JPH06511152A - 病原体耐性トランスジェニック植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病原体耐性トランスジェニック植物 本発明はナショナルサイエンスファンデーションからのグラン）・番号ＤＭＢ　 ８８−１１０７７の下に政府の援助により完成された。政府は本発明について所 定の権利を有する。

発明の分野 本発明は概して植物病原体を防除する方法に関し、さらに特に植物寄生性線虫を 防除する方法に関する。

従来技術 世界中で、植物寄生性線虫は生命維持作物の最も破壊的な病原体の一種である。

１９８４年に、線虫は１億ドルを超える経済的損失の原因となった。米国のこの 額はほぼ６百万トルである。

かかる金銭的な額は驚異的であるか、この作物の絶滅の多くは農業生産かしばし ば生死にかかわる問題となる熱帯および亜熱帯地域で発生する。

特定の線虫種に対する遺伝的耐性は若干の栽培変種として入手可能であるが、こ れらは数て制限され所望の農業経済上の特徴および耐性を有する栽培変種の利用 能には限界かある。さらに、植物栽培のための従来の方法は生存能力のある栽培 変種を生産するのに５〜１０年を必要とし、新規な線虫防除手段か直接的かつ絶 対的に必要である。

線虫防除の主要な手段は化学的抗線虫薬の利用てあった。１９８２年の間に、米 国単独で１億ポンドを超える抗線虫薬か作物に適用された。化学的抗線虫薬は一 般的に環境に実質的影響を与える既知の高毒性化合物である。過去数年において 、地下水汚染のような問題、晴れ類および鳥類の毒性、ならびに食品中の残留に より化学的抗線虫薬の使用において一層厳重な制限が生じた。残念ながら、多く の場合栽培者が作物を根瘤および包のう線虫から保護するために用いる抗線虫薬 は選択して入手することかできない。

最近、特定の害虫に耐性を有する作物植物を遺伝的に操作することか可能になっ てきた。おそらくこの方法の最初の例はタバコに導入したウィルスコートタンパ ク質遺伝子のものである。タバコモザイクウィルスコートタンパク質遺伝子を有 し発現するように遺伝的に操作したタバコ植物は無傷のウィルスによる組織的感 染に抵抗性を示す。他の戦略は病原体を直接死滅させ防除する遺伝子配列を用い ることである。この方法は、昆虫か摂取した際に、消化管麻痺を生しる、細菌バ チルス　スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） がらの昆虫毒素遺伝子を発現するトランスジェニック植物を作出することである 。この戦略により特定の害虫に耐性を有する作物栽培変種が得られるか、これら の方法には種々の欠点がある。第一に、任意の［毒素Ｊ遺伝子の本質的発現か害 虫集団に対する耐性の極めて強力な選択的圧力を起こす。この方法の他の欠点は 宿主植物が害虫の圧力かない場合にこうむる負のエネルギーバランスである。

最後に、毒素遺伝子の本質的で全体的な発現が、ヒトを含めた、非標的種をこの タンパク質生成物に曝すことになる。

本発明は植物病原体に対抗する新規な方法を開発する本発明者らの研究に基づい たものである。

発明の開示 植物に病原体の耐性を与える本発明の方法は病原体それ自体でなく植物細胞に毒 素化合物を振り向ける上述の戦略とは著しく異なる。従って、病原体が植物に感 染する場合感染した細胞は死滅する傾向があり、これにより植物に感染する病原 体の能力を阻害しかつ病原体の正常な生活環を破壊する。

上述の点において、本発明の第１の観点は形質転換した植物細胞から成る組換え 病原体耐性植物である。形質転換した植物細胞は、構成が５′から３′方向に、 プロモータ、プロモータの下流に位置し機能的に結合した構造遺伝子、および構 造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配列を含む発現カセットから成る 異種ＤＮＡ構成物を含む。プロモータは植物を攻撃する植物病原体により活性化 され、さらに構造遺伝子は植物細胞に有毒な生成物を暗号化する。

本発明の第２の観点は農場（すなわち、病原体か作物の植物間で共有される温室 を含めた任意の普通の環境）で相互に栽培される上記多数の植物から成る作物で ある。

本発明の第３の観点は農場における植物病原体に対抗する方法である。この方法 は上記の組換え病原ｔｈｗｊ性植物の作物を農場に移植することを含む。

本発明の第４の観点は組換え病原体耐性植物を作出する方法である。この方法は 再生することかできる植物細胞を提供し１、次いて発現力セントを含むＤＮＡ構 成物で植物細胞を形質転換することから成り、この構成物は５′から３′方向に 、植物病原体により活性化されるプロモータ、前記プロモータの下流に位置し機 能的に結合した構造遺伝子、および構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した 終結配列を含む。組換え病原体耐性植物は形質転換した植物細胞から再生する。

本発明の第５の観点は発現カセットを含むＤＮＡ構成物であり、この構成物は５ ′から３′方向に、植物病原体により活性化されるプロモータ、前記プロモータ の下流に位置し機能的に結合した構造遺伝子、および構造遺伝子の下流に位置し 機能的に結合した終結配列を含む。この構造遺伝子は植物細胞に有毒な生成物を 暗号化する。

本発明の上述のおよび他の目的ならびに観点を図面および以下の説明を基に詳細 に説明する。

図面の簡単な説明 図１は根特有のｃＤＮＡクローンＴｏｂＲＢ７とハイブリダイゼーションするゲ ノムクローンの制限地図を示す。ゲノムクローンはＢａｍＨ［（Ｂ）、Ｈｉｎｄ ［ＩＩ（Ｈ）、Ｐｓｔ［（Ｐ）　、ＥｃｏＲ［（Ｒ）およびＳａｌ　Ｉ（Ｓ）に ついて制限地図を作成された。根特有のｃＤＮＡクローンＲＢ７にハイブリダイ ゼーションする領域を線の下に示す：さらに図２にはゲノムＲＢ７ブロモータ配 列の欠失分析を概略で示す。種々の長さのＲＢ７フランキング領域を調製しβ− グルクロニダーゼ（ＧＬＩＳ）遺伝子に結合し、この構成物を用いてトランスジ ェニック植物を調製し、さらにＧＵＳ活性をトランスジェニック植物の根および 葉においてアッセイした。結果を図の右側に要約する。

発明の詳細な説明 本発明の方法により対抗できる植物病原体には細菌、ウィルス、真菌、および線 虫か含まれる。病原体は植物の葉および根を含む、任意の組織を攻撃するもので あるが、本発明は根に攻Ｗｌ（または感染）する病原体に対抗するのに特に有効 と考えられる。本発明は単子葉植物および双子葉植物の種々の植物のいずれを用 いても実施することかてきるか、双子葉植物か好ましい。

本発明は線虫、特に根瘤線虫〔メロイドジン種（ＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅＳｉｌ ｌ）、））および包のう線虫〔グロポデラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ　ｓｐｐ、） およびヘテロデラｆ’Ｊ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ　ｓｐｐ、）　）に関して例示 することかできるか、これらは同様の生活環を有する。根瘤線虫は宿主植物に対 して極めて親密で複雑な関係を有する定住性内部寄生者である。感染の第２段階 の幼若体（Ｊ２）は土壌には含まれない。宿主の根の位置において、Ｊ２は根の 細胞内でちょうと根冠よりも後の領域に貫入し発達中の中心柱に移動する。次い て線虫はそれ自体柱に平行に向きその頭部の周りの植物細胞に腺分泌物を注入し 、線虫飼養細胞を始動させる。これらの５〜７個の細胞は急に核分裂を起こし、 寸法を著しく増し、さらに孔で満たされ細胞壁陥入を起こす。飼養部位細胞、ま たは「巨細胞」は、発育中の線虫に食物を提供するためのスーパートランスファ ー細胞として機能する。この時間中に、線虫は運動能力か消失し正常なウナギ型 をしたＪ２から大きな、ナシ型をした成体の雌に膨張する。巨細抱土て線虫か養 われる場合、単為発生の（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃ）生殖により３００〜４ ００個の卵か産みつけ（ｄｉｓｐ。

５ｉｔｉｏｎ）られる。この全体の過程は２０〜３０日の期間にわたり起こり、 さらに根瘤線虫は収集期間に７世代はとも完了する場合かある。包のう線虫の生 活環は、その摂食部位か「シシシチウム」と称される以外は本質的に同一で、有 性生殖か行われる。

病原体を養うことになる細胞を植物自体か死滅させまたは無力にすることにより 、この病原体は植物に著しく不十分にしか感染しない、二と（こなる。

２つの遺伝子型の病原体誘導プロモータ（または「病原体応答要素」）を本発明 で用いることかできる：（ａ）植物組織では通常発現されないか、病原体感染に 応答して発現される遺伝子；および（ｂ）病原体感染に応答して発現か増加する 植物組織で通常発現される遺伝子。種々のスクリーニング戦略により遺伝子、お よびそれらに対応する各型の病原体応答要素を単離することができる。例えば、 エム、コンクリング（Ｍ、　Ｃｏｎｋｌ　ｉｎｇ）等の、ｒＰｌａｎｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、９３．１２０３〜１２１１　（１９９０年）」、ニス、グアー（Ｓ、 　Ｇｕｒｒ）等の、ｒｌｉｌｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２２６．３６１〜３ ６６　（１９９１年）Ｊを参照。スクリーニングは、米国特許第４．６８３．１ ８５号および第４．６８３．２０２号明細書に記載しているように、ポリメラー ゼ鎖成長反応法を用いて実施することができ、これらの開示は参考のため、すな わちあまり厳密でないハイブリダイゼーション法（ｌｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃ ｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）　（例えば、５×ＳＳ Ｃて、２５％のホルムアミドおよび０．１％のＳＤ３４２℃の洗浄の厳密さのよ うな、プローブか６０９６の相同性を有する配列にハイブリダイゼーシヨンする ことができるハイブリダイゼーション法）としてここに記載する。一般に、病原 体に感染した植物組織のｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーは（ａ）病原体に 感染した植物組織（例えば、植物の根組織）および（ｂ）この病原体に感染して いない対応する植物組織のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡにより作製したプローブを 用いて特異的にスクリーニングして病原体に感染した植物で著しい発現を示す遺 伝子のクローンを確認する。これらの遺伝子の病原体応答要素を次に欠失分析に より確認する。

これらの要素を交互に用いて相同な病原体応答要素について低い厳密さて他の植 物および他の植物組織のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。

ｍＲＮＡのレヘルか約０．０５０６のポリ　（Ａ　”　）ＲＮＡのように低いｃ ＤＮＡクローンを単離させるハイブリダイゼーション法を利用することかできる 。エム　コンクリング等の前記文献を参照。簡単には、ｃＤＮＡライブラリーを 植物組織（すなわち、根および葉）からのｍＲＮＡて逆転写された単鎖ｃＤＮＡ プローブを用いてスクリーニングする。特異的スクリーニングのために、ニトロ セルロースまたはナイロン膜を５ＸＳＳＣに浸し、９６ウエルの吸引マニホルド に配置し、　１５０μＬの静置した一昼夜培養物をマスタープレートから各ウェ ルに移し、さらにすへての液体がフィルタを通過するまで減圧した。１５０μＬ の変性させる溶液（０，５Ｍ　ＮａＯＨ１１，５Ｍ　ＮａＣ１）をマルチプルピ ペッタ−を用いて各ウェルに配置し約３分間静置する。上述のように吸引しフィ ルタを除去して０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、１．５　Ｍ　 ＮａＣ１中で中和する。次にこれを減圧下で２時間乾燥させ関連するプローブと インキュベーションする。ナイロン膜フィルタを用いマスタープレートを一７０ °Ｃで７９６のＤＭＳＯ中に保存し続けることにより、フィルタを数年間保存し た後多数のプローブおよび適当なりローンを用いて多数回スクリーニングするこ とかできる。

例えば、線虫の感染により発現が誘導されあるいは高められる遺伝子を単離する ために、線虫か感染したタバコの根から単離したｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリ ーを作製した。ｍＲＮＡを巨細胞の始動と同時に単離するために根の準備をする 。次にライブラリーを上述の線虫に感染した根および対照の根から単離したｍＲ ＮＡの単鎖ｃＤＮＡプローブを用いた方法によりスクリーニングする。次に特異 な発現を示すこれらのｃＤＮＡクローンをタバコゲノムササンプロット（タバコ の転写物て線虫の転写物でない対応するｃＤＮＡを確認するため）ならびに感染 した組織および対照組織からの根のＲＮＡのノサンプロットにおいて（特異な発 現を確認するため）プローブとして用いる。次いて特異な発現を示すこれらのク ローンをプローブとして用い存在するタバコゲノムライブラリーをスクリーニン グする。本質的に同様の方法をタバコ以外の植物および根瘤線虫以外の線虫（ま たは他の病原体）を用いて行う。この方法は包のう線主により誘導されるプロモ ータを確認するのに有用であり、この場合根をｍＲＮＡかシンシチウムの始動と 同時に単離されるように準備する。例えば、ジャガイモ包のう線虫（Ｇｌｏｂｏ ｄｅｒａ　ｓｐｐ、）が誘導可能なプロモータを上述の方法によりジャガイモ植 物〔ソラナム　チューベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）　）か ら単離する。例えば、ニス、グア等の、前記文献を参照。

本発明を実施するのに特に好ましいプロモータはＴｏｂＲＢ７ブロモータの線虫 応答要素であり、さらに本発明で有用なものは他のタバコ遺伝子から、または以 下に示すようなタバコ以外の植物から単離したプロモータおよび病原体応答要素 であり、これらはＴｏｂＢ７ブロモータ線虫応答要素と相同であり線虫感染に応 答して植物細胞で下流の構造遺伝子の直接的転写を可能にする。ＲＢ７ブロモー タ配列およびその線虫応答要素は上述のように、プローブとしてＴｏｂＲＢ７構 造遺伝子セグメントを用いることにより他の植物種から得られ低い厳密さの条件 下のＤＮＡハイブリダイゼーションにより他の植物中で相同な構造遺伝子をスク リーニングすることかできる。あるいはまた、種間で保存されるＴｏｂＲＢ７構 造遺伝子の領域はＰＣＲプライマーとして用いられタバコ以外の種からの一層長 いセグメントを増幅し、さらにこの一層長いセグメントはハイブリダイゼーショ ンプローブとして用いられる（後者の方法は一層高い厳密さのスクリーニングを 可能にする）。上述の方法に従って用いられ追加のＲＢ７配列を生じさせること かできる植物種の例にはノイズ、ジャガイモ、ワタ、テンサイ、ヒマワリ、ニン ジン、セロリ、アマ、キャベツおよび他のアブラナ科の植物、コシヨウ、トマト 、カンキツ属の木、マメ、イチゴ、レタス、ノイズ、アルファルファ、カラスム ギ、コムギ、イネ、オオムギ、モロコシ属およびカノラが含まれる。他の植物か らのＲ８７線虫応答要素は一般に植物細胞中の下流の構造遺伝子の線虫応答発現 を指示することがてきるタバコＲＢ７ブロモータの５０個の塩基セグメントに、 少なくとも約７５％相同なもの、さらに特に少なくとも約８５％相同なもの、お よび最も特に少なくとも約９０％相同なものである。ｒ５０個の塩基セグメント 」かＴｏｂＲＢ７ブロモータ、またはその線虫応答要素の連続した部分を意味す ることにより、この要素は５ｏヌクレオチドの長さである。

病原体がジェミニウィルスである、他の実例となるプロモータはジエミニウイル スのＡＬ２プロモータであり、これはジエミニウイルスのＡＬ３タンパク質によ り活性化される。従って、ジェミニウイルスＡＬ２プロモータはＡｌ１に応答す るジエミニウィルス応答要素として機能する。

本発明の利点は２以上のプロモータを単一の構造遺伝子に「つなぎ合わせる」こ とがてきることである。各プロモータは異なる病原体に応答し、次いて植物は多 数のプロモータに対する抵抗性を提供される。例えば、第２のプロモータは構造 遺伝子が多数のプロモータに結合して、異なる植物病原体により活性化される各 プロモータに関連するように構造遺伝子の上流に位置し機能的に結合される場合 かある。所望の場合さらに多くのプロモータが含まれる。

ここで用いるｒ機能的に結合した」とは、ある機能か他の機能により影響を受け るように結合される単一のＤＮＡ分子上のＤＮＡ配列を意味する。従って、構造 遺伝子の発現に影響を与えることかできる場合にプロモータを構造遺伝子に機能 的に結合する（すなわち、構造遺伝子はプロモータの転写制画下にある）。プロ モータは構造遺伝子から「上流」にあり、反対に構造遺伝子はプロモータから「 下流Ｊにある。

本発明のＤＮＡ構成物、または「発現力セント」には、転写の方向か５′〜３′ で、上述したようなプロモータ、プロモータと機能的に結合した構造遺伝子、さ らに、機能的に、ＲＮＡポリメラーゼのための停止信号およびポリアデニル化ゼ のためのポリアデニル化信号〔例えば、ノス（ｎｏｓ）ターミネータ〕を含む終 結配列か含まれる。これら調節領域のすへては形質転換されるへき組織の細胞中 で操作することかできる必要がある。３′終結領域は転写開始領域と同一の遺伝 子から誘導される場合かありあるいは異なる遺伝子から誘導される場合がある。

構造遺伝子はおそらくリボゾーム結合部位および／または翻訳開始コドンを含む か、プロモータを欠いた、タンパク質、ポリペプチド、またはその一部をコード するＤＮＡセグメントを含む遺伝子のこれらの部分である。またこの用語は細胞 内で自然に見出せるか人工的に導入される構造遺伝子の複写物を意味する。この 構造遺伝子は異種構造遺伝子と称される場合に、遺伝子か導入されあるいは、操 作可能に結合するプロモータと組み合わされる植物細胞内で通常見出せないタン パク質を暗号化することができる。植物種における発現のために本発明のプロモ ータを操作可能に結合することかできる遺伝子を染色体遺伝子、ｃＤＮＡ、合成 遺伝子、またはそれらの組み合わせから誘導することができる。

本発明を実施するのに用いた構造遺伝子は植物細胞に有毒な生成物を暗号化する 。植物細胞に有毒な広範な種類のタンパク質またはペプチド生成物は、ヌクレア ー七、制限エンドヌクレアーゼ球菌ヌクレアーゼ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅ ｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｍ１ｃｒｏｃ。

ｃｃａｌ　ｎｕｃｌｅａｓ）　、リボヌクレアーゼＡ（Ｒｎａｓｅ　Ａ）　、お よびバーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）のような核酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）を分解す ることができる酵素、トリプシン、プロナーゼＡ、カルボキシペプチダーゼ、エ ンドブロティナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドブロティナーゼＧｌｕ−Ｃ１およびエン ドブロティナーゼＬｙｓ−Ｃのようなタンパク質を攻撃する酵素、リボヌクレア ーゼＣＬ−３およびリボヌクレアーゼＴ１のようなりポリメラーゼ、ファセオロ トキシン、タブトキシン、およびンリンゴトキンンのような植物病原体細菌から の毒素、ブタ膵臓およびカンジダ　シクリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｃ ｌｉｎｄｒａｃｅａ）から作製したリパーゼ、ｇｔｐＦおよびコネクシン（ｃｏ ｎｎｅｘｉ口）（ギャップジャンクションタンパク質）のような膜チャネルタン パク質、ｍ胞においてタンパク質と結合しそれにより細胞を死滅させあるいは衰 弱させる抗体を含めて用いることかできる（これらに制限されない）。植物細胞 タンパク質に対する抗体を生産する遺伝子はダブり二一、ヒュース（Ｗ、Ｈｕｓ ｅ）等の、ｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　２４６．１２７５〜１２８１　（１９８９年 ）に記載されているように作製することができる。かがる抗体に結合することか できるタンパク質には、ＲＮＡポリメラーゼ、呼吸酵素、チトクロームオキシダ ーセ、クレブス回路酵素、タンパク質キナーゼ、アミノシクロプロパン−１−カ ルボン酸シンターゼ、およびエノールピルピルソキミ酸−５−リン酸シンターセ が含よれるか、これらに限定されない。

成熟バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉ ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）リボヌクレアーゼ（またはハルナーゼ）を暗号化する構 造遺伝子が特に好ましい。例えば、シー、マリアニ（Ｃ，Ｍａｒｉａｎｉ）等の 、ｒＮａｔｕｒｅＪ　３４７．７３７〜７４１（１９９０年）：ノー。

バトン（Ｃ，Ｐａｄｄｏｎ）およびアール、ハートレイ（Ｒ，Ｈａｒｔｌｅｙ） の［ＧｅｎｅＪ　４０．２３１〜３９（１９８５年）を参照。毒性生成物は発現 する植物細胞を死滅させあるいは細胞を簡単に無力にして病原体を維持すること かほとんどできない。特に植物か食用植物である場合、植物−毒性生成物か動物 に対して有毒でなく、さらに特にヒトに対して有毒てないことか好ましい。

構造遺伝子の発現生成物が細胞質以外の細胞内区画に位置する必要があり、構造 遺伝子は、細胞の原形質膜のような、特定の部位に生成物を移動させる特定のア ミノ酸配列をコードする領域を含むように構成され、あるいはべりブラズム間隙 または細胞の外部環境に分泌される場合がある。種々の分泌線リーダー、膜組み 込み配列、および特定の部位に対するペプチド発現生成物を指示するための移動 配列か文献に記載されている。例えば、キャシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）等の 、ｒＢｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ　３．８０３〜８０８（１９８５年）、ラ イフナ−（Ｗｉ　ｃｋｎｅｒ）およびロディッシュ（Ｌｏｄｉｓｈ）のｒＳｃｉ ｅｎｃｅ　Ｊ　２３０、４００〜４０７（１９８５年）を参照。

また発現カセットは少なくとも一つの複製系を有するＤＮＡ構成物に設けられる 場合かある。便宜上、大腸菌において機能する、Ｃｏ１ＥＩ　、ｐｓｃＩｏｌ、 　ｐＡｃＹｃ１８４、等のような複製系を有するのが普通である。この方法では 、各操作の後各段階で、得られた構成物をクローニングし、配列決定し、さらに 操作の正確さを測定した。さらに、または大腸菌復製系の代わりに、Ｐ−１不和 合性プラスミド、例えば、ｐＲＫ２９０のような広い宿主範囲の複製系を用いる ことかできる。複製系に加え、しばしば少なくとも１つのマーカーか存在し、こ れは１種以上の宿主において有用で、あるいは個々の宿主に対する異なるマーカ ーである場合かある。このことは、あるマーカーを原核細胞宿主における選択に 用いることができ、一方他のマーカーを真核細胞宿主、特に植物宿主における選 択に用いることかてきる。これらのマーカーは、抗生物質、毒物、重金属、等の ような生命破壊剤に対する防護であり、栄養要求性宿主に無機物から栄養をとる ことを伝えることにより、相補性を提供し　または植物における新規な化合物の 生産により目に見える表現型を提供する場合かある。用いることかできる典型的 な遺伝子にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）　、ノ１イ グロマイシンホスホトランスフエラーゼ（ＨＰＴ）　、クロラムフエニコールア セチルトランスフエラーセ（ＣＡＴ）　、ニトリラーゼ、およびゲンタマイシン 耐性遺伝子か含まれる。植物宿主選択のため、適当なマーカーの非制限的な例は 、インジゴを生成する、β−グルクロニダーセ、目に見える光を生成する、ルシ フエラーセ、カナマイシン抵抗性またはＧ４１８抵抗性を与えるＮＰＴＩＩ　、 ／１イグロマイシン抵抗性を与える、）ＩＰＴ　、およびグリホセート（ｇｌｙ ｐｈｏｓａｔｅ）抵抗性を与える、突然変異したアロＡ遺伝子である。

種々の構成物、発現カセット、マーカー、等から成る種々のフラグメントは、適 当な複製系の制限酵素切断、および有効な部位への特定の構成物またはフラグメ ントの挿入により連続して導入することかできる。連結してクローニングした後 ＤＮＡ構成物をさらなる操作のために単離することかできる。これらの方法のす へては文献に十分に例示されており特にマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ　Ｊコールドスプリングハーバ−研究所、コールドスプリングハーバ−、ニ ューヨーク州、１９８２年に具体例か見出される。

本発明のＤＮＡ構成物で植物組織を形質転換するのに用いることかできるベクタ ーにはアグロバクテリウムベクターおよび弾道ベクター（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　 ｖｅｃｔｏｒ）、ならびにＤＮＡを媒介する形質転換に適当なベクターが含まれ る。

本発明のＤＮＡ構成物を含むアグロバクテリウム　ツメファシェンス細胞は、こ のＤＮＡ構成物かＴｉプラスミドから成り、形質転換した植物を作製する方法に 有用である。植物細胞を上述のようなアグロバクテリウム　ツメファシェンスに 感染させ形質転換した植物細胞を作製し、次いて植物を形質転換した植物細胞か ら再生させる。本発明を実施するのに有用な多数のアグロバクテリウムベクター 系が知られている。例えば、米国特許第４、４５９．３５５号明細書には双子葉 植物を含めた、感受性植物を、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム株を用 いて形質転換するための方法か開示されている。木質の植物をアグロバクテリウ ムベクターを用いて形質転換することは米国特許第４．７９５．８５５号明細書 に開示されている。さらに、シュイルペルールト（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ） 等の米国特許第４．９４０．８３８号明細書には本発明を実施するのに有用な一 対のアグロバクテリウムベクター（すなわち、アグロバクテリウムかＴｉプラス ミドのＴ領域てはな（ｖｉｒ領域を有する１つのプラスミド、ｖｉｒ領域てはな くＴ領域を有する第２のプラスミドを含むもの）か開示されている。

本発明のＤＮＡ構成物を有する微粒子は、植物細胞の弾道形質転換に適当である が、さらに本発明の形質転換植物を作出するのに有用である。微粒子を植物細胞 内に推進し形質転換植物細胞を作出し、さらに植物を形質転換植物細胞から再生 する。典型的な器具および方法はサンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）およびウルツ （Ｗｏｌｆ）の、米国特許第４．９４５．０５０号明細書、およびｒＰｏｌｌｅ ｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｐｌａｎｔ　ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＪ　と題グ るアグラセタス（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ）欧州特許出願公開第０２７０３５６号明 細書に開示されている。弾道形質転換法を用いる際、発現カセ・ノドを形質転換 すべき細胞中で複製することかてきるプラスミドに組み込むこと力１できる。か かる系で用いるのに適した微粒子の例には１〜５μｍの金製スフイアか含まれる 。ＤＮＡ構成物は、沈殿によるような、任意の適当な方法により微粒子上に堆積 させることかてきる。

植物種は本発明のＤＮＡ構成物を用いて植物細胞のプロトプラストのＤＮＡ媒介 形質転換次いでこの技術でよく知られた方法（こよる形質転換したプロトプラス トからの植物の再生により形質転換することかできる。

その後の、器官形成もしくは胚形成によるクローン増殖力く可能な任意の植物組 織は本発明のベクターにより形質転換することかできる。ここで用いる「器官形 成」とは、シ、−トおよび根が分裂組織的中心から連続して発生する過程を意味 し：ここで用いる「胚形成」とは、シュートおよび根か相互に協調した形で（連 続せずに）、体細胞または配偶子から、発生する過程を意味する。選択された特 定の組織は形質転換される特定の種類に有効な、最も適したクローン増殖系に依 存して変化する。

典型的な組織標的にはリーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カル ス組織、存在する分裂組織的組織（例え（ｆ、頂端分裂組織、腋芽、および根分 製組織）、および誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組 織）が含まれる。

本発明の植物は種々の形態をとり得る。これらの植物は形質転換した細胞と形質 転換してない細胞とのキメラてよく：これらの植物はクローン形質転換体（例え ば、発現カセットを含むよう形質転換されたすべての細胞）である場合があり： これらの植物は形質転換された組織および形質転換されていない組織の接ぎ木（ 例えば、カンキツ種において形質転換されていない接ぎ穂に接ぎ木された形質転 換した根茎）を含むことかある。

形質転換された植物は種々の手段、例えばクローン増殖または従来の育種法によ り増殖させることかできる。例えば、第１世代（またはＴＩ）の形質転換植物を 自家受粉させ同型接合の第２世代（またはＴ２）形質転換植物を作製し、さらに Ｔ２植物を従来の育種法により増殖させた。優性の選択可能なマーカー（例えば ｎｐｔ　Ｉ［）を発現カセットに結合させて育種に利用することができる。

本発明を実施するのに用いることかできる植物には、これらに限定されないが、 タバコ〔ニコチアナ　タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）　）　、 ジャガイモ（ソラナム　チューベロサム）、ノイズ〔グリシン　マックス（ｇｌ ｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）　）　、ビーナツツ〔アラキス　ヒボガエア（Ａｒａｃｈ ｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ））　、ワタ〔ゴツシビウム　ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙ ｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ））　、サツマイモ〔イボモニア　バタタス（Ｉｐ ｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔｕｓ）　）　、カサバ〔マニホ・ソトエスキュレンタ（ Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）　）　、コーヒー〔カフニア種（Ｃｏｆ ｅａ　ｓｐｐ、））　、ココナツツ〔ココス　ヌシフエラ（Ｃｏｃｏｓ　ｎｕｃ ｉｆｅｒａ））　、パイナツプル〔アナナス　コモサス（Ａｎａｎａｓ　ｃｏｍ 。

５ｕｓ））　、カンキツ属の木〔シトラス種（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐｐ、）　）　 、ココア〔セオブロマ　カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）　）　、チ ャツキ〔カメリア　シネレシス（ＣａＩＩｌｅｌｌｉａ　５ｉｎｅｎｓｉｓ）　 〕、バナナ（ムサ種（Ｍｕｓａ　ｓｐｐ、）　）　、アホカドノキ〔ベルセア　 アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ））　、イチジク〔フイカス 　力シカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｓｉｃａ）〕、バンジロウ〔サイジウム　グアヤバ （Ｐｓｉｄｉｕｍ　ｇｕａｊａｖａ）〕、〕マンゴーマンギフエラ　インディカ （Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　１ｎｄｉｃａ）〕、オリーブ〔オレア　ニーロバエア（ Ｏｌｅａ　ｅｕｒｏｐａｅａ）　）　、パパイヤ〔カリ力　パパヤ（Ｃａｒｉｃ ａ　ｐａｐａｙａ）　）　、カシュー〔アナカルシウム　オシデンタル（Ａｎａ ｃａｒｄｉｕｍ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））　、クィーンズランドナット〔マ カデミア　インチグリフオーリアＱｌａｃａｄａｍｉａ　ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌ ｉａ））　、ｚ−タンキョウ〔プルナス　アミグダラス（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｍｙ ｇｄａｌｕｓ））　、テンサイ〔ベータ　ブルガリス（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒ ｉｓ）　）　、）ウモロコシ〔セア　メイズ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ））、コムギ、 エンバク、ライムギ、オオムギ、イネ、野菜、観賞植物、および針葉樹か含まれ る。野菜にはトマト〔リコペルシコン　エスキュレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉ ｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）　）　、チシャ〔例えば、ラクツエア　サテイ バ（Ｌａｃｔｕｅａ　５ａｔｉｖａ））　、リョッキョウインゲン〔ファセオラ ス　ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ））　、ライマビーン 〔ファセオラス　リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｌｉｍｅｎｓｉｓ））　、 エントウ〔ラティラス種（Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｓｐｐ、）　）およびキュウリ〔 シー、サティバス（Ｃ，５ａｔｉｖｕｓ）　）　、カンタローブ〔シー、カンタ ルペンシス（Ｃ，ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）　）　、およびマスクメロン〔 シー、メロ（Ｃ，ｍｅｌｏ））のようなりクミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属の仲間か 含まれる。観賞植物にはアザレア〔ロートプントロン種（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒ ｏｎ　ｓｐｐ、）　）　、アジサイ〔マクロフイラハイドランゲア（Ｍａｃｒｏ ｐｈｙｌｌａ　ｈｙｄｒａｎｇｅａ）　）　、ハイヒスカス〔ハイビスカス　ロ ササネンシス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）　）、バラ〔ロ ーザ［（Ｒｏｓａ　ｓｐｐ、）　）　、チユーリツプ〔ツリバ種（Ｔｕｌｉｐａ 　ｓｐｐ、）　）　、スイセン〔ナルシサス種（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ　ｓｐｐ、 ））ペチュニア〔ペチュニア　ハイブリーダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ ）　）、カーネーション〔ディアンタス　力すオフィラス（ｄｉａｎｔｈｕｓ　 ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）　）　、ショウジヨウソウ〔ニーフォルビア　プル チェリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　ｐｕｌｃｈｅｒｉｍａ））　、およびキルサン テマム（ｃｈｙｒｓａｎ　ｔｈｅｍｕｍ）か含まれる。本発明の実施に用いるこ とかできる針葉樹には、例えば、テーダマッ〔ピナス　タエダ（Ｐｉｎｕｓ　ｔ ａｅｄａ）　：ｌ　、スラッシュマツ〔ピナス　エリオチ（Ｐｉｎｕｓ　ｅｌｌ ｉｏｔｉｉ）〕、ボンテローサマツ〔ピナス　ポンデローサ（Ｐｉｎｕｓ　ｐｏ ｎｄｅｒ。

ｓａ）〕、ロッジポールマツ〔ピナス　コンドルタ（Ｐｉｎｕｓ　ｃｏｎｔ。

ｒｔａ）］　、およびモジンレーマツ〔ピナス　ラジアタ（Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄ ｉａｔａ）　）のようなマツ：アメリカトガサワラ〔シュートツガメンジエシイ （Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ　ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）　’Ｊ　；アメリカツガ〔ツ ガ　カナテンシス（Ｔｓｕｇａ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））　；ヘイトウヒ〔ビ セアグラウ力（Ｐｉｃｅａ　ｇｌａｕｃａ））　；イチイモドキ〔セクオイア　 センパーヒレシス（Ｓｅｑｕｏｉａ　ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））　；シルバ ーモミ　〔アヒエス　アマビリス（Ａｂｉｅｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ））およびバ ルサムモミ　〔アヒエス　バルサメア（Ａｂｉｅｓ　ｂａｌｓａｍｅａ））のよ うなトウルーモミ：ならびにベイスギ〔ツジャ　プリカタ（Ｔｈｕｊａ　ｐｌｉ ｃａｔａ）　）およびアラスカヒノキ〔チャマエシバリス　ノト力テンシス（Ｃ ｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ　ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））のようなヒマラヤス ギか含まれる。

本発明により保護される植物からの若干の植物寄生性線虫、および対応する植物 を、次に示す　アルファルファ：ジチレンカス　ディプサシ（Ｄｊｔｙｌｅｎｃ ｈｕｓ　ｄｉｐｓａｃｉ）　、メロイドジン　バプラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ 　ｈａｐｌａ）　、メロイドジン　インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ　ｉ ｎｃｏｇｎｉｔａ）　、メロイトジン　ジャバニカ（Ｍｅ　ｌｏ　ｉｄｏｇｙｎ ｅ　ｊａｖａｎｉｃａ）、ブラチレンカス種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｓｐ ｐ、）　、／＜ラチレンカス種（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｓｐｐ、）、お よびキシフイネマ種（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ　ｓｐｐ、　）　；バナナ、ラドフオ ラス　シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ　５１ｍ１１ｉｓ）、へりコチレン力ス 　マルチシンクタス（）（ｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｍｕｌｔｉｃｉｎｃ ｔｕｓ）、メロイドジン　インコグニタ、エム。

アレナリア（Ｍ、　ａｒｅｎａｒｉａ）、エム、ジャバニカ（Ｍ、　ｊａｖａｎ ｉｃａ）、プラチレン力ス　カフエア１（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｃｏｆｆ ｅａｅ）、およびロチレンチュラス　レニフォルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌ ｕｓ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）；マメおよびエンドウニメロイドジン種、ヘテロ デラ種、へロノライムスｆ！１（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ　ｓｐｐ、）　、ヘ リコテイレンカス種（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｓｐｐ、）、ロチレン チュラス　レニフオルミス、バラトリコドラス　アネモネズ（Ｐａｒａｔｒｉｃ ｈｏｄｏｒｕｓ　ａｎｅｍｏｎｅｓ）、およびトリコドラス種（Ｔｒｉｃｈｏｄ ｏｒｕｓ　ｓｐｐ、）　；カサバ・ロチレンチュラス　レニフオルミス、メロイ トジン種、穀物、アングニア　トリチシ（Ａｎｇｕｉｎａ　ｔｒｉｔｉｃｉ）　 （エマ−、ライムギ、スペルトコムギ）、ビデラ　アベナエ（Ｂｉｄｅｒａ　ａ ｖｅｎａｅ）　（エンバク、コムギ）、ノチレン力ス　ディプサシ（ライムギ、 エンバク）、スハングイナ　ラブイノコラ（Ｓｕｂａｎｇｕｉｎａ　ｒａｄｉｃ ｉｃｏｌａ）　（エンハク、オオムギ、コムギ、ライムギ）、メロイトジン　ナ ラシ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ　ｎａａｓｉ）　（オオムギ、コムギ、ライムギ ）、ブラチレンカス種（エンハク、コムギ、オオムギ、ライムギ）、パラチレン カスｆｌｌ（コムギ）、チレンコルヒンカス種（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈ ｕｓ　ｓｐｐ、）　（コムギ、エンバク）：ヒョコマメ　ヘテロデラ　カジャ＝ （Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ　ｃａｊａｎｉ）　、ロチレンチュラス　レニフオルミ ス、ホブロライムス　セインホルスチ（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓｓｅｉｎｈｏｒ ｓｔｉ）、メロイドジン種、ブラチレンカス種、：カンキツ＠：チレンキュラス 　セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ　ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ） 　、ラドフオラス　シミリス、うＩ・フオラス　シトロフィラス（Ｒａｄｏｐｈ ｏｌｕｓ　ｃｉｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）　（フロリダ州のみ）、ヘミシクリオフオ ラ　アレナリア（Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ　ａｒｅｎａｒｉａ）、プラ チレンカス種、メロイトシン種、ポロノライムス　ロンギカウダタス（Ｂｏｌｏ ｎｏｌａｉｍｕｓ　ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ）　（フロリダ州のみ）、トリ コドラス、バラトリコドラス、キシフィネマ種：クローバー・メロイドジン種、 ヘテロデラ　トリフすり（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ　ｔｒｌｆｏｌｉｉ）　：ココ ナツ：ラジナフエレン力ス　ココフィラス（Ｒｈａｄｉｎａｐｈｅｌｅｎｃｈｕ ｓ　ｃｏｃｏｐｈｉｌｕｓ）　；コーヒーツキ：メロイドジン　インコグニタ（ ブラジルで最も重要）、エム、エクシグア（Ｍ、ｅｘｉｇｕａ）　（広く行き渡 った）、ブラチレン力ス　力フェアエ、ブラチレン力ス　ブラキュラス（Ｐｒａ ｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）　、ラトフオラス　シミリス、ロ チレンチュラス　レニフオルミス、ヘリコテイレンカス種：トウモロコシ：ブラ チレンカス種、バラトリコドラス　ミノア（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ　 ｍ１ｎｏｒ）　、ロンシトラス種（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ　ｓｐｐ、）　、ホブ ロライムス　コラツプス（Ｈｏｐｌ。

ｌａｉｍｕｓ　ｃｏｌｕｍｂｕｓ）　：ワタ：メロイドジン　インコグニタ、ベ ロノライムス　ロンジ力ウダタス（Ｂｅ４ｏｎｏｌａｉｍｕｓ　ｌｏｎｇｉｃａ ｕｄａｔｕｓ）、ロチレンチュラス　レニフオルミス、ホブロライムス　ガレア タス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ　ｇａｌｅａｔｕｓ）、ブラチレンカス種、チレ ンコルヒンカス種、パラトリフトラス　ミノア；ブトウ：キソフィネマ種、プラ チレン力ス　プルナス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｖｕｌｎｕｓ）、メロイド ジン種、チレンキュラス　セミペネトランス、ロチレンチュラス　レニフオルミ ス：草・ブラチレンカス種、ロンジトラス種、バラトリフトラス　クリスチェイ （Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓｃｈｒｉｓｔｉｅｉ）　、キソフィ不マ種、 ジチレンカス種（ＤｉｔｙＬｅｎｃｈｕｓｓｐｐ、　）　；ラッカセイ：ブラチ レンカス種、メロイドジン　ハブラ、メロイドシン　アレナリア（Ｍｅｌｏｉｄ ｏｇｙｎｅ　ａｒｅｎａｒｉａ）、クリコア・メラ種（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌ ａ　ｓｐｐ、）　、へ口／ライムスロンジ力つダタス（米国東部）：キマメ、ヘ テロデラ　カシヤニ、ロチレンチユラス　しニフォルミス、ホブロライムス　セ インポルスチ、メロイドジン種、ブラチレンヵス種、パイナップル：パラトリコ ドラス　クリスチェイ、クリコネメラ種、メロイドジン種、ロチレンチュラス　 レニフォルミス、ヘリコテイレンカス種、ブラチレンカス種、バラチレンヵス種 ；ジャガイモ、グロボデラ　ロストキニンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ　ｒｏｓｔ ｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）　、グロボデラ　バリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ　ｐａｌｌ ｉｄａ）　、メロイドジン種、ブラチレンカス種、トリコトラス（Ｔｒｉｃｈｏ ｄｏｒｕｓ　ｐｒｉｍｉｔｉｖｕｓ）、ジチレンカス種、バラトリコドラス種（ Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ　ｓｐｐ、）、ナコアブス７　ヘラシス（Ｎａ ｃｏａｂｂｕｓ　ａｂｅｒｒａｎｓ）　；イネ：アフエレンキオデス　ベツセイ イ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｉｏｄｅｓ　ｂｅｓｓｅｙｉ）、ジチレン力ス　アング スタス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ａｎｇｕｓｔｕｓ）、ヒルキマニエラｆ！ｌ （Ｈｉｒｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ　ｓｐｐ、）　、ヘテロデラ　オリサ−ｒ−（ Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ　ｏｒｙｚａｅ）　、メロイドジン種、小果樹：メロイド ジン種、ブラチレンカス種、キシフィネマ種、ロンジトラス種（Ｌｏｎｇｉｄｏ ｒｕｓ　ｓｐｐ、）　、パラトリコドラス　キリスチェイ（Ｐａｒａｔｒｉｃｈ ｏｄｏｒｕｓｃｈｒｉｓｔｉｅｉ）　、アブへレンコイデス種（Ａｐｈｅｌｅｎ ｃｈｏｉｄｅｓ　ｓｐｐ、）（イチゴ）：ダイズ：ヘテロデラ　グリシシス（Ｈ ｅｔｅｒｏｄｅｒａ　ｇｌｙｃｉｎｅｓ）　、メロイドジン　インコグニタ、メ ロイドシン　ジャハニ力、ベロノライムス種、ホブロライムス　コランブス：テ ンサイ：ヘテロデラ　ソヤクチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ　５ｃｈａｃｈｔｉｉ ）、ジチレン力ス　ディプサシ、メロイトジン種、ナコアブス　アヘランス、ト リコドラス種、ロンシトラス種、パラトリコドラス種、；サトウキビ：メロイト ジン種、ブラチレンヵス種、ラドフオラスｆｉ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ　ｓｐｐ 、）　、ヘテロデラｆｌ、ホブロライムス種（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ　ｓｐｐ 、）、へりコチレンヵス種、スキュテロネマ種（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ　ｓ ｐｐ、）　、ベロノライムス種、チレンコリンカス種、キンフィネマ種、ロンジ トラス種、パラトリコトラス種；チャツキ、メロイドジン種、プラチレンヵス種 、ラドフォラス　ンミリス、ヘミクリコネモイデス　力ナヤエンシス（Ｈｅｍｉ ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ　ｋａｎａｙａｅｎｓｉｓ）　、へりコチレンヵス 種、パラチレンカス　クルビティタス（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｃｕｒｖ ｉｔａｔｕｓ）　；タバコ：メロイドジン種、ブラチレンヵス種、チレンコルヒ ン力スクレイトニ（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｃｌａｙｔｏｎｉ）　 、グロポデラ　タバカム（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ　ｔａｂａｃｕｍ）、トリコドラ ス種、キシフィネマアメリカナム（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ　ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ ）、ジチレン力ス　ディプサン（欧州のみ）、パラトリコドラス種、トマト：ブ ラチレンカス種、メロイドジン種、高木に実る果実、ブラチレンヵスｆｌ（リン ゴ、セイヨウナシ、セキ力）、バラチレンヵス種（リンゴ、セイヨウナシ）、キ シフィネマ種（セイヨウナシ、サクランボ、モモ）、カコパウラス　ペスティス （Ｃａｃｏｐａｕｒｕｓ　ｐｅｓｔｉｓ）　（クルミノキ）、メロイドジン種（ セキ力、リンゴ、等）、ロンジトラス種（サクランボ）、クリコネメラ種（モモ ）、およびチレンキュラスＦｊ（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ　ｓｐｐ、）　（オリ ーブ）。

線虫に加え、本発明を用いて植物病原体ウィルス、植物病原体細菌、および植物 病原体真菌に対抗することができる。一般には、シー、アグリオス（Ｇ、　Ａｇ ｒｉｏｓ）の、ｒＰＩａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｊ（第３版、アカデミツク ブレス社）を参照。本発明により対抗することができる植物ウィルスの例には一 本鎖ＲＮＡウィルス（エンベロープを有するものと有しないもの）、二本鎖ＲＮ Ａウィルス、ならびに（これらに限定されないが）タバコモザイクウィルス、タ バコラットルウイルス、エンドウエネーションモサイクウイルス、ムギ斑葉モザ イクウィルス、ジャガイモＸウィルスおよびＹウィルス、カーネーション潜在ウ ィルス、ピート萎黄ウィルス、メイズクロロティックウィルス（ｍａｉｚｅ　ｃ ｈｌｏｒｏｔｉｃ　ｖｉｒｕｓ）　、タバコネクロシスウイルス、カブ黄斑モザ イクウィルス、トマトブッシースタントウィルス、南部インゲンモザイクウィル ス、オオムギ黄萎ウィルス、トマトスポッテッドウイルトウイルス、レタス不ク ロティックイエローズウィルス（１ｅｔｔｕｃｅ　ｎｅｃｒｏｔｉｃ　ｙｅｌｌ ｏｗｓ　ｖｉｒｕｓ）、ウーンドトウモアウイルス（ｗｏｕｎｄ　ｔｕｍｏｒ　 ｖｉｒｕｓ）　、メイズストリークウィルス（ｍａｉｚｅ　５ｔｒｅａｋ　ｖｉ ｒｕｓ）、およびカリフラワーモザイクウィルスのような、一本鎖および二本鎖 ＤＮＡウィルスが含まれる。本発明により対抗することができる植物病原体細菌 の例には（これらに限定されない力りアグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｊｕｍ　ｓｐｐ、）、クラビバクタ一種（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ 、）　Ｃまたはコリネバクテリウムｆｌ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓ ｐｐ、）〕、エルウィニア種ＣＥｒｗ１ｎｉａ　ｓｐｐ、）、ベウドモナス種（ Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ、）　、キサントモナス種（ＸａｎＣｈｏｍｏ口 ａｓ　ｓｐｐ、）、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ 、）、およびキンレラＦｌ　（Ｘｙｌｅｌ　ｌａ　ｓｐ＋１．　）か含まれる。

本発明により対抗することができる植物病原体真菌の例、および本発明によりこ れらから保護することができる若干の植物には、（これらに限定されないか）フ リゴ種（Ｆｕｌｉｇｏ　ｓｐｐ、）　、ムシラボ種（Ｍｕｃｉｌａｇｏ　５ｌ） Ｉ）、）　、フイサラム種（Ｐｈｙｓａｒｕｍ　ｓｐｐ、）　、プラスモジフす ラ　ブラッン力エア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｐｈｏｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅａ）　 （アブラナ科の各種草本の根こふ病を発生させる）、ポリミキサ　グラミニス（ Ｐｏｌｙｍｙｘａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）　（コムギおよび池の穀類に寄生性）、 スボンゴスボラ　サプテラナエ（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ　５ｕｂｔｅｒｒａｎ ｅａ）〔ジャガイモ塊茎の粉状の瘉伽病（ｐｏｗｄｅｒｙ　５ｃａｂ）を生じる 〕、オリビデイウム　ブラッシカエ（Ｏｌｐｉｄｊｕｍ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ） 　（キャベツの根に寄生性）、フィソデルマ　メイジス（Ｐｈｙｓａｄｅｒｍａ 　ｍａｙｄｉｓ）（ｈウモロコシに褐色の点を発生させる）、シチトリウムエン ドビオチカム（Ｓｙｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ）　、ウロフ ィリティス　アルファルファ工（ＩＪｒｏｐｈｙｌｙｔｉｓ　ａｌｆａｌｆａｅ ）、ア７ｙノマイセス種（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ、）　（多くの野菜 に根腐れを生しる）、フィトフラワ　インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ ｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎＳ）、アルブゴ　カンジダ（Ａｌｂｕｇｏ　ｃａｎｄｉ ｃｌａ）、ペロノスポラ　ニコチアナエ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｎ１ｃｏｔ ｉａｎａｅ）、ベルミア　ラクチュカ工（Ｂｅｒｍｉａ　１ａｃｔｕｃａｅ）　 、スフレロスポラ　グラミニコラ（Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ　ｇｒａｍｉｎｉｃ ｏｌａ）　、シュウドベロシスボラキューヘンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏ ｓｐｏｒａ　ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｐｐ。

）（果実およびヤサイの腐敗病を生じる）、コアンフォラ　キュキュルビアタラ ム（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ　ｃｕｃｕｒｂｉｔａｒｕｍ）、サツカロマイセス 　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ボド スファエラ　ロイコトリ力（ＰｏｄｏｓＩ）ｈａｅｒａ　１ｅｕｃｏｔｒｉｃｈ ａ）　（リンゴのウドノコ病を生じる）、スパエロセカ　バンノサ（Ｓｐａｅｒ ｏｔｈｅｃａｐａｎｎｏｓａ）　（バラおよびモモのウドノコ病を生じる）、ハ イポキジロン　ママタム（Ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ　ｍａｍｍａｔｕｍ）　（ポプラ の潰瘍を生じる）、コクリオボラス　サティバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　 ５ａｔｉｖｕｓ）（粒状作物における斑点病および根腐れ病を生じる）、ジブロ カルボン　ロサエ（Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ　ｒｏｓａｅ）　（バラの黒斑病を 生じる）、ロフォデルミウム（Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｉｕｍ　ｓｐｐ、）　（松葉 枯れ病を生じる）、ジブロシア　メイジス（Ｄｉｐｌｏｄｉａ　ｍａｙｄｉｓ） 　（）ウモロコシの柄および黒穂病（ｓｔａｌｋ　ａｎｄ　ｅａｒ　ｒｏｔ）を 生じる）、ポトリティス　シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）　（ 灰色カビ病を生じる）、グラフイウム　ウルミ（Ｇｒａｐｈｉｕｍ　ｕｌｍｉ） 　にし立ち枯れ病を生しる。雌雄段階はセラトシスティス（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓ ｔｉｓ）である〕、ウウスティラボ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ　Ｓｐｐ、　）　（）ウ モロコシ、コムギ、オオムギ、等の黒穂病を生じる）、およびアルミラリアメレ ア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｍｅｌｌｅａ）　（森林および果樹の根腐れを生し る）か含まれる。

当業者はここに開示したＲＢＴ線虫応答要素か他の戦略、例えば、バチルス　ス リンギエンシスの毒素のような昆虫毒素を生成する遺伝子の活性化において用い ることかできることを認識することかできる。このようにして、本発明は形質転 換した植物細胞から成る組換え病原体耐性植物を提供する。この形質転換した植 物細胞は発現カセットを有す異種ＤＮＡ構成物を含み、この構成物は、５′から ３′方向に、プロモータ、プロモータの下流に位置し機能的に結合した構造遺伝 子、および構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配列から成る、。こ のプロモータはＲＢＴ線虫応答要素、およびバチルス　スリンギエンシスの毒素 のような線虫に有毒な生成物を暗号化する構造遺伝子を含む。かかる植物は本質 的に上述のように作製し使用することができる。

次に例を示して本発明を説明するか、これらに限定して解釈すべきてない。

実施例１ 根特異的りローンＲＢ７ゲノムの単離および発現ニコチアナ　タバカム　ジーブ イ　ライスコンシン３８をクローニングおよび遺伝子特徴付は用の材料の供給源 として用いた。ゲノムＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分的に消化し５〜２０９６の酢酸 カリウム勾配においてサイズ分画（ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔ　１ｏｎａｔｅ）　Ｌ ／た。１７〜２３ｋｂのサイズの画分をプールし、ＢａｍＨ［およびＥｃｏＲ［ て消化したλヘクター、ＥＭＢＬ３ｂに結合した。ニー、フライシャラフ（Ａ、 　Ｆｒ１ｓｃｈａｕｆ）等の、ｒＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　Ｊ　１７０．８２７ 〜８４２（１９８３年）を参照。約３．５　ＸＩＯ＠個の組換え体の最初のライ ブラリーをブラークハイプリダイセーションによりスクリーニングした。陽性の クローンをプラーク精製した。このゲノムクローンの制限地図をラヒビイッッ（ Ｒａｃｈｗｉ　ｔｚ）等のｒＧｅｎｅ」３０、１９５〜２００（１９８４年）の 迅速なマツピング法を用いて作成した。

根特異的クローンの暗号化領域をササンプロットにより確認した。さらに転写さ れた領域を決定するため、これらの遺伝子か高レベルで発現する事実を利用した 。このようにして、逆転写されたポリ（Ａ＋）ＲＮＡのｃＤＮＡて作製したプロ ーブを制限分解されたゲノムクローンのササンプロットに種々のスクリーニング 実験と類似した方法でハイブリダイゼーションさせた。エフ。

キルヒ−？　−（Ｆ、　Ｋｉ　１ｃｈｅｒｒ）の、ｒＮａｔｕｒｅＪ　３２Ｌ　 ４９３−４９９（１９８６年）を参照。クローンを適当な制限酵素で消化しこれ らのフラグメントをアガロースゲル上で分離した。次にこれらのフラグメントを ニトロセルロースフィルタにサザンブロツティングし逆転写した根のポリ（Ａ＋ ）ＲＮＡを用いて厳密に調へた。ランダムへキサヌクレオチド（ファルマシア　 バイオケミカルズ社）を用いて、ｍＲＮＡ分子の３′末端かプローブ間に過剰に 現れないようにこのプローブをプライミングする。

各根特異的ｃＤＮＡクローンにハイブリダイゼーションするクローンをプラーク 精製した。若干の単離したゲノムクローンの最初の制限地図を図１に示す。ゲノ ムサザンハイブリダイゼーション実験を用いたゲノムクローン（図１）の制限地 図の比較（図示せず）は根特異的ｃＤＮＡクローンにハイブリダイゼーションす る配列の良好な関係を明らかにする。クローンλ５Ａおよびλ８Ｄは重複してお りさらに、λ１８Ｃに加えて、ｃＤＮＡクローンＴｏｂＲＢ７にハイブリダイゼ ーシヨンする。ゲノムサザンハイブリダイゼーション実験においてＴｏｂＲＢ７ に強力にハイブリダイゼーションするすべてのフラグメントはゲノムクローンか らハイブリダイセーソヨンするこれらにより説明することかでき、このｃＤＮＡ を暗号化するゲノム配列か単離されたことを示す。クローンλ１８Ｃは、クロー ンλ５Ａおよびλ８Ｄからの異なる遺伝子を暗号化するか、構造遺伝子の上流の 第一の８００塩基対に約９０９６のヌクレオチド配列の相同性を示す。

クローンλ５ＡをＴｏｂＲＢ７−５Ａ　（配列番号、ｌ）として用いて以下に示 す実験において用いるプロモータ配列を作製する。このクローンは細胞膜チャネ ルタンパク質（配列番号：２）をコードすると考えられる。

実施例２ ＴｏｂＲＢ７　プロモータを用いる外来受容体遺伝子の根特異的発現約１．４ｋ ｂの５′フランキング配列をｐＢ［１０１，２にクローニングすることによりλ ５ＡゲノムクローンのＴｏｂＲＢ７ブロモータ領域か異種受容体遺伝子の発現を 調節する能力を試験した。要約すると、ＴｏｂＲＢ７　５’フランキング領域（ 配列番号　３）をλ５Ａから単離しアグロバクテリウムバイナリーヘクター、ｐ Ｂｒｌｏｌ、２中のβ−グルクロニダーゼと融合させた。このヘクターはβ−グ ルクロニダーゼ（ＧＬＩＳ）受容体遺伝子およびＴ−ＤＮＡボーダー配列により フランキングされたｎｐｔ［［の選択可能なマーカーを含む〔アール、ジェファ ーソン（Ｒ，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）等の、ｒＥＭＢｏ　Ｊ、　Ｊ６．３９０１〜 ３９０７　（１９８７年））。本質的にアン（Ａｎ）等により、ニス　ベルビン （Ｓ、３ｅ１ｖｉｎ）およびアール、ンルペルート（Ｒ，５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏ ｔ）の、編集、ｒＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕ ａｌ」、？ルティヌス　ナイホフ（Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ）、ドル ドレヒト（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）　、オランダ国、ｐｐ　Ａ３−１−１９　（１ ９８８年）に記載されているように、Ｔ−ＤＮＡのトランスファと植物ゲノム中 への組み込みに必要なりｌｒ機能を提供（トランスで）することかできる非武装 Ｔｉプラスミド（ＬＢＡ４４０４）を有するアグロバクテリウム宿主中てこの構 成物を起動させた。ニコチアナ　タバカムＳＲＩのリーフディスクに感染させ形 質転換体をアン等の、ｒＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ。

１、Ｊ８１．３０１〜３０５（１９８６年）により記載されたように選択し再生 させた。植物全体または摘出した根および葉の組織をシェフ・アーソン等の、上 記文献に従いＧＵＳ発現についてアッセイした。組織化学的染色のために、３７ °Ｃて一昼夜５−ブロモー４−クロロー３−インドリルβ−Ｄ−グルクロニダー セ（Ｘ−ＧＬＵＣ）中てインキュベーションした。ＧＵＳ活性を発現する組織は この基質を切断しこれにより青色に染まる。インキュベーションした後、組織を ７０９６エタノールで漂白した。ＧＵＳ酵素活性をンエファーソン等により記載 されたフルオロジェニックアッセイを用いて測定した。

以下の表１は５つの個々の形質転換体からの根および葉のＧＯ８活性の測定結果 を示す。種々の発現レベルか形質転換体毎に観察されたか、すへての場合におい てＧＵＳ活性は根に特異的であり、これらの配列か調節された遺伝子発現に対し 十分であることを示した。

表１ 実施例３ ＴｏｂＲ８７ブロモータの欠失分計 これらの実験を、（ａ）用いられたＴｏｂＲＢ７フランキング領域の長さを変化 させフランキング領域の種々の部分かとのようにＧＵＳの発現に影響を与えたか を探査すること、および（ｂ）ＴｏｂＲＢ７構造遺伝子を完全に除去しＴｏｂＲ Ｂ７フランキング領域をメチオニンコドンから始まるＧｔＪＳに融合させたこと 以外は、上記実施例２に記載した実験と同一の方法で実施した。

これらの実験においてプロモータ配列として用いた欠失変異体を図２に線図て要 約する。これらの欠失変異体を△１．８（配列番号：４）、Δ１．３（配列番号 ：５）、Δ１．２（配列番号。

６）、Δ１．０（配列番号　７）、Δ０．８（配列番号、８）、八０．６（配列 番号　９）、およびΔ０．３（配列番号・１０）とした。

これらの種々の変異体の活性を図２の右側部分に要約する。

最大の根性異的発現かΔ０．６欠失変異体て得られ、上流のサイレンサー領域の 存在を示すことが注目される。ＧＵＳ活性データを次の表２に詳細に示す。Δ０ ．３（配列番号・１０）がプロモータとして不活性で、ＴｏｂＲＢ７プロモータ がＴｏｂＲＢ７構造遺伝子の上流の約８００ヌクレオチドにわたる領域に見出さ れることが示されたことか注目される。しかし、Δ０．３欠失変異体は以下に述 へるような、Ｒ８７線虫応答要素を含む。

表２ 平均ＧＵＳ　活性 （活性の範囲） 植物　根　葉　中央比 のＮｏ、　（根／葉） 野性型　８　４　０．７　２．８ （Ｉ〜ＩＩ）　（０，１７〜２．２６）１１Ｂ！−０，０２１１８７６，９１９ ，０（４〜６１４）　（０，１８〜９５．７）１）ＢＩ−０，３２１１６０５， ２２１，１（ｌ〜５８６）　（０，８〜２８．４）１）８１−０．６　２２　２ ２４２　２４．７　１２２．３（４〜１１．５４０）　（０，０５〜２１７．５ ）ｐＢＩ−０，８１７６５２４，８１０３，２（２〜３３９４）　（０，０３〜 ２３．５）１）Ｂ［−１，０９８０４５５，７９７，１（３〜２０６８）　（１ ，７２〜３７３．４）ｐＢＩ−１，２２３８８＋　４．３　１１３．５（２〜４ ６８８）　（０，１４〜２２．４）ｐＢＩ−１，３２４１４７５３，０１６６， ４（５〜＋４．　ｎｏ）（ｏ、　１４〜８．９）ｐＢＩ−１，８１ｇ　１００７ 　６．５　１２１．３（１〜４２７４）　（０，３〜２０．０）実施例４ 線虫感染植物における遺伝子活性化の位置測定上記実施例１および２に記載した ように調製したトランスジェニックタバコ植物を既知の方法によりタバコ根瘤線 虫（メロイドジン　インコグニタ）に感染させた。例えば、シー、オソペルマン （Ｃ，Ｏｐｐｅｒｍａｎ）等の、ｒＰｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　」、８６９〜 ８７１（１９８８年ｌＯ月）を参照。根をＧＵＳ活性について染色（青色）し線 虫を３段階：（ａ）感染後２４〜４８時間、（ｂ）感染後７〜１０日；（Ｃ）感 染後２０〜２５日で赤く染色した。９５９３エタノール／氷酢酸（ｌ：１）に５ 滴（１００ｍＬ当たり）のアソッドフソシン（ａｃｉｄ　ｆｕｓｈｓｉｎ）を加 えた溶液中で根を４時間インキュベーションすることによりＧ［ＪＳ染色した後 線虫を染色し、次に飽和させた抱水クロラール溶液中で１２時間〜−昼夜脱色し た。

一般にＧＵＳ活性は根の伸長領域に見出される。感染後２４〜４８時間で、第２ 期の幼若体線虫はタバコの根に浸透し、表層（ｃｏｒｔｉｃｌｅ）組織に存在し 適当な摂食部位をめて移動する。この段階の維管束組織中の幼若体は既に摂食部 位を確立し始めていた。感染後７〜ｌＯ日で、ふくれた後期第２段階の幼若体か 摂食部位においてこれらの頭部と共に見出される。感染後２０〜２５日で、成体 線虫は傷ついた根組織から突き出ているように見え、これらの頭部はなお維管束 組織に埋め込まれておりこの後部は露出して卵の蓄積を可能にする。

実施例３に記載された種々の欠失変異体で形質転換した線虫に感染した植物の根 の組織におけるＧＵＳ活性はＴｏｂＲＢ７ブロモータの線虫応答要素かΔ０．３ （配列番号＝ｌＯ）欠失変異体中に位置することを示した。

同様の結果はラッカセイ根瘤線虫（メロイトシン　アレナリア）で得られる。

前述の実験中に、線虫感染植物における遺伝子発現の継続時間か未感染植物にお けるより著しく長いこと、および遺伝子活性の領域か根の伸長領域にもはや限定 されないことが観察された。例えば、線虫か摂食部位を確立することかできる各 々の位置で、２５〜３０日（すなわち、線虫の生活環の継続時間）と同様に長い 間この部位で遺伝子発現か続いた。さらに、欠失構造体の少なくとも１つ（Δ０ ．３）は感染植物において発現か検出される前に遅延を示した。遅延は線虫を用 いた植物のイノキュレージタン後の３〜６日に観察された。

実施例５ 組換え線虫耐性タバコ この例は本質的に上述の実施例２および４に記載された同一の方法で、プロモー タとしてＴｏｂＲＢ７　Δ０．３欠失変異体（線虫応答要素）、および発現カセ ット中の構造遺伝子として、バチルス　アミロリクエファシェンスのりポヌクレ アーゼ（バルナーセ）を暗号化する遺伝子、ソー　バトンおよびアール、ハート レイの、ｒＧｅｎｅ」４０．２３１〜２３９（１９８６年）を参照、を用いて実 施する。バルナーセは成熟タンパク質としてそこで発現される場合に植物細胞に 有毒であることか知られている。シー　マリア二等の、ｒＮａｔｕｒｅ」３４７ ．７３７〜７４１（１９９０年）を参照。

バルナーゼ遺伝子を含む発現カセットの作製は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中のプラスミドｐＵｃ１８において実施する。

大腸菌は本質的にはアール、ハートレイのｒＪ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｊ２ ０２．９１３〜９１５（１９８８年）に記載されているようにカセットの作製中 にバルナーセから保護される。要約すると、細菌は修飾され第２のプラスミド、 ｐＳａ４を含み、このプラスミドはｐＬｌｃＩ８の異なる複製の起点を有しバー スター（Ｂａｒｓｔａｒ）を発現し、ハースターはバルナーゼに結合しバルナー ゼか大腸菌ＲＮＡを消化するのを防ぐ。

成熟バルナーゼタンパク質を暗号化する遺伝子（すなわち、分泌リーダー配列を 有しない）を次の方法で調製する。５′合成オリゴヌクレオチドバルナーセＰＣ Ｒプライマは、５′〜３′の順に、ＢａｍＨＩ制限部位、開始されるＡＴＧコド ン、および成熟バルナーゼのＮ−末端に相同な１８塩基を有するように作製する 。

３′合成オリゴヌクレオチドバルナーゼＰＣＲプライマは、５′〜３′の順に、 成熟バルナーゼのＣ−末端に相同な２１塩基およびＳａｃ　Ｉ制限部位を有する ように作製する。バルナーゼ遺伝子のこれらの２つのＰＣＲプライマを用いたＰ ＣＲ増幅は、５′〜３′の順に、Ｂａｍ　Ｈ１制限部位、開始されるＡＴＧフト ン、成熟バルナーゼタンパク質の全コーディング配列、およびＳａｃ　Ｉ制限部 位を有するＤＮＡ配列を作製する。次にそのように調製されたバルナーセ遺伝子 をＴｏｂＲＢ７　Δ０．３プロモータの３′末端までスプライソングしてさらに この配列をｎｏｓ遺伝子の終結配列の５′末端（ｎｏｓターミネータ）までスプ ライシングする。

上述のように作製されたカセッｌ−（ＴｏｂＲＢ７　Δ０．３プロモータ；ＡＴ Ｇ；成熟バルナーゼコーディング配列；　ｎｏｓターミネータ）をアグロバクテ リウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ）ＬＢＡ４４０４、それて形質転換された植物リーフディスク、および上記実 施例２に記載したように再生した全植物においてアグロバクテリウムバイナリ− ベクターｐＢｉｎ１９中でクローニングする。

上述のカセットを有するタバコ植物を上記実施例４に記載した方法てタバコ根瘤 線虫に感染させる場合、巨細胞の形成か妨げられ、さらに線虫の生活環に有害な 作用を及はすことか見出される。

上述の例は本発明を例示するものであり、従ってそれらに限定して解釈すべきて はない。本発明は次の請求項により、この明細書に含まれる請求項と均等なもの とともに、定義される。

配　列　表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人・コンクリング、マーク　ニー、（ＣＯ口ｋｌｉＢ、ＭａｒｋＡ、 ） オツペルマン、チャールス　エイチ、　（Ｏｐ＋）ｅｒｍａｎ　、　Ｃｈａｒｌ ｅｓ　Ｈ，） ティラー、クリストファー　ジー、　（Ｔａｙｌｏｒ。

Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｇ、） （１１、発明の名称、病原体耐性トランスジェニック植物（ｉｉｉ）配列の数＝ １０ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）受信人工ケニス　ディー、シブリーフベル、セルツアー、パークおよびギ プソン （Ｂ）通り　ポストオフィスドロウアー３４００９（Ｃ）都市：シャーロット （Ｄ）州：ノースカロライナ （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：　２８２３４ （Ｖ）コンピュータ判読可能形態。

（Ａ）媒体形式、フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　［ＢＭＰＣコンパティフル（Ｃ）　オヘレーティン’） ’　システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア、パテントイ ン（Ｐａｔｅｎｔ［ｎ）リリース＃１．０、バージョン＃１．２５ （ｖｉ）本出願のデータ。

（Ａ）出願番号・ （Ｂ）出願口： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／代行者の情報： （Ａ）名前、シブシー　ケニス　ディー。

（Ｂ）登録番号・３１．６６５ （Ｃ）参照／登録書番号：　５０５１−１６６（ｉｘ）電話情報。

（Ａ）電話：　９１９−８８１−３１４０（Ｂ）テレファックス：　９１９−８ ８１−３１７５＜Ｃ＞テレックス：　５７５１０２ （２）配列番号＝１の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：　３４２６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）　！の数・単鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし くｖｌ）最初の供給源： （Ａ）生物：ニコチアナ　タバカム （ｖｉｉ）直接の供給源 （Ｂ）クローン・ＴｏｂＲＢ７−５Ａ （ＩＸ）特＠： （Ａ）名称／キー・プロモータ （Ｂ）位置：１．．１８７７ （ｉｘ）特徴。

（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置　連結（１９５４，，２０７９，２３７６、，２６２７，２９１３、 、３２８４） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー　５’　ＵＴＲ （Ｂ）位置　＋８７８．　、　ｌ　９５３（ｘｌ）配列の記載：配列番号：１： ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴ　ＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴ　ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＴ　ＴＡＣ ＴＴＴＡＴＴＴ　ＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴ　ＡＡＴＡＡＡＡＴ`Ａ　６０ ＡＣＣＡＴＡＴＡＧτ　ＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡ　ＴＧＡＴｔｌ、ＡＣＴＴＧ　Ｔ ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＴＣτ■s　１２０ ＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＧＴＴＧＣＡＡＣＧ　ＧＣＣＣｎＧＴＣＴ　ＧＣＧＡＧ ＣＴＣＧＡ　ＴＡＣＴＧＧｎＣＧ　ＡＧＣＴＣＧＧＣＡＴ　P８０ ＴＧＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＴ　ＧＧＴＣＣＧＡＧＣＴ　ＣＧＡｎ ＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＣＧＧＴＡｎＣＧＧＧ　２４O ＧＴＧＡＧ丁ＧＴＴＧ　ＧＴＣＧＧＴＣＴＡＴ　ＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡ　ＴＡＡ ＴＣＴＣＣＧＴ　ＴＴｒＧＣＣＴＣＧＴ　ＡＧＴＴＣＧＡｎs　３００ ＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＧＡ　ＴＡＣＣＧＡＧＣＴＴ　ＧＴＣＡ ＴＴＧＡτＣＧＧＴＣＴＴＡＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＡＧＴＴＣR６０ ＧＡＣＧＣＣＴＴＴＡ　ＣＴＴＣＧＧＡＣＣＴ　ＴＧＡＣＣＧＡＧＣＴ　ｖＧｎ ＡｉｃｖＡｃ　ＡＴＡＴＣＣＴＴＴＧ　ＡＴＣＧＡＡＡＣＡs　４２０ ＴＡＴＣＧＴＴｎＧ　ＡＣＣＡＡＴＣＣＧＴ　ＡＣＣＡＣＴ（、ＡＣＴ　ＣＡＡ ＡＴＣＣＡＴＴ　ＴＧＡＣＣＧＣＡＣＡ　ＣＡＡＧＡＴＴＡsτ　４８０ ＴＴＣＧＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＧＡＣＧＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＴＡ　ＡＡＡ丁Ａ ＡＴＴＴＡ　ＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧ　ＴＡＡＴＴＧＴＴＣＧ@５４０ ＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴ　ＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴ　ＣＣＡＡＧＣＡＴＡＣＣＣＣＴ ＴＡＴＴＧＴ　ＡＣ’ｒｒＣＭＴＴＡ　ＡＴＴＡＴＣＡＴＴ`　６００ ＴＡＴＣＡＧＣＡＴＡ　ＡＡＣＡｎＡＴＡＡ　ＴＡＡＧＴＴＴＣＴＴ　ＧＣＧ丁 ＧＴＴＧＣＡ　ＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴ　ＡＧＴＴＡＴＴＣＴ`　６６０ ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴ　ＡＧＴＴＴＣＴＴｒＴ　ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡ　ＣＡＴ ＣＡＧＡＣＡＴ　ＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴ　ＡＴＡＣＴＧＧＡfＴ　７２０ ＴＴＡＣＣＴｍＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴ　ｍＣＴＴＡＴＴＧ　ＴＴＣＣＴＣＴＭ Ａ　ＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡ　７８０ＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴ 　ＡＡＡＣＴＴＡＴＣＴ　ＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴ　ＴＡＡＡＡＴＴＣＡＴ　ＴＴ ＣＴｒＧＡＡＴＧ　ＣＣＣＡＴＴＡＣ`Ａ　８４０ ＴＧＴＡＡＴＡＧＴＡ　ＴＭＣＴＴＭＴＴ　ＡＧＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＭＣＣ ＡＴＴ　ＡＡＴＡＣＧＴＡＣＧ　ＧＡＧＴＭＴＡＴＡ　９０O ＡＡＡＣＡＣＣＡｎ　ＧＧＧＧＡＧｎＣＡ　ＡＴＴＴＧＣＡＡＴＡ　ＡＴＴ丁Ｃ ＴＴＧＣＡ　ＡＡＡＡＴＧＴＡＡＡ　ＧＴＡＣＣＴＴ下　９U０ ＧＴＴＣＴＴＧＣＡＡ　ＭＴＴＴＴＡＣＡＡ　ＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴ　ＧＣＡＧ ＣＴＣＴＴｒ　ＴＴＴＴｒＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＡ@１０２０ ＣＴＡＧＣＴＣＡＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴ　ＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴ　ＴＴＡ ＴＧＧＣＡＴＡ　ＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴ　ＧＣＧＴＴＴＧＡsＧ　１０８０ ＣＡＡＣＴＡＴＴＴＴ　ＣＣＴＴＴＡＧＧＡＡ　ＡＴＡＴＴＣＡＣＡＡ　ＣＡＡ ＴＣＴＡＡＧＡ　Ｃ品ＴＣんμＡＡ　ＧＴＡＧんυいＴＡ　P１４０ ｃＴＴＴＧＴＡＡＡＡ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＧＧ　ＡＧＧＡＣＡ丁ＣＴＴ　ＡＡＴ ＣＡＡＡＴＡＴ　丁ＴＴＣＡＧＴＴＴＡ　ＡＡＡＣＴＴＧＡ`Ａ　１２００ ＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧ　ＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴ ＴＡＡＴＡ　ＴＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧ丁ＧＡＡＴＴ　P２６０ ＴＧＡＡＴＴＡＧＴＴ　ＴＧＧＴＣＡＴＡＣＧ　ＧＴＡＴＡＴＣＡＴＡ　ＴＧＡ ＴＴＡＴＡＡＡ　ＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ　ＴＡＧＣＡＡＡＡfＡ　１３２０ ＡＴＡＴＭＴＴＴＡ　ＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＡＴＡＣＣＡＭＣＡ ＣＡＡＣＣＧＣＡＴＴＡＴＡＴ　ＡＴＭＴＣＴＴＡＡ　１３W０ ＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴ　ＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＡ　ＴＧＡ丁 ＴＣＣＣＣＴ　ＡＴＧＣＧｎＧＧＡ　ＡＣＧＴＣＡＴＴＡＴ@１４４０ ＡＧＴＴＡＴＴＣＴＡ　ＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧ　ＡＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡ ＣＡＴＣＡＧ　ＡＣＡＴＣＴＡＧＴＡ　ＴＴＡＴＡＡＣＴＣs　１５００ −　ＡＧＴＧＧＡＧＣＴＴ　ＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴ　ＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴ　Ｔ ＴＴＴＴＣＴＴＣＴ　ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴ　ＡＴＣＡＣＴsＴＴＴ　１５６０ ＡＡＡＴＣＴＴＧＴＡ　ＴＡＴＴＡＧＴ”、Ｍ　ＧＣｎＡＴＣＴＡＡ　ＡＣＡＡ ＡＧＴＴｎ　ＡＡＡＴＴＣＡＴＴＴ　ＣＴＴＡＡＡＣＧＴＣP６２０ ＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧ　ＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴ　ＴＡＧＴＣＧＴＣＴＣＡＡＴＴ ＡＡＡＣＣＡ　ＴＴＭＴＧＴＧＡＡ　ＡＴＡＴＡＡＡＴＣＡ@１６Ｅ ＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡ　ＡＡＧＧＧＣＧＧＴＧ　ＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＴＣ ＡＴＴＴＧＴ　ＣＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡＧＧ@１７４ ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＧ　ＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡ　ＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧ　ＴＧＴ ＴＡＴＴＴｎ　ＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣ丁ＣｎＴｒＡＴＴＧ　P８００ ＴＴＡＡＡＧＴＴＧＣＭＡＡＴＧＴＧＴＴ　ＡＴＴＴＴＴＧＧＴＡ　ＡＧＡＣＣ ＣＴＡＴＧ　ＧＡＴＡ丁ＡＴＡＡＡ　ＧＡＣＡＧＧＴＴＡＴ@１８６０ ＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧ　ＧＡＡＡＡＣＣＡ丁ＣＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧ　ＣＡＡＡ ＡＣＣＣＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴ　ＡＡＡＴＴＧＡＧＣＴ@１９２０ ′４ ＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡ　ＴＣＴ［ｆＴＣＴＡＧ　ＣＡＣＴＡＡＡＴＡＧ　ＴＡＡ ＡＡＡＧＡＧＣＡＡＴＣＡＩ＝ＧＴＧＣＡＣＴ閣ｅｌｌ、ＴbＣ２ｉ７ ＣＡＴＴＡＡＴＴＣＧ　ＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴ　ＧＣＣＡＣＧＧＡＧＴ　ＣＴＡ ＧＡＧＡＡＡＧ　ＡＣＴＡＧＡＣＴＧＧ　ＣＴＣＴＡＴＣＡsＡ　２２３ τＴＣＭＴＴＴＴＡ　ＣＣＴＴＡＣＡＴＴＴ　ＴＡＣＴＡＧＡＴＧＣＣｆｌ、Ｔ ＴＴＴＣＴＣＡ　ＡＴＣＣＡＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣ`　２２９ ＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡ　ＡＧＡＣＴＧＣＣＴＡ　ＡＴＴＡ ＡＣＣ丁ＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　丁ＴＴｒＴＧＣＴＴs　２３５ ＣＭＴＣＣＡＴＡＴ　ＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴ　ＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴ　ＴＣＡＣ ＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡ　ＣＡＡＣＴＴＴＡＣ口@２７０７ ＴＭＧＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＡＴＡＧＣＣＧＴ　ＣＣＡＴＣＣ ＡＡＣＣＣＴＴＴＡＡＡＴＴＡ　ＡＡＡＡＧＡＧＣＣＧ　２V６７ ＧＣＡＴＡＧＴＣＡＴ　ＭＴＡＴＡＴＧＴＡ　ＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴ　ＡＧＡＡ ＴＡＴＴＴＧ　ＴＡＴＡＡＴＴＡＧＴ　ＧＴＡＴＡＴＴＧＴ`　２８２７ ＣＧＴＡＴＡＴＣＧＡ　ＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡ　ＡＴＡＭＴＡＡＴＧ　ＡＡＴＡ ＴＧＡＣＴＧ　ＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡ　ＡＴＴＧＧＡＧＴＴf　２８８７ 丁ＧＴＧＴＧＴＴＴＴ　ＣＡＡＡＴＧＣＡＡＴ　ＧＴＴＧＡＴＴＴｎ　ＡＡＴＴ ＴＡＡＧＣＴ　ＴＴＧＴＡＴＡＴＴＡ　ＴＧＣＴＡＴＧＣＡ`　３３８４ ＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴ　ＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡτＡτＣＡＴＧＴＴＴ　ＴＧＧτ ＴτＣτＴＴ　ＴＧ　３４２６（２）配列番号、２の情報 （ｉ）配列の特性。

（、Ａ）長さ　２５０アミノ酸 （Ｂ）種類、アミノ酸 （０）トポロジー口直線 Ｃ１１）分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Ｍｅｔ　ＶａＴ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　ＰｈｅＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＧＴｙ　Ｓｅｒ　ＡＴａ　ＩＩｓ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＡｓｐＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ｈ ａｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａ１ＴＭＴＴＡＡＡＣＴ　ＴＧＣＡＴＧＣＴ ＡＡ　ＣＡＴＡＡＡＴＡＣＴ　ＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＡＧＣＡＣＴＡＡＡ　Ｔ ＡＧＴＡＡＡＡＡＧ@１６８０ ＡＧＣＡＡＴＣＡＧＧ　ＴＧＣＡＣＴＡＡＧＧ　ＴＣＣＣＡｎＡＡＴ　ＴＣＧＴ 丁ＡＴＧＣＡ　ＣＡＴＧＣＣＡＣＧＧ　ＡＧＴＣＴＡＧＡＧ`　１７４０ ＡＡＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＴ　ＴＴＡＣＣ ＴＴＡＣＡ　ｎｎＡｃＴＡＧＡ　ＴＧＣＣＧＴＴｒｒＣ１８O０ ＴＣＡＡＴＣＣＡＴＡ　ＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡ　ＡＣＡＴＡＡＣＴＴＴ　ＴＡＣ ＡＧＴＴＡＣＡ　ＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＴＡＡＴＴＡＡＣb１８６０ ＴｎｍＴｒＴＴ　ＴＴｎｍＴＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴ　ＧＡＴＴｎＧＴＡＣ； 　ＡＴＡＡＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡ　１９２０ＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ ＣＡＧ　１９３３（２）配列番号、４の情報 （１）配列の特性 （Ａ）長さ：　１８５９塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖の数・単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載、配列番号＝４： ＣＣＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣＧＡＴＴＴＴＣＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＴ　ＣＴＣＣＣ ＡＴＡＧＴ　ＧＣＧＧＴＴＧＣＡＡ　ＣＧＧＣＣＣＴＴＧＴ@６０ ＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴ　ＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＧ ＡＣＣＧＡ　ＧＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＧＡＧ　P２０ ＣＴＣＧＡＴＴＣＴＧ　ＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＣＧＧＴＡＴＴＣＧ　ＧＧＧＴ ＧＡＧＴＧＴ　ＴＧＧＴＣＧＧＴＣＴ　ＡＴＧＣＡＴＣＴＴb１８０ ＧＡＴＡＡＴＣＴＣＣＧｎＴＴＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＴＣＧＡＴ　ＴＴＧＧＡＴ ＡＴＧＡ　ＧＣＴＣＧＡＴＡＡＴ　ＧＡＴＡＣＣＧＡＧＣ２S０ ゛口’ＧＴＣＡＴＴＧＡ　ＴＣＧＧＴＣＴＴＡＧ　ＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴ　ＴＣ ＣＡＣＧＣＣＴｒ　ＴＡＣＴＴＣＧＧＡＣＣＴＴＧＡＣＣＧ`Ｇ　３００ ＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴ　ＡＧＡＴＡＴＣＣＴＴ　ＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＴＡ ＴＣＣＴＴＴ　ＴＧＡＣＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＣＴＧＡ@３６０ ＣＴＣＭＡＴＣＧＡ　ＴＴＴＧＡＣＣＧＣＡ　ＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡ　ＴＴＴｒ ＣＧＡＡＡＧ　ＡＣＣＣＴＣＧＡＣＧ　ＴＣＴＴＧＧＡＧＴ`　４２０ ＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴ　ＴＡＧＴＡＡＡＧＡＧ　ＡＧＴＭＴ陀ＴＴ　ＣＧＴＴＡ ＡＡＡＡＴ　ＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡ　ＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴ@４８０ ＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴ　ＧＴＡＣＴＴＣＡＡＴ　ＴＡＡＴＴＡＴＣＡＴ　ＴＡ丁 ＡＴＣＡＧＣＡ　ＴＡＡＡＣＡＴＴＡＴ　ＡＡＴＡＡＧＴＴsＣ５４０ ＴＴＧＣＧＴＧＴＴＧ　ＧＡＡＣＧＴＣＡＴＴ　ＴｒＡＧＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡ ＧＡＧＧＭ　ＡＴＡＧＴＴＴＣ’ロ°丁ロ丁ＧＣＴＣＡＴ　U００ ＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＴＡ　ＣＴＡＴＡＣＴＧＧＡ　ＧＴＴＴ ＡＣＣＴｒＴ　ＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＡＴ@６６０ ＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡ　ＴＴＡＡＴＡＣＧＴＡ　ＣＧＧＡＧＴＡＡＴＡ　ＴＡＡ ＡＡＣＡＣＣＡ　ＴＴＧＧＧＧＡＧＴＴ　ＣＡＡＴＴｒＧＣ`Ａ　８４０ ＴＡＡＴｎＣＴＴＧ　ＣＡＡＡＡＡＴＧＴＡ　ＡＡＧＴＡＣＣＴＴＴ　ＴＴＧｎ ＣＴＴＧＣＡＡＡＡｍＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴ　９００ＴＴＧＣＡＧＣＴＣ Ｔ　ＴＴＴＴＴｎＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡ　ＴＡＣＴＡＧＣＴＣＡ　ＡＡＡ ＣＣＣＡＣＡＡ　ＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡ@９６０ ＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡ　ＴＡＣＴＴＴｒＡＧＡ　ＡＴＧＣＧＴ’口“ＧＡ　ＴＧ ＣＡＡＣＴＡＴＴ　ＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧ　ＡＡＡＴＡＴＴbＡＣ１０２０ ＡＡＣＡＡＴＣＴＡＡ　ＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＧＴＡＧＭＡＡ　ＴＡＧＴ ＴＴＧＴＡＡ　ＡＡＡＧＧＧＡＴＧ丁　ＧＧＡＧＧＡＣＡＴb１０８０ ＴＴＡＡＴＣＡＡＡＴ　ＡＴＴＴＴＣＡＧＴＴ　ＴＡＡＡＡＣＴＴＧＡ　ＡＡＡ ＴＧＡＡＡＡＡ　ＡＣＡＣＣＣＧＡＡＡ　ＧＧＡＡＡＴＧＡsＴ　１１４０ ＣＧＴＴＣＴｎＡＡ　ＴＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡ　ＴＴＴＧＡ ＡＴＴＡＧ　ＴＴＴＧＧＴＣＡＴＡ　ＣＣＧＴＡＴＡＴＣＡ@１２００ ＴＡＴＧＡＴＴＡＴＡ　ＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡ　ＧＡＡ ＴＡＴＡＡＴＴ　ＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴ　ＴＴＴＡＣＡＣＣ`Ｔ　１２６０ ＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡ　ＡＣＣＧＣＡＴＴＡＴ　ＡＴＡＴＭＴＣＴＴ　ＡＡＴＴ ＡＴＣＡＴＴ　ＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡ　ＴＣＡＡＣＡＴＴＡs　１３２０ ＡＡＴＧＡＴＴＣＣＣＣＴＡＴＧＣＧＴＴＧ　ＧＡＡＣ［；ＴＣＡＴＴ　ＡＴＡ ＧＴＴＡｎＣＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡ　ＡＧＡＡＡＴｎＧＴ　P３８０ ＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＡＧ　ＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴ　ＣＴＡＧ ＴＧＧＡＧＣｎＡｃｃｎＴＴｃ　ＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴ　１S４０ ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ　ＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＴＡ丁ＣＡＣＴＴＴ　ＴＴＡ ＡＡＴＣＴＴＧ　ＴＡＴＡＴＴＡＧｎ　ＡＡＧＣＴ丁ＡＴＣ噤@１５００ ＡＡＡＣＭＡＧＴＴ　ＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴ　ｎＣＴＴＡＡＡＣＧ　ＴＣＣＡＴ ＴＡＣＡＡ　ＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡ　ＣＴＴＡＧＴＣＧＴＣP５６０ ＴＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＴＧ　ＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴ　ＣＡＡＡ ＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＧＧ　ＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧ@１６２０ ＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴ　ＧＴＣＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡ　ＧＧＣＣ ＣＡＴＧＧＴ　ＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡ@１６８０ ＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴ　ＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ　ＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴ　ＴＧＴ ＴＡＡＡＧＴＴ　ＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧ　ＴＴＡＴＴＴＴｒfＧ　１７４０ ＴＡＡＧＡＣＣＣＴＡ　ＴＧＧＡＴＡＴＡＴＡ　ＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴ　ＡＴＧ ＴＧＡＡＡＣＴ　ＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡ　ＴＣＡＡＧＴＴｎ`　１８００ ＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＴＴＧＡＧ　ＣＴＴＣＴ ＴＴＴｆｌ；Ｇ　ＧＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＧＡＧＡＡ@１８５９ （２）配列番号・５の情報 （１）配列の特性 （Ａ）長さ　１３８５塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列の記載：配列番号＝５゜ ＣＣＣＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴ　ＴＡＴＣＡ ＴＴＡＴＡ　ＴＣＡＧＣＡＴＡＡＡ　ＣＡＴｒＡＴＡＡＴＡ@５０ ＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴＡＧ　ＴＴＡＴＴ ＣＴＡＡＡ　ＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧ　ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴ@１２０ ＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡ　ＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴ　ＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴ　ＡＣＴ ＧＧＡＧｍ　ＡＣＣＴｍＣＴＴ　ＣＴＣＣＴＣｎＴＴ　１８O ＴＣＴＴＡＴＴＧｎ　ＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴ ＡＡＡＴＧ　ＣＡＴＴＡＧＴｒＡＡ　ＡＣＴＴＡＴＣＴＣＡ@２４０ ＡＣＡＡＣＧＴｎＡ　ＡＡＡＴＴＣＡｍ　ＣＴＴＧＭＴＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡ ＴＧ　７Ｍ１’ＡＧＴＡＴＡ　ＡＣｎＡＡＴＴＡＧ　３００ＴＣＧＴＣＴＣＣＡ Ｔ　ＧＡＡＣＣＡｎＭ　ＴＡＣＧＴＡＣＧＧＡ　ＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡ　ＡＣＡ ＣＣＡＴＴＧＧ　ＧＧＡＧＴＴＣＡＡ丁@３６０ ＴＴＧＣＡＡＴＭＴ　ＴＴＣＴＴＧＣＡＡＡ　ＡＡＴＧＴＡＡＡＧＴ　ＡＣＣＴ ＴＴＴＴＧＴ　ＴＣＴＴＧＣＡＡＡＡ　ＴＴＴＴＡＣＡＡＡs　４２０ ＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡ ＡＴＡＣＴ　ＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＡＴ　S８０ ＴＴｎＧＡＡｍ　ＡＴＧＧＣＡＴＡＣＴ　ｍＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＴＧＡＴＧＣ Ａ　ＡＣＴＡＴｍＣＣｍＡＧＧＡＡＡＴ　５４０ＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡ　ＡＴＣ ＴＡＡＧＡＣＡ　ＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴ　ＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴ　ＴＴＧＴＡＡ ＡＡＡＧ　ＧＧＡＴＧＴＧＧ`Ｇ　６００ ＣＡＣＣＡＴＡＣＣＡ　ＡＡＣＡＣＭＣＣＧ　ＣＡＴＴＡＴＡＴＡＴ　ＡＡＴＣ ｎＡＡＴＴ　ＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡ　ＣＣＡＧＣＡＴＣＭ　W４０ ＣＡＴＴＡＴＡＡＴＧ　ＡＴＴＣＣＣＣＴＡＴ　ＧＣＧＴＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡ ＴＴＡＴＡＧ　ＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡ　ＣＡＡＧＡＡＡＧＡ`　９００ ＡｎＴＧＴＴＣＴＴ　ＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＡＧＴＡｎ　ＡＴＡＡＣＴ ＣＴＡＧ　ＴＧＧＡＧＣｎＡＣＣＴＴｒＴＣＴＴＴｒ　９６O ＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡ　ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴ　Ｃ，Ａ ＣＴＴＴＴＴＡＡ　ＡＴＣＴＴＧＴＡＴＡ　ＴＴＡＧＴＴＡ`ＧＣ１０２０ ＴＴＡＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡ　ＡＴＴＣＡＴＴＴＣ丁　ＴＡＡＡ ＣにＴＣＣＡ　ＴＴＡＣＡＡＴＧＴＡ　ＡＴＡＴＡＡＣＴＴ`　１１０８ ０ＧＴＣＧＴＣＴＣＴＴＡＡＡＣＣＡＴＴ　ＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴ　ＡＴＡＡＡ ＴＣＡＡＡ　ＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡ　ＧＧＣＣＧＧＴＧＧＧ@１１４０ ＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡ　ＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡ ＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣ１２O０ ＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧ　ＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡ　ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴ ＡＴＴＧＴＴ　ＡＡＡＧＴＴＧＣＭ　ＡＡＴＧＴＧＴｒＡＴ@１２６０ ＴＴＴＴＧＧＴＭＧ　ＡＣＣＣＴＡＴＧＧＡ　ＴＡＴＡＴＡＡＡＧＡ　ＣＡＧＧ ＴＴＡＴＧＴ　ＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡ　ＡＡＡＣＣＡＴＣＡ`　１３２０ ＧＴＴＴＴＡＡＧＣＡ　ＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴ　ＡＡＧＡＡＣＴＴＭ　ＡＴＴＧ ＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＡ　ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴ@１３８０ ＧＡＧＭ　１３８５ 輯）配列番号　６の情報 （ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ：　１２６８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トボロノー二直線 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号、６゜ ＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧ　ＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡ　ＴＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴＡ ＣＴＧＧＡＧ　ＴｎＡＣＣｎｎ　ＣｎＣＴＣＣＴＣＴ　６０ＴＴｒＴＣＴＴＡＴ Ｔ　ＧＴＴＣＣＴＣＴＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴ　ＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡ　Ａ ＴＧＣＡＴｒＡＧＴ　ＴＡＡＡＣＴＴＡsＣ１２０ ＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴ　ＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡ　ＴＴＴＣＴＴＧＡＡＴ　ＧＣＣ ＣＡ丁ＴＡＣＡ　ＡＴＧＴＡＡＴＡＧＴ　ＡＴＡＡＣＴＴＡ`Ｔ　１８０ ＴＡＧＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴ　ＴＡＡＴＡＣＧＴＡＣＧＧＡＧＴ ＭＴＡＴ　ＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴ　ＴＧＧＧＧＡＧＴｒＣ２S゜ ＡＡＴＴＴＧＣＡＡＴ　ＭＴＴＴＣτＴＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＡＡ　ＡＧＴＡＣ ＣＴＴＴＴ　ＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡ　ＡＡＡＴＴｒＴＡＣＡ@３００ ＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴ　ＴＡＡＴＣＡＡＡＴＡ　ＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴ　ＡＡＡ ＡＣＴＴＧＭ　ＭＴＧＭＡＡＡＡ　ＣＡＣＣＣにＭＡＧ　５S０ ＡＧＴＧＡＧＡＡ　１２６８ （２）配列番号　７の情報 （ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ：１１００塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖の数　単鎖 （Ｄ）トポロジー　直線 （２）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列の記載　配列番号　７゜ ＣＣＣＡＴＡＴＴＴＡ　ＡｎＡＧＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＴＡＡＴ ＡＣＧＴ　ＡＣＧＧＡＧＴＡＡＴ　ＡＴＡＡＡＡＣＡＣＣ６O ＡＴＴＧＧＧＧＡＧＴ　ＴＣＡＡＴＴＴＧＣＡ　ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴ　ＧＣＡ ＡＡＡＡＴＧＴ　ＡＡＡＧＴＡＣＣＴＴ　ＴＴＴＧＴＴＣＴsＧ　１２０ ＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡ　ＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡ　ＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴ ＴＴｒＴＣＴ　ＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡ　ＡＴＡＣＴＡＧＣＴb１８０ ＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡ　ＡＡ’、ＡＴＴＴＴｒＧ　ＡＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡ ＣＴＴｎＡＧ　ＡＡＴＧＣＧＴＴＴＧ　ＡＴＧＣＡＡＣＴＡs　２４０ ＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧ　ＧＡＡＡＴＡｎＣＡ　ＣＡＡＣＡＡＴＣＴＡ　ＡＧＡＣ ＡＡＴＣＭ　ＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡ　ＡＴＡＧＴＴＴＧＴＡ@３００ ＡＡＡＡＧＧＧＡＴＧ　ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴ　ＣＴＴＡＡＴＣＡＡＡ　ＴＡＴ ＴＴＴＣＡＧＴ　ＴＴＡＡＡＡＣＴＴＧ　ＡＡＡＡＴＧＡＡ`Ａ　３５０ ＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡ　ＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴ　ＴＣＧＴＴＣＴＴＴＡ　ＡＴＡ ＴＧＴＣＣＴＡ　ＣＡＣＭＴＧＴＧＡ　ＡＴｒＴＧＡＡＴＴ`　４２０ ＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴ　ＡＣＧＧＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴ　ＡＡＡＴ ＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＴＴＡＧＣＡＡＡ　ＡＧＡＡＴＡＴＡＡs　４８０ Ｔ丁ＡＴＴＡＡＡＴＡ　ＴＴＴＴＡＣＡＣＣＡ　ＴＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＣ ＧＣＡＴＴＡ　ＴＡＴＡＴＡＡＴＣＴ　ＴＡＡＴｒＡＴＣＡs　５４０ ＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡｎＡ　ＴＡＡＴＧＡＴＴＣＣＣＣＴＡＴＧ ＣＧＴＴ　ＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴ　ＴＡＴＡＧＴＴＡＴＴ　U００ ＣＴＭＡＣＡＡＧＡ　ＡＡＧＡＡＡＴＴｒＧ　ＴＴＣＴＴＧＡＣＡＴ　ＣＡＧＡ ＣＡＴＣＴＡ　ＧＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＣＴＡＧＴＧＧＡＧ@６６０ ＡＴＧＴＡＡＴＡＴＡ　ＡＣＴＴＡＧＴＣＧＴ　ＣＴＣＭＴＴＡＭ　ＣＣＡＴＴ ＡＡＴＧＴ　ＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡ　ＴＣＡＭＡＡＭＧ　８S０ ＣＣＡＡＡＧＧＧＣＧ　ＧＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＴＣＡＴＴ　ＴＧＴＣ ＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡ　ＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧ@９００ ＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡ　ＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴ　ＴＴＴＡ ＡＴＴＴＴＴ　ＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡ　ＴＴＧＴＴＡＡＡＧs　９６０ ＴＧＣＡＡＡＡＴＧＴ　ＧｎＡＴＴＴＴＴＧ　ＧＴＡＡＧＡＣＣＣＴ　ＡＴＧＧ ＡＴＡＴＡＴ　ＡＡＡＧＡＣＡＧＧＴ　ＴＡＴＧＴＧＡＡＡb１０２０ Ｔ１０２０ＴＴＧＧ　ＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴ　ＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴ ＡＡＧＡＡ　ＣＴＴＭＡＴＴＧＡ　ＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧ　P０８０ ＧＧＧＣＡＴＴＴｎ　ＣＴＡＧＴＧＡＧＭ　１１００（２）配列番号＝８の情報 ・ （１）配列の特性 （Ａ）長さ　８９０塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖の数・単鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列悉号　８゜ ＣＣＣＡＴＡｎＡＧ　ＡＡＴＧＣＧＴＴＴＧ　ＡＴＧＣＡＡＣＴＡＴ　ＴｎＣＣ ｎＴＡＧ　ＧＡＡＡＴＡｎＣＡ　ＣＡＡＣＡＡＴＣＴＡ　６O ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡ　ＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡ　ＡＴＡＧＴＴＴＧＴＡ　ＡＡＡ ＡＧＧＧＡＴＧ　ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴ　ＣＴＴＭＴＣＡＡ`　１２０ ＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴ　ＴＴＡＡＡＡＣＴＴＧ　ＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡ　ＡＡＣ ＡＣＣＣＧＡＡ　ＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴ　ＴＣＧＴＴＣＴＴsＡ　１８０ ＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡ　ＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡ　ＡＴＴＴＧＡＡＴＴＡ’ＧＴＴ ＴＧＧＴＣＡＴ　ＡＣＧＧＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡs　２４０ ＡＡＡ丁ＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＴＴＡＧＣＡＡＡ　ＡＧＡＡＴＡＴＡＡＴ　丁ＴＡ ＴＴＡＡＡＴＡ　ＴＴＴＴＡＣＡＣＣＡ　ＴＡＣＣＡＡＡＣ`Ｃ３０［ ＭＣＣＧＣＡｎＡ　ＴＡＴＡＴＭＴＣＴ　ＴＡＡＴＴＡＴＣＡＴ　ＴＡＴＣＡＣ ＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡ　ＴＭＴＧＡＴＴＣＣ３６ｆＣＣＴＡＴＧＣＧｎ 　ＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴ　ＴＡＴＡＧｎＡｎ　ＣＴＡＡＡＣＡＡＧＡ　ＡＡＧＡ ＡＡｍＧ　ＴＴＣｎＧＡＣＡＴ　４２［ＣＡＧＡＣＡＴＣＴＡ　ＧＴＡＴＴＡＴ ＡＡＣＴＣＴＡＧＴＧＧＡＧ　ＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴ　ＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴ ＴＴＴＴＴＴＴＣＴ@４８０ ＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴ　ＴＴＴＭＡＴＣＴＴ　ＧＴＡＴＡ ＴＴＡＧＴ　ＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴ　T４０ ＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡ　ＴＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＴＣＣＡＴＴＡＣＡ　ＡＴＧＴ ＡＡＴＡＴＡ　ＡＣＴＴＡＧＴＣＧＴ　ＣＴＣＭＴＴＡＡＡ@６００ ＣＣＡＴＴＡＡＴＧＴ　ＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡ　ＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧ　ＣＣＡ ＡＡＧＧＧＣＧ　ＧＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＭＴＣＡＴＴ@６６０ ＴＧＴＣＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡ　ＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧ　ＴＣＧＧ ＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡ　ＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴ@７２０ ＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴ　ＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡ　ＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴ　ＴＧＣ ＡＡＡＡＴＧＴ　ＧＴＴＡＴＴＴＴＴＧ　ＧＴＡＡＧＡＣＣbＴ　７８０ ＡＴＧＧＡＴＡＴＡＴ　ＡＡＡＧＡＣＡＧＧＴ　ＴＡＴＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＧ ＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴ　ＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣW４０ ＣＴＣｎＡＡＧＡＡ　ＣＴＴＡＡＡＴＴＧＡ　ＧＣＴＴＣＴＴｎＧ　ＧＧＧＣＡ ＴｍＴ　ＣＴＡＧＴＧＡＧＡＡ　８９０（２）配列番号、９の１ａ報。

（１）配列の特性： （Ａ）長さ、７Ｉ３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数二単鎖 （Ｄ）　ｌ−ポロソー：直線 （１１）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載、配列番号：９゜ ＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣ丁ＡＣＡＣＭＴＧ　ＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡ　ｎＡＧＴＴ ＴＧＧＴ　ＣＡＴＡＣＧＧＴＡＴ　ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴ　U０ ＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴ　ＡＡＴＴ ＴＡＴＴＡＡ　ＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡ　ＣＣＡＴＡＣＣＭＡ@１２０ ＣＡＣＭＣＣＧＣＡ　ＴＴＡＴＡＴＡＴＭ　ＴＣｎＡＡＴＴＡＴ　ＣＡＴＴＡＴ ＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＭＣＡ　ＴＴＡＴＡＡＴＧＡＴ　１８O ＴＣＣＣＣＴＡＴＧＣＧＴＴＧＧＡＡＣＧＴ　ＣＡＴＴＡＴＡＧＴＴ　ＡＴＴＣ ＴＡＡＡＣＡ　ＡＧＡＡＡＧＡＭＴ　ＴＴＧＴＴＣ汀ＧＡ　Q４０ ＡＡＡＣＣＡＴＴＭ　ＴＧＴＧＡＡＡＴＡＴ　ＡＡＡＴＣＡＭＡＡ　ＡＡＧＣＣ ＡＡＡＧＧ　ＧＣＧＧＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＭＴＣ４８O ＡＴｎＧＴＣＣＴＡ　ＧＴＣＣＡＣＴＣＭ　ＡＴＡＡＧＧＣＣＣＡ　ＴＧＧＴＣ ＧＧＣＭ　ＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴ　５S０ ＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴ　ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴ　ＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡ　ＡＧＴ ＴＧＣＡＡＡＡ　ＴＧＴＧＴｒＡＴＴＴ汀ＧＧＴＡＡＧＡＣT００ ＣＣＴＡＴＧＧＡＴＡ　ＴＡＴＡＡＡＧＡＣＡ　ＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡ　ＡＡＣ ＴＴＧＧＡＡＡ　ＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴ　ＴＴＴＡＡＧＣＡ`Ａ　６６０ ＡＣＣＣＴＣＴＴＭ　ＧＭＣｎＡＡＡＴ　ＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴ　ｎＧＧＧＧｃ ＡＴｒ　ＴＴＴＣＴＡＧＴＧＡ　ＧＡＡ　７１３（２）配列番号：１０の情ぞ１ （１）配列の特性 （Ａ）長さ　３７５塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖の数二単鎖 （Ｄ）トポロジー・直線 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載：配列番号、ｌＯ・ ＣＣＣＡＴＡＴＡＧＣｎＡＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡ　ＡＴＴＣＡＴ ＴＴＣＴ　ＴＡＡＡＣＧＴＣＣＡ　ＴＴＡＣＡＡＴＧＴＡ　U０ ＡＴＡＴＡＡＣＴＴＡ　ＧＴＣＧＴＣＴＣＭ　ＴＴＡＡＡＣＣＡＴＴ　ＡＡＴＧ ＴＧＡＡＡＴ　ＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＡＡＧＣＣＡＡ`　１２０ ＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧ　ＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡ　ＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＴ ＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＧＧＣ１W０ ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧ　ＴＴＡＴＴＴＴＴＭ　ＴＴＴｒＴ ＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴ　ＡＡＡＧＴＴＧＣＡＡ　Q４０ ＡＡＴＧＴＧＴＴＡＴ　ＴＴＴＴＧＧＴＡＡＧ　ＡＣＣＣＴＡＴＧＧＡ　ＴＡＴ ＡＴＡＡＡＧＡ　ＣＡＧＧＴＴＡＴＧＴ　ＧＡＡＡＣＴＴＧfＡ　３００ ＡＡＡＣＣＡ丁ＣＭ　ＧＴＴｒＴＡＡＧＣＡ　ＡＡＡＣＣＣＴＣＴｒ　ＡＡＧＡ ＡＣＴＴＡＡ　ＡＴｒＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＡ@３６０ ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴ　ＧＡＧＡＡ　３７５り＜クク＜り＜ 箪 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜Ｄ Ｅ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ 、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＡ （７２）発明者　オツペルマン　チャールズ　エイチアメリカ合衆国　ノースカ ロライナ州 ２７６１５　ローリ−セント　アントリユース　コート５００ （７２）発明者　ティラー　クリストファー　ジ−アメリカ合衆国　ノースカロ ライナ州 ２７６０７　ローリ−ディクシ−トレイル

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．形質転換した植物細胞から成る組換え病原体耐性植物であって、前記形質転 換した植物細胞が発現カセットから成る異種ＤＮＡ構成物を含み、この構成物が ５′から３′方向に、プロモータ、前記プロモータの下流に位置し機能的に結合 した構造遺伝子、および前記構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配 列から成り、前記プロモータが前記植物を攻撃する植物病原体により活性化され 、さらに前記構造遺伝子が前記植物細胞に有毒な生成物を暗号化することを特徴 とする組換え病原体耐性植物。
2. ２．前記プロモータがウイルス、細菌、真菌、および線虫より成る群から選択し た病原体により活性化されることを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
3. ３．プロモータが植物寄生性線虫により活性化されることを特徴とする請求項１ に記載の組換え植物。
4. ４．プロモータが根瘤線虫および包のう線虫より成る群から選択した線虫により 活性化されることを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
5. ５．病原体が前記植物の葉および根の組織より成る群から選択した組織を攻撃す ることを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
6. ６．病原体が前記植物の根の組織を攻撃することを特徴とする請求項１に記載の 組換え植物。
7. ７．プロモータがＲＢ７線虫応答要素であることを特徴とする請求項１に記載の 組換え植物。
8. ８．植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
9. ９．植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
10. １０．植物がタバコ、ジャガイモ、ダイズ、ラッカセイ、パイナップル、ワタ、 および野菜作物より成る群から選択した双子葉植物であることを特徴とする請求 項１に記載の組換え植物。
11. １１．構造遺伝子がＤＮＡおよびＲＮＡより成る群から選択した核酸を消化する ことができる酵素を暗号化することを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
12. １２．構造遺伝子がバチルスアミロリクエファシエンスリボヌクレアーゼを暗号 化することを特徴とする請求項１に記載の組換え植物。
13. １３．さらに前記構造遺伝子が多数のプロモータと結合するように前記構造遺伝 子の上流に位置し機能的に結合した第２プロモータを含み、前記各々のプロモー タが異なる植物病原体により活性化されることを特徴とする請求項１に記載の組 換え植物。
14. １４．形質転換した双子葉植物の細胞から成る組換え線虫耐性植物であって、前 記形質転換した植物細胞が発現カセットから成る異種ＤＮＡ構成物を含み、この 構成物が５′から３′方向に、プロモータ、前記プロモータの下流に位置し機能 的に結合した構造遺伝子、および前記構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合し た終結配列から成り、前記プロモータが前記植物の根を攻撃する線虫により活性 化され、さらに前記構造遺伝子が前記植物細胞に有毒な生成物を暗号化すること を特徴とする組換え線虫耐性植物。
15. １５．プロモータが根瘤線虫および包のう線虫より成る群から選択した線虫によ り活性化されることを特徴とする請求項１４に記載の組換え植物。
16. １６．プロモータがＲＢ７線虫応答要素であることを特徴とする請求項１４に記 載の組換え植物。
17. １７．植物がタバコ、ジャガイモ、ダイズ、ラッカセイ、パイナップル、ワタ、 および野菜作物より成る群から選択した双子葉植物であることを特徴とする請求 項１４に記載の組換え植物。
18. １８．構造遺伝子がＤＮＡおよびＲＮＡより成る群から選択した核酸を消化する ことができる酵素を暗号化することを特徴とする請求項１４に記載の組換え植物 。
19. １９．構造遺伝子がバチルスアミロリクエファシエンスリボヌクレアーゼを暗号 化することを特徴とする請求項１４に記載の組換え植物。
20. ２０．さらに前記構造遺伝子が多数のプロモータと結合するように前記構造遺伝 子の上流に位置し機能的に結合した第２プロモータを含み、前記各々のプロモー タが異なる植物病原体により活性化されることを特徴とする請求項１４に記載の 組換え植物。
21. ２１．農場で相互に栽培した請求項１または１４に記載の多数の植物から成るこ とを特徴とする作物。
22. ２２．農場において植物病原体に対抗するにあたり、形質転換した植物細胞から 成る組換え病原体耐性植物の作物を農場で栽培することから成り、前記形質転換 した植物細胞が発現カセットから成る異種ＤＮＡ構成物を含み、この構成物が５ ′から３′方向に、プロモータ、前記プロモータの下流に位置し機能的に結合し た構造遺伝子、および前記構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配列 から成り、前記プロモータが前記植物を攻撃する線虫により活性化され、さらに 前記構造遺伝子が前記植物細胞に有毒な生成物を暗号化することを特徴とする農 場で植物病原体に対抗する方法。
23. ２３．組換え病原体耐性植物を作出するにあたり；再生することができる植物細 胞を供給し；発現カセットから成るＤＮＡ構成物で前記植物細胞を形質転換し、 この構成物は５′から３′方向に、植物病原体により活性化されるプロモータ、 前記プロモータの下流に位置し機能的に結合した構造遺伝子、および前記構造遺 伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配列から成り、前記構造遺伝子は植物 細胞に有毒な生成物を暗号化し；さらに次いで前記形質転換した細胞から組換え 病原体耐性植物を再生することから成ることを特徴とする組換え病原体耐性植物 の作出方法。
24. ２４．前記植物細胞が再生可能な植物組織に属することを特徴とする請求項２３ に記載の方法。
25. ２５．前記形質転換の工程を前記発現カセットを有する微粒子で前記植物細胞に 衝撃を与えることにより行うことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
26. ２６．前記形質転換の工程を前記発現カセットを有するＴｉプラスミドを含むア グロバクテリウムツメファシエンスを前記植物細胞に感染させることにより行う ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
27. ２７．発現カセットから成るＤＮＡ構成物であって、この構成物が５′から３′ 方向に、植物病原体により活性化されるプロモータ、前記プロモータの下流に位 置し機能的に結合した構造遺伝子、および前記構造遺伝子の下流に位置し機能的 に結合した終結配列から成り、前記構造遺伝子が植物細胞に有毒な生成物を暗号 化することを特徴とするＤＮＡ構成物。
28. ２８．植物形質転換ベクターにより運ばれることを特徴とする請求項２７に記載 のＤＮＡ構成物。
29. ２９．形質転換した植物細胞から成る組換え病原体耐性植物であって、前記形質 転換した植物細胞が異種ＤＮＡ構成物を含み、この構成物が５′から３′方向に 、線虫応答要素、前記線虫応答要素の下流に位置し機能的に結合した構造遺伝子 、および前記構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配列から成り、 さらに前記植物の細胞中の前記線虫応答要素の活性化によりこの細胞が死滅する ように前記構造遺伝子が前記植物細胞に有毒な生成物を暗号化することを特徴と する組換え病原体耐性植物。
30. ３０．植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項２９に記載の組換え植物 。
31. ３１．植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項２９に記載の組換え植物 。
32. ３２．植物がタバコ、ジャガイモ、ダイズ、ラッカセイ、パイナップル、ワタ、 および野菜作物より成る群から選択した双子葉植物であることを特徴とする請求 項２９に記載の組換え植物。
33. ３３．構造遺伝子がＤＮＡおよびＲＮＡより成る群から選択した核酸を消化する ことができる酵素を暗号化することを特徴とする請求項２９に記載の組換え植物 。
34. ３４．構造遺伝子がバチルスアミロリクエファシエンスリボヌクレアーゼを暗号 化することを特徴とする請求項２９に記載の組換え植物。
35. ３５．形質転換した植物細胞から成る組換え病原体耐性植物であって、前記形質 転換した植物細胞が異種ＤＮＡ構成物を含み、この構成物が５′から３′方向に 、線虫応答要素、前記線虫応答要素の下流に位置し機能的に結合した構造遺伝子 、および前記構造遺伝子の下流に位置し機能的に結合した終結配列から成り、 前記植物の細胞中の前記線虫応答要素の活性化によりこの細胞が死滅するように 前記構造遺伝子が前記植物細胞に有毒な生成物を暗号化し； さらに前記線虫応答要素が欠失変異体Δ０．３ＴｏｂＲＢ７であり、前記欠失変 異体が配列番号：１０としてここに記載した配列を有することを特徴とする組換 え病原体耐性植物。
36. ３６．植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項３５に記載の組換え植物 。
37. ３７．植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項３５に記載の組換え植物 。
38. ３８．植物がタバコ、ジャガイモ、ダイズ、ラッカセイ、イネ、およびワタより 成る群から選択した双子葉植物であることを特徴とする請求項３５に記載の組換 え植物。
39. ３９．構造遺伝子がＤＮＡおよびＲＮＡより成る群から選択した核酸を消化する ことができる酵素を暗号化することを特徴とする請求項３５に記載の組換え植物 。
40. ４０．構造遺伝子がバチルスアミロリクエファシエンスリボヌクレアーゼを暗号 化することを特徴とする請求項３５に記載の組換え植物。