)；S.sordidusLeConte(灰色葵花籽象甲)；Sphenophorus maidis Chittenden(玉米象虫)；S.livis Vaurie(甘蔗象虫)；Rhabdoscelus obscurus Boisduval(新几内亚蔗象甲)；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：Chaetocnema ectypa Horn(沙漠玉米跳甲)；C.pulicaria Melsheimer(玉米跳甲)；Colaspis brunnea Fabricius(葡萄肖叶甲)；Diabrotica barberi Smith&Lawrence(北方玉米根虫)；D.undecimpunctata howardi Barber(南方玉米根虫)；D.virgifera virgiferaLeConte(西方玉米根虫)；Leptinotarsa decemlineata Say(科罗拉多马铃薯甲虫)；Oulema melanopus Linnaeus(谷物叶甲虫)；Phyllotretacruciferae Goeze(玉米跳甲)；Zygogramma exclamationis Fabricius(向日葵甲虫)；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：Epilachnavarivestis Mulsant(墨西哥豆甲虫)；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括但不限于：Antitrogus parvulus Britton(Childers蔗蚧螬)；Cyclocephala borealis Arrow(北方隐金龟子，白蚧螬)；C.immaculataOlivier(南方隐金龟子，白蚧螬)；Dermolepida albohirtum Waterhouse(灰背蔗甲虫)；Euetheola humilis rugiceps LeConte(甘蔗甲虫)；Lepidiota frenchi Blackburn(法国蔗蚧螬)；Tomapus gibbosus De Geer(胡萝卜甲虫)；T.subtropicus Blatchley(甘蔗蚧螬)；Phyllophaga crinitaBurmeister(白蛴螬)；P.latifrons LeConte(六月甲虫)；Popillia japonicaNewman(日本甲虫)；Rhizotrogus majalis Razoumowsky(欧洲金龟子)；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自以下各科属的线虫：叩头虫科(Elateridae)、伪金针虫属(Eleodes spp.)，纹叩甲属(Melanotus spp.)，包括M.communis Gyllenhal(线虫)；宽胸叩头虫属物种(Conoderus spp.)；丘胸叩甲属物种(Limonius spp.)；细胸叩甲属物种(Agriotes spp.)；旱地金针虫属物种(Ctenicera spp.)；Aeolus属物种；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle)；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)科的甲虫，例如但不限于Migdolus fryanusWestwood(长角甲虫)；和来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括但不限于Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger(潜叶吉丁虫)。
双翅目的成体和未成熟体是值得关注的，包括潜叶虫Agromyzaparvicornis Loew(玉米斑潜叶虫)；摇蚊，包括但不限于：Contariniasorghicola Coquillett(高粱摇蚊)；Mayetiola destructor Say(黑森蝇)；Neolasioptera murtfeldtiana Felt(向日葵籽摇蚊)；Sitodiplosis mosellanaGéhin(小麦摇蚊)；果实蝇(实蝇科(Tephritidae))、Oscinella fritLinnaeus(麦秆蝇)；蛆，包括但不限于：地种蝇属(Delia spp.)，包括Delia platura Meigen(玉米种蛆)；D.coarctata Fallen(麦种蝇)；Fanniacanicularis Linnaeus，F.femoralis Stein(小家厕蝇)；Meromyza americanaFitch(麦秆蛆)；Musca domestica Linnaeus(家蝇类)；Stomoxyscalcitrans Linnaeus(厩蝇类)；面蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属物种(Chrysomyaspp.)；伏蝇属物种(Phormia spp.)；和其他蝇类(muscoid fly)害虫、马蝇类虻属物种(Tabanus spp.)；肤蝇类胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；牛蝇类皮蝇属物种(Hypoderma spp.)；鹿蝇类斑虻属物种(Chrysops spp.)；Melophagus ovinus Linnaeus(虱蝇类)；和其他短角亚目(Brachycera)、蚊类伊蚊属物种(Aedes spp.)；按蚊属物种(Anopheles spp.)；库蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇类原蚋属物种(Prosimulium spp.)；蚋属物种(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
作为所关注的昆虫，包括半翅目的那些昆虫，例如但不限于以下科：球蚜科(Adelgidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、链蚧科(Asterolecaniidae)、沫蝉科(Cercopidae)、叶蝉科(Cicadellidae)、蝉科(Cicadidae)、菱飞虱科(Cixiidae)、软介壳虫科(Coccidae)、缘蝽科(Coreidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、飞虱科(Delphacidae)、盾蚧科(Diaspididae)、毡蚧科(Eriococcidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、圆飞虱科(Issidae)、长蝽科(Lygaeidae)、硕蚧科(Margarodidae)、角蝉科(Membracidae)、盲蝽科(Miridae)、旌介壳虫科(ortheziidae)、蝽科(Pentatomidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)和网蝽科(Tingidae)。
来自半翅目的农艺学上重要的成员包括但不限于：Acrosternum hilareSay(绿蝽象)；Acyrthisiphon pisum Harris(豌豆蚜虫)；球蚜属物种(Adelges spp.)物种(球蚜类)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(苜蓿褐盲蝽)；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜缘蝽)；Aphis craccivoraKoch(豇豆蚜虫)；A.fabae Scopoli(黑豆蚜虫)；A.gossypu Glover(棉花蚜虫，甜瓜蚜虫)；A.maidiradicis Forbes(玉米根蚜虫)；A.pomi DeGeer(苹果蚜虫)；A.spiraecola Patch(绣线菊蚜虫)；Aulacaspistegalensis Zehntner(甘蔗介壳虫)；Aulacorthum solani Kaltenbach(毛地黄蚜虫)；Bemisia tabaci Gennadius(烟草粉虱，甘薯粉虱)；B.argentifoliiBellows&Perring)(silverleaf whitefly)；Blissus leucopterus leucopterus Say(麦长蝽)；负子蝽科(Blostomatidae)物种；Brevicoryne brassicae Linnaeus(卷心菜蚜虫)；Cacopsylla pyricola Foerster(梨木虱)；Calocorisnorvegicus Gmeli(马铃薯盲蝽)；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓蚜虫)；臭虫属(Cimicidae spp..)；缘蝽科(Coreidae)物种；Corythucagossypii Fabriciu(棉花网蝽)；Cyrtopeltis modesta Distant(番茄蝽)；C.notatus Distant(吸蝇(suckfly))；Deois flavopicta(吹沫虫)；Dialeurodes citri Ashmead(柑橘粉虱)；Diaphnocoris chlorionis Say(皂荚树蝽)；Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko(俄罗斯小麦蚜虫)；Duplachionaspis divergens Green(盾介壳虫)；Dysaphis plantagineaPaaserini(红苹果蚜虫)；Dysdercus suturellus(棉蝽)；Dysmicoccus boninsis Kuwana(灰甘蔗粉蚧)；Empoasca fabae Harris(马铃薯叶蝉)；Eriosoma lanigerum Hausmann(苹绵蚜)；葡萄斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄斑叶蝉)；Eumetopina flavipes Muir(岛屿甘蔗飞虱)；扁盾蝽属(Eurygaster)物种；Euschistus servus Say(褐椿象)；E.variolarius Palisot de Beauvois(一斑蝽象)；长蝽属(Graptostethus)物种(长蝽系群(complex of seed bugs))；以及桃大尾蚜(Hyalopterus prunlGeoffroy)(桃大尾蚜)；Icerya purchasi Maskell(吹绵蚧)；Labopidicolaallii Knight(洋葱蝽)；Laodelphax striatellus Fallen(灰飞虱)；Leptoglossus corculus Say(松叶根蝽)；Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer(甘蔗网蝽)；Lipaphis erysimi Kaltenbach(芜箐蚜虫)；Lygocorispabulinus Linnaeus(通绿盲蝽)；Lygus lineolaris Palisot de Beauvois(牧草盲蝽)；L.Hesperus Knight(西部牧草盲蝽)；L.pratensis Linnaeus(普通牧场蝽)；L.rugulipennis Poppius(欧洲牧草盲蝽)；Macrosiphumeuphorbiae Thomas(马铃薯蚜虫)；Macrosteles quadrilineatus Forbes(翠菊叶蝉)；Magicicada septendecim Linnaeus(周期蝉)；Mahanarvafimbriolata(甘蔗沫蝉)；M.posticata(甘蔗小蝉)；Melanaphissacchari Zehntner(甘蔗蚜虫)；Melanaspis glomerata Green(黑白介壳虫)；Metopolophium dirhodum Walker(麦无网长管蚜)；Myzus persicaeSulzer(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；Nasonovia ribisnigri Mosley(莴苣蚜虫)；Nephotettix cinticeps Uhler(绿叶蝉)；N.nigropictus(水稻叶蝉)；Nezara viridula Linnaeus(南方绿蝽象)；Nilaparvata lugens(褐飞虱)；Nysius ericae Schilling(假臭虫)；Nysius raphanus Howard(假臭虫)；Oebalus pugnax Fabricius(稻蝽象)；Oncopeltus fasciatus Dallas(大马利筋蝽)；Orthops campestris Linnaeus；瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)(根蚜和瘿蚜)；Peregrinus maidis Ashmead(玉米飞虱)；Perkinsiellasaccharicida Kirkaldy(甘蔗飞虱)；Phylloxera devastatrix Pergande(美洲山核桃葡萄根瘤蚜)；Planococcus citri Risso(柑橘粉蚧)；Plesiocorisrugicollis Fallen(苹果盲蝽)；Poecilocapsus lineatus Fabricius(四线盲蝽)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；Pulvinaria elongata Newstead(羊胡子草介壳虫)；Pyrilla perpusilla Walker(甘蔗叶蝉)；红蝽属(Pyrrhocoridae spp.)；Quadraspidiotus perniciosus Comstock(梨园蚧)；猎蝽属物种(Reduviidae spp.)；Rhopalosiphum maidis Fitch(玉米叶蚜虫)；R.padi Linnaeus(禾谷缢管蚜)；甘蔗红粉蚧(Saccharicoccus sacchariCockerell)(甘蔗红粉蚧)；褐根椿象(Scaptacoris castanea Perty)(褐根椿象)；Schizaphis graminum Rondani(麦二叉蚜)；Sipha flava Forbes(黄色甘蔗蚜虫)；Sitobion avenae Fabricius(麦长管蚜)；Sogatella furciferaHorvath(白背飞虱)；Sogatodes oryzicola Muir(水稻飞虱)；Spanagonicus albofasciatus Reuter(白斑盲蝽)；Therioaphis maculataBuckton(斑点苜蓿蚜）；谷蛾科(Tinidae)物种；Toxoptera aurantii Boyer deFonscolombe(黑色柑橘蚜虫)；和T.citricida Kirkaldy(褐色柑橘蚜虫)；Trialeurodes abutiloneus(纹翅粉虱)和T.vaporariorum Westwood(温室粉虱)；Trioza diospyri Ashmead(柿木虱)；以及苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹果白叶蝉)。
另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，诸如Aceriatosichella Keifer(小麦卷叶螨)Panonychus ulmi Koch(欧洲红螨)；Petrobia latens Müller(褐色小麦螨)；Steneotarsonemus bancrofti Michael(甘蔗茎蟎)；叶螨科(Tetranychidae)的蜘蛛螨和红螨、Oligonychus grypusBaker&Pritchard、O.indicus Hirst(甘蔗叶蟎)、O.pratensis Banks(班克斯草螨)、O.stickneyi McGregor(甘蔗蜘蛛螨)；Tetranychus urticae Koch(二斑蜘蛛螨)；T.mcdanieli McGregor(McDaniel螨)；T.cinnabarinusBoisduval(红蜘蛛螨)；T.turkestani Ugarov&Nikolski)(草莓蜘蛛螨)、细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨类、Brevipalpus lewisi McGregor(柑橘扁平螨)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱类。Ixodes scapularis Say(鹿蜱)；I.holocyclus Neumann(澳洲寄生蜱)；Dermacentor variabilis Say(美洲犬蜱)；Amblyomma americanumLinnaeus(美洲钝眼蜱)；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫是值得关注的，诸如Lepisma saccharinaLinnaeus(蠹虫)；Thermobia domestica Packard(小灶衣鱼)。
所涵盖的其他节肢害虫包括：蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，诸如Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik(brown recluse spider)；和Latrodectusmactans Fabricius(黑寡妇蜘蛛)；和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类诸如Scutigera coleoptrata Linnaeus(蚰蜒)。此外，等翅目(Isoptera)中的病害昆虫是值得关注的，包括白蚁科(termitidae)的那些病害昆虫，例如但不限于：白蚁(Cornitermes cumulans Kollar)、Cylindrotermes nordenskioeldiHolmgren和Pseudacanthotermes milttarts Hagen(甘蔗白蚁)；以及鼻白蚁科(Rhinotermitidae)的那些病害昆虫，包括但不限于Heterotermes tenutsHagen。缨翅目(Thysanoptera)的昆虫也是值得关注的，包括但不限于：蓟马类，例如微直鬃蓟马(Stenchaetothrips minutus van Deventer)(甘蔗蓟马)。
昆虫害虫可以为成虫、幼虫或甚至卵细胞。用于测试杀虫活性的优选发育阶段为昆虫害虫的幼虫或其他不成熟形态。饲养昆虫幼虫和进行生物测定的方法在本领域中是熟知的。参见例如Czapla&Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485(Czapla和Lang，1990年，《经济昆虫学杂志》，第83卷，第2480-2485页)；Griffith&Smith(1977)J.Aust.Ent.Soc.16：366(Griffith和Smith，1977年，《澳大利亚昆虫学会杂志》，第16卷，第366页)；Keiper&Foote(1996)Hydrobiologta 339：137-139(Keiper和Foote，1996年，《水生生物学》，第339卷，第137-139页)；以及美国专利No.5,351,643。例如，可将昆虫害虫在完全黑暗中在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度下饲养。
新型嵌合杀虫多肽在与不含溶解性增强多肽的杀虫多肽相比时可表现出改善的杀虫活性。如本文所用，术语“改善的杀虫活性”是指如通过本文所公开的方法制备的按照本发明所公开的方法相对于不含溶解性增强多肽的相应杀虫多肽的活性具有增强的杀虫活性的多肽，和/或有效抗更宽范围的害虫的多肽，和/或对于在用本发明所公开的方法对多肽序列进行修饰之前不易受所述多肽的毒性影响的害虫具有特异性的多肽。发现改善的或增强的杀虫活性需要证明：如针对同一害虫进行测定，相对于添加溶解性增强多肽之前的多肽的杀虫活性而言，对昆虫靶标的杀虫活性提高至少10％，或杀虫活性提高至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％或300％或更高。
例如，如果相对于受序列修饰之前的多肽影响的害虫范围而言受该多肽影响的害虫范围更宽或更窄，则就提供了改善的杀虫活性。在需要多用途性的情况下，更宽的影响范围可能是合乎需要的，而在例如益虫可能反而会被该杀虫多肽的使用或存在影响的情况下，较窄的影响范围可能是合乎需要的。虽然本发明不受任何特定作用机理的约束，但也可通过多肽的一个或多个特性的改变而提供改善的杀虫活性；例如，多肽在昆虫肠道中的稳定性或寿命可相对于相应的野生型蛋白的稳定性或寿命得到提高。
“受试植物或植物细胞”是其中已针对目标基因进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此修改的植物或细胞遗传下来并包含该修改的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。
对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，如包含标志基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化隔离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同但不暴露于会引起所关注基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
如上所述，该方法涉及生成新型嵌合杀虫多肽序列和编码此类多肽的核苷酸序列。新型嵌合杀虫多肽序列通过制备融合蛋白而产生，该融合蛋白包含有效连接到杀虫蛋白尤其是cry蛋白的氨基酸序列的溶解性增强多肽氨基酸序列。
任何杀虫蛋白均可用于本发明所公开的方法。在一些实施例中，杀虫蛋白为芽孢杆菌属物种的δ-内毒素。δ-内毒素的比活性被视为高度有益的。与大部分杀昆虫剂不同，δ-内毒素不具有广谱活性，因此它们通常不会杀灭益虫。此外，δ-内毒素对哺乳动物(包括人类、家养动物和野生动物)是无毒的。在特定实施例中，δ-内毒素为Cry蛋白。
熟知的是，天然存在的δ-内毒素由苏云金芽孢杆菌孢子形成细胞作为蛋白质性晶状包涵体原毒素(proteinaceous crystalline inclusion protoxin)而合成。被易感昆虫幼虫摄取后，该微晶溶于中肠，并且原毒素通过位于昆虫肠道中的消化酶特有的蛋白酶而转化成生物活性部分。活化的δ-内毒素以高亲和力结合到刷状缘膜囊上的蛋白受体。中肠的内衬上皮细胞是内毒素的主要靶标，并因毒素形成门控、阳离子选择性通道所导致的膜穿孔而被快速破坏。Cry和Cyt毒素均为形成孔的毒素。Cry毒素的α-螺旋区形成跨膜孔，而Cyt毒素则通过由各单体形成由β-折叠构成的β-桶结构而插入膜中。
Bt Cry蛋白具有五个保守序列域和三个保守结构域(参见例如deMaagd et al.(2001)Trends Genetics 17：193-199(de Maagd等人，2001年，《遗传学趋势》，第17卷，第193-199页))。大多数氨基末端的保守结构域(结构域I)由七个α螺旋组成，其中中央疏水螺旋-α5被六个其他两亲螺旋包围，并且参与膜插入和孔形成。第二保守结构域(结构域II)由涉及细胞结合的三个反平行的β-折叠片组成，并且大多数羧基末端的保守结构域(结构域III)由β-夹层组成。结构域II和III中的暴露区域参与受体识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。这些结构域的位置和性质是本领域技术人员已知的。参见例如Grochulski et al.(1995)J MolBiol 254：447-464(Grochulski等人，1995年，《分子生物学杂志》，第254卷，第447-464页)；Morse，Yamamoto，and Stroud(2001)Structure 9：409-417(Morse、Yamamoto和Stroud，2001年，《结构》，第9卷，第409-417页)；Li et al.(1991)Nature 353：815-821(Li等人，1991年，《自然》，第353卷，第815-821页)；Galitsky et al.(2001)Acta CrystD57：1101-1109(Galitsky等人，2001年，《晶体学报》，第D57卷，第1101-1109页)；Boonserm et al.(2006)J Bacteriol188：3391-3401(Boonserm等人，2006年，《细菌学杂志》，第188卷，第3391-3401页)；Boonserm et al.(2005)JMol Biol 348：363-382(Boonserm等人，2005年，《分子生物学杂志》，第348卷，第363-382页)；以及Guo et al.(2009)J Struct Biol 168：259-266(Guo等人，2009，《结构生物学杂志》，第168卷，第259-266页)。
Bt Cyt蛋白具有单个α-β域，其包含围绕β-折叠而缠绕的两个α-螺旋发夹外层(Li，Koni，and Ellar(1996)J Mol Biol257：129-152(Li、Koni和Ellar，199年，《分子生物学杂志》，第257卷，第129-152页)；以及Cohen et al.(2008)J Mol Biol380：820-827(Cohen等人，2008年，《分子生物学杂志》，第380卷，第820-827页))。β-折叠涉及膜插入。
一些已知的δ-内毒素(Cry和Cyt内毒素)的列表及其GenBank登录号列于表2中，其可用作用于本文所公开的方法的核酸和氨基酸序列的来源。
表2
*表2中的登录号对应的氨基酸和相应核苷酸序列以引用方式并入本文。
δ-内毒素的例子还包括但不限于美国专利No.5,880,275和No.7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利No.8,304,604、No.8,304,605和No.8,476,226的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白诸如Cry1A、Cry3A的α-螺旋1和/或α-螺旋2变体的N端缺失)；美国专利申请Nα.10/525,318的Cry1B；美国专利No.6,033,874的Cry1C；美国专利No.5,188,960和No.6,218,188的Cry1F；美国专利No.7,070,982、No.6,962,705和No.6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；Cry2蛋白，诸如美国专利No.7,064,249的Cry2Ab蛋白)；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公布No.2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利No.7,329,736、No.7,449,552、No.7,803,943、No.7,476,781、No.7,105,332、No.7,378,499和No.7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，诸如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Naimov，et al.，(2008)Applied and Environmental Microbiology，74：7145-7151(Naimov等人，2008年，《应用与环境微生物学》，第74卷，第7145-7151页)的Cry15蛋白；美国专利No.6,127,180、No.6,624,145和No.6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利No.6,248,535、No.6,326,351、No.6,399,330、No.6,949,626、No.7,385,107和No.7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公布No.2006/0191034、No.2012/0278954和PCT公布No.WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利No.6,083,499、No.6,548,291和No.6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利申请公布No.2008/0295207的TIC807；PCTUS 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利No.8,513,494的TIC853毒素，美国专利No.8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利No.7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO2005/021585的AXMI-003；美国专利申请公布No.2004/0250311的AXMI-008；美国专利申请公布No.2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公布No.2004/0210965的AXMI-007；美国专利申请No.2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公布No.2004/0197917的AXMI-014；美国专利申请公布No.2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利No.8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公布No.2011/0023184的AXMI-205；美国专利申请公布No.2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利申请公布No.2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 2011/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利No.8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公布No.2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公布No.2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利No.8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利申请公布No.2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137，美国专利No.8,319,019的cry蛋白，诸如具有经修饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A；美国专利申请公布No.2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的Crickmore，et al.，“Bacillus thuringiensis toxinnomenclature”(2011)(Crickmore等人，“苏云金芽孢杆菌毒素命名”，2011年))。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述，参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.101：1-16(vanFrannkenhuyzen，2009年，《转化途径杂志》，第101卷，第1-16页))。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于表达Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的植物的Cry转基因植物已取得监管批准(参见Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal9：283-300(Sanahuja，2011年，《植物生物技术杂志》，第9卷，第283-300页)和cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database(可使用“www”前缀在万维网上访问)的CERA(2010)GM Crop Database Centerfor Environmental Risk Assessment(CERA)，ILSI Research Foundation，Washington D.C.(CERA(2010)转基因作物数据库，环境风险评估中心(CERA)，国际生命科学学院研究基金，华盛顿))。
杀虫多肽的一级结构可以其天然形式使用或加以修饰以便引入氨基酸残基(通过添加或置换)，这些残基有助于或疑似有助于至少一种杀虫多肽的杀虫活性。可以查阅得自结构-功能分析的功能数据和结果以鉴定有助于杀虫活性而应当保留或引入候选多肽序列的序列和/或氨基酸残基。有助于或疑似有助于杀虫活性的那些残基包括增强效力的那些残基或决定杀虫特异性的那些残基，包括变窄或增宽杀虫蛋白的害虫范围的那些残基。
例如，已发现分别在Bt Cry4Ba毒素的第7个螺旋中的第249和264位的酪氨酸和苯丙氨酸的芳香性对于毒性具有重要意义(Tiewsiri andAngsuthanasombat(2007)J Biochem Mol Biol 40：163-171(Tiewsiri和Angsuthanasombat，2007年，《生物化学与分子生物学杂志》，第40卷，第163-171页))。因此，在其中候选多肽与Bt Cry4Ba毒素同源的那些实施例中，在对应于Cry4Ba的第249和264位的位置处的残基应在它们为芳香族时加以保留，或在它们为非芳香族时进行修饰。
另外，可将额外的突变引入杀虫多肽序列以改善杀虫活性。例如，如美国专利No.7,462,760和No.7,105,332(这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文)所述，可将突变引入候选多肽序列以破坏蛋白水解位点，从而保护多肽免受例如植物蛋白酶的降解消化的影响。又如，Bt Cry蛋白的毒性可通过以下方式而改善：将至少一个对蛋白酶更敏感的位点(例如，胰蛋白酶裂解位点)引入位于内毒素蛋白的域1的α螺旋3与4之间的区域(参见美国专利申请公布No.US2004/0091505，其全文以引用方式并入本文)。作为另一个非限制性例子，可将容易被昆虫胰凝乳蛋白酶(例如，披肩粘虫或玉米穗虫中存在的胰凝乳蛋白酶)裂解的蛋白酶敏感位点(Hegedus et al.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47(Hegedus等人，2003年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第53卷，第30-47页)；以及Lenz et al.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212(Lenz等人，1991年，《昆虫生物化学与生理学档案》，第16卷，第201-212页))加入候选多肽序列以向多肽提供改善的毒性。
在本发明的某些实施例中，Cry蛋白包含SEQ ID NO：8、10、12或14所示的氨基酸序列或其片段或变体。编码8、10、12或14所示的氨基酸序列或其片段或变体的任何核苷酸序列均可用于本发明的方法和组合物，包括但不限于编码SEQ ID NO：8、10、12和14的核苷酸序列，它们分别如SEQ ID NO：7、9、11和13所示。在本发明的一些实施例中，将对本发明的核苷酸序列进行优化以在所关注的宿主生物体或细胞(具体地讲植物，更具体地讲作物植物，最具体地讲玉蜀黍植物)中表达。
通过昆虫生物测定法测量杀虫活性的方法在本领域中是熟知的。参见例如Brooke et al.(2001)Bull.Entomol.Res.91：265-272(Brooke等人，2001年，《昆虫学报告》，第91卷，第265-272页)；Chen et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：13901-13906(Chen等人，2007年，《美国国家科学院院刊》，第104卷，第13901-13906页)；Crespo et al.(2008)Appl.Environ.Microb.74：130-135(Crespo等人，2008年，《应用与环境微生物学》，第74卷，第130-135页)；Khambay et al.(2003)Pest Manag.Sci.59：174-182(Khambay等人，2003年，《害虫治理科学》，第59卷，第174-182页)；Liu&Dean(2006)Protein Eng.Des.Sel.19：107-111(Liu和Dean，2006年，《蛋白质工程、设计与选择》，第19卷，第107-111页)；Marrone et al.(1985)J.Econ.Entomol.78：290-293(Marrone等人，1985年，《经济昆虫学杂志》，第78卷，第290-293页)；Robertson et al.，Pesticide Bioassays with Arthropods(2nd ed.，CRC Press 2007)(Robertson等人，《节肢动物的杀虫剂生物测定》，第2版，CRC出版社，2007年)；Scott&McKibben(1976)J.Econ.Entomol.71：343-344(Scott和McKibben，1976年，《经济昆虫学杂志》，第71卷，第343-344页)；Strickman(1985)Bull.Environ.Contam.Toxicol.35：133-142(Strickman，1985年，《环境污染与毒物学通报》，第35卷，第133-142页)；以及Verma et al.(1982)Water Res.16 525-529(Verma等人，1982年，《水研究》，第16卷，第525-529页)；以及美国专利No.6,268,181。昆虫生物测定法的例子包括但不限于害虫在取食和暴露于杀虫剂或杀虫多肽达适当时长后的害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫排斥性、害虫吸引性以及害虫的其他行为和身体变化。一般方法包括将杀虫剂、杀虫多肽或具有杀虫多肽的生物体添加至封闭容器中的饮食来源。参见例如美国专利No.6,339,144和No.6,570,005。
另外，编码新型嵌合杀虫多肽的核酸可衍生自氨基酸序列并可使用本领域已知的任何方法生成。因此，本发明提供了隔离的新型杀虫多肽和编码所述多肽的隔离的核酸分子。“隔离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白或其生物活性片段，实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或蛋白的天然环境中存在的、与该多核苷酸或蛋白相伴随或相互作用的成分。因此，隔离的或纯化的多核苷酸或蛋白，当通过重组技术制备时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最佳的是，“隔离的”多核苷酸不含在得到该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳的是蛋白编码序列)。例如，在各个实施例中，隔离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在得到该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。实质上不含细胞物质的蛋白包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以千重计)的污染性蛋白的蛋白的制品。因此，当本发明的蛋白或其生物活性片段用重组法制备时，最佳的是，培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以千重计)的化学前体或非目的蛋白的化学品。
本发明还提供了新型嵌合杀虫多肽以及编码此类新型嵌合杀虫多肽的核酸分子，所述新型嵌合杀虫多肽包含溶解性增强多肽和/或杀虫蛋白的片段和变体。本发明还提供了所述新型嵌合杀虫多肽和编码嵌合杀虫多肽的核酸分子的片段和变体。所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白的一部分。多核苷酸的片段可编码保持溶解性增强活性和/或杀虫活性的蛋白片段。作为另一种选择，可用作杂交探针的多核苷酸的片段一般不编码保持溶解性增强活性和/或杀虫活性的蛋白片段。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码新型嵌合杀虫多肽的全长多核苷酸的范围内。
在编码杀虫剂的多核苷酸中编码溶解性增强多肽或杀虫蛋白的生物活性片段的片段将编码存在于本发明的嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白中的至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1,100个连续氨基酸或最多至所有氨基酸。可用作杂交探针或PCR引物的嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白的片段一般不需要编码嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白的生物活性片段。
因此，嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白的片段可编码杀虫蛋白的生物活性片段，或其可以为可通过本领域熟知的且在本文别处所公开的方法而用作杂交探针或PCR引物的片段。杀虫蛋白的生物活性片段可通过以下方式制备：隔离编码杀虫剂的多核苷酸之一的一部分，表达杀虫蛋白的编码部分(例如，通过体外重组表达)，以及评估杀虫蛋白的该编码部分的活性。作为嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白序列的片段的多核苷酸包含存在于使用本文所公开的方法发现的编码全长杀虫剂的多核苷酸中的至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500或3000个连续核苷酸或最多至所有核苷酸。
“变体”旨在意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括在5′和/或3′末端具有缺失(即，截短)；在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点置换一个或多个核苷酸的多核苷酸。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包含因遗传密码简并性而编码本发明的嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体(如这些)可用熟知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如通过使用定点诱变而生成的但仍编码本发明的嵌合杀虫多肽、溶解性增强多肽或杀虫蛋白的那些多核苷酸。通常，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数进行测定，本发明的特定多核苷酸的变体将具有与该特定多核苷酸至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
本发明的特定多核苷酸(即参比多核苷酸)的变体还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该参比多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分比来进行评估。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：2的多肽具有给定百分比的序列同一性的多肽的隔离多核苷酸。任何两个多肽之间的序列同一性百分比可用本文别处所述的序列比对程序和参数来计算。在任何给定的本发明多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽所共享序列同一性百分比进行评估的情况中，两个被编码的多肽之间的序列同一性百分比为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
“变体”蛋白旨在意指通过如下方式而衍生自天然蛋白的蛋白：在天然蛋白的N末端和/或C末端缺失(所谓的截短)一个或多个氨基酸；在天然蛋白中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白中的一个或多个位点置换一个或多个氨基酸。本发明所涵盖的变体蛋白是生物活性的，也就是说它们继续拥有天然蛋白的所需生物活性，即如本文所述的杀虫活性。此类变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。如通过本文别处所述的序列比对程序和参数进行测定，本发明的嵌合杀虫多肽的生物活性变体将具有与天然蛋白的氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性。本发明的蛋白的生物活性变体与该蛋白可相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个(如6-10个)、少至5个、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
使用本发明所公开的方法制备的新型嵌合杀虫多肽可以以多种方式变更，包括嵌合杀虫多肽的溶解性增强多肽和/或杀虫多肽部分的氨基酸置换、缺失、截短和插入。此类操纵的方法是本领域熟知的。例如，嵌合杀虫多肽、杀虫多肽和溶解性增强多肽的氨基酸序列变体和片段可通过DNA中的突变而制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》，麦克米兰出版公司，纽约)，以及其中引用的参考文献。有关不会影响所关注蛋白的生物活性的适当氨基酸置换的指导可见于以下文献所述的模型中：Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)，该文献以引用方式并入本文。保守置换，例如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。
本文所涵盖的新型嵌合杀虫多肽序列、杀虫多肽序列和溶解性增强多肽序列的缺失、插入和置换预计不会产生蛋白特性的根本性变化。但是，当在进行置换、缺失或插入之前难以预测置换、缺失或插入的准确效应时，本领域技术人员应认识到该效应将通过常规的筛选测定进行评估。也就是说，可使用如本文别处所述的昆虫取食生物测定法评估杀虫活性。优选地，通过以下方式评估溶解性增强多肽或其片段或变体的生物活性：将溶解性增强多肽、片段或变体有效连接到杀虫多肽，并使用本文所公开的方法或者说是本领域已知的方法测定所得的嵌合杀虫多肽的杀虫活性。可将嵌合杀虫多肽的杀虫活性与杀虫肽(即，不具有溶解性增强多肽、片段或变体)的杀虫活性进行比较以确定溶解性增强多肽、片段或变体是否增加嵌合杀虫多肽的杀昆虫活性。优选地，在其中比较嵌合杀虫多肽与其相应杀虫多肽的任何昆虫取食测定法中，将对喂给昆虫的相应多肽的量进行调整以考虑到嵌合杀虫多肽的大分子量，以使得将基于每分子或每摩尔而有效地比较杀虫活性。此外，已经认识到，还可以评估具有不同溶解性增强多肽或溶解性增强多肽的片段或变体的嵌合杀虫多肽的杀昆虫活性，并以相似的方式且优选地对进行比较的嵌合杀虫多肽之间的分子量的任何差异进行调整，从而在彼此之间进行比较。
变体多核苷酸和蛋白还涵盖由诱变和重组方法(如DNA改组)获得的序列和蛋白。通过这种方法，可以操纵一个或多个不同的编码杀虫剂的序列以形成具有所需性质的新杀虫多肽，并且可将这些新的杀虫蛋白用于本文所公开的方法以制备嵌合杀虫多肽。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer(1994)Nature 370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameri et al.(1998)Nature 391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)；以及美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分比”。
(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
(b)如本文所用，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列比对以作比较的方法是本领域熟知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分比的确定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17(Myers和Miller，1988年，《生物信息学》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的算法；Karlin and Altschul(1990)Proc..Natl.Acad.Sci.USA 872264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页)的算法，其在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。
这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类程序包括但不限于：PC/Gene程序(可获自加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California))中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software版本10(可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(AccelrysInc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的序列比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins et al.(1988)Gene 73：237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；Higgins et al.(1989)CABIOS 5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang et al.(1992)CABIOS 8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)；以及Pearsonet al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可以使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分(score)＝100、字长(wordlength)＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所述采用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。
除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。以及它们的任何等同程序。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。
GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白序列，GCGWisconsin Genetics Software Package的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0-200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
(c)如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的情形中的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比针对蛋白使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于此类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California))中所执行那样进行计算。
(d)如本文所用，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
在杂交技术中，将已知的多核苷酸的全部或一部分用作探针，该探针选择性地杂交到来自选定生物体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即基因组文库或cDNA文库)中所存在的其他相应多核苷酸。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团(诸如32P)或任何其他可检测标志物进行标记。因此，例如，杂交用探针可通过对基于babyboom多核苷酸的合成寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)中有所公开。
例如，整个编码杀虫剂的多核苷酸或其一个或多个部分可用作能够与相应的编码杀虫剂的多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，此类探针包含在编码杀虫剂的多核苷酸序列当中独特的序列，并且优选长度为至少约10个核苷酸，最优选长度为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过PCR从选定的生物体扩增相应的编码杀虫剂的多核苷酸。这个技术可用于从所需生物体隔离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括对平板DNA文库(噬菌斑或菌落)的杂交筛选；参见例如Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)中有所公开。
此类序列的杂交可以在严格条件下进行。所谓“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度将可检测地大于与其他序列杂交的程度(例如，比背景大至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，最佳地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为那些其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，一般约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的等式近似获得：的方程Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需程度的错配导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选的是增加SSC浓度以便可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter2(Elsevier，New York)(Tijssen，1993年，《生物化学和分子生物学实验技术-核酸探针杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔出版社，纽约)；以及Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)(Ausubel等人编辑，1995年，《分子生物学实验手册》，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience出版社，纽约)。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)中有所公开。
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等等。
编码新型嵌合杀虫多肽的核酸可用于DNA构建体以在包括植物的多种宿主中表达。因此，提供了用于在所关注的生物体中表达的包含编码新型嵌合杀虫多肽的核酸的表达盒。该表达盒将包含有效连接到编码新型嵌合杀虫多肽的多核苷酸的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，所关注多核苷酸与调控序列(即启动子)之间的有效连接是可使该所关注多核苷酸得以表达的功能连接。就融合蛋白或融合多肽而言，在例如所关注的第一氨基酸序列与所关注的第二氨基酸序列之间的有效连接产生单个氨基酸序列，其同时包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，并且其中第一氨基酸序列的C端氨基酸通过肽键共价附接到第二氨基酸序列的N端氨基酸。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。表达盒可另外含有至少一个待共转化到生物体中的所关注的额外多核苷酸。作为另一种选择，可在多个表达盒上提供所关注的额外多核苷酸。这种表达盒设有多个限制性位点和/或重组位点，以使编码杀虫剂的多核苷酸的插入处于调控区的转录调节之下。表达盒可另外含有选择性标志基因。
本发明的嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的氨基酸序列的溶解性增强多肽的氨基酸序列。已经认识到，在这种有效连接中，溶解性增强多肽的氨基酸序列可与Cry内毒素的氨基酸序列邻接，或可由居间连接基或其他氨基酸序列分隔开。同样，本发明的编码嵌合杀虫多肽的核酸分子包含有效连接到编码Cry内毒素的核苷酸序列的编码溶解性增强多肽的核苷酸序列。还已认识到，在这种有效连接中，编码溶解性增强多肽的核苷酸序列可与编码Cry内毒素的核苷酸序列邻接，或可由编码居间连接基的核苷酸序列或其他核苷酸序列分隔开。
表达盒将在5′-3′转录方向上包含在引入表达盒的生物体中起作用的转录和翻译起始区(即，启动子)、编码新型杀虫剂的多核苷酸以及转录和翻译终止区(即，终止区)。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或编码杀虫剂的多核苷酸对宿主细胞或彼此而言可以是天然的/同功的。作为另一种选择，调控区和/或编码杀虫剂的多核苷酸对宿主细胞或彼此而言可以是异源的。如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，有效连接至异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者实质上从它们的原始形式和/或基因座修饰而得，或者该启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。
终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的所关注的杀虫多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、所关注的杀虫多核苷酸、植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。还可参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas etal.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshi et al.(1987)Nucleic AcidsRes.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
如适当的话，可对多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主优选密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物优选性基因的方法。参见例如，美国专利No.5,380,831和5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，将该文献以引用方式并入本文。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类充分表征的可能有害于基因表达的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：微RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virology 154：9-20(《病毒学》，第154卷，第9-20页))以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in MolecularBiology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物学》，Cech编辑(Liss，纽约)，第237-256页))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。还可参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(例如转换和颠换)。
可将编码嵌合杀虫多肽的核酸分子、包含该核酸分子的表达盒或该嵌合杀虫多肽引入生物体或宿主细胞，尤其是非人类宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在一些例子中，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞。
可将编码新型嵌合杀虫多肽的核酸引入在植物(附生植物)上繁殖的微生物以将嵌合杀虫多肽递送到潜在的靶害虫。作为另一种选择，可将嵌合杀虫多肽直接引入此类微生物。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
根定殖细菌例如可通过本领域已知的方法从所关注的植物隔离。具体而言，可从植物的根隔离出根棲的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株(参见例如，Handelsman et al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718(Handelsman等人，1991年，《应用和环境微生物学》，第56卷，第713-718页))。可通过本领域已知的标准方法将编码本发明的杀虫蛋白或嵌合杀虫多肽的核酸引入根定殖蜡状芽孢杆菌中。
可将编码嵌合杀虫多肽的核酸借助电转化而引入例如根定殖芽孢杆菌中。具体地讲，可将编码杀虫蛋白的核酸克隆到穿梭载体如pHT3101中(Lerecius et al.(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218(Lerecius等人，1989年，《欧洲生物化学学会联盟微生物学快报》，第60卷，第211-218页))。含有编码特定嵌合杀虫多肽的核酸的编码序列的穿梭载体pHT3101可例如借助于电穿孔而转化到根定殖芽孢杆菌中(Lerecius et al.(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218(Lerecius等人，1989年，《欧洲生物化学学会联盟微生物学快报》，第60卷，第211-218页))。
可设计表达系统，以使得嵌合杀虫多肽被分泌到革兰氏阴性细菌(诸如大肠杆菌)的细胞质之外。使嵌合杀虫多肽分泌的优点有：(1)避免所表达的嵌合杀虫多肽的潜在细胞毒性作用；和(2)改善嵌合杀虫多肽的纯化效率，包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白回收和纯化效率和降低每单位蛋白的回收和纯化时间和/或成本。
可例如通过将适当的大肠杆菌信号肽与杀虫蛋白的氨基末端融合，使嵌合杀虫多肽在大肠杆菌中分泌。被大肠杆菌识别的信号肽可存在于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白，例如OmpA蛋白(Ghrayeb et al.(1984)EMBO J，3：2437-2442(Ghrayeb等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2437-2442页))。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白，因此它的信号肽据认为在转移过程中有效。另外，在加工前不需要对OmpA信号肽进行修饰，而其他信号肽例如脂蛋白信号肽则需要(Duffaud et al.(1987)Meth.Enzymol.153：492(Duffaud等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第492页))。
可在细菌宿主中发酵本发明的嵌合杀虫多肽，并且将所得的细菌加工并以与苏云金芽孢杆菌菌株用作杀昆虫喷剂相同的方式用作微生物喷剂。就从芽孢杆菌属分泌的嵌合杀虫多肽而言，使用本领域已知的方法将分泌信号移除或使之突变。此类突变和/或缺失防止嵌合杀虫多肽在发酵过程中分泌到生长培养基中。嵌合杀虫多肽被保持在细胞内，然后对细胞进行加工以产生包囊嵌合杀虫多肽。任何合适的微生物都可用于这个目的。已用假单胞菌属将苏云金芽孢杆菌内毒素表达为包囊蛋白，并且将所得的细胞进行加工并作为杀昆虫剂喷施(Gaertner et al.(1993)，in：AdvancedEngineered Pesticides，ed.Kim(Gaertner等人，1993年，载于《高级工程化杀虫剂》，Kim编辑))。
作为另一种选择，通过将编码嵌合杀虫多肽的异源核酸引入细胞宿主而产生嵌合杀虫多肽。异源核酸的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在当将细胞施用于靶标害虫的环境时能延长该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些天然包囊嵌合杀虫多肽以便施用于靶标害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如EPA 0192319，以及其中引用的参考文献。
可将编码新型嵌合杀虫多肽的多核苷酸和嵌合杀虫多肽引入植物细胞或植物以产生可抵抗易受该嵌合杀虫多肽影响的昆虫的转基因植物。
可将编码新型嵌合杀虫多肽的多核苷酸与组成型、组织优选的或其他启动子相结合以在植物中表达。启动子可基于所需的结果来选择。
此类组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；遍在蛋白(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(第5,659,026号美国专利)等等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142和No.6,177,611。
一般来讲，从诱导型启动子，特别是从病原体诱导型启动子表达基因将会是有利的。此类启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些，该蛋白在病原体感染后诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参见例如Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254(Redolfi等人，1983年，《荷兰植物病理学杂志》，第89卷，第245-254页)；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4：645-656(Uknes等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第645-656页)；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116(Van Loon，1985年，《植物分子病毒学》，第4卷，第111-116页)。还可参见WO 99/43819，该文献以引用方式并入本文。
在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如，Marineau et al.(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342(Marineau等人，1987年，《植物分子生物学》，第9卷，第335-342页)；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331(Matton等人，1989年，《分子植物-微生物相互作用》，第2卷，第325-331页)；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430(Somsisch等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第2427-2430页)；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98(Somsisch等人，1988年，《分子遗传学与普通遗传学》，第2卷，第93-98页)；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977(Yang，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第14972-14977页)。还可参见Chen et al.(1996)Plant J.10：955-966(Chen等人，1996年，《植物杂志》，第10卷，第955-966页)；Zhanget al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511(Zhang等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2507-2511页)；Warner et al.(1993)Plant J.3：191-201(Warner等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第191-201页)；Siebertz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968(Siebertz等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第961-968页)；美国专利No.5,750,386(线虫诱导型)；以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)诱导(参见例如Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200(Cordero等人，1992年，《生理与分子植物病理学》，第41卷，第189-200页))。
另外，因为病原体可通过伤口或昆虫损伤进入植物中，可将伤口诱导型启动子用于本发明的构建体中。此类伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449(Ryan，1990年，《植物病理学年评》，第28卷，第425-449页)；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology 14：494-498(Duan等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第494-498页))；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208(Stanford等人，1989年，《分子遗传学与普通遗传学》，第215卷，第200-208页))；系统素(McGurl et al.(1992)Science 225：1570-1573(McGurl等人，1992年，《科学》，第225卷，第1570-1573页))；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792(Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页)；Eckelkamp etal.(1993)FEBS Letters 323：73-76(Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生物化学学会联盟快报》，第323卷，第73-76页))；MPI基因(Corderok etal.(1994)Plant J.6(2)：141-150(Corderok等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第141-150页))；等等，这些文献以引用方式并入本文。
可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作前突生(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他值得关注的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如，糖皮质类固醇诱导型启动子，载于Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；以及McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页))和四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)；以及美国专利No.5,814,618和No.5,789,156)，这些文献和专利以引用方式并入本文。
组织优选的启动子可用于将增强的嵌合杀虫多肽表达靶向特定的植物组织内。组织优选的启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Campet al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto et al.(1994)PlantCell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；以及Guevara-Garcia et al.(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对此类启动子进行修饰以用于弱表达。
叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页)；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Gotoret al.(1993)Plant J.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页)；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；以及Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)。
根优选的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头隔离。参见例如，Hire et al.(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(Hire等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第2期，第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller andBaumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(Keller和Baumgartner，1991年，《植物细胞》，第3卷，第10期，第1051-1061页)(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.)，14(3)：433-443(Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第3期，第433-443页)(根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao et al.(1991)PlantCell 3(1)：11-22(Miao等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第1期，第11-22页)(编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还可参见Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2(7)：633-641(Bogusz等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第7期，第633-641页)，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因隔离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotuscorniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达rolC和rolD根诱导基因的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76(《植物科学》，Limerick，第79卷，第1期，第69-76页))。他们得出结论认为，增强子和组织优选的DNA决定子在那些启动子中是隔离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合，表明编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合(参见EMBO J.8(2)：343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第2期，第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772(Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》，第29卷，第4期，第759-772页))；以及rolB启动子(Capana et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691(Capana等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第4期，第681-691页))。还可参见美国专利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。
“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子(那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompson et al.(1989)BioEssays 10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)，该文献以引用方式并入本文。此类种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利No.6,225,529；所述专利通过引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)基因启动子是代表性的胚芽特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米蛋白基因启动子、22kDa玉米蛋白基因启动子、27kDa玉米蛋白基因启动子、γ-玉米蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。还可参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选的启动子；将这些专利和文献以引用方式并入本文。
如果需要低水平表达，则要使用弱启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/1000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。作为另一种选择，已经认识到，弱启动子还涵盖仅在少数细胞中而不在其他细胞中表达从而造成总表达水平较低的启动子。如启动子以不可接受的高水平表达，则可缺失或修饰启动子序列的一些部分以降低表达水平。
此类弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463和No.5,608,142。还可参见美国专利No.6,177,611，其以引用方式并入本文。
表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因被利用于转化细胞或组织的选择。选择性标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4--二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标志物包括表型标志物如β-半乳醣苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Suet al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)和Fetter et al.(2004)Plant Cell16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标志物，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao et al.(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Hu et al.(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown et al.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge et al.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，海德堡大学博士论文)；Reineset al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb etal.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，海德堡大学博士论文)；Gossenet al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka et al.(1985)Handbookof Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill etal.(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用方式并入本文。
上面关于选择性标志物基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标志物基因均可用于本发明。
在一个实施例中，将所关注的多核苷酸靶向叶绿体进行表达。这样，如果所关注的多核苷酸不直接插入叶绿体，则表达盒另外将含有编码转运肽的核酸以将所关注的基因产物导向叶绿体。此类转运肽是本领域已知的。参见例如Von Heijne et al.(1991)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126(Von Heijne等人，1991年，《植物分子生物学报告》，第9卷，第104-126页)；Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550(Clark等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第17544-17550页)；Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)；Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421(Romer等人，1993年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第196卷，第1414-1421页)；以及Shah et al.(1986)Science 233：478-481(Shah等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页)。
叶绿体靶向序列是本领域已知的，并包括叶绿体核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亚基(de Castro Silva Filho et al.(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780(de Castro Silva Filho等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第769-780页)；Schnell et al.(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342(Schnell等人，1991年，《生物化学杂志》，第266卷，第5期，第3335-3342页))、5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer etal.(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810(Archer等人，1990年，《生物能学和生物膜杂志》，第22卷，第6期，第789-810页))、色氨酸合酶(Zhao et al.(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087(Zhao等人，1995年，《生物化学杂志》，第270卷，第11期，第6081-6087页))、质体蓝素(Lawrence et al.(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363(Lawrence等人，1997年，《生物化学杂志》，第272卷，第33期，第20357-20363页))、分支酸合酶(Schmidt et al.(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457(Schmidt等人，1993年，《生物化学杂志》，第268卷，第36期，第27447-27457页))以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa et al.(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999(Lamppa等人，1988年，《生物化学杂志》，第263卷，第14996-14999页))。还可参见Von Heijne et al.(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126(Von Heijne等人，1991年，《植物分子生物学报告》，第9卷，第104-126页)；Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550(Clark等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第17544-17550页)；Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)；Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421(Romer等人，1993年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第196卷，第1414-1421页)；以及Shah et al.(1986)Science 233：478-481(Shah等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页)。
转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530(Svab等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第8526-8530页)；Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917(Svab和Maliga，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第913-917页)；Svab and Maliga(1993)EMBO J.12：601-606(Svab和Maliga，1993年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第12卷，第601-606页)。该方法依赖于粒子枪输送含选择性标志物的DNA以及通过同源重组将DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过细胞核编码和质体介导的RNA聚合酶的组织优选表达来反式激活沉默的质体携带的转基因而完成。这种系统已在McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305(McBride等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第7301-7305页)中报道。
可对要靶向叶绿体的所关注多核苷酸进行优化以在叶绿体中表达，从而考虑植物细胞核与该细胞器之间的密码子用法的差异。这样，可使用叶绿体优选的密码子合成所关注的多核苷酸。参见例如美国专利No.5,380,831，该专利以引用方式并入本文。
本发明的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物或其他生物体。“引入”意指以使得序列得以进入生物体细胞的内部的方式将多核苷酸或多肽呈递到生物体。本发明的方法不取决于将序列引入生物体中的具体方法，只要多核苷酸或多肽得以进入生物体的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。
转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页)、农杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见例如美国专利No.4,945,050；美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和No.5,932,782；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，(施普林格，柏林))；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))以及Lec1转化(WO 00/28058)。还可参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou et al.(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然(伦敦)》，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulationof Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(DeWet等人，1985年，《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑(朗文出版社，纽约)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler et al.(1990)PlantCell Reports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda et al.(1996)NatureBiotechnology 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)；所有这些文献均以引用方式并入本文。
在具体的实施例中，可使用多种瞬时转化方法向植物提供本发明的编码嵌合杀虫多肽的序列。此类瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入杀虫蛋白或其变体和片段，或向植物中引入编码杀虫剂的转录物。此类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页)；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepleret al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有文献均以引用方式并入本文。作为另一种选择，可使用本领域已知的技术将编码杀虫剂的多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用包被有聚乙基亚胺的粒子。
在其他实施例中，可通过将植物与病毒或病毒核酸接触，将编码新型嵌合杀虫多肽的多核苷酸引入植物。通常，此类方法涉及将核苷酸构建体结合到病毒DNA或RNA分子内。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931和Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；将这些专利和文献以引用方式并入本文。
转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。
如本文所用，术语植物还包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物物种的例子包括但不限于：玉米(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如，欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobroma cacao)、荼(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea am ericana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(truefirs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆以及甘蔗植物是优选的，在另外的实施例中玉米植物是优选的。
其他的所关注植物包括提供所关注种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
本发明还提供包含有效量的至少一种本发明的嵌合杀虫多肽以降低对植物的害虫损害的杀虫组合物，和保护植物免受害虫损害的方法，该方法涉及向植物或植物附近提供有效量的杀虫组合物。所谓“有效量”和“有效浓度”分别意指足以杀灭植物害虫或抑制植物害虫生长的量和浓度。确定“有效量”和“有效浓度”的方法是本领域普通技术人员已知的，并包括例如涉及以下步骤的测定法：将不同量或浓度的活性成分(例如，嵌合杀虫多肽)与害虫接触和/或置于害虫附近，并监测害虫随时间推移的存活和/或生长。
如上所述，有效量的嵌合杀虫多肽可根据制剂和将制剂施用于植物或植物环境的方法而变化。照此，可将细菌用编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列转化，并可用于如本文所述的杀虫组合物。因此，杀虫组合物可以是经转化以表达嵌合杀虫多肽的生物体。作为另一种选择，可从如上所述的细菌中纯化嵌合杀虫多肽。在一些实施例中，杀虫组合物或杀虫制剂可包含其他农业保护剂，如上所述。如本文所用，除非另外指明或从所用的上下文中显而易见，否则术语“杀虫组合物”和“杀虫制剂”是具有相同含义的等价术语。
如上所述，有效量的嵌合杀虫多肽可根据制剂和将制剂施用于植物或植物环境的方法而变化。照此，可将细菌用编码嵌合杀虫多肽的核苷酸序列转化，并可用于如本文所述的杀虫组合物。因此，杀虫组合物可以是经转化以表达嵌合杀虫多肽的生物体。作为另一种选择，可从如上所述的细菌中纯化嵌合杀虫多肽。在一些实施例中，杀虫组合物或杀虫制剂可包含其他农业保护剂，如上所述。
如上所述，杀虫组合物可例如为粉尘、乳液、固体(例如，粒子或微丸)或液体。
可通过以下方式向植物提供杀虫组合物：将杀虫组合物直接施用到植物的环境中或植物的附近，例如在植物周围的土壤或其他生长培养基中，以保护植物免受害虫攻击。例如，可在害虫(诸如昆虫害虫)已开始出现在植物上时或在昆虫害虫出现之前通过雾化、撒播、涂覆或倾倒、喷粉、撒布、土壤浸湿、喷洒或种子涂覆直接向植物施用杀虫组合物来作为保护性措施。
作为另一种选择，可将杀虫组合物引入灌溉用水，然后在灌溉期间施用于植物。优选的是，在植物生长的早期阶段获得对害虫的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时期。为了在植物生长时维持保护并获得对大株植物的最大保护，反复施用杀虫组合物可能是有益的。
施用次数和施用率取决于相应害虫侵染的强度。当杀虫组合物不仅包含嵌合杀虫多肽和/或表达嵌合杀虫多肽的细菌，还包含另一农业保护剂时，可将制剂同时或接连地(即，连续地)施用到待处理的作物区或植物。
杀虫组合物将使与害虫相关的损害降低至少约5％至约50％、至少约10％至约60％、至少约30％至约70％、至少约40％至约80％或至少约50％至约90％或更高。因此，可将所述方法用于保护植物免受害虫损害。保护可在害虫所致的植物损害略微降低至完全降低的范围内变化，以使得植物不受害虫的存在的影响。
本发明因此通过提供包含嵌合杀虫多肽的杀虫组合物来提供保护植物、植物部分和植物宿主细胞的方法。
在某些实施例中，本发明的多核苷酸可与所关注的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠，以产生具有所需性状的植物。如本文所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。例如，本发明的多核苷酸可与任何其他编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，所述多肽为例如其他苏云金芽孢杆菌毒性蛋白(在美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,737,514、No.5,723,756、No.5,593,881和Geiser et al.(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)中有所描述)、凝集素(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825(VanDamme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))、五邻体(pentin)(在美国专利No.5,981,722中有所描述)等等。所产生的组合还可包括所关注的多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可与任何其他基因或基因的组合堆叠，以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于：动物饲料所需的性状例如高油基因(如美国专利No.6,232,529)、平衡氨基酸(如，hordothionins(美国专利No.5,990,389、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,703,409)、大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))、消化性提高(例如经修饰的贮藏蛋白(提交于2001年11月7日的美国专利申请No.10/053,410)；和硫氧还蛋白(提交于2001年12月3日的美国专利申请No.10/005,429))；以上公开内容以引用方式并入本文。
本发明的多核苷酸也可与以下进行堆叠：疾病或除草剂抗性所需的性状(例如伏马毒素脱毒基因，美国专利No.5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones et al.(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin et al.(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos etal.(1994)Cell 78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如草丁膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因)；以及加工或加工产物所需的性状例如高油(如，美国专利No.6,232,529)、改性油(如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544、WO 94/11516))；改性淀粉(如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(如，美国专利No.5.602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)；以上公开内容以引用方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与提供诸如雄性不育(如，参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间的农艺性状或诸如细胞周期调节或基因靶向(如，WO 99/61619、WO 00/17364和WO99/25821)的转化技术性状的多核苷酸进行组合；以上公开内容以引用方式并入本文。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与所关注多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，这些文献的全部均以引用方式并入本文。
有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
所关注基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。所关注作物和市场在变化，并且随着发展中国家面向世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。所关注基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(诸如锌指)、涉及通信的那些基因(诸如激酶)和涉及看家的那些基因(诸如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、籽粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些。
除了使用传统的育种方法之外，还可通过遗传方式变更农艺上重要的性状如油脂含量、淀粉含量和蛋白含量。修饰包括提高油酸、饱和油和不饱和油的含量，提高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸以及修饰淀粉。Hordothionin蛋白修饰在美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中有所描述，这些文献以引用方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或富含硫的种子蛋白，以及Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)中所述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，所述专利和文献的公开内容以引用方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦抗胰凝乳蛋白酶抑制剂，美国专利申请No.08/740,682(1996年11月1日提交)和WO 98/20133，它们的公开内容以引用方式并入本文。其他蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，诸如来自葵花籽(Lilley et al.(1989)Proceedingsof the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods andAnimal Feedstuffs，ed.Applewhite(American Oil Chemists Society，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，植物蛋白在人类食品和动物饲料中的利用世界大会会议录，Applewhite编辑，伊利诺伊州香巴尼市美国油类化学家学会，第497-502页)；以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara et al.(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；两篇文献均以引用方式并入本文)；和水稻(Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页)，以引用方式并入本文)。其他农艺上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可以编码针对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫例如是根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。此类基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,736,514、No.5,723,756、No.5,593,881，和Geiser et al.(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))等。
编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，如对伏马毒素(fumonosin)的解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒力(avr)和抗病性(R)基因(Jones etal.(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin et al.(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；以及Mindrinos et al.(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；等。
除草剂抗性性状可包括编码对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(如，含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，例如草胺膦或basta(如，bar基因)。草甘膦(例如EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国公开号20040082770和WO 03/092360)；或者本领域知道的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。以此类方式使用的基因的例子包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)，在美国专利No.5,583,210中有所描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，经修饰的hordothionin蛋白在美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中有所描述。
还可在基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白的表达。经转化的植物的另一个重要商业应用是生产聚合物和生物塑料，如美国专利No.5,602,321中所述。诸如β-酮基硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))的基因有利于聚羟基烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和植物产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些酶和产物。此类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的此类蛋白来实现。
在本说明书和权利要求书全文中，措辞“包含”、“含有”和“包括”以非排他的意义使用，除非其中语境中有别的要求。
如本文所用，术语“约”当指值时，意在涵盖偏离指定的量达，在一些实施例中，±50％的偏差，在一些实施例中，±20％的偏差，在一些实施例中，±10％的偏差，在一些实施例中，±5％的偏差，在一些实施例中，±1％的偏差，在一些实施例中，±0.5％的偏差，在一些实施例中，±0.1％的偏差，只要此类偏差适于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
另外，在量、浓度或其他值或参数以范围(优选范围)或上限优选值和下限优选值列表给出时，这应该理解为具体地公开了由任何范围上限或上限优选值和任何范围下限或下限优选值的任何配对形成的所有范围，而无论是否单独公开了这些范围。如果本文中叙述了数值的范围，除非另外指明，否则该范围旨在包括它们的端点，以及该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，无意于使本公开的主题的范围受限于所叙述的具体值。
以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实例1
增强Cry蛋白在融合到MBP时对西方玉米根虫和黑地蚕的杀昆虫活性
将称为IP3-1的经计算机设计并人工合成的Cry3Aa型蛋白(SEQ ID NO：8)、从Bt菌株克隆的截短RX002蛋白(SEQ ID NO：12)、称为2A-12的改组Cry8Bb型蛋白(SEQ ID NO：10)和称为4c6的截短天然CrylBd蛋白(SEQ IDNO：14)在大肠杆菌BL21中表达为包含有效连接的MBP的融合蛋白。MBP-IP3-1、MBP-RX002、MBP-2A-12和MBP-4c6融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：21、23、25和27所示。编码MBP-IP3-1、MBP-RX002、MBP-2A-12和MBP-4c6融合蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：20、22、24和26所示。
为了表达具有这些Bt Cry蛋白的MBP，将相应的基因在NEB pMAL载体中克隆，并使用直链淀粉树脂按照制造商推荐的方法对蛋白进行纯化(美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)；目录号E8021L)。将从淀粉酶树脂中洗脱的靶蛋白在Amicon Centricon浓缩仪(10kDa截止值)中浓缩。将最终融合蛋白以大约2mg/mL的浓度溶解于25mM HEPES-NaOH缓冲液(pH8)。使用牛血清白蛋白作为参照，通过SDS-PAGE测定蛋白浓度。pMAL载体具有对于从Cry蛋白裂解MBP和连接基的因子Xa具有特异性的蛋白酶位点。本申请中所包括的所有Cry蛋白都抗因子Xa。在20℃下以1∶25的蛋白酶与底物比率在HEPES缓冲液中进行16小时的蛋白酶消化。通过SDS-PAGE确认，消化导致了MBP的完全移除。
将融合MBP的Cry蛋白和不含MBP的Cry蛋白在25mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 8)中稀释，并将10μL稀释样品与通过低温熔化琼脂糖制备的40μL熔化的人工昆虫食物混合。然后，将该食物混合物置于96孔微孔板的每个孔中，并让新生昆虫幼虫取食。在27℃下4天后，使用基于大小和死亡的0-3数值评分系统对昆虫对Cry蛋白的响应进行评分。如果未观察到响应或观察到正常生长，则给予0分。当生长受到稍微阻滞但无任何死亡时，分值为1。分值2意味着部分死亡(每个孔中使用多只昆虫)和强烈的生长抑制。分值3表示完全死亡。将每种处理重复6次，以得到可能最高的分值18(3×6)。在该评分系统中，一种处理重复6次得到分值9意味着50％的处理响应(9/18)，并称为ILC50(50％响应对应的生长抑制和致死浓度)。这些测定的结果在表3和表4中示出。
采用四种不同的Cry蛋白的表3和表4中所示的结果证实了：MBP-Cry融合蛋白与其相应的游离Cry蛋白的杀昆虫活性相比时显著增强了对鞘翅目(西方玉米根虫)和鳞翅目(黑地蚕)昆虫物种的杀昆虫活性。这些结果还证实了本发明的方法增强Cry蛋白的杀昆虫活性的普适性。表3显示了MBP-Cry融合蛋白和游离Cry蛋白对西方玉米根虫的杀昆虫活性的ILC50(基于Cry蛋白部分的大小或重量)值。
表3
*在2480ppm下仅观察到11％的响应。
表4显示了MBP-4c6Cry融合蛋白和游离4c6Cry蛋白对黑地蚕的杀昆虫活性的ILC50值。
表4
MBP-4c6融合体 游离4c6
75ppm 148ppm
实例2
对WCRW具有增强活性的MBP-Cry融合蛋白
构建新载体pMAL-SA(SEQ ID NO：19)以制备MBP-Cry融合蛋白。该载体基于NEB pMAL载体。其具有在MBP的末端由SphI和BamHI识别序列描绘的cry基因克隆位点和在MBP与Cry克隆位点之间的称为“SA”连接基的专门设计的连接基。
为了克隆Bt cry基因，将cry编码区通过PCR用合适的正向引物和反向引物扩增。在正向引物中，存在位于ATG翻译起始位点上的SphI位点。在反向引物中，存在处于cry基因编码区的末端的终止密码子和BamHI位点。
合成经计算机设计的cry3Aa序列IP3-1，并用作PCR模板。IP3-1核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。将该IP3-1基因如上所述在pMAL-SA中克隆以制备包含MBP、SA连接基和IP3-1编码区的质粒(SEQ ID NO：1)。将IP3-1的第二氨基酸残基从His突变回Asn，以制备SEQ ID NO：2所示的MBP-SA-IP3-1核苷酸序列。
将MBP-SA-IP3-1融合蛋白在大肠杆菌BL21中表达，并通过直链淀粉树脂亲和层析根据实例1所述的方法进行纯化。将柱洗脱液在AmiconCentricon中浓缩，并将其缓冲液换成25mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 8)。将融合蛋白用胰蛋白酶以1∶25的胰蛋白酶-底物比率在37℃下消化1小时。胰蛋白酶裂解连接基末端的蛋白，以从MBP和SA连接基释放Cry蛋白。IP3-1在该消化条件下耐受胰蛋白酶。通过SDS-PAGE确认消化。针对WCRW测定融合蛋白和不含MBP的IP3-1蛋白。表5显示了MBP-SA-IP3-1和不含MBP的IP3-1对西方玉米根虫的杀昆虫活性的ILC50值。表5中的测定结果证明，当将IP3-1有效连接到MBP-SA时(即，MBP-SA-IP3-1)，与不含MBP的IP3-1对WCRW的杀昆虫活性相比，其WCRW活性显著增强。
表5
蛋白 ICL50
MBP-SA-IP3-1 6ppm
不含MBP的IP3-1 269ppm
实例3
融合到NusA和Trx时Cry3Aa蛋白活性的增强
将称为IP3-1的经计算机设计并人工合成的cry3Aa型基因按照制造商的说明(美国威斯康辛州麦迪逊的EMD生物科学公司(EMD Biosciences，Madison，WI，USA))在pET-43.1EK/LIC中克隆以进行NusA融合，并在pET-32中克隆以进行TrxA融合。将这些载体用于表达NusA-IP3-1和TrxA-IP3-1融合蛋白。NusA-IP3-1和TrxA-IP3-1融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16和18所示。编码NusA-IP3-1和TrxA-IP3-1融合蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：15和17所示。IP3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。编码IP3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
通过亲和层析用Ni-NTA琼脂糖(美国加利福利亚州巴伦西亚的凯杰公司(Qiagen Inc.，Valencia，CA，USA))根据制造商的说明对融合蛋白进行纯化。然后用肠激酶从标签(包括NusA、TrxA、6XHis等)消化Cry3Aa蛋白，并将游离的Cry3A蛋白的杀昆虫活性与其NusA和TrxA融合蛋白进行比较。使用WCRW如上所述进行昆虫测定。表6显示了MBP-SA-IP3-1和不含MBP的IP3-1蛋白对西方玉米根虫的杀昆虫活性的ILC50值。通过肠激酶消化从NusA-Cry3Aa融合体制备IP3-1蛋白样品。如表6中的结果所证明，与游离IP3-1的杀昆虫活性相比时，包含溶解性增强多肽和Cry3A蛋白(IP3-1)的NusA-IP3-1融合蛋白和TrxA-IP3-1融合蛋白均具有对WCRW的增强的杀昆虫活性，如通过明显更低的ICL50值所证实。
表6：
蛋白 ICL50
NusA-IP3-1融合体 26ppm
TrxA-IP3-1融合体 31ppm
无标记的IP3-1 554ppm
实例4
MBP-SA-RX002转化构建体的生成
将麦芽糖结合蛋白(MBP-SA)(SEQ ID NO：4)在为本发明所设计的合成基因(编码SEQ ID NO：33的SEQ ID NO：32)中融合到RX002(SEQ IDNO：11)的N端。将该基因作为BamHI-StuI片段克隆到Gateway入门载体中，该载体包含具有BSV(AY)TR启动子-ADH1内含子1序列和马铃薯PIN II终止子序列的植物表达盒。所得的植物表达盒含有以此顺序有效连接在一起的下列元件：BSV(AY)TR启动子-ADH1-内含子1、MBP-SA-RX002基因和PIN II终止子。表达盒两侧为Gateway attL3和attL4重组位点，并且该入门载体用于将表达盒转移至含有attR3和attR4的双元目的转化载体中。最终的转化载体含有MBP-SA-RX002表达盒，该表达盒处于含有控制PAT选择性标志基因的表达的玉蜀黍泛素1启动子-5’UTR-泛素内含子1以及35S终止子序列的盒的上游。
实例5
农杆菌介导的玉蜀黍转化和转基因植物的再生
为用本发明的启动子序列进行农杆菌介导的玉蜀黍转化，采用了Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和PCT专利公布WO98/32326；所述专利的内容以引用方式并入本文)。简单而言，从玉蜀黍隔离出未成熟的胚，并使胚在农杆菌能够将本发明的启动子序列转移到至少一个所述未成熟胚的至少一个细胞的条件下接触农杆菌悬浮液(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中以启动接种。使胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在该共培养期之后，进行了任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。为了消除农杆菌以及为了感染细胞的静息期，将未成熟胚在含有抗生素但不含选择剂的固体培养基上培养。接着，在含有选择剂的培养基上培养接种的胚，并且回收生长的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚，从而导致转化细胞的选择性生长。然后使愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并且固体培养基上进行培养在选择性培养基上培育的愈伤组织以便再生植株。
实例6
在转基因玉蜀黍组织中表达MBP-RX002融合体
通过Western分析对衍生自测试载体的转基因事件评估MBP-RX002的表达。将表达MBP-RX002的转基因玉蜀黍的叶和根材料进行冻干，然后通过5/32英寸BB(即，鸟弹)用Geno/Grinder 2000匀化器以每分钟击打1700次的速率粉化30秒。将80μL研磨缓冲液(1X PBS+0.1％Tween-20+1％2-巯基乙醇，含有Roche cOmplete蛋白酶抑制剂(美国印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏应用科学公司(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)；目录号04693124001；每7mL一片)加入每个样品中。再反复粉碎30秒，然后将样品在室温下于VWR 75D超声波仪中超声处理5分钟。在21,000g/4℃下离心15分钟后，收集上清液。使用Thermo ScientificCoomassie Plus试剂盒(23236)和SpectraMAX 190分光光度计测定上清液中的蛋白浓度。使用研磨缓冲液作为稀释剂，针对21μL中的总蛋白对样品进行归一化。将7微升含有1％2-巯基乙醇的4X LDS染料加入每个样品中，然后在80℃下加热10分钟。在NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris midi凝胶(Invitrogen WB1402BOX)上，每条泳道上样25微升样品，然后在200V下电泳1小时。使用含有转移堆积层的Invitrogen iBlot(IB301001)将蛋白转移到硝化纤维素膜。将膜在1X PBS+0.1％Tween-20+5％奶粉(w/v，封闭缓冲液)中封闭30分钟，然后在4℃下用抗RX002的兔多克隆抗体(在封闭缓冲液中以1∶4000稀释)温育过夜。将膜在PBST(1X PBS+0.1％Tween-20)中洗涤4×5分钟，然后用在封闭缓冲液中以1∶5000稀释的山羊抗兔HRP偶联二抗(Pierce 31460；10μg/mL工作储液)温育2小时。将膜在PBST中洗涤4×5分钟，然后用Thermo Super Signal West Dura持久性化学发光底物(Thermo Super Signal West Dura Extended Duration Substrate，34076)显影。使用Fujifilm LAS-4000成像系统实现杂交信号的可视化。
该分析的结果在表7中示出。在对于根或叶和根组织中的Western分析所采样的10个事件中，有8个检出了MBP-RX002的积聚。在叶和根或根组织中均观察到对应于MBP-RX002融合体的预期大小的118kD蛋白条带，从而证明该融合体可在植物中表达。除了全长蛋白外，在一些事件中还观察到对应于RX002的预期大小的75kD免疫反应蛋白条带，从而表明一定比例的全长融合蛋白在植物中被加工而释放出RX002。
表7
事件编号 叶中的表达 根中的表达
对照 - -
123434603 - -
123434607 +++ ++++
123434610 - -
123434613 ++++ ++++
123434614 - +
123434615 - ++
123434616 ++++ ++++
123434617 ++++ ++++
123434618 ++++ ++++
123434619 - +++
本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。以举例的方式，“一个要素”是指一个或多个要素。
本说明书中提及的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修饰。

Claims (18)

1.一种增强Cry内毒素的杀虫活性的方法，所述方法包括将溶解性增强多肽的第一氨基酸序列有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列，从而制备嵌合杀虫多肽，所述嵌合杀虫多肽包含有效连接到所述第二氨基酸序列的所述第一氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶解性增强多肽选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白和转录延伸因子NusA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶解性增强多肽包含选自SEQ ID NO：4、6、34、35和36所示氨基酸序列的氨基酸序列。
4.根据权利要求1、权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述Cry内毒素包含选自SEQ ID NO：8、10、12和14的氨基酸序列。
5.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述嵌合杀虫多肽包含选自SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27和33所示氨基酸序列的氨基酸序列。
6.一种嵌合杀虫多肽，包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列，其中所述有效连接的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示的氨基酸序列；以及
(b)由SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7.一种核酸分子，编码根据权利要求6所述的嵌合杀虫多肽。
8.一种表达盒，包含有效连接到根据权利要求7所述的核酸分子的驱动宿主细胞中的表达的启动子。
9.一种载体，包含根据权利要求8所述的表达盒。
10.一种转化植物、植物部分、植物细胞或种子，在所述转化植物、植物部分、植物细胞或种子的基因组中包含根据权利要求8所述的表达盒。
11.一种杀虫组合物，包含有效量的根据权利要求6所述的嵌合杀虫多肽或其具有杀虫活性的活性变体或片段。
12.一种保护植物免受昆虫害虫损害的方法，所述方法包括提供有效量的根据权利要求10所述的杀虫组合物以降低对所述植物的昆虫害虫相关损害。
13.一种植物，包含稳定结合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含有效连接到驱动所述植物中的表达的启动子的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码嵌合杀虫多肽，所述嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列，其中所述溶解性增强多肽选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白和转录延伸因子NusA。
14.根据权利要求13所述的植物，其中所述核苷酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示的核苷酸序列；以及
(b)编码SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示氨基酸序列的核苷酸序列。
15.一种保护植物、植物部分或植物宿主细胞免受昆虫害虫损害的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向所述植物、植物部分或植物宿主细胞中引入根据权利要求7所述的表达盒；以及
(b)使所述植物、植物部分或植物宿主细胞再生成形态正常的可育植物，其中所述植物或其部分包含嵌合杀虫多肽。
16.一种增强植物对至少一种害虫的抗性的方法，所述方法包括向植物或至少一个植物细胞中引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含有效连接到驱动所述植物中的表达的启动子的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码嵌合杀虫多肽，所述嵌合杀虫多肽包含有效连接到Cry内毒素的第二氨基酸序列的溶解性增强多肽的第一氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述溶解性增强多肽选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白和转录延伸因子NusA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、15、17、20、22、24、26或32所示的核苷酸序列；以及
(b)编码包含SEQ ID NO：2、16、18、21、23、25、27或33所示氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列。
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